Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Разработка и применение полимерных систем доставки препаратов нейротропного действия

Тарасов Вадим Владимирович

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ ПРЕПАРАТОВ НЕЙРОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ

14.04.01 - Технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 4 МАЙ 2012

Москва - 2012

005044693

005044693

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

профессор Краснюк Иван Иванович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, на- Боковикова Татьяна Николаевна чальник лаборатории химико-фармацевтических препаратов №1 Испытательного центра ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России

доктор фармацевтических наук, Гузев Константин Сергеевич ведущий специалист отдела обеспечения качества ЗАО «Ретиноиды»

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» РАСХН.

Защита состоится «20» июня 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при Первом Московском государственном медицинском университете имени И.М. Сеченова по адресу: 119991 г. Москва ул. Трубецкая, д.8, стр. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан «_» мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Современный ритм жизни, неблагоприятные экологические условия, сложная социальная обстановка в мегаполисах приводят к увеличению числа нервно-психических расстройств непсихотического типа («пограничных состояний»), и, как следствие, увеличение потребления препаратов нейротропно-го действия, таких как анксиолитики, препараты снотворного действия, психостимуляторы. При этом эффективность терапии во многом остается недостаточной, что объясняется следующими причинами. С одной стороны, длительный прием таких препаратов, как бензодиазепины, приводит к развитию толерантности, что, в свою очередь, влечет за собой увеличение количества принимаемого препарата и, соответственно, как следствие, усиление токсического действия. С другой стороны, большинство лекарственных веществ, обладают неселективным действием и в незначительной степени проникают через ГЭБ.

Одним из способов решения данной проблемы является использование высокоселективных нейротропных веществ, к числу которых относятся соединения эндогенного происхождения, в частности пептидной структуры или их искусственные аналоги. Эндогенные пептиды обладают высокой селективностью действия к определенным группам рецепторов, подвергаются естественной биологической деградации и не оказывают токсического эффекта на организм. В этой связи разработка пептидных препаратов для терапии пограничных состояний является перспективным направлением фармакологии и фармацевтической технологии.

Однако, использование лекарственных средств на основе пептидов связано со сложностями, в частности с протеолизом пептидазами крови при введении в организм.

Возможный способ решения данной проблемы - создание наноразмерных систем доставки. Наночастицы позволяют осуществить доставку веществ направленно: внутрь клеток, через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и т.п.. При этом обеспечивается защита сорбированного или включенного в наноча-

стицы вещества от воздействия агрессивных факторов внутренней среды организма, таких как хлористоводородная кислота и ферменты, входящие в состав желудочного сока; от разрушения протеазами крови и др., что позволяет увеличивать эффективность препарата.

Перенос через ГЭБ актуален для такого вещества, как рекомбинантный эритропоэтин человека (РЭЧ), способного предотвращать гибель нейронов in vitro и in vivo, однако высокая молекулярная масса и значительная степень гликозилирования молекулы РЭЧ существенно снижают его проникновение в мозг при внутривенном введении.

Использование наноразмерных носителей актуально и при применении традиционных анксиолитиков бензодиазепинового ряда, в частности феназепа-ма, т.к. позволяет снизить присущие им нежелательные эффекты: миорелакса-цию и седацию.

Таким образом, в работе предлагается использовать преимущества наноразмерных форм препаратов для повышения эффективности новых и традиционных лекарственных препаратов нейротропного действия, а также снижения выраженности нежелательных эффектов. Цель исследования

Теоретически и экспериментально обосновать технологические и фармакологические аспекты применения наноразмерных систем доставки препаратов нейротропного действия. Задачи исследования

1. Разработать подходы к целенаправленному синтезу пептидов с анксиоли-тическими свойствами.

2. Разработать технологию получения наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.

3. Разработать подходы к стандартизации наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.

4. Изучить основные технологические факторы, влияющие на получение наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.

5. Провести сравнительное фармакологическое изучение полученных нано-

размерных форм препаратов нейротропного действия.

Научная новизна результатов исследования

В результате проведенных исследований синтезирован оригинальный тетрапептид (ТП) структуры РНе-(3-А1а-01у-Тгр-МН2 и показана его анксиоли-тическая активность, получен патент «Тетрапептид, обладающий анксиолити-ческим действием» (№2429003 от 20.09.2011).

Впервые на основе комплекса физико-химических, технологических и биофармацевтических исследований разработаны составы наночастиц (НЧ) на основе полибутилцианоакрилата (ПБЦА) с тетрапептидом и феназепамом, получена экспериментальная форма наночастиц с эритропоэтином на основе ПБЦА, а также разработаны технологические схемы получения стабильных лиофилизатов наночастиц тетрапептида и феназепама.

Изучены физико-химические и технологические характеристики полученных экспериментальных наносомальных форм тетрапептида, феназепама и рекомбинантного эритропоэтина человека.

Изучена специфическая активность полученных экспериментальных форм на лабораторных животных. Показано, что применение наночастиц тетрапептида РЬе-р-Ак-Оу-Тгр-ИНг обеспечивает повышение анксиолитической активности и пролонгирование действие вещества в сравнении с субстанцией, а в случае использования наноносителей феназепама снижение нежелательных миорелаксантного и седативного действия при сохранении выраженного ан-ксиолитического эффекта.

На модели ПБЦА-НЧ с рекомбинантным эритропоэтином человека показано, что использование наночастиц, нагруженных биологически активными веществами, обеспечивает их доставку через неповрежденный ГЭБ при внутривенном введении.

Практическая значимость полученных результатов

На основании проведенных исследований разработаны:

- Оригинальное лекарственное вещество - тетрапептид структуры: РЬе-Р-А1а-01у-Тгр-Ш2;

Состав экспериментальной лекарственной формы наночастицы с феназе-памом (лиофилизат для инъекций)

- Состав наноразмерной формы тетрапептида анксиолитического действия (лиофилизат для приготовления назальных капель);

Состав наноразмерной формы рекомбинантного эритропоэтина человека;

- Технология получения лиофилизата наночастиц тетрапептида (Лабораторный регламент, апробированный в лаборатории биологически-активных соединений НИИ фармации).

