Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение аллергоида из клещей Dermatophagoides farinae и характеристика его физико-химических и иммунобиологических свойств

Р Г Б ОД

'л ОНТ 190-'}

российская академия медицинских наук

НАУЧНО-ЙССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК им. И.И.Мечникова

получение аллергоида из клещеи вегтагорьадохйез 1аг1пае и характеристика его физико-химических и ичмунобиологических свойств

i4.oo.36. - аллергология и иммунология

автореферат " диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

УДК: 576.8.097.2.001.5:576.895.421+613.633.

ПЕРОВА Наталия Александровна

МОСКВа - 1994

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕ5ШИНСКИХ НАУК КАУЧНО-ИССЛЕДОЗАТЕЯЬСЮЯ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК им. И.И.Мечникова

На правах рукгписи

УДК: 576.8.097.2.001.5:576.895.421+613.63 3.

ПЕРОВА Наталия Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ АЛЛЕРГОИДА ИЗ КЛЕЦЕЙ СегтаСорЛадо1с(е.9 Гаппае И .ХАРАКТЕРИСТИКА ЕГО 0ИЗИК0-ХКМИЧЕСКИХ И МЫУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ свойств

14.00.36. - аллергология и иммукслогил

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВа - 199 4

Работа выполнена б Научно-исследовательском институте вакцин г. гивороток им.И.И.Мечникова -Российской АМН.

Научный руководитель - доктор биологических наук В.М.БЕРЖШ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессо] В.Н.ФЕДОСЕЕВА

доктор медицинских наук, профзссо] И. В. ПЕТРОВ."

Ведущее учреждение - Государственный научко-исследовательст институт стандартизации и контре медицинских биологических препарат юл. Л.А." расевича Министерства здра! охранения к медицинской промышленное1] Российской Федерации

Запита диссертации состоится "_" _ 1994

в _ часов на заседании специализированного Сове

(Д ooi.38.oi) при Научно-исследовательском институте вакцт сывороток им.И.И.Мечникова Российской АМН по адресу: юзое Москва, пер.Мечникова, д. 5-а.

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке Научг исследовательского института вакцин и сывороток им.И.И.Кечг коза Российской АМН.

Автореферат разослан __"__1994 г.

Учешй секретарь специализированного Совета кандидат медицинских наук

Н.Г.КУДРЯЗЦЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для диагностики и специфической га.му-

гатерзпии аллергических заболеваний, связанных с сенсибилизацией с клещам домашней mi.ni рода Dernatophagoides, прженяют препараты, предетавлягсдие собой водно-солеЕые экстракты из культуры кле-цей. Недостатком таких препаратов, в силу их аллергешюсти и сла-3nx иилуногенных свойств, является необходимость проведения про-цолхштелького курса инъекций, а также риск возникновения аллергических осложнений при специфической иммунотерапии. Кроме того, в проявлении силптомов аллергических заболеваний кле-цевой этиологии не отмечается сезонности, что затрудняет гзг.г-'Жздуальный подбор начальных доз аллергенных препаратов из 1слещсй „омашкей шли и увеличивает. сороятность_ спрово-днровать у больного аллергические реакции- местного или зистемного характера (Bousquet J., 1985; Platts-Hills Т.А.Е., 1S87). Снижение аллергешюсти водно-солевых препаратов аллергенов путем модификации их разетшы».я химическими агента™ целает специфическую шдаупотерзшта более безопасной и Эффективной (Grammar L., 1985; Bousquet J., 1989; Noraan Ph., 1990). В этой связи разработка еознх лечебных форм клещевых аллергенов является особенно актуальной.

В последние годы широкое распространение в клинической практике получил? аллергоидч - препараты аллергенов,модкфЩ1фовашшх альдегидами. Использование в качестве модифицирующих агентов формальдегида Й глутарового альдегида (Harsh D., 1970; Patterson R., 1973) позволило создать целый ряд ал.таргоидор из различного

- г -

SJKSjr-CEHOrO сырья (Marsil D. , 1981; Mueller U. ,1982; Puttoncn E i3£2; ílakada Si»., 1985; Guerra F., 1993). В НЗШвЯ Стране

ocsose одноэтапного метода формадинизациг получены аллергоида шльца амброзии и других растений (Райкис Б.Н., i9g7). Показан чго применение кх для гкпосенсибилизащш дает положительный тер певтическкй эффект (Райкис Б.Н., 1904; Ворбнккн Н.И., iss6; г> рлчкша Л.А., 1990; Epeinn Г.Г., 1993). Однако до настоящего вр( мени способы изготовления отечественных кодифицированных препар; тов из клеазй домашней шли разработаны не были.

