Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологические и биофармацевтические исследования каликс[4]резорцинов и их комплексов с фосфорилацетогидразидами

На правах рукописи 005051509 |

ПАШИНА ИННА ПЕТРОВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КАЛИКС [4]РЕЗОРЦИНОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С ФОСФОРИЛАЦЕТОГИДРАЗИДАМИ

14.03.06. - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 АПР 2013

Москва-2013

005051509

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Семина Ирина Ивановна

кандидат фармацевтических наук, доцент

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории фармакокинетики ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией химико-биологических исследований ФГБУН Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра РАН

Мустафин Руслан Ибрагимович

Колыванов Геннадий Борисович

Зобов Владимир Васильевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится <<Л5у> (Ь^А&Ц-^ 2013 г. в /2) ч. на заседании диссертационного совета ^Д.001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315 Москва, Балтийская ул. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

Авторефератразослан Л » мш 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема доставки лекарственных веществ (J1B) привлекает огромный интерес со стороны исследователей по всему миру, поскольку направленный транспорт лекарств в очаг развития патологического процесса позволит добиться повышения эффективности лекарственной терапии, уменьшения режима дозирования и минимизации побочных эффектов [Hoffman Allan S., 2008, Шиков А.Н., и соавт., 2008, Пальцев М.А., 2009, Белоусов Ю.Б. и со-авт., 2011].

В настоящее время интенсивно разрабатываются различные способы доставки JIB — липосомы, естественные и синтетические полимеры, наноразмерные формы углерода (фуллерены), циклодекстрины, наночастицы золота, магнитные наноча-стицы и т.д. [Thassu М. et al„ 2007, Дмитриева Е.Г, 2010]. Особую актуальность приобретает разработка средств доставки ЛВ в центральную и периферическую нервную систему с целью лечения заболеваний ЦНС [Kreuter J., 2007, Чехонин В.П. и соавт., 2009]. Подобные исследования находятся на стадии интенсивных поисков и на сегодняшний день пока не созданы системы, способные избирательно доставлять ЛВ в ЦНС.

Одним из новых, интенсивно развивающихся направлений в этой области является разработка уникальных систем доставки на основе соединений, содержащих большие молекулярные полости, таких как каликсарены, которые способны образовывать комплексы по типу «гость-хозяин» с различными химическими соединениями, в том числе с ЛВ [Asfari Z et al., 2001].

Среди каликсаренов наиболее удобной матрицей для создания систем доставки ЛВ являются каликс[4]резорцины, позволяющие моделировать множество трехмерных структур с различным размером внутренней полости и числом центров связывания с химическими веществами [Asfari Z et al., 2001, Гаврилова Е.Л., 2010, Сайфутдинова М.Н., 2012].

В настоящий момент разработаны комплексы каликсаренов с' нифедипином [Wenzhan Y. et al., 2004], никлозамидом, фуросемидом [Yang W. et al., 2004, 2005] и рядом других биологически активных соединений [Danylyuk О. et al., 2007, Xiaox-uan L. et al., 2008].

Изучение каликс[4]резорцинов с модельными веществами, содержащие четы-рехкоординированный атом фосфора с различными функциональными группами (с гидразидом дифенилфосфорилуксусной кислоты - фосфабензидом (ФБ) и гидрази-дом Р-хлорэтокси-4-диметиламинофенилфосфорилуксусной кислоты (КАПАХ), позволит исследовать свойства каликс[4]резорцинов как потенциальных систем доставки ЛВ, что приведет к развитию новых подходов к лечению многих заболеваний, в том числе и нейродегенеративных.

Цель исследования

Изучение фармакологических и биофармацевтических свойств различных модификаций каликс[4]резорцинов и их комплексов с модельными биологически активными веществами как систем доставки лекарственных субстанций.

Задачи исследования

1. Изучение фармакологических свойств различных каликс[4]резорцинов (с и-толильным радикалом по нижнему «ободу» молекулы, аминофункционализиро-ванных по верхнему или по нижнему «ободу» молекулы) как потенциальных систем доставки ЛВ в ЦНС с применением поведенческих моделей на животных;

2. Изучение нейротропных свойств комплексов каликс[4]резорцинов с модельным биологически активным веществом - ФБ с применением различных поведенческих моделей на животных;

3. Изучение нейротропных свойств комплексов каликс[4]резорцинов с модельным биологически активным веществом - КАПАХ с применением различных поведенческих моделей на животных;

4. Изучение кинетики высвобождения модельных биологически активных веществ (ФБ, КАПАХ) из полости каликс[4]резорцина в условиях, имитирующих физиологические среды;

5. Изучение фармацевтических свойств капикс[4]резорцина с целью определения подлинности, доброкачественности и количественного содержания субстанции каликс[4]резорцина.

Научная новизна работы

Впервые исследованы фармакологические и биофармацевтические свойства комплексов каликс[4]резорцинов (с л-толильным радикалом по нижнему «ободу» молекулы, аминофункционализированных по верхнему или по нижнему «ободу»

молекулы) с модельными биологически активными веществами группы фосфорил-ацетогидразидов (ФАГ).

Установлено, что каликс[4]резорцин и его комплексы с модельными веществами являются малотоксичными соединениями. ФБ и КАПАХ, включенные в полость каликс[4]резорцина, являются менее токсичными, чем исходные субстанции.