Положения, выносимые на защиту

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию стратегии синтеза соединения - тетрапептида РЬе-Р-А1а-01у-Тгр-МН2, а также состава и технологии получения его экспериментальной формы с наночастицами;

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию состава и технологии получения экспериментальной формы феназепама с наночастицами;

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по разработке технологии получения наноразмерной формы эритропоэтина;

- результаты исследований физико-химических и технологических характеристик полученных наноразмерных форм биологически-активных соединений;

- результаты изучения специфической активности полученных наноразмерных форм на лабораторных животных.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на заседании №4 от 15.11.2011 межкафедральной научно-практической конференции на кафедре фармацевтической технологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Положения и практические результаты работы доложены на VI междуна-

6

родной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность (Москва, 2009 г.).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 - Технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.

Связь задач исследования с проблемным планом

Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер Государственной регистрации 01.2.00606352).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ полностью отражающих ее содержание, в том числе 2 статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ и патент «Тетрапептид, обладающий анксиолитическим действием» (№2429003 от 20.09.2011).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 183 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», экспериментальной части (результаты собственных исследований и их обсуждение), выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 53 рисунками.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе (обзор литературы), представлены основные направления в области разработки и применения препаратов пептидной структуры, фармацевтических нанотехнологий; оценивается перспективность применения пептидов и наночастиц в качестве потенциальных лекарственных средств, а также возможности модификации препаратов, применяющихся в клинической практике.

Во второй главе (материалы и методы) изложены материалы и методы, использовавшиеся при проведении технологических исследований по получению наноразмерных форм, изучению их фармакологической активности.

В третьей главе (результаты собственных исследований) представлены полученные в ходе экспериментальной работы данные по разработке наноразмерных форм препаратов нейротропного действия, а также дано подтверждение их эффективности на моделях с лабораторными животными.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть исследования проводилась в лаборатории биологически-акгавных соединений НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. ИМ. Сеченова

Методы исследования

1 Методы синтеза, идентификации и количественного определения теграпептида в субстанции и экспериментальных формах

1.1 Методика синтеза тегра пептида

Синтез тетрапегтщла с аминокислотой последовательностью Phe-|3-Ala- Gly-Tip-Nl-ybm выполнен на твердой фазе с использованием пеггщцного синтезатора Applied Biosys-

terns 433А, применяли Fmoc-сгратегию.

12 Аналю структуры и чисплы пептида

Проводили методом жид костной хроматографии с масс-спеюрометрическим детектором на аналитической колонке (хроматограф Agilent Technologies 1200, США) путем измерения времени удерживания для главного пика, которое затем сравнивали с расчетным. Пробу пегтщпа растворяли в смеси ацегонигрил: тетрагидрофуран : вода в соотношении 40:40:20 и анализировали методом ВЭЖХ с масс-спеюрометрическим детектированием, при этом влияние растворителя (1% АсОН в воде) оценивали по хромагограмме, полученной в первую минуту наблюдения как при положительных ионах (0,5 мин), так и в отрицательных ионах (0,5 мин). Масс спектр пептида получали прямым вводом с электроионизашей в режиме снятия положительных ионов.

13 Методика очистки тетрапептида

Очистку проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия ВЭЖХ: колонка Watere DehaPak, CI 8,5 цм, 100 А, 3,9 х 150 мм; детекторная ячейка: аналитическая; скорость потока -1.0 мл/мин; длит волны: 214 нм; диапазон де-тектирования: 0,5 AUFS; величина петли: 100 цл (петля заполняется 150 [± 10] цл образца, объем впрыска = 100 цл); элюенг А: 5.0% ацегонитрила, 0.1% трифгоруксусной кислоты, в воде; элюенг В: 60% ацетоншрила, 0.085% трифгоруксусной кислоты, в воде; градиент. 0-60% В в течение 60 мин.

1.4 Методика определения степени сорбции тетрапептида на НЧ

Степень сорбции ТП (а%) на поверхности наночасгац определяли как отношение количества ТП, связанного с наночасгищми, к общему количеству ТП, введенного в попимери-зационную среду по следующей формуле:

ао/о=С£2кШ где, ОД

С(а) - исходная концентрация ТП в суспензии, C(f) - концентрация ТП в супернатанте.

Для расчета а% свободный и связанный ТП сепарировали методом улырацентрифуги-рования в течение 30 минут при 80000 g (ценгрифуга BECKMANMODELL 5, USA). Концентрацию ТП в супернатанте определяли методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором.

2 Методы идентификации и количественного определения феназепама в субстанции и экспериментальных формах

2.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография

Для проведения качественного анализа использовали хроматограф жидкостный -1200 («Agilent Technologies», США) с фогодаодно-матричным детектором.

Условия хромагографирования: Колонка Zoibax SB-C18,5mkm, 50*4,6мм. Подвижная фаза: ацегонигрил/раслвор додецилсульфата натрия в воде (3,5мМ), подкисленной оргофос-форной кислотой (0,1%)-37/63 % об.

22 Спекгрофотомегрический анализ субстанции феназепама

Концентрацию феназепама в НЧ определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-121 «ЛОМО» (спектральный диапазон от200 до 760 нм). Для построения калибровочного графика, измеряли оптическую плотность феназепама в растворе диме-талсульфоксида (ДМСО) и находили максимум поглощения феназепама в р-ре ДМСО для последующих измерений концентраций феназепама в образцах.

3 Методы изучения свойств наночаспщ

3.1 Определение размера наночаспщ.

Размф определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K). Лиофилизат из 1 мл растворяли в 2 мл воды, отбирали аликвогу (50 мкл) и помешали в кювету, содержащую 3 мл бидисгиллированной воды. Величину частиц определяли немедленно при следующих рабочих параметрах: scattering angle 90°, температура 25°С, вязкость 0,01 пуаз., показатель преломления 1,333.