Цель к задачи исследования. Целью настоящей работы явилас)

разработка технологии получения эллергоида из клещ Derratophjçoidcs farinae И ХЭраКТерисМКЗ его фИЗИК0-ХЮ.шч8ских *:с5уно02о;.огкчсс:гзг свойств. Исходя из этого были поставлены еле дуетке задачи:

- разработка технологи! получения аллергоида из клеще о.íarinae на основе модификации клещевого аллергена альдегидами

- характеристика физико-химических свойств полученного мода: фшироБЭЕкого препарэта;

- исследование антигепшех свойств клещевого аллергоида;

- сравнительное изучение аллергенной активности злл-зргоида аллергела из клзцей D.farinae.

Научная новизна. На основе метода одноэтапной кодифжацп

формальдегидом бала разработана технология изготовления клеяевог сякиргокка. Впервые получен отечественный водафящованяЕй пр&пс рат аллергена (аллергоид) из клет,зй D.farinae.

Изучено влияние модификации формальдегиде;: на фззлко-хнш ческиз свойства клещевого аллергена. Установлено, что в рззульта is Фор:'.злинизз"-ТЯ1 происходят яазгс&сжю и ковфорчещконннб дрооб

раззвялия компонентов клетевого аллергена. Для модифицированного препарата (клецзвого аллергоида) показано изменение величин изоз-лектрическид точек белков и значительная потеря эстеразной активности.

Исследованы антигенные свойства клетевого аллергоида. Показано, что модифицированный препарат способен индуцировать Еыра-ботку специфических антител к немоди5ицирсвашюму клесевому аллергену в организме животных ( кролика и морской свинки). Обнаружено, что аллергоид вызывает выработку антител того же спектра, что и кледевой аллерген.

Сравнительный анализ аллергенных свойств двух препаратов выявил снижение способности клешевого аллергоида связывать специфические 1дЕ-аятитела человека. На модели секреции гистамина тучкы-ш клетками кшсы показано, что аллергенная активность аллергсида з 5оо раз нляе активности клещевого аллергена.

Практичеекзначимость работы. Разработанная технология по-

киеенч в основу "Инструкции по изготовление и контролю аллергоида :э клепей пета^рпадо^еэ гаппае". Экспериментальные серии препарате, изготовленные совместно со Ставропольским НПО "Аллерген", росли проверку в ГИСК им. Л.А.Тарзсевичэ и Комитетом по мйш |азрек:эны для испытания на ограниченных контингента больных

протокол N 7 от 15.07.1993).

Применена методов изоэлектрофокусирсЕания и определения стеразнсй активности ферментов позволило выявить степень мсдифи-ации клепеюго аллергена формальдегидом. Зтк методы могут Сыть спользованы в дальнейшем для стандартизации препарата клетевого ллергслда.

Для характеристики аллергенной активности модифицированного

препарата (клеяевого аллергоида) методом высвобождения гнетами подобраны оптимальные условия пассивной сенсибилизации перитоне лънш тучшх клеток крысы сыворотками больных.

Полот пая, швостне на защиту.

- разработанная технология формалинизации клещевого аллерп на позволяет получить модифицированный препарат из клеи-d.farina«, обладаний свойствами аллергоида;

- контроль модавнкации ¡следевого аллергена может осущес вляться с помощью физико-химических методов: изоэлектрофокусир вания ( определение pi ) н измерения эстеразной активности npi парата ;

- полученный клецевой алларгоид обладает высокой иммуноге] костью и cbbs8ehoS аллергенной активностью, что позволит повиси: эффективность н Сэзопасность специфической иммунотерапии п] клекевой сенсибилизации.

Апробация работы диссертация апробирована на научной конф

ревдз отдела аллергологии и инфекционной иммунологии НИИБС га H.Ii.lîû4H2K0sa РАМН з.ов. 199« года. По теме диссертации опубл! ковано s работ, список которш: приводится в конце автореферата.

Структура е объем диссертации. Диссертация состоит из введе

ния, обзора литература, описания материалов и методов исследовг ния, двух глав собственных исследований, заключения, выводов списка литература* Работа изложена на ... страницах мапшнописног текста, содерзшт 5 таблиц, г схемы и 15 рисунков. Сшсок литерг

туры включает ---- наименований работ отечественных и ззрубежнь

авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Сырьем для получения аллерге;лого препарата слукила культура клеаеа Darraatophagoidsq farinso (сем. Pyroglyphidao) , вар^ЗЗННЫХ

нз домашней шля. Кулыкзировзнпв осуществляли з тергостзтах при темперагуре 26 1 2°С и относительной влзеностп воздуха 75 5%.

Экстракцию аллергенного сырья прово„тал по разрзбот?1"~му нг-:ж методу. ЙЕТД1С15Й экстракт да/чссвала и л:о£и~:гщэсвсл:1.

Модк^икгтованйне тори ктекетюго аллергена (зллерговдн) получали, обрабатывая лю^аякзированные клесевне зхстрэкта (ЛКЗ) зльдегпда.'я : формзлыегздои ( одкоэтапны» способен по иагзь п., 1S70) к глутзрокш альдегидом (по методу nsfcada sn., isss).