Впервые показано, что каликс[4]резорцины способны усиливать фармакологические эффекты соединений, обладающих нейротропной активностью. Ка-ликс[4]резорцины усиливают анксиолитические свойства транквилизатора ФБ и способность улучшать память КАПАХ.

Установлено, что высвобождение модельных веществ из полости ка-ликс[4]резорцина в средах, имитирующих пероральное и внутрибрюшинное введение, происходит постепенно и с постоянной скоростью.

Впервые изученные фармацевтические свойства каликс[4]резорцина, несущего л-толильный радикал по нижнему «ободу» молекулы, подтверждают подлинность и доброкачественность субстанции каликс[4]резорцина, а также его количественное содержание.

Научно - практическое значение роботы

Результаты исследования фармакологических и биофармацевтических свойств каликс[4]резорцинов и их комплексов с модельными веществами ФБ и КАПАХ дают направление для оптимизации исследования каликс[4]резорцинов как потенциальных систем доставки J1B. Практическое значение работы также состоит в том, что результаты исследования представляют экспериментальную основу для дальнейшего анализа возможности и целесообразности изучения ка-ликс[4]резорцинов как средств доставки JIB в ЦНС.

Внедрение результатов работы

Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ. Разработан проект временной фармакопейной статьи на субстанцию каликс[4]резорцина, несущего п - толильный радикал по нижнему «ободу» молекулы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Каликс[4]резорцины усиливают фармакологические эффекты биологически активных веществ с нейротропной активностью.

2. Каликс[4]резорцины в комплексе с модельными биологически активными веществами значительно снижают их токсичность.

3. Профиль высвобождения модельных биологически активных веществ из капиксареновой матрицы демонстрирует постепенное высвобождение в физиологических средах, имитирующих внутрибрюшинное и пероральное ведение.

4. Оптимальной модификацией каликс[4]резорцина среди исследованных как потенциального средства доставки JIB является модификация с «-толильным радикалом по нижнему «ободу» молекулы.

Связь исследования с планами научных работ

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ «Фармакологические и биофармацевтические исследования каликс[4]резорцинов и их комплексов с фосфорилацетогидразидами» (№ гос. регистрации 0120.15334).

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 08-04-01431а (2008 - 2010 гг.), фант 12-04-97095 (2012-2014 гг.), а также Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (по программе У.М.Н.И.К.) (2011 - 2012 гг.).

Апробация работы

Основные результаты исследования доложены на: Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008, 2009, 2010 гг.); XV Международной конференции по химии соединений фосфора, посвященная 100-летию со дня рождения М.И. Кабачника (Казань, 2008 г.); Российской конференции «Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ», посвященной 75-летию профессора И.А. Студенцовой (Казань, 2008 г.); X Международной научной конференции «НАНО-ТЕХ' 2009» (Казань, 2009 г.); 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средства» (Москва,

б

2010 г.); III и IV Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2011, 2012 гг.); Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 2011 г.); 38th Annual Meeting of Controlled Release Society - CRS (2011, Maryland; U.S.A.); Annual Meeting of American Association of Pharmaceutical Sciences - AAPS (2012, Chicago, U.S.A.); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 5 статей - в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Лнчный вклад автора

Автор принимала непосредственное участие в создании концепции работы, планировании диссертации. Все экспериментальные исследования проведены автором лично или при ее активном участии. Автор самостоятельно проводила сводку и обработку полученного экспериментального материала, его статистический анализ, принимала участие в написании трудов, опубликованных по теме диссертации.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 2 главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий 111 отечественных и 185 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 46 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования явились каликс[4]резорцин, несущий л-толильный радикал по нижнему «ободу» молекулы (КР); каликс[4]резорцин, несущий ароматический радикал по нижнему (КРр) и верхнему (КРА) «ободу» молекулы; модельные вещества ряда фосфорилацетогидразидов (ФАГ) - гидразид дифенил-фосфинилуксусной кислоты (ФБ), гидразид р-хлорэтокси-4-диметиламинофенилфосфорилуксусной кислоты (КАПАХ), включенные в ком-

плексы вышеперечисленных модификаций каликс[4]резорцина. Физические смеси комплексов с модельными веществами и модельные вещества были использованы как объекты сравнения. Исследования проводили с образцами, полученными на кафедре органической химии ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» под руководством д.х.н., профессора ГаВ-риловой Е.Л.

Фармакологические исследования проведены на 1500 белых беспородных мышах - самцах массой 18-22 г. До начала экспериментов все животные содержались в стандартных условиях вивария с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной диете (ГОСТ Р 50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96). Все исследования были одобрены комитетом по этической экспертизе.

Дозы изучаемых соединений и препаратов сравнения представлены в каждом разделе конкретно при описании результатов исследований.

Для исследования спектра нейротропной активности соединений были использованы поведенческие методы. Для изучения двигательной и исследовательской (ориентировочной) реакции животных использовали метод «открытое поле» (OpenScience, Россия) [Buccafusco J.J., 2009]. Для возможности измерения исследовательского поведения животных независимо от величины их двигательной активности использовали метод «крестообразный лабиринт» (OpenScience, Россия). Поведение животных анализировали по следующим показателям: латентный период начала исследовательского поведения (FLAT) и общее число патрулирований (PATN) [Salimov R.M., 1988]. Возможное мнемотропное действие изучаемых соединений исследовали на 2-х видах моделей: метод с отрицательным подкреплением - условная реакция пассивного избегания (УРПИ) [Mondadori С., 1990], метод с положительным подкреплением — Т-образный лабиринт (OpenScience, Россия) [Deacon R.M., 2006]. Для изучения антиконфликтной активности у исследуемых соединений использовали метод «конфликтной ситуации с водной депривацией» [Воронина Т.А. и др., 1982]. Для выявления у соединений возможного действия на

периферическую нервную систему (мышечная релаксация, нарушения равновесия и координации движений) использовали метод «вращающийся стержень».