32 Сканирующая электронная микроскопия

Для изучения структуры наночаспщ применяли сканирующую алекгронную микроскопию, работу выполняли на приборе «JEOL JSM-ТЗЗО» (Япония) при напряжении 20 кВ. При приготовлении образец суспензии наночаспщ ОД мл помешали на стеклянную подложку. После высушивания на образец напыляли тонкий спой коллоидного золота (толщиной порядка 70А) при помощи прибора«JEOL JFS-ПОО» (Япония).

4 Изучение специфической активности

4.1 Методика изучения анксиолитического эффекта

Анксисшитическое действие изучали в тесте «драка животных». Исследования прово-

дили на белых беспородных мышах самцах, массой 20-25 г. Животных делили на три группы по 10 особей в каждой. Поведение мышей на электродном полу изучали по изменению порогов агрессивной реакции. Пороги определяли при раздражении пары мышей постепенно увеличивающимся по силе прерывистым электротоком, подаваемым на электродный пол камеры [ТА. Воронина, С.Б. Середенин. Методические указания по изучению анксиалитического действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ ред Р.У. Хабриева М.: Медицина, 2005. С. 253-263].

42 Методика изучения «дативного эффекта

Седагавное действие оценивали с помошью метода «открытое поле» [ГА. Воронина, С.Б. Середенин. Методические указания по изучению анксиолигаческого действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ ред Р.У. Хабриева М.: Медицина, 2005. С. 253-263.].

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Синтез оригинального тетрапептида анксиолитического действия

1.1 Разработка подходов к целенаправленному синтезу пептида

Стратегия конструирования биологически-активных веществ пегтщдной структуры

основана га расшифровке аминокислотой последовательности эндогенных пептидов, обнаружении биологически-активных фрагментов, соответствующих рецептору, и выявлении действующей конформации пегтщца (Гудашева ТА., 2003). Обычно дизайн оригинальных пеп-тидомиметиков разрабатывают посредством оптимизации исходного пептида за счет замены функциональных трупп в аминокислотных остатках, компонентов основной последовательности. Важную роль играет определение структуры белка-рецептора, мест связывания его с лигавдом, механизма его функционирования. Используя разработанную (на основании соединений с известной активностью) количественную модель "структура-активность" (QSAR -Quantitative Structure-Activity Relationship), предсказывающую необходимые структурные формулы, ограничивали круг синтезируемых соединений в поиске БАВ. В итоге по структурной формуле соединения аналога прогнозируются его агонисгические или антагонистические

свойства. Таким образом, создается модель, содержащая в себе важную структурную информацию, необходимую для достижения оптимальной биологической активности. Эта модель может служить стартовым началом для создания новых пегтщдомимегиков (Шульгин С.В., 2008).

Связывание молекулы ССК-4 с рецептором ССК2 обусловлено принятием ею определенной биологически активной конформации (БАК) (Никифорович Г.В. и др., 1983),. Методами молекулярного моделирования была получена вероятная БАК ССК-4. Она характеризовалась свернутой ¿образной конформавдей пептидной цепи, тремя внутримолекулярными водородными связями, наличием С-кониевой прогонированной амидной группы (-С(0)-МНЗ+), сближении« «активных» фупп (-СОО-фуппы Аф32 и МНЗ+-группы РЬеЗЗ) и образованием водородной связи между их атомами.

Для создания аналогов ССК-4 с анксисшишческой активностью был применен топо-химический принцип, сформулированный в 1969 году Шемякиным ММ, Овчинниковым Ю А и Ивановым В.Т. Согласно этому принципу пегтщд, состоящий из О-аминокислот (АК), расположенных в порядке, обратном природному, и исходный пегтщц из ¿-аминокислот могут обладать одинаковой активностью.

В результате анализа этою принципа было сделано предположение, что только обращение конфигурации всех аминокислотных остатков (АКОС) пегтщда, либо только изменение направления хода пептидной цепи с сохранением конфигурации АКОС приведёт к обращению знака биологической активности. Таким образом, в результате применения топохими-ческого принципа к структуре ССК-4 (¿-Тгр-1-Ма-/,Азр-£-РЬе-МН2) был сконструирован его ретро-аналог ¿-Нте-^-Азр-^-Мй-^Ттр-ЫНг, структура которого легла в основу будущего нового анксиолигака.

Решением задач исследования явился синтез пепщда-анксиолтика, аналога холеци-стокинина-4 (ССК-4). Основываясь на данных Могап Т.Н. 1968, Бтаф С. 1995, Каузег V. 1998, определили, что индолильный и фенильный фрагменты боковых радикалов аминокислот триптофана (Ггр) и фенилаланина (РЪе) являются главными фармакофорными элементами, участвующими в гидрофобном взаимодействии с рецептором. Эти аминокислоты были сохранены в разработке аналога ССК-4. Для соединения этих аминокислот использовали безрадикальный спейсер, состоящий из Р-аланина ф-А1а) и глицина (С1у). Такие фрагменты мо-

лекулы позволяют получил, желанную конформацию молекулы и повысил, биологическую активность молекулы пептида. Таким образом, в качестве аналога ССК-4 синтезирован тетрапептид РЬе-Р-АЫ31у-Т1р-№12

12 Подтверждение структуры тетрапегтгида

Для подтверждения структуры тетрапегтгида использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате проведенного эксперимента были получены следующие данные, представленные на Рис. 1. и Рис2

Масс-хроматограмма образца РАв^' по базовым пикам

___ V III, I ...

i 1« 2В J* 40 60

I—we ш -ин .jui us. m.i.w

Рис.1 Масс-хроматограмма пешипа Нк^З-АЫЭуТтр-ЫНг Масс-спектр MS образца FAGW

Спектр MS/MS образца FAGW

Рис2 Масоспастры пегпвда Нте-р-АЫЭу-Тгр-ЫНг

Представленные данные ш Рис. 1 и Рис2 подтверждают, что полученное соединение

13

соответствует предполагаемой структуре. Масса пептида РЪе-(3-А1а-С1у-Тгр-МН2 ~478.