Содерпат.3 бедка в препаратах клекг/к зллзргг.ноз (ЛКЗ) и а/лергскдов определяли с использов;.::пем i; -счтсля Кунассг '."-".го

(s.-;dY.dk j. , 1977).

Кзоэлектричес.кие точки (pi) белковых ксдокекгов кл?рзвого аллергена и зллергоида определяли с покецьр метода нзозлектрсЛто-ку сиро в з кия (ИЗО) в агарозпсм ге.г'3, содернасем эмфэлинп ;рН 5-9,5). В качестве кэдкбрзнтоз использовали набор стандартных белков с диапазоном pi о i з,о до ю,о (i-hamacia, Швеция).

Гель-фильтрацин проводили с использованием носителей сефадекса г,-хоо и сефзхрхпа s-зоо •.•. o,i ¡; фэофдтно-содсБого элпипуег^.го буфзра (рн з,о).

Эстерззную активность прззгратсв чазкевого аллергена и сл-дергоида определяли спехтрофотометрнчес"-:; ао начал:-.:-1М"л скоростям гидролиза синтетического субстрата - зтк.лоеого эХирз с°нзо-лд-ь-зргнкснз (БЛЗЭ) (Пэсхина Т.С., 136«),

Антагеннке свойства клещевого аллергоида ^зу-гэли ¡.-зт^деги

иммунодаДйузии ( ouchteriony о., 1958 ) и иммуноэлектрофорез, (Аксельсен Н.,1977). Для получения антисыворотск кроликам вводил: препараты клещевого аллергена и аллергоида в сочетании с полны адьювантом Фрейнда (i:i) при первой инъекции.

Реакцию активной системной анафилаксии воспроизводил!:, н морских свинках в соответствии с общепринятым методом (Титов С.И.,.1973). Животных сенсибилизировали двухкратно препаратам: клещевого аллергена и аллергоида (ю-15 мкг белка) в смеси с не полный адьювантом Фрейнда (з:2). разрешающую дозу препарата: (зо-4о мкг белка) вводили на 28-ой день внутривенно. Реакци оценивали по четырехбалыюй системе с расчетом индекса Вейгла.

При изучении аллергенных свойств препаратов клещевого аллер гена и аллергоида использовали сыворотки больных с сонскбилизаци-ей к клещам D.farinae, отобранные по результатам кояного тестирования ( предоставлены лечебными учреждениями г.Москвы ] Московской области).

Для характеристики специфической активности препаратов клещевых аллергенов и аллергоидов применяли микроточечный иммуно-ферментный анализ (МТИФА) (Михайлов А.Г., 1991,• Юров C.B., 1991) Степень снижения аллергенности модифицированного формальдегидом препарата оценивали с помощью метода, основанного на количественном определении гистамина, секретируемого тучными клеткам крысы в условиях in vitro в ответ на клещевой аллергоид или аллерген. Тучные клетки выделяли из перитонеальной полости крысы

к

Пробы, содержащие sxicr клето2:, инкубировали 2 часа с сыворотг.о! больного с высоким содержанием специфических клещевых igE-антите. (пассивная сенсибилизация), и затем добавляли индуктор - клещеsoi аллерген (о,1-50 мкг/мл белка) или аллергоид (10-50 мкг/мл белка) .

Количество секретируемого гистамина определяли в осадке (гистамян, оставшийся в клетках), и в супернатанте (гистамш, высвободившийся в результата индуцирования) после конденсации его с ортофталевым альдегидом (спектрофдуориметрйческий. 'метод

Shorâ Р., 1959). ; ■

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием критерия Стъвдепта.

РЕЗУЛЬТАТЫ. ИССЛЕДОВАНИЙ И ОЕдУГДЕЖЗ Модификация альдзгидЕШ аллергена из клецей D.farinaa и характеристика фкзико-хи.пчес:ш: свойств получение: тдифицпроззн-нз£х препаратов. Главной задачей настоящего исследования явилось

получение шдифлцпрованного. прзпарата клзвдгого аллергена. Для этой цели га применили два [.тает^пц^РУШК агента - йорглавьдзгид п глутаровкй альдегид. Изезстео, что оба соэдпес-екя рзагируэт, главным образом, со свободные ксзогруппамз бздксв. Результатом взаимодействия является образование вгянчзскпх связей в впдз внутримолекулярных метилзпопн ":.:остпков" (в случае фор:.'.альдзги-да), либо мзп.юлзкулярзая "cehbks" бзшгав ( в случая глутаральде-

гида) ( Habseb А.; -1968; lïarsh О. , 1970; Sachs О., 1Э70) .

Сырьем для аллергенного прзпарзта слуяала культура клецзй d.farinas, Еырацешдсс на домс-пшей шли. При изготовлении экстракта из клещевой культурн m использовал; осеовныз технологические прис:.и получения водно-солевых препаратов - кледевых аллергенов. Однако в связи с необходимостью последующей лнофидиззцип клецево-го экстракта нами были внесены существенные изменения в стадию экстрагирования.