Все фармакологические эксперименты обрабатывались статистически с применением t-критерия Стьюдента.

Исследование кинетики высвобождения ФБ и КАПАХ из каликсареновой матрицы проводилось методом «вращающаяся корзинка» на приборе для определения высвобождения JIB из пероральных лекарственных форм марки DT-626 («Erweka», Германия). Исследования проводились при условиях максимально приближенных к физиологическим параметрам: модельные среды, стимулирующие продвижение матрицы по различным отделам кишечника: фосфатные буферы со значениями рН=5,8 (2часа), рН=6,8 (2часа) и рН=7,4 (2часа). В течение первых двух часов производили отбор проб через каждые 15 мин и через 30 мин в оставшееся время. Взамен отобранных проб приливали равное количество буфера с соответствующим значением pH. Количественно высвободившееся действующее вещество определяли УФ-спектрофотометрически на приборе Lambda 25 («Perkin Elmer», США) при длине волны 267 нм для ФБ и его комплексов с KP и 286 нм для КАПАХ и его комплекса с KP. В качестве раствора сравнения использовался фосфатный буфер с соответствующими значениями pH. Матрицы для исследования кинетики высвобождения ФБ и КАПАХ получали прямым прессованием на ручном гидравлическом прессе марки ПГПР (Россия) из порошков исследуемых соединений при давлении 25 кгс/см2. Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась согласно ГФ XI вып.1.

Фармацевтические методы исследования каликс[4]резорцина включали в себя методики качественного, количественного анализа и определение чистоты исследуемого соединения.

Качественный анализ каликс[4]резорцина проводили с использованием физико-химических методов (ЯМР'Н-, Масс-, ИК-спектроскопия) и химических реакций (реакция с хлоридом железа (III)). ИК-спектр снимали в растворе ДМСО на приборе «BRUKER» FT-IR Vector 22 (Германия) интервале 838-3462 см'1 на базе ИОФХ им. Арбузова. Масс-спектр получали на приборе TRACE MS («Finning МАТ», США) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ методом электронного удара. Прогрев ампулы испарителя системы прямого ввода осуществляли в про-

граммированном режиме. Обработку Масс-спектральных данных производили с использованием программы «Xcalibur». Спектры ЯМР'Н записаны на приборе («Вгикег», Германия) с рабочей частотой 400 МГц относительно сигналов остаточных протонов дейтерированных растворителей (d6-DMSO).

Разработку методик количественного определения каликс[4]резорцина и определения в нем посторонних примесей проводили с помощью метода УФ - спек-трофотометрии на приборе Lambda 25 («Perkin Elmer», США). Доброкачественность каликс[4]резорцина определяли по температуре плавления (прибор для измерения температуры плавления ПТП), прозрачности, мутности, цветности и рН раствора, с использованием рН-метра рН-744 («Metrohm», Швейцария).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нейротропная активность комплексов каликс[4]резорцина, несущего и-ТОЛИЛЫ1ЫЙ радикал по нижнему «ободу» молекулы с фосфорилацетогидрази-дамн

Все изучаемые комплексы являются практически нетоксичными веществами, их средние смертельные дозы не определялись при внутрибрюшинном введении мышам в максимально высокой дозе (5000 мг/кг), которую представлялось возможным ввести животным. При этом LD50 ФБ составляет 315±24,8 мг/кг, КАПАХ — 960±35 мг/кг.

В ходе проведения фармакологических исследований было показано, что включение ФАГ в полость каликс[4]резорцина приводит к значительному усилению их нейротропной активности по сравнению с активностью исходных субстанций. Следует отметить, что различные модификации каликс[4]резорцина по-разному воздействуют на изменения спектра психотропной активности ФБ и КАПАХ.

К усилению всех видов изученной нами нейротропной активности субстанций приводит включение их в полость первой модификации каликс[4]резорцина, несущего л-толильный радикал по нижнему «ободу» молекулы (КР). Причем усиление активности наблюдалось как в отношении комплексов КР с ФБ, так и с КАПАХ. Установлено, что сам КР фармакологической активностью не обладает. Следует отметить, что КР в составе физической смеси с ФАГ в отличие от комплексов

ю

включения не приводит к усилению нейротропной активности субстанций ЛВ в проведенных экспериментах.

Комплексы КР с ФБ и КАПАХ (50 мг/кг) обладают выраженным угнетающим действием на ЦНС и при внутрибрюшинном, и при пероральном введении, что выражается в уменьшении числа заглядываний мышей в отверстия (снижение исследовательской активности), а также уменьшении числа пересечения линий (снижение двигательной активности) на модели «открытое поле». Угнетающий эффект комплексов как на исследовательскую, так и на двигательную активность мышей при внутрибрюшинном введении практически в 2 раза (р<0,05) превышает аналогичное действие субстанций ФБ (20 мг/кг) и КАПАХ (12,5 мг/кг) (рис.1).