2 Разработка технологии получения и состава наноразмерных форм

В настоящее время среди систем для адресной доставки лекарственных препаратов особый интерес представляют полимерные наночаспшы (НЧ) размером от 10 до 1000 нм, сочетающие такие важные для носителей качества, как стабильность и высокая емкость в отношении широкого спекгра лекарственных веществ. При размере менее 1000 нм, наночаспшы способны проходить через мельчайшие капилляры тела, а также проникать в различные органы, способствуя переносу лекарственных веществ.

С цепью обоснования оптимального состава и технологии наночасгац были изучены физико-химические и технологические свойства тетрапетида, феназепама и РЭЧ, что позволилосделатъпредположениео перспективности выбора полимеризационныхметодов изготовления наночасгац, позволяющих использовать устойчивые в кислой среде вещества, а также их способность сорбировался на поверхности полимера.

Для получения наноразмерных форм был выбран бугнлцианоакрилат, обладающий низкой токсичностью, эффективно сорбирующий биологически-активные вещества В водной среде наночаспшы из полибутил иианоакршша (ПБЦА-НЧ), размером 150-500 нм, образуют коллоидные системы, которые могут быть использованы для парентерального, интраназального и других путей введения.

Ввиду поликомпонентносга составов, исследуемых при получении наночасгац, в качестве определяющих критериев качества были выбраны: размер наночасгац, степень включения/сорбции веществ в наночаспшы, наличие агломератов в наноразмерной системе и стабильность образующейся наносуспензии.

Для получения наночасгац использовали методику анионной полимеризации в водной среде, позволяющую варьировать значительное количество технологических параметров, среди которых рН дисперсионной среды, концентрация поверхностно-активных веществ (ПАВ), продолжительности инкубации, концентрации полисорбата-80 (ПС-80).

Одним из важнейших параметров для получения наночасгац является рН дисперсионной среды. При значениях рН более 3,5 полимеризация проходит слишком быстро, молекулярная масса остается на определенном уровне, начинается агломерация частиц При рН ниже 1,5 полимеризация проходит медленно, наночаспшы увеличиваются за счет свободного мо-

номера, что также приводит к агрегации. Ниже представлены результаты измерения размеров наночастиц (Рис. 3) на основе бугилцианоакрилша в образцах, полученных в диапазоне рН 1,9-3,0. Аппроксимация была проведена способом линейного сглаживания (у=тх+Ь), причём величина достоверности (К2) больше 0.8 линейного (Я2 = 0.8764).

Рис. 3 Зависимость межцу уровнем рН полимфизаииоиной среды и средним рщиером формирующихся наночасшц

Выявленная зависимость размера наночастиц от рН реакционной среды позволила

ограничиться именно этим интервалом значений рН (1,9-КЗ), который обеспечивал

возможность синтеза ПБЦА-НЧ заданного размера (190500 нм). Из д анных, представленных

на Рис. 3 виино, что снижение рН среды с 3 до 1,9 приводило к повышению среднего размера

наночастицс231±17до54ШЗ нм.

3 Исследование морфологической структуры наночастиц

Структура ненагруженных наночастиц, а также образцов с максимальной сорбцией была изучена методом электронной микроскопии. Установлена высокая степень полидисперсносга наночастиц из ПБЦА, наличие агломератов и обнаружено, что отдельные наночаспшы имеют правильную шаровидную форму (Рис. 4 и 5) и значительно различаются по величине и плотности, причем плотность крупных частиц значительно выше плотности мелких. Некоторые частицы ассоциирована в агрегаты могут быть соединены между собой

фибриллярным материалом.

-.»■•;.• * • - ■» *

ш

Рис. 4 Трансмиссионная зпаарондая микроскопии Рис 5 Трансмиссионная алегаронная микроскопия суспензии ненагружЕнных ПБЦА-НЧ суо1ензииШиД-Шс(хр&фС1ва1!нь1мтЕ1рапешнаом

15

4 Разработка технологии получения наночастиц с теграпеггщдом

Степень сорбции вещества на наночастииах зависит от ряда факторов, в частности от размера, типа и концентрации повфхностно-акшвного вещества, вводимого при формировании частиц, продолжительности инкубации, и концентрации полисорбагат80, вводимого после сорбции вещества на поверхности.

Анализируя данные представленные на Рис. 6, можно отметить, что степень сорбции для тетрапегтгида зависит от размера частиц При этом максимальные значения сорбции тет-ралеглпида достигаются в диапазоне 231 -311 нм. По результатам экспериментов для дальнейших исследований были выбраны частицы размером 311±23 нм, полученные при рН=2,6.

г*

*

311 нм; 41,8%

231нм;40.4% Т Г|: 2 24 мм: 38.8% ™

308 нм; 39.4%

541 нм; 28,9%

462 нм; 27,6%

200 2 25 250 275 ЗОО 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 Рп-»1>(е|» 'шеищ (нм)

Рис.63авиа4\юс1ъстшениоорбиии^^

Оценку влияния природы ПАВ, а также их концентрации та характеристические гара-метры образования наноразмерных частиц и степень сорбции тетрапегтгидд, использовали по-локсамер-188 и полисорбат-80 (ПС-80) в диапазоне концентраций 0,5-1,5%. Полученные данные представлены на Рис 1.