В качестве экстрагента мы применили 0,125 M раствор гидрокарбоната вм-дзния (pH а,о), не содери!зий фенола, поскольку фенол

ко 223 т реагировать с а льда гидами и мешать дальнейшему процессу мо ди$як8цаи. Опытным путем было установлено оптимальное соотношени сырья и экстрагента ( т.юо) и'время экстракции - 45 часов. Полу чешый поело фильтрования и центрифугирования (зооо об/мин, 4: шн.) сттрта аллергенный экстракт подвергали диализу -<52 час: протез о.,002 и раствора гидрокарбоната аммония, последние 4 час: - против дистиллированной вода) и люфилизашш. После определение содержания бежа в 1 кг лаоЗилизированного клещевого экстракт; (ЛКЗ) в контроля сдецвфстаской активности клещевой аллерген моди-фЗЕровали глутарешм альдегидом в формальдегидом (табл. а).

Таблица 1. Услозня годфпсацан клещевого аллергена альдегидами.

Шдафшрупзаа Концентрация Реггм обработки

агент ' -

(МА) НА (%) ЛКЭ (ИГ/мл) рН t ( °С) время

Форыальдагид 1,о Глутаральдегид 1,о

Для освобовдения от избытка альдегидов и гипосульфита натрия, которым останавливали реакции клещевого аллергена с глу-таровым альдегидом, препараты диализовзли против о,ш фосфатного буфера (рн 7,0-7,2) и использовали для дальнейшего изучения.

.С этой целью мы примедми зизико-химические метода (изоэ-

4,0. 7,5 32 2 32 ДНЯ

зо.о 7,0 20 1 2 2 часа

тектряческое фокусирование и гель-фпльтрацию), позволяющие оце-шть изменения величин р1 и молекулярную массу белковых компонентов клещевого аллергена после взаимодействия их с альдегидами. '

Изучение модифицированного 'глутаровнм альдегидом клещевого аллергена с-помощью гель-фильтрации на сефадексе в-юо и методом 1-Ш показало, что обработка глутаровым альдегидом в описанных условиях не привела к увеличению молекулярной массы и не вызвала значительных изменений р1 белков по сравнении с неиодифлцирован-вым препаратом. Мы полагаем, что "полЕ.ьэррзованяый" клещевой зл-лергоид ке удалось полупггь из-за низкого содерзашя белка в ЛКЭ. Увеличение ;~е концентрации белка с помощью частичной очистки кле-девого экстракта связано с большими затратами дефицитного клещевого сырья. Учитывая вышеизложенное, мы отказались от дальнейшей разработки способа получения моди'Сгцировашюго глутаровым альдегидом препарата и использовали в качестге модийгщирующего агента формальдегид.

Следующим этапом нашей работа явплось изучение физико-химических сеойств модифицированного формальдегидом клещевого аллергена.

Одновременное ИЗФ образцов исходного клещевого аллергена и формалинизированного препарата (аллергоида) позволило выявить различия в значениях рх белковых фракций этих препарэтов. Обнаружено, что фракции немодпфицированного аллергена более гетерогенны по заряду и располагаются в нейтральной и кислой областях градиента рн (р1 от 3,5 до 7,4). Фракции аллергоида йокусируются ближе к аноду в пределах узкого интервала рн (р1 от з,5 до 4,35), максимально.концентрируясь в зона-{ с рн з, <1-3,6 и рн 4,0-4,55 (рис.1). Наблюдаемые различия в кгрткне исоэлектрофорети^еского разделения обусловлены взаимодействием формальдегида с полога:-

тельяо зарязенЕкми аминогруппами белковых компонентов аллергена Изменение суммарного поверхностного заряда вызывает изменение р1 поэтому фракции аллергоида смещаются в кислую зону градиента р] при изоэлектрофокуспровании. Метод ИЭФ позволяет достоверно выявить изменения рх и монет зцть использован как для контроле процесса модификации, так и для дальнейшей стандартизации клещевых аллергоидов.

Для оценки изменений молекулярной массы компонентов клещевого аллергена, обработанного формальдегидом, мы сравнивали объеш выхода образцов клещевого аллергена и формалкнизированного аллергоида при гель-фильтрации на колонке с сефакрилом з-зоо. Профит

3.50

1 Щ'Л 4.55

I'-* -г 5.20

I

5,85 ____

6,55 ~

- 6,39 -

7,35 -

С* 8.15 схема

<1 р! а Ь

Рис.1 Результаты ИЭФ (электрофореграмма к схема): а - клецевог аллерген; ь - аллерген, дадифицпрозакшй глутароЕым альдегидом; с - аллерген, шдкфпцвровашв! Фо£..:зльазгедо'.д; л - маркера рх.