КР+2ФБ Физ.см. КР КР+КАПАХ Физ.см. КР КР+2ФБ КР+КАПАХ ■ Число заглядываний в отверстия (%) _□ Число пересеченных линий (%)_

Рис. 1. Влияние комплексов КР с ФАГ на двигательно-ориентировочную реакцию мышей при внутрнбргошинном введении.

Примечание: * - различия при сравнении с животными контрольной группы достоверны при р<0,05; Контрольные значения (препараты сравнения) приняты за 100%

При пероральном введении комплекс КР с ФБ также приводит к более выраженному угнетению ЦНС по сравнению с действием субстанции (двигательной реакции в 1,9 раз (р<0,05), исследовательской реакции - в 2,0 раза (р<0,05) (рис.2.).

Результаты исследований по влиянию комплексов КР с ФБ и КАПАХ на изменение исследовательского поведения на модели «крестообразный лабиринт» также показали, что изучаемые комплексы в большей степени по сравнению с действием субстанций угнетают исследовательскую активность животных - число патрулирований мышей в лабиринте снижалось соответственно в 2.1 и 1,7 раза

(р<0,05) (рис. 3.). К тому же композиции значительнее уменьшают латентный период начала исследовательского поведения (РЬАТ) по сравнению с действием субстанций.

160 140

100

Физ.см. КР КР+КАПАХ Физ.см. КР+2ФБ _ КР+КАПАХ ■ Число заглядываний в отверстия (%) □ Число пересеченных линий (%)______

Рис. 2. Влияние комплексов КР с ФАГ на двнгательно-ориентировочную реакцию мышей при пероральном введении.

Примечание: * - различия при сравнении с животными контрольной группы достоверны при р<0,05; Контрольные значения (препараты сравнения) приняты за 100%

р ё

| § 20

_14(] £120 У 00

с 40

I 20

1 1:1 -¡г

* 1 ......;Шйв

КР+2ФБ физ.а

КР КР+КАЛАХ Фнз.см.

КР+КАПАХ

Соединения

Рис. 3. Влияние комплексов КР с ФАГ на поведение мышей на модели «крестообразный лабиринт» при внутрибрюшинном введении.

Примечание: * - различия при сравнении с животными контрольной группы достоверны при р<0,05; Контрольные значения (препарат-ы сравнения) приняты за 100%

Так как последний показатель можно рассматривать как баланс между любопытством и тревогой животного в новой обстановке (Магкта е1 а1., 2004), можно сделать вывод, что ФАГ ассоциируемые с КР помимо выраженного угне-

тающего действия на исследовательскую активность животных, уменьшают и состояние тревожности в незнакомой для них обстановке.

Установлено, что композиция КР с ФБ обладает выраженным анксиолитиче-ским действием, превосходящим таковое у субстанции ФБ, что выражается в увеличении числа подходов к поилке в 1,6 раза (р<0,05) на модели «конфликтной ситуации» (рис. 4). Таким образом, включение ФБ в полость КР приводит к усилению антиконфликтного действия препарата.

КР+2ФБ Физ.см. КР КР+КАПАХ Физ.см. КР

КР+2ФБ КР+КАПАХ

Соединения

Рис. 4. Аиксиолитическая активность комплексов КР с ФАГ на модели «конфликтная ситуация сводной дспрмвацпсП».

Примечание: * - различия при сравнении с животными контрольной группы достоверны при р<0,05; Контрольные значения (препараты сравнения) прйняты за 100%

Проведенные нами исследования по изучению влияния соединений на процессы памяти (мнемотропное действие) показали, что введение мышам композиции КР+КАПАХ положительно влияет на процессы памяти, что выражается в увеличении латентного периода захода мышей в темный отсек камеры в 1,5 раза (р<0,05) (рис.5). К тому же памятный след сохраняется и на 7 день эксперимента.

Интересно отметить, что включение ФАГ в матрицу КР придает веществам еще и дополнительный фармакологический эффект - положительное влияние на обучаемость животных, который отсутствует у субстанций ФБ и КАПАХ. Число правильных побежек на модели «Т-образный лабиринт» при введении комплексов КР с ФБ и КАПАХ увеличивается соответственно в 1,7 и 1,8 раза (р<0,05).

Рис. 5. Влияние комплексов КР с ФАГ на латентный период захода животных в темный отсек камеры на модели УРПИ.

Примечание: * - различия при сравнении с животными контрольной группы достоверны при р<0,05; Контрольные значения (крахмальная слизь) приняты за 100%

Нейротропная активность комплексов каликс[4| резорцина, к аминофункционализированного по верхнему «ободу» молекулы с фосфорил-ацетогидраз идами

Модификация каликс[4]резорцина, аминофункционализированного по верхнему «ободу» молекулы также приводит к усилению фармакологических свойств, включенных в него ФАГ. Однако комплексы КРА с КАПАХ и ФБ оказались менее активными по сравнению с каликс[4]резорцином, несущим и-толильный радикал по нижнему «ободу» молекулы.

КРА способствует усилению мнемотропной активности субстанции КАПАХ на модели УРПИ (в 1,4 раза (р<0,05) по сравнению с действием КАПАХ (10 мг/кг). Причем эффект при введении комплекса сохраняется и на 7 день введения. Установлено, что введение КАПАХ в полость КРА в отличие от КР не приводит к усилению угнетающего действия КАПАХ на ориентировочную реакцию на модели «открытое поле», уменьшению состояния тревоги и угнетению исследовательской активности на модели «крестообразный лабиринт». КРА (40 мг/кг) фармакологической активностью не обладает.