ÍÍПoлoкc.lмcp-311 мм; 54.1

-188

.9%

Полокслмор-1 88 1.54 298 нм; 53.1%

Попоислмер-188

0.5%; §

394 нм; 4 2,8%

0ат-80 1.0% X

V»; 28.7% Т

ЗОО 320 340 360

Р»'1М«|> ЧПСТИЦ (ИМ)

Рис. 7 Зависимость степени сорбции тарапегтщдз от типа и концентрации ПАВ

16

Полученные экспериментальные данные позволили сделать вывод о целесообразности использования полоксамера-188 в концентрации 1% , обеспечивающем получение НЧ со средним размером 311±23 нм. Полученную суспензию фильтровали через фильтр ИШроге МШех НА (450 нм). Фильтрат собирали и передавали на следующую стадию. Осадок на фильтре, состоящий из агломератов полимера, полоксамера-188 растворяли в ацетоне и отбрасывали. Суспензию наночастиц нейтрализовали 0,1 М р-ром №ОН до рН=7,0 и центрифугировали 50 мин при 20000 g (центрифуга .121, Весктшп). Далее, методом декантации удаляли надосадочную жидкость (водную фракцию). Центрифугированные наночастицы разводили юдой очищенной, вводили криопрслектор О-маннитол 3% по массе и перемешивали на магнитной мешалке в течение 15 мин при скорости 500 об/мин до его равномфного распределения. Затем частицы передавали на стадию инкубации.

Одним из важнейших параметров, влияющих на степень сорбции теграпепгида, является продолжительность инкубации с наночасгииэми. Во время инкубации вводят полисор-бат-80, препятствующий процессу опсонизации наночастиц и захвату клетками ретикуло-эндотелиапьной системой (РЭС), а также способствующий проникновению наночастиц через гемато-энцефалический барьф. Помимо положительных качеств указанных выше, вводят по-лисорбат-80 обладает сильными десорбирующими свойствами, что приюдит к снижению сорбции тетрапештша на полимере. В связи с этим, следующий этап исследований по разработке технологии получения НЧ был посвящен поиску оптимальной концентрации твина-80 в реакционной среде.

Рис. 8 Зависимость степам сорбции тетрапегпкда от гродалжигельности инкубации с ПБЦД-НЧ

В результате экспериментов было установлено, что оптимальная концентрация ПС-80

составляет 0,2% по массе, а длительность процесса инкубации НЧ с веществом составляет 16

17

ч, при этом максимальная степень сорбции достигает 67,2±3,7% (Рис. 8).

Оценку специфической активности полученных образцов наночасшц с теграпептвдом изучали на лабораторных животных - белых беспородных крысах самцах, массой 200-250 г. Результаты исследований представлены на Рис. 9 и Рис. 10.

■контроль ятетрапстид ■ тетрапетид-НЧ

довведени 1чэспосле через2часа через3часа введения после после введения введения

■доводим

|1чк после ждаим |ч<рн2«ха ■черо Зчка

гатрол» клпктид !(грапмш№НЧ

Рис. 10 Изменение выраженности ашсшпитическш активности "Ш и ТП-ИЧ внутри группы * - различие оо столбцом одо ввздения» достоверно при р <

Рис 9 Изменение анксиалитичесгой активности ТП-НЧ в сравнении с отрицательным и положительным контролем

*- различие с отриштепьиым контролем (О,19% доо- 0,05

товсрно при р <0,05;

#- различнее положиютьным контролем (тетрапептвд)дос-тоаерно при р <0,05

В ходе проведения исследований выявлены отличия в активности образцов: через час после введения препаратов у контрольной группы отмечали снижение сопротивляемости животных с 64±5 до 52±3 В, 1% р-р тетрапептида увеличивал сопротивляемость животных к напряжению с 67±4 до 81±6 В, а ТП-НЧ с 65±6 до 97±5 В. Через два часа у контрольной группы снижалась сопротивляемость до 45±3, у группы, получавшей ТП, напряжение оставалось статистически более высоким, чем было до введения. Животные, получавшие ТП-НЧ вступали в драку лишь при 92±4 В, что достоверно выше, чем в группе с ТП. После трех часов наблюдений в группе, получавшей ТП анксиолитический эффект не регистрируется, в то время как у группы, получавшей ТП-НЧ присутствует выраженный анксиолитический эффект.

5 Разработка технологии получения наночастиц с феназепамом

Для разработки оптимальной технологии получения наночастиц с феназепамом важно было определить ряд параметров, в частности зависимость степени включения от рН среды, времени введения субстанции после начала полимеризации, соотношения вещество/органический растворитель, нагрузку на полимер.

Влияние рН среды на степень включения феназепама представлено на Рис. ¡0. Отмечается, что при повышении рН с 2,11 до 3 степень включения феназепама падает. Полученные данные могут быть объяснены следующим: повышение рН дисперсионной среды ускоряет процесс формирования наночастиц, соответственно, при рН~3 к моменту введения феназепама в суспензию большая часть наночастиц уже в основном сформирована, и диффузия ФЗ внутрь частицы затруднена. В этом случае включение становится менее эффективным. В связи с этим, в дальнейших экспериментах была проведена полимеризация при значении рН 2,11, когда степень включения максимальна. При более высоких значениях рН быстрее достигается равновесие, как по размеру, так и по молекулярной массе.

Важным технологическим параметром также является период технологического процесса, при котором вводится субстанция феназепама. При получении наночастиц методом анионной полимеризации основная часть мономера полимеризуется при рН 2 в диапазоне 30-60 минут, при рН 2,5 и 3 - еще быстрее.

450

100 »21 ♦ 38 7 ♦ ♦ Размер, им

350 ■ Включение в %

г | ЗОО 250 - 309 ♦ 278 ♦ 253 ♦ 227 ♦

а. 1 200 1БО

е8 100

50 37 т 48 ■ ОН ■ 55 ■ 53 ■ но ■

О

1.5 1.7 1.9 2.1 2.3 2.5 2.7 2,9 3,1

рН среды

Рис. 11 Зависимость степени включения феназепама стрН среды

Полученные данные можно интерпретировать следующим образом: при введении фе-

назепама в промежутке 3045 мин после начала полимеризации происходит их активное включение в матрикс наночастиц. К 60 мин, когда процесс формирования частиц в основном закончен, диффузия лекарственного вещества внутрь наночастиц затруднена Введение субстанции феназепама в ацетоне на 45 мин после начала полимеризации можно считать оптимальным и обеспечивающим максимальную степень включения в матрикс наночастиц, что и подтверждено результатами эксперимента, приведенными на Рис. 11.