ь

а

элзэцкл клещевого аллергена и аллергоидэ были сходны. В обоих случаях образцы элшровалксь одним пиком, однако максимум кривой элзцаи аллергоида был несколько сдвинут в более высокомолекулярную область. Средние значения объемов выхода клещевого аллергена и'аллергоидэ составляли 37 мл и 80 мл соответственно (рис. 2).

Незначительное уменьшение объема выхода клецевого аллергоида по сравнении с аллергеном не соответствует представления об укрупнены! молекул аллергоида в процессе аормалкниззцди. Иозно предположить, что разница з объемах выхода исходного п модифицированного препаратов связана с кок 1тармащ10 иными преобразованиями

Рис.2 Результаты гель-фильтрации аллергена из клещей о.£г.г1г.го и формалтшзированного клещеЕого ■ аллергоида на се'факриле з-зоо. Профили эл;ддии: аллергена (—), аллергоида (- —). КалиОранты: Д - де:-стран (з.ооо кДа), К - каталзза (гзо кПд), X - хпмотрипси-коген А (25 кДа), Р - рибонуклеаза (13.6 кДа).

беякоЕых компонентов клещевого аллергена в результате их взаимодействия с формальдегидом. Нарушение нативной конформации приводит к изменению форма молекул й влияет на их способность проникать во внутреннюю фазу носителя при гель-фильтрации, что проявляется в уменьшении объема Бахода, т.е. "капусемся" увеличенш молекулярной массы.

Косвенным подтверждением конформационных изменений в молекулах белков формалинизнрованвого препарата могут слукить результаты исследования его ферментативной активности. Известно, чтс большинство клиначекз! значках клещевых аллергенов являются ферментами, относящимися к цистепнов^и к ссриковым протеиназам типе папгипа и трипсина а., гевз). Эти ферменты катализирую

расцепление пептидьнх, аьзщшх и слошюэфарных связей, в образовании которих принимают участие карбоксильные группа основнш аминокислот аргинина и лизина.

Для определения зстеразной активности мы использовали этиловый эфир бензоил-ь-аргншна (БАЭЗ), являющийся классическим низкомолекулярным субстратом трипсина и папаина. Показано, что экстракт из клещей о.£аг1пгс шее? шсокую зстеразную активноси (19.36 мкЫ Ь'.ЭЭ в мш/мт белка), сравнимую с активностью трипсин; (27,9 мкЫ Е'.ЭЭ в млн/мг белка). Обнаружено, что после обрабогю формальдегидом препарат сохраняет лпсь 8% активности исходногс клещевого аллергена ( 1,5 мкм БАЭЭ в мин/мг бзлка). Вероятно формалинпзация привела к затруднению взаимодействий, обеспечивающих связывание и расщепление субстрата клещевыми протекназами. Снижение эстеразной активности клещевого аллергоида монет такгд являться свидетельством того, что кодификация затрагивает клеще-вне аллергены, являющиеся фзрмзнтЕ:.;п.

Результаты изучения фкзико-хплгческих свойств форма лшшзиро-

¡энного клещевого аллергена показали, что обработка ЛКЭ формальдегидом в описанных условиях позволила получить модифицированный грепарт - клещевой аллергоид.

Изучение антигенных и аллергенных свойств формалннизирйван-

ного клещевого аллергена. Основным преимуществом применении для

¡пещфгсеской ишуштбрзшш модйЕшировзшых £орм аллергенных [репаратов является их снизенная аллэргекность п£и сохранении зялуногенных СВОЙСТВ;' ,

Сравнительное изучение антигенных свойств клзсзвого аллерго-да и аллергена проводили с-луеохгтпчзскпя кзтодпмз с пспольго-(знием получении наглз спешфиескгх кроличьих еятасыворотох. 06-:арупено, что оба препарата внэнвгвт у швбТЕнг наработку прзцз-итиругашх антител. Кгк ездпо из результатов рэетет дгоЗноа ра-гальпой гэдуЕояф&узиз в егароЕСм гдлз (рпс.э), кзгшй прзпзрат орлфует огсэтлекз прзцяштатн о гсг^аэтптшжл сзтаснвороткЕет. лияние лпнй! прзцшштацяз, образовании аллергеном а

ллергоидом, является годтЕзрздеЕгзы пз оптигзееоЗ идентичности, лодует ответить, что при рзгок Еонцэптрзщшг изучаем препара-ов (0,5 иг/мл) реакция аллэргоздэ с антатвлагли к исходного ал-ергену вырагона слабее (рпс.з,1). в то та время, набладаэтся ильное взаимодействие клегевого аллергена с аятиаллергоидной сы-ороткой (рис.з,п). следовательно, з аятпаллергоиднгой сыворотке рисутствуют антитела, сходаые по спецсфпшста с антптелзгш, об-азуидаяся при иммунизации животных клецевнм аллергеном. Об этом е свидетельствуют и результаты, полученные методом линейного им-' уноэлектрофореза (ЛЮФ). Прн одновременном ЛШ'образцов изучаете препаратов в геле, содержащем антиаллергоидную сыворотку, об-арузг-зно формирование иммунопреципитатов как клещевым аллергои-

з 0_ o fícT) о'

2 1 4

7 О

О

II г

О

foil о

6

5

8

Рес.э Реакция двойной радиальной имаднодиффузии с антисыворогкг к класзвому аллгргену (i) п аллергопду (ii). В лунках:i - sirrn воротка к аллергену; г - экстракт домзшюй шла; з,б - аллерга 4,7,8 - зллергсЕДН; 5 - антисшзороткз к аллергоиду.