При введении животным комплекса КРД+2ФБ (50 мг/кг) наблюдается угнетение ЦНС на модели «открытое поле», но менее выраженное по сравнению с действием комплекса КР+2ФБ (50 мг/кг). Комплекс усиливает только исследователь-

скую активность (в 1,9 раза (р<0,05)) по сравнению с действием субстанции ФБ (15 мг/кг)) и только при внутрибрюшинном введении.

Комплексы КРА с ЛВ не уменьшают состояние тревожности животных на модели «крестообразный лабиринт».

Композиция КРА+2ФБ (50 мг/кг) обладает способностью устранять проявления невротического состояния на модели «конфликтная ситуация с водной депри-вацией», что выражается в увеличении количества подходов к поилке по сравнению с действием ФБ в 1,4 раза (р<0,05) (рис. б).

С? 300 и § 250 = 200 аа © 150 о *

*

1 шшя

Число под сл с о о с — 1 —

КР +2ФБ Физ.см. +2ФБ КРД ФБ КРА КР д Физ.см. КРД КАПАХ +КАПАХ +КАПАХ Соединения КР а

Рис. 6. Анксиолитическая активность комплексов КРд с ФАГ на модели «конфликтная ситуация».

Примечание: * - различия при сравнении с животными контрольной группы достоверны при р<0,05; Контрольные значения (крахмальная слизь) приняты за 100%

Нейротропная активность комплексов каликс[4|резорц11на, аминофункциоиализированиого по нижнему «ободу» молекулы с фосфорил-ацетогидраз идами

Результаты фармакологических экспериментов показали, что выраженной нейротропной активностью обладает не только композиция растворимого ка-ликс[4]резорцина с ФБ (50 мг/кг), но и сам КРР (44 мг/кг).

КРР обладает выраженным угнетающим действием на ЦНС, угнетает как исследовательскую, так и двигательную активность животных. Причем КРР вызывает

более сильное угнетение исследовательской активности животных, чем его комплекс с ФБ и субстанция ФБ (6 мг/кг) (рис. 7).

ВН_

■В

I

КРр КРр+ФБ ФБ Физ.см. КРр+ФБ

Н Число заглядываний в отверстия (%)

_□ Число пересеченных линий (%)_

Рис. 7. Влияние комплексов КРр с ФАГ на двигательно-ориентировочную реакцию мышей при внутрибршшинном введении.

Примечание: * - различия при сравнении с животными контрольной группы достоверны при р<0,05; Контрольные значения (бидистиллированая вода) приняты за 100%

Если на модели «открытое поле» введение животным КРР и комплекса КРр+ФБ приводило к угнетению исследовательской активности, то в «крестообразном» лабиринте уменьшение числа патрулирований не наблюдалось. Это можно объяснить тем, что количественное измерение исследовательского поведения животных в лабиринте происходит независимо от величины его двигательной активности.

В отличие от двух первых модификаций каликс[4]резорцина результаты экспериментов продемонстрировали наличие у КРР проконфликтного действия. В то время как комплекс КРр+ФБ в 2,5 раза (р<0,05) увеличивает число подходов к поилке по сравнению с действием субстанции, каликс[4]резорцин их уменьшает.

Проведенные фармакологические эксперименты показали, что введение молекул ФБ и КАПАХ в полость каликс[4]резорцина позволяет существенно повысить нейротропную активность субстанций ЛВ.

После проведенных фармакологических исследований в качестве оптимальной матрицы для создания потенциальной системы доставки ЛВ рассматривается модификация каликс[4]резорцина, несущая л-толильный радикал по нижнему

«ободу» молекулы. КР приводит к выраженному усилению всех спектров нейро-тропной активности изучаемых модельных веществ. Необходимо отметить тот факт, что КР усиливает фармакологические свойства как ФБ, так и КАПАХ. Другие вариации каликс[4]резорцина усиливают в основном эффекты только ФБ. Таким образом, именно КР является наиболее универсальным средством доставки ЛВ.

Оценка кинетнкн высвобождения фосфорилацетогндразилов из матрицы калмкс[4]резорцина и сравнение с транспортными характеристиками индивидуальных фосфорилацетогидразидов и их физических смесей

Оценка диффузионно-транспортных свойств исследуемых соединений показала кардинальные различия в профилях высвобождения ФАГ из матриц КР, индивидуальных ФАГ и их физических смесей. Задача, стоявшая перед нами в ходе эксперимента, заключалась в сравнении профилей высвобождения ФАГ из матриц КР, индивидуальных ФАГ и их физических смесей в физиологических средах.

Методом «вращающаяся корзинка» были изучены параметры высвобождения модельных биологически активных веществ в условиях, симулирующих продвижение по желудочно-кишечному тракту (ЖКТ) - пероральное введение: в кислой среде желудочного сока (рН=1,2) и различные отделы кишечника (рН=5,8; 6,8; 7,4), а также внутрибрюшинное введение (рН=7,4).

Высвобождение ФБ и КАПАХ из матрицы индивидуальных ФАГ в средах, имитирующее пероральное введении, происходит намного быстрее (100% ЛВ высвобождается уже в течение 30 минут), в то время как ФАГ из матриц, приготовленных из комплексов, высвобождаются медленно и с постоянной скоростью (рис.8). Следует отметить, что физические смеси, полученные простым смешением модельных биологически активных веществ и КР распадались сразу же при помещение матриц в тестируемые среды.