О 15 ЗО 45 ео ЭО 120

Время введения (мин)

Рис. 11 Зависимость степени включения феназегама от времени введения субстанции после начапа полимеризации.

Введение нерастворимых веществ в методике анионной полимеризации проводят при помощи метода «испарения растворителя». Нерастворимое вещество, в частности феназепам, растворяется в ацетоне и вводится в систему с на-ночастицами. При этом соотношение феназепам/органический растворитель оказывает влияние на степень включения вещества в матрикс частиц. Это связано со скоростью испарения растворителя и переходом ФЗ из ацетона в дисперсионную среду.

В результате проведенных экспериментов был сделан вывод, что степень включения ФЗ в наночастицы зависит от соотношения компонентов, при этом оптимальными соотношениями феназепам/ацетон (мг/1 мл) являются 10:1 и 20:1, что объясняется относительно быстрым испарением ацетона из системы. С целью минимизации использования органического растворителя для дальнейшей работы было выбрано соотношение компонентов 20 мг феназепама в 1 мл ацетона (Рис. 12).

М 20

||||||

1:1 3:1 5:1 Ю:1 20:1 50:1

Соотношение компонентов фенаэепом:ацетон (мг/ил)

Рис 12 йшяние соотношения компонентов фенаэепам/ацегон на степень включения.

Одним из основных критериев оценки качества наносомальных форм является нагрузка субстанции на полимер. После выявления основных технологических параметров была изучена степень нагрузки на полимер в полученной наносомальной форме (Рис. 13) и выявлено, что максимальная нагрузка фена-зепама на бутилцианоакрилат составляет 30 мг/100 мкл.

Рис. 13 Зависимосгь степени включения феназепама от количества вводимой субстанции Таким образом, в ходе экспериментов разработана оптимальная технология получения наночастиц с феназепамом, позволяющая получать наночастицы со степенью включения 85,7%±4,5, степенью нагрузки феназепама на полимер 280-310 мг/г полибутилцианоакрилата при размере частиц 225±24,5 нм. Исследование седативного и анксиолитического действия феназепама как в виде ПБЦА-НЧ, так и виде субстанции изучали на экспериментальных животных

- белых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г, при введении его внут-

21

рибрюшинно в дозах 0,5 и 1 мг/кг соответственно (Рис. 14 и 15).

8 5®

I

I ™

S №

«ад«/« 4Slw/W

Рис. 14 Анксиолитическое действие ПБЦА- НЧ с феназепамом и феназепама- субстанции в тесте конфликтной ситуации в дозе 0,5 и 1 мг/кг в опытах на крысах

* - различие с контролем достоверно при р <0.05

Put 15 Седпивное действие ПБЦА НЧ с феназепамом и фенаэепама в субстанции в тесте открытое пдаевдсве I мг/кг в опытах на крысах * - разл и» ме с кя пролем достовдрно при р <0,05

В ходе экспериментальных исследований было выявлено, что феназе-пам в субстанции в дозе 0,5 и 1 мг/кг обладает выраженным анксиолитиче-ским эффектом в тесте конфликтной ситуации, седативным действием в тесте открытого поля и вызывает нарушение координации движений в тесте вращающегося стержня.

Феназепам, включенный в матрикс наночастиц, в дозах 0,5 и 1 мг/кг оказывал анксиолитический эффект сходный по выраженности с феназепамом -субстанцией в тесте конфликтной ситуации. Однако, его проявление было более выраженным при сравнении образцов препарата вводимых в одинаковых дозах (Рис. 14) В то же время седативный эффект, определенный по угнетению поведения в тесте «открытое поле», приведении ПБЦА НЧ с феназепамом в дозе 1 мг/кг не выявлен (Рис. 15).

6 Разработка и фармакологическое изучение наноразмерной формы

РЭЧ

Получение наноразмерной формы рекомбинантного эритропоэтина человека (РЭЧ) проводили аналогично получению тетрапептида. В результате были

найдены оптимальные технологические параметры, позволяющие получать ПБЦА-НЧ с сорбированным РЭЧ. При этом степень сорбции составляет 46±6,3%, нагрузка на полимер составляет 195-230 мг/г полибутилцианоакрила-та, размер частиц 329±26 нм.

В результате измерения концентрации РЭЧ в образцах тканей мозга экспериментальных животных, отобранных на 45 минуте после введения тестируемых веществ и комбинаций, было обнаружено статистически достоверное увеличение уровня РЭЧ в мозге мышей, получавших РЭЧ, сорбированный на ПБЦА-наночастицах, покрытых ПС-80, в сравнении с группой контроля (группа животных, получавших 0,9% раствор натрия хлорида) (Табл. 1).

Наименование образца Физиологический раствор ПБЦА-НЧ РЭЧ РЭЧ-ПС-80 РЭЧ ПБЦА

Концентрация нтАщт 0,2*0,1 0,3±0,2 1,8±0,4 2,2±0,7 6,2±0,9*

Табл. 1 Содержание РЭЧ в тканях головного мозга экспериментальных животаь* после внутривенного введамя разных форм РЭЧ (* - сгатстчески достоверное отличие аг группы физиологического раствора I критерий СтьюденгарО,01 п=14).

В группе 2 (ПБЦА-наночастицы) увеличения концентрации РЭЧ по сравнению с группой 1 не наблюдали. В группе животных, получавших водный изотонический раствор РЭЧ, статистически значимого увеличения уровня РЭЧ в ЦНС экспериментальных животных не отмечали (рис 3). В группе 4 (РЭЧ-ПС80) отметили устойчивую тенденцию к росту уровня РЭЧ в тканях мозга мышей, однако статистически достоверной разницы не наблюдали.

Таким образом установлено, что ПБЦА-НЧ обеспечивают доставку РЭЧ через неповрежденный ГЭБ при внутривенном введении, достоверно увеличивая его содержание в тканях мозга мышей.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны подходы к целенаправленному синтезу пептидов с анксиолити-ческими свойствами, синтезирован тетрапептид РЬе-Р-А1а-01у-Тгр-ЫН2, выявлена его анксиолитическая активность.