дом, хак и аллергеном, причем, последний по количеству прещппи тов превосходил аллвргоид. Сниженная реактивность клещевого £ лергоида i.;oect быть связана с отдифякацпей препарата формальде1 док, в результате которой происходит блокирование и /или экраг рование антигенных детер:.;пнанг. Напротив, эффективное' ваша действие ЕзыодпфпцароЕаЕНого аллзргека с антиаллергоидыой сш роткой обусловлено доступность» его зпитопов для igG-антител.

Способность клещевого аллергокдз стимулировать синтез алле генспецкфических антител обнарунена такжэ и в реакции актквг системной анафилаксии in vivo. Эксперименты проводились на де группах морских свинок, которых сенсибилизировали клещевым алле

"■енсм (I груша) и клещеЕым аллергоидом (и груша). В обеих дуплах у сенсибилизированных морских свинок, получивших разреша-зшую инъекцию одноименного препарата (аллергена и аллзргоида) 1роязления анафилаксии были сходными (таблица 2). слабые симптомы знафнлаксии наблюдали при постановке перекрестной реакции, когда юрским свинкам I групш вводил* разрешающую инъекцию аллергоида.

Саблица 2. Результаты реакции активной системной анафилаксии в условиях сенсибилизации морских свинок аллергоидом и аллергеном из клещей о^агл-пае

га Сенсибилизирующий Разрешающая Индекс Вейгла

группы препарат инъекция

клещевой аллерген 2.50

клещевой аллергоид 1.16

Клещевой клещевой аллергоид 2.зз

п аллергоид----

клещевой аллерген 2.вг

3 то 7.е время, при введении !'.орским свинкам и групш разрешающей дгьекцки эдлзргена, наблюдали ярко выракенную реакцию анафилаксии, по силе не уступающую ответу яивотшх I группы при сенси-5ип^зэшш и разрешении их аллергеном.

Нз основании полученных данньи можно заключить, что нммуно-?енные свойства клещевого аллергоида сохранены и препарат спосо-

Клецевой аллерген

бен индуцировать выработку антител, специфичных к нешдифшкгров; ному клещевому аллергену. Этот факт согласуется с современны! представлениями об имм.унологкческих механизмах распознавания aj тигенов. Известно, что Т-эпитопы, распознавание которих Т-клетк; r-'ii оОуслозгавоот дальнейший иммунный ответ, являются секвенциал! жза. Поскольку клещеЕой еллергогд, отличающийся от зллерге! кокформзцдей, сохраняет аминокислотную последовательность неис кзкпсй, koseo преддолошть, что в ход; процессикта обз фзрьы-пр€ парзтэ проходят одна и тот ze путь превращений, что обеспечивав B^isOOTxy антител, Бзаккодзйстзукгих с перекрестко-реагирукгдз, cKTErc-:nas.¿í дзтеркинезтаьк ккегаевсго йялеогона и аллергоидв.

Особый интерес представляет ьопрос об аллергенной активное та: гада$пщро£2кнш. прокфзюй. Кэес«ко, что ттгоце-с хвлическс иои&дазцда затрагивает, как правило, ювформащ^кныв Ь-кдеточн:; гпитош еллергенов. В то re среия детермикиты, определяйте последсззтелыюст^а емкго^тсло:', являпся устоагжагк v в мспъдз степени шдззргжты елиявлю химических агентов ( ъовыыего к. 1990). Поэтому ва::«ой"характеристикой аллерголдоъ яв~ястся и "остаточнзя аллергедиость". Оетзто'-дхгя аллеггекность оз?;ачаз сохраняющуюся после модификации способность гллергоида реагкро взть со cnaiKii£a45Cí3SKa 1дЕ-ак:л1телгм:.т и доллла составлять не со лее от зллергег ;Dl! активности немоджфгщирслэтюго препарат (Karsh D., lili).