120 -i 100 -j 80 60 -40 -20 0

рН=1,2

рН=5,8

0,5 1 1,5

рН=6,8

рН=7,4

2 2,5 3 „ 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 Время,ч

Рис. 8. Профили высвобождения ФБ из матриц КР н ФБ в условиях, имитирующих продвижение по ЖКТ

В среде, симулирующей рН крови (рН=7,4), происходит постепенное медленное высвобождение лекарственной субстанции в течение 2 часов (рис.9). В то время как индивидуальная субстанция ФАГ высвобождается полностью уже в течение первых 30 минут, а матрицы физических смесей, как указывалось ранее, вовсе сразу разрушаются. Более длительное сохранение определенной концентрации ФАГ в крови животных по результатам экспериментов in vivo можно объяснить также тем, что каликс[4]резорцин защищает функциональную гидразидную группу ФАГ от быстрой инактивации.

Высвобождение ФАГ из каликсареновых матриц в среде симулирующей пероральное введение в желудок (0,1 М раствор кислоты хлористоводородной, рН=1,2) также происходит с постоянной скоростью и медленно. КАПАХ и ФБ постепенно высвобождаются на протяжении 7 часов. В то время как из матриц индивидуальных веществ в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной ФАГ высвобождаются полностью уже через 30 минут.

100 —* -КР+2ФБ —»-ФБ

80 рН=7,4

г?

® 60 X ф

140 о

о 20 .а —*- —*—чиГ

ш 0 1 -*-*- А___*-*

г

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Время, ч 4,5 5 5,5 б 6,5 7

Рис. 9. Профили высвобождения ФБ из матриц КР и ФБ в условиях, имитирующих внутрибрюшннное введение (рН=7,4)

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что каликс[4]резорцин является перспективным носителем JIB. Капикс[4]резорцин приводит к усилению нейротропной активности модельных биологически активных веществ. Полученные профили высвобождения их из каликсареиовых матриц в физиологических средах (имитирующих пероральное и внутрибрюшинное введение) свидетельствуют о способности каликс[4]резорцина пролонгировать действие JIB. И в будущем возможно использование матрицы каликс[4]резорцина в качестве инновационной формы с модифицированным высвобождением J1B.

Фармацевтические исследования каликс[4|резорцина

КР (2,8,14,20-тетракис-(4-метилфенил)резорцин[4]арен) - продукт циклической тетрамеризации резорцина с и-толуиловым альдегидом.

Для идентификации КР нами предложены физико-химические методы анализа (ЯМР'Н-, ИК- и Масс- спектроскопии), а также качественные реакции (реакция с хлоридом железа (III)). Определение доброкачественности КР предлагается проводить по следующим характеристикам: температуре плавления, рН раствора, прозрачности и мутности, определению посторонних примесей методом УФ -спектрофотометрии. Количественное определения КР предложено проводить методом УФ - спектрофотомерии по стандартному образцу.

выводы

1. Транквилизатор фосфабензид в комплексе с каликс[4]резорцином, несущим п-толильный радикал по нижнему «ободу», обладает более выраженным анксиоли-тическим действием по сравнению с действием субстанции фосфабензида и физической смесью (при внутрибрюшинном введении мышам), увеличивая число подходов к поилке на модели «конфликтная ситуация с водной депривацией».

2. КАПАХ в комплексе с каликс[4]резорцином, несущим л-толильный радикал по нижнему «ободу», улучшает процессы памяти и обучения у мышей при внутрибрюшинном введении на модели УРПИ и «Т-образный» лабиринт.

3. Фосфабензид и КАПАХ, ассоциируемые с каликс[4]резорцином, несущим п-толильный радикал по нижнему «ободу», обладают более выраженным угнетающим действием на ЦНС (при внутрибрюшинном и пероральном введении мышам) на моделях «открытое поле» и «крестообразный лабиринт».

4. Модификация каликс[4]резорцина, аминофункционализированного по нижнему «ободу» молекулы, обладает выраженным угнетающим действием и прокон-фликтной активностью.

5. Комплексы фосфабензида и КАПАХ с каликс[4]резорцинами обладают значительно более низкой токсичностью по сравнению с исходными субстанциями.

6. Каликс[4]резорцины способствует медленному пролонгированному высвобождению модельных веществ в физиологических средах (имитирующих перораль-ное и внутрибрюшинное введение).

7. Каликс[4]резорцин, несущий и-толильный радикал по нижнему «ободу», является оптимальной модификацией среди изученных каликс[4]резорцинов матрицей для создания новых систем доставки ЛВ.

Практические рекомендации:

1. Перспективен синтез и разработка новых модификаций каликс[4]резорцинов как потенциальных средств доставки лекарственных веществ.

2. Целесообразно дальнейшее фармакологическое изучение комплексов ка-ликс[4]резорцинов с модельными биологически активными веществами как систем доставки лекарственных веществ.

3. Изученные фармацевтические свойства каликс[4]резорцина, несущего п-толильный радикал по нижнему «ободу», могут быть использованы для определения подлинности, доброкачественности и проведения количественного анализа.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пашина, И.П, Химико-фармацевтические и фармакологические исследования некоторых соединений ряда фосфорилацетогидразидов, обладающих психотропной активностью / И.П. Пашнна, Р.И. Тарасова, И.И. Семина// VI Всероссийская конференция с международным участием «Химия и медицина»: Сборник тезисов. - Уфа, 2007. - С. 204 - 205.