2. Разработаны подходы к стандартизации наноразмерных форм, выявлены основные параметры определяющие качество полученных наноразмерных форм: размер частиц, степень включения/сорбции действующего вещества, агрегационная устойчивость.

3. Разработана технология получения наноразмерных форм препаратов нейро-тропного действия: ПБЦА-НЧ феназепама со степенью включения 85,7%±4,5; ПБЦА-НЧ тетрапептида структуры РЬе-(3-А1а-01у-Тгр-ЫН2 со степенью сорбции биологически активного вещества 67,2±3,7%; ПБЦА-НЧ эритропоэтина со степенью сорбции - 46±6,3%. Выявлено, что частицы с включенным феназепамом и сорбированным тетрапептидом устойчивы при хранении в течение 27 месяцев при температурах +4° С и +20° С.

4. Изучены основные технологические факторы, влияющие на получение наноразмерных форм препаратов нейротропного действия. Выявлено, что среди факторов, оказывающих влияние на получение наноразмерных форм существенно влияют: значение рН полимеризационной среды, соотношение полимер/растворитель, скорость и продолжительность перемешивания в процессе полимеризации, время введения субстанции (для феназепама), продолжительность инкубации и концентрация полисорбата-80 (для тетрапептида и эритропоэтина).

5. В ходе проведенных исследований выявлена способность ПБЦА наночастиц статистически достоверно увеличивать анксиолитическую активность тетрапептида и пролонгировать действие; установлено изменение спектра нейроп-сихотропного действия наноразмерной формы феназепама (отсутствие мио-релаксантного и седативного эффектов); показана способность наноразмерной формы облегчать транспорт эритропоэтина через гематоэнцефалический барьер.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тарасов В.В., Павлова Л.А., Краснюк И.И. Снижение негативных эффектов феназепама путем создания наносомапьной лекарственной формы. // Сборник материалов VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - 2009. - С. 219-220

2. Тарасов В.В., Белушкина H.H., Дегтярева О.Г. и др. Разработка наноформ препаратов антиагрегационного действия на основе RGD-пептидов. // Сборник тезисов и статей «Наномедицина и нанотоксикология». - 2009. - С. 4-6

3. Тарасов В.В., Павлова Л.А., Краснюк И.И., Аляутдин Р.Н. Создание и исследование наноразмерных лекарственных форм для анксиолитиков пептидной структуры. // Сборник тезисов и статей «Наномедицина и нанотоксикология». - 2009. - С. 24-26

4. Тарасов В.В., Дегтярева О.Г., Павлова Л.А., Краснюк И.И. Перспективы применения препаратов пептидной структуры в патоэндосаногенетической терапии тревожных расстройств // Клиническая патофизиология. 2011. № 1-З.С. 18-28

5. Тарасов В.В., Солев И.Н., Елизарова О.С., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.. Применение полимерных систем доставки для направленного транспорта ре-комбинантного эритропоэтина человека через гемато-энцефалический барьер // Естественные и технические науки. - 2011. № 5. С. 196-201

6. Тарасов В.В., Солев И.Н., Елизарова О.С., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.. Разработка технологии получения наноформ рекомбинантного эритропоэтина человека // Фармация. 2011. №6. С. 36-38

7. Патент № 2429003 от 20 сентября 2011 г. Тетрапептид, обладающий анксио-литическим действием. Опубликован: 20.09.2011. Бюл. № 26. Авторы: Белушкина H.H., Ковтун А.Л., Махлай А.А, Павлова Л.А., Петров В.Е., Ульянов A.M., Дегтярева О.Г., Гайдуков И.О., Тарасов В.В.

Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 Экз. Заказ № А717 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Современный ритм жизни, неблагоприятные экологические условия, сложная социальная обстановка в мегаполисах приводят к увеличению числа нервно-психических расстройств непсихогическош типа («пограничных состояний»), и, как следствие, увеличение потребления препаратов нейрогропного действия, таких как анксиолитики, препараты снотворного действия, психостимуляторы. При этом эффективность терапии во многом остается недостаточной, что объясняется следующими причинами. С одной стороны, длительный прием таких препаратов, как бензодиазепины, приводит к развитию толерантности, что, в свою очередь, влечет за собой увеличение количества принимаемого препарата и, соответственно, как следствие, усиление токсического действия. С другой стороны, большинство лекарственных веществ, обладают неселекшвным действием и в незначительной степени проникают через ГЭБ.

Одним из способов решения данной проблемы является использование высокоселективных нейротропных веществ, к числу которых относятся соединения эндогенного происхождения, в частности пептидной структуры или их искусственные аналоги. Эндогенные пептиды обладают высокой селективностью действия к определенным группам рецепторов, подвергаются естественной биологической деградации и не оказывают токсического эффекта на организм. В этой связи разработка пептидных препаратов для терапии пограничных состояний является перспективным направлением фармакологии и фармацевтической технологии.

Однако, использование лекарственных средств на основе пептидов связано со сложностями, в частности с протеолизом пептидазами крови при введении в организм.

Возможный способ решения данной проблемы - создание наноразмерных систем доставки. Наночастицы позволяют осуществить доставку веществ направленно: внутрь клеток, через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и т.п. При этом обеспечивается защита сорбированного или включенного в наночастицы вещества от воздействия агрессивных факторов внутренней среды организма, таких как хлористоводородная кислота и ферменты, входящие в состав желудочного сока; от разрушения протеазами крови и др., что позволяет увеличивать эффективность препарата.

Перенос через ГЭБ актуален для такого вещества, как рекомбинантный эритропоэтин человека (РЭЧ), способного предотвращать гибель нейронов in vitro и in vivo, однако высокая молекулярная масса и значительная степень гликозилирования молекулы РЭЧ существенно снижают его проникновение в мозг при внутривенном введении.