JIpofCEuHHoe iia«cí изучение аллергенной гкотвноста модвдацирэ-ванного формальдегидом клеаевого зл^оргенэ о помощью метода мик-рстсчечного кллуноферментного анализа (.¡ГГИФА) показало, что в от личие от клещевого аллергена клецевоЛ алдзргсщт значительно слабее связывает igE-антителз из ензороток Гюлыд-Х с гльдево:; сс>.с;;-билизашей. Визуальное сравнение результата:. MTiííA показало, чте

гробы аллергоидов с концентрацией белка о,4 ur/мл, ках/о0г„,'чзсззн-вне на нитроцеллшозной мембране, после инкубирования с скзорот-кзми и иммунодетекции давала чуть сакзтеое окраяявакие с хро;ю-генныы субстратом днзмнЕОбеязщинэи, срзвшаюе с окрзсзшонпзм аллергена при концентрации белка в препарате 0,01 irr/мл.

Для оценки степени сниязпгя аллергенной активности 5зог-.Лшл-рованного формальдегидом аллергена из клекэй D.farii-зэ in crpiузнали метод, основэнннЯ на количестве несу спрэх-з-гсня гастсглшй, секретируемого тучньага клэтклиз крыси (в условиям in vitro). в качестве модели мы использсзалз пзрзтонэздьныз тучпш кдегкл крысы, пассивно сенсибвлЕзпрся£Г5аз сигорогсгот б-ojsnaz с аллергией к клещам доасгнзй пала d.farinas. В ücshz зкспзр^итах сенсибилнзацвя тучжт. кдатск ззепсэлз от cïccsia рззавгокм cjso-роткз. Нещ бита пркяпззн сыворотка з рвзввКЕзях i: ю. и«, на. Установлено, что snxyûainn клеток с снворотхоЯ в рззвздзглл im приводят к 13%-еоиу B4CBoOogf.3EZB гастсгзшэ, что приблизительно на киз уровня спонтанной сзкрзштя (рзс. 4 з,с).

СгязызаЕЕс xgs на клетка - это процзсс, гэЕисиша от ни. О кинетика св-чснвання судили но сакрз1тз! гест£?л<яо тучньта клетками, активированными клеше в;-? i аллергеном в кс;гдентр'";.'Л1 ю мкг/ил. Удлинение времени инкубации с сшюротксй от 5 кшут г.о 120 минут привело к увеличение количества Еысвобоздэеюто гистэ-ютна тучными клетками более, чей в два рзза (25% и 52г соответственно) .

Полученные .результаты свидетельствует о том, что оптимальная сенсибилизация наступает после двухчасовой инкубации тучках клеток с сывороткой в разведении i : 4.

В каждом опыте контролем слухили тучные клзтки, спонтанно секретирущие гистамин в течение 120 минут. Для проверки секрета-

40

30

5" Р0

щ Ж

* *

п

Рис.4 Влияние клещевого аллергена и аллергоидз на секрецию гиста мина. Секреция гистамина (%): спонтанная (а); при действии: кон канавалина А в концентрации зо мкг/мл (Ь); сыворотки в разведенн 1:4 (с); аллергена в концентрациях 50 мкг/мл (<2) и о,1 мхг/м. (е) ; аллергоида В концентрации 50 МКГ/МЛ (П (*р<0.05; **р<0,01)

рущей способности не сенсибилизированных клеток был пспользова; Кон А, который в концентрации зо мкг/мл вызывал 49%-ную секреции Исследование влияния различных концентраций клещевого аллергена на секрецию гистамина сенсибилизированными тучными клеткам показало, что препарат в диапазоне концентраций 0,1-50 мкг/"" вызывает высвобождение гистамина из тучных клеток, при этом количество секретируемого медиатора зависит от дозы индуктора (рис.5). Максимальная секреция (48%) наблюдалась при действии не

тучные клетки аллергена в концентрации ю мкг/мл. Дальнейшее увеличение дозы индуктора не приводило к повышению уровня секреции. Следует отметить, что эффективная концентрация аллергена (0,1 (¿кг/мл) оказалась на два порядка ниже концентрации Аллергена, вызывающей максимальную секрецию. Это свидетельствует о высокой специфической активности клещевого аллергена.

Для сравнения аллергенных свойств модифицированных и немоди-фицированных препаратов аллергенов применяют несколько подходов {МоэЪесь н.; 1988). С одной стороны, отличие в аллергенных свойствах моает быть показано как разшща в ответах, полученных

гл

1С о

Рис.5 Высвобождение гистагаия из тучных ¡слеток, стимулированных клещевым аллергеном в концентрациях 0,1 мкг/мл (з), 1 мкг/мл (Ь),

10 МКГ/МЛ (С), 50 ЮТ/МЛ {(3) ( * р< 0,05; ** р<0,01).

при использовании равных доз аллергена и аллергоида. Нами уст; новлено, что клещевой аллергоид и аллерген в концентрации ; мхг/мл вызывают 18%-ную и 48%-ную секрецию гистамина соо: ветственно (рис.4). С другой стороны, аллергенную активность мог но выразить как относительное увеличение дозы, необходимой да того, чтобы секреторный ответ клеток на клещевой аллергоид бь равен-ответу клеток на клещевой аллерген. Так, аллергоид в ко! центрации 50 ькг/мл вызывает 18%-ную секрецию гистамина, сравнимую с секрецией в ответ но аллерген в концентрации 0,1 мкгди Полено. заключить, что относительная аллергенная активность клеще еого аллергоида в 500 раз ниже активности клещевого аллергена.