2. Пашина, И.П. Изучение фармакологических свойств комплексов ка-ликс[4]резорцина с фосфарилацетогидразидами / И.П. Пашина, И.И. Семина, E.JI. Гаврилова, А.З. Байчурина Е.А. Макарова, Н.И. Шаталова // «Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ»: Материалы Российской конференции, посвященной 75-летию профессора И.А. Студенцовой. - Казань, 2008. - С.46.

3. Gavrilova, E.L. New neurotropic agents on the base of calyx[4]resorcines and phosphorylacetic acids hydrosides / E.L. Gavrilova, N.I. Shatalova, R.I. Tarasova, I.I. Semina, I.P. Pasliina, M.N. Shipova, A.Z. Baychorina, M.A. Pudovik, A.L.Konovalov // Тез. докл. XV Международная конференция по химии соединений фосфора, по-свящёпная 100-летию со дня рождения М.И. Кабачника. - Санкт - Петербург, 2008. -С.133.

4. Пашнна, И.П. Использование каликс[4]резорцина для доставки лекарственной субстанции в центральную нервную систему / И.П. Пашина // X международная научная конференция «Нанотех 2009»: Материалы конференции. - Казань, 2009.-С. 340-344.

5. Пашина, И.П. Нейротропная активность каликс[4]резорцина и его комплексов с фосфорилацетогидразидами / И.П. Пашина, Е.А. Макарова // XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые в медицине»: Материалы конференции. - Казань, 2009. - С. 139

6. Gavrilova, E.L. Host-Guest complexes on the base of resorcines and phosphorylacetic acid's hydrozides. Their farmacological activity / E.L. Gavrilova, N.I. Shatalova, M.N. Shipova (M.N. Saifutdinova), I.I. Semina, R.I. Tarasova, I.P. Pashina, E.V. Maka-rova, A.R. Burilov, M.A. Pudovic, A.I. Konovalov // Design and Synthesis of Supramo-lecular Architectures: Abstracts of Vth International Symposium. - Kazan, Russia, 2009. -P. 162.

7. Сайфутдинова, M.H. Синтез и фармакологические свойства молекулярного комплекса на базе каликс[4]резорцина, несущего пара-толильный радикал по «нижнему» ободу молекулы, и фосеназида / М.Н. Сайфутдинова, Н.И. Шаталова, ЕЛ. Гаврилова, Р.И. Тарасова, И.П. Пашина, И.И. Семина // Вестник Казанского технологического университета -2010. -№ 7. - С. 294-299.

8. Пашина, И.П. Новые модификации каликс[4]резорцина для адресной доставки лекарственных веществ / И.П. Пашина // XV Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине»: Материалы конференции. - Казань, 2010. - С. 237- 238.

9. Сайфутдинова, М.Н. Новые нейротропные средства на основе гидразидов фосфорилуксусной кислоты и каликс[4]резорцинов / М.Н. Сайфутдинова, E.JI. Гав-

рилова, Н.И. Шаталова, Р.И. Тарасова, И.И. Семина, И.П. Машина, A.A. Наумова // VIII Всероссийская конференция с международным участием «Химия и медицина»: Сборник тезисов. - Уфа, 2010. - С. 295.

10. Пашнна, И.П. Изучение нейротропной активности комплекса фосфабензида с новой модификацией каликс[4]резорцина / И.П, Пашина, А.З. Байчурина, Е.В. Шиловская // 5-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам»: Материалы конференции. -Москва, 2010.-С. 25

11. Гаврилова, E.J1. Молекулярные комплексы на основе каликс[4]резорцинов ¡t гидразидов фосфорилуксусной кислоты - подход к созданию новых нейротропных средств / E.JI. Гаврилова, Н.И. Шаталова, М.Н. Сайфутдинова, Р.И. Тарасова, А.А, Наумова, И.И. Семина, И.П. Пашина // International Symposium on Advanced Science in Organic Chemistry: book of abstracts. - Miskhor, Crimea, 2010. - C. 48.

12. Gavrilova, E.L. Phosphorylacetic acid's hydrazides and their complexes with calyx[4]resprcines / E.L. Gavrilova, N.I. Shatalova, M.N. Saifutdinova, R.I. Tarasova, A.A. Naumova, I.I. Semina, I.P. Pashina, A.R. Mustafina, A.T. Gubaidullin // 18th International Conference on Phosphorus Chemistry: book of abstracts. - Wroclaw, Poland, 2010.-P. 57.

13. Сайфутдинова, M.ft. Разработка подходов к созданию новых ноотропных средств на основе каликс[4]резорцина и гидразидов фосфорилуксусной кислоты / М.Н. Сайфутдинова, Н.И. Шаталова, ЕЛ. Гаврилова, Р.И. Тарасова, И.И. Семина, И.П. Пашнна // Актуальные проблемы органической химии: Тезисы докладов Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи. - Казань, 2010. - С. 62.

14. Сайфутдинова, М.Н. Молекулярные комплексы на основе ка-ликс[4]резорцинов и гидразидов фосфорилуксусных кислот. Синтез и фармакологические исследования / М.Н. Сайфутдинова, Н.И. Шаталова, E.JI. Гаврилова, Р.И. Тарасова, И.П. Пашнна, И.И. Семина // Вестник Казанского технологического университета.-2011.-Т. 14, № 11.-С. 127- 130.

15. Шаталова, Н.И. Каликс[4]резорцины, несущие аммониофенильные радикалы по нижнему «ободу» молекулы. Исследование в реакциях с гидразидами фосфорилуксусных, кислот / Н.И. Шаталова, М.Н. Сайфутдинова, E.JI. Гаврилова, Р.И. Тарасова, И.П. Пашина, И.И. Семина // Вестник Казанского технологического университета.-2011.-Т. 14, № 8. - С. 28-34.

16. Пашина. И.П. Изучение психотропной активности комплекса ка-ликс[4]резорцина с транквилизатором фосфабензидом / И.П. Пашнна, И.И. Семина, А.З. Байчурина, М.Н. Сайфутдинова // Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности: Сборник статей XI Международной научно-практической конференции. - Санкт-Петербург, Россия, 2011. - С. 223 - 225.

17. Пашнна, И.П. Изучение фармакологической активности комплексов водорастворимого каликс[4]резорцина с фосфабензидом и КАПАХ / И.П. Пашина, И.И. Семина, Б.Г. Идиятуллин // Российская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров»: Материалы конференции. - Казань, 2011. - С. 109 - 112.

18. Пашина, И.П. Каликсарёны - новые средства доставки лекарственных веществ / И.П. Пашина, И.И. Семина, А.З. Байчурина // III-я Российская научно-

практическая конференция «Здоровье человека в XXI веке»: Материалы конференции. - Казань, 2011. - С. 278 - 280.

19. Макарова, Е.А. Контроль количественного содержания 25,26,27,28-тетрагидроксикаликс[4]арена спектрофотометрическим .методом / Е.А. Макарова, С.А. Сидуллина, И.П. Пашина, И.И. Семина // Ш-я Российская научно-практическая конференция «Здоровье человека в XXI веке»: Материалы конференции. - Казань, 2011. - С. 261 - 264.

20. Макарова, Е.А. Количественное определение каликс[4]резорцина методом УФ-спектрофотометрии / Е.А. Макарова, И.П. Пашина, С.А. Сидуллина // Российская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров»: Материалы конференции. -Казань, 2011.-С. 70-73.

21. Сайфутдинова, М.Н. Поиск путей функционализации каликс[4]резорцина препаратом глицин / М.Н. Сайфутдинова, Н.И. Шаталова, Р.И. Тарасова, И.П. Пашина И Современные техника и технологии: сборник трудов XVII Международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. -Томе, 2011. - Т.З. - С. 439 - 440.

22. Semina, I. Calyx[4]resorcines as novel potential delivery systems of medicinal substances /. I. Semina, I. Pashina, A. Baychurina, E. Gavrilova, N. Shatalova, M. Saifutdinova, R. Mustafin, A. Gubaidullin, O. Sinayshin // 38th Annual Meeting & Exposition of the CRS: book of abstracts. - Maryland, U.S.A., 2011. - P. 568.

23. Gavrilova, E.L. Calixresorcines, modifided by amino groups - transport facilities for nootropic based on phosphorylacetic acides hydrazides / E.L. Gavrilova, N.I. Shatalova, M.N. Saifutdinova, R.I. Tarasova, I.I. Semina, I.P. Pashina, O.G. Synyashin // XIX Mendeleev congress on general and applied chemistry: book of abstracts. - Volgograd, 2011.-P. 177.

24. Пашина, И.П. Исследование каликс[4]резорцина как носителя фармакологических веществ / И.П. Пашина, Е.А. Макарова, И.И. Семина, С.А. Сидуллина, М.Н. Сайфутдинова, Е.Л. Гаврилова, Н.И. Шаталова, Р.И. Мустафин // Фармация. - 2012. - № 5. - С. 6 - 8.

25. Пашина, И.П. Комплекс каликс[4]резорцина с фосфабензидом и его фармацевтическая характеристика / И.П. Пашина, И.И. Семина, Р.И. Мустафин, P.C. Га-раев, А.З. Байчурина // IV-я Российская научно-практическая конференция «Здоровье человека в XXI веке»: Материалы конференции. - Казань, 2012. - С. 477 - 480.

26. Макарова, Е.А. Фармакологическое изучение новых производных гидразидов фосфорилуксусной кислоты / Е.А. Макарова, И.И. Семина, Е.В. Шиловская, И.П. Пашина, Р.И. Тарасова, А.З. Байчурина, P.C. Гараев // IV-я Российская научно-практическая конференция «Здоровье человека в XXI веке»: Материалы конференции. - Казань, 2012. - С. 456 - 460.

27. Сайфутдинова, М.Н. Синтез и фармакологические исследование молекулярных комплексов на основе каликс[4]резорцинов и гидразидов фосфорилуксусных кислот - подход к созданию лекарственных препаратов / М.Н. Сайфутдинова, Н.И. Шаталова, И.П. Пашина // Тез. докл. VI Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» -Санкт-Петербург, 2012.-С. 101 - 102.

28. Макарова, Е.А. Синтез и нейротропная активность в ряду гидразидов фосфорилуксусных кислот / Е.А. Макарова, Р.И. Тарасова, И.И. Семина, Ш.А. Фаттахов,

Байчурина А.З., Шиловская Е.А., И.П. Пашина, О.В. Воскресенская, Р.С. Гараев // Фундаментальные исследования. - 2012. - №8. - С. 470 - 473.

29. Пашина, И.П. Каликс[4]резорцины — новые системы доставки лекарственных веществ / И.П. Пашина, И.И. Сбмина, Р.И. Мустафин, А.З. Байчурина, Р.С. Гараев // IV