Использование надаразмерных носителей актуально и при применении традиционных анксисшитиков бензодиазегшновош ряда, в частности феназепама, т.к. позволяет снизить присущие им нежелательные эффекты: миорелаксацию и седацию.

Таким образом, в работе предлагается использовать преимущества наноразмерных форм препаратов для повышения эффективности новых и традиционных лекарственных препаратов нейротропного действия, а также снижения выраженности нежелательных эффектов.

Цель исследования

Теоретически и экспериментально обосновать технологические " и фармакологические аспекты применения наноразмерных систем доставки препаратов нейротропного действия.

Задачи исследования

1. Разработать подходы к целенаправленному синтезу пептидов с анксиолитическими свойствами.

2. Разработать технологию получения наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.

3. Разработать подходы к стандартизации наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.

4. Изучить основные технологические факторы, влияющие на получение наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.

5. Провести сравнительное фармакологическое изучение полученных наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.

Научная новизна работы.

В результате проведенных исследований синтезирован оригинальный тетрапептид структуры РЬе-(3-А1а-С1у-Тгр-ЫН2 и показана его анксиолитическая активность, получен патент «Тетрапептид, обладающий анксиолитическим действием» (№2429003 от 20.09.2011).

Впервые на основе комплекса физико-химических, технологических и биофармацевтических исследований разработаны составы наночастиц (НЧ) на основе полибутилцианоакрилата (ПБЦА) с теграпептидом и феназепамом, получена экспериментальная форма наночастиц с эритропоэтином на основе ПБЦА, а также разработаны технологические схемы получения стабильных лиофилизатов наночастиц тетрапептида и феназепама.

Изучены физико-химические и технологические характеристики полученных экспериментальных наносомальных форм биологически-активных соединений

Изучена специфическая активность полученных экспериментальных форм. Показано, что применение наночастиц тетрапептида РЬе-Р-А1а-С1у-Тгр-ЫН2 обеспечивает повышение анксиолитической активности и пролонгирование действие вещества, а в случае использования наноноситеяей феназепама снижение нежелательных миорелаксантнош и седативного действия при сохранении выраженного анксиолитического эффекта

На модели ПБЦА-НЧ с эритропоэтином доказано, что использование наночастиц, нагруженных биологически активными веществами, обеспечивает их доставку через неповрежденный ГЭБ при внутривенном введении.

Научно-практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований разработаны:

Оригинальное лекарственное вещество - тетрапептид структуры: РЬе-(3-А1а-С1у-Тгр

Состав экспериментальной лекарственной формы наночастицы с феназепамом лиофилизат для инъекций)

Состав экспериментальной лекарственной формы наночастицы с тетрапептидом анксиолитического действия (лиофилизат для приготовления назальных капель); Экспериментальная лекарственная форма наночастиц с эритропоэтином человека; Технология получения лиофилизата наночастиц тетрапептида (Лабораторный регламент, апробированный в лаборатории биологически-активных соединений НИИ фармации).

Положения, выносимые на защиту:

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию стратегии синтеза соединения - тетрапептида РЬе-(3-А1а-С1у-Тгр-ЫН2 , а также состава и технологии получения его экспериментальной формы с наночастицами;

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию состава и технологии получения экспериментальной формы феназепама с наночастицами;

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по разработке технологии получения экспериментальной формы эритропоэгина с наночастицами;

- результаты исследований физико-химических и технологических характеристик полученных экспериментальных наносом альных форм биологически-активных соединений;

- результаты изучения специфической активности полученных наносомальных форм на лабораторных животных

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и сташстическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспфиментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и внедрения в практику.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседании №4 от 15.11.2011 межкафедральной научно-практической конференции на кафедре фармацевтической технологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Положения и практические результаты работы доложены на VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность (Москва, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК РФ и патент «Тетрапептид, обладающий анксиолитическим действием» (№2429003 от 20.09.2011).

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер Государственной регистрации 01.2.00606352).

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 183 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы: материалы и методы, экспериментальной части (результаты собственных исследований и их обсуждение), выводов, списка литературы, а также Приложения. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 53 рисунками.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны подходы к целенаправленному синтезу пептидов с анксиолитическими свойствами, синтезирован тетрапегтщц РЬе-Р-А1а-01у-Тгр-ЫН2, выявлена его анксиолитическая активность.

2. Разработаны подходы к стандартизации наноразмерных форм, выявлены основные параметры определяющие качество полученных наноразмерных форм: размер частиц, степень включения/сорбции действующего вещества, агрегационная устойчивость.

3. Разработана технология получения наноразмерных форм препаратов нейротропнош действия: ПБЦА-НЧ феназепама со степенью включения 85,7%±4,5; ПБЦА-НЧ тетрапептида структуры РЬе-^-А1а-С1у-Тгр-ЫН2 со степенью сорбции биологически активного вещества 67,2±3,7%; ПБЦА-НЧ эритропоэтина со степенью сорбции -46±63%- Выявлено, что частицы с включенным феназепамом и сорбированным теграпептидом устойчивы при хранении в течение 27 месяцев при температурах +4° С и +20° С.

4. Изучены основные технологические факторы, влияющие на получение наноразмерных форм препаратов нейротропнош действия. Выявлено, что среди факторов, оказывающих влияние на получение наноразмерных форм существенно влияют: значение рН полимеризационной среды, соотношение полимер/растворитель, скорость и продолжительность перемешивания в процессе полимеризации, время введения субстанции (для феназепама), продолжительность инкубации и концентрация полисорбата-80 (для тетрапептида и эритропоэтина).

5. В ходе проведенных исследований выявлена способность ПБЦА наночаспщ статистически достоверно увеличивать анксиолитическую активность тетрапептида и пролонгировать действие; установлено изменение спектра нейропсихолропного действия наноразмерной формы феназепама (отсутствие миорелаксантного и седативнош эффектов); показана способность наноразмерной формы облегчать транспорт эритропоэтина через гематоэнцефалический барьер.