Полученные нами результаты согласуйся с данными литератуг ко определения аллергенной активности шльцевых аллергоидс

(ПггсЬ О., 19Ы; РиЪ1спсл О., 1902).

Таю:?,! образом, полученный нами клещевой аллергоид в сравни мих с аллергеном концентрациях практически не обладает спосоС костью симулировать секрецию гистамина из тучных клеток,что мо служить основанием для безопасного применения клещевого аллергет: да в более бысо;зз дозах при лечении аллергических заболевании вызванных сеискб;:лкззцией к клещам о.гаг!пао,

ВЫВОДЫ

1. Разработанная технология однозтапной формзлинизации ал дергана из клещей о.ГагЛпае позволяет получить модифицировании препарат - клещевой аллергоид.

2. Обработка формальдегидом приводит к хмяячеекпм к г.окфор мацконным изменениям компошнтоз клещевого аллоргена, о чом саи дзтельствует снигенке езличин р! к значительная потеря эстеразно

- 21 -

активности клещевым аллергоидом.

3. Установлено, что в результате формалинизащш снижается способность клещевого аллергоида взаимодействовать со специфическими к немодифидаровзнному клещевому аллергену ?хдо-антителами животных и i-gE-антителами человека. На модели секреции гистаминз тучными клетками крысы показано, что аллергенная активность аллергоида в 5оо раз ниже активности клещевого аллергена.

4. Показано, что клещевой аллергоид сохраняет иммуногенную активность и способен индуцировать у тавотных (кролика и морской свинки) выработку антител, специфичных к ^модифицированному аллергену .

5. Совокупность данных, полученных в работе, свидетельствует о том, что предложенные наш! физико-химические методы (изоэлект-рофокусироваяие, гель-фильтрация, определение эстеразной активности) и тест высвобождения гистамина из тучных клеток могут быть использованы для оценки степени модификации и аллергенней активности модифицированных препаратов аллергенов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ® ДИССЕРТАЦИИ

1. "Изучение фракционного состава аллергенов из клещей Dnrmatophagoides farinaa" (СОЭВТ. БеркеЦ'В.М., ЕмвЛЬЯНОВЗ О.Ю., Голышева М.А.). Б кн.: "Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов", Пермь,

1908, С. 164-165.

2. !|0ценка аллергенов ИЗ клещей рода Dermatophagoidss кмму-нофермзнтним- методом" (соавт. БержецВ.М., Емельянова О.Ю., Смирнова Е.Я., Петрова Н.С.). В кн.:"Применение иммунофзрментлого анализа в медицине" (Материалы распуб. науч.конф., 1939), Харь-

КОВ, 1989, С.97-98.

3. "Изучение свойств аллергенов из клещей домашней шли" (соавт. Бержец В.М., ШельякОва O.K., Голышева М.А.). Материалы i-го съезда иммунологов, М., гэээ, т.2, с.зго.

4. "Разработка технологии, оценка фракционного состава и применение для диагностики и лечения аллергенов из клещей Dermatophagoides farinae" (СОЭВТ. БеркеЦВ.М., Емельянова O.D., Голышева Ы.А.). В кн.¡"Проблемы медицинской иммунобиотехнологии" (Материалы Всесоюз. науч. конф., октябрь, 1988), Л., 1ээо,

C.103-105.

5. "Фракционный состав и очистка аллергена из клещей

D.farinae" (соавт. йлельянова О.Ю., Бержец В.М.). В кн.: "Актуальные вопросы медицинской биотехнологии", Томск, 1991, c.7i.

е. "Антигенные и аллергенные свойства экстракта из клещей d.farinae" (соавт. Оиельянова О.Ю., Голышева М.А., Бержец В.К.). Журн. МШфОбИОЛ., 1992, N 4, 0.51-54.

7. "Стимуляция клещевым аллергеном и аллергошюм секреции гистамкна из тучных клеток" (соавт. Хлгатян C.B., Бержец В.М.). БЮЛ. ЗКСПер. бИОЛ., 1993, N 9, с.311-313.

8. "Activation of Na/H-exchange in rat peritoneal mast cello (RPMC) by allergen from Dermatophagoides farinae mites" (Khlgatian S.V., Pinelis V.G., Strukova S.U.). J.Allergy Clin.Immunol., 1993, v.91, N 1, part 2, p.lGO.

9. "Влияние модификации формальдегидом на физико-химические свойства и специфическую активность аллергена из клещей d.farinae" (соавт. Емельянова О.Ю., Хлгатян C.B., Бержец В.Ы.). Курн. микробиол., 1993 (принято в печать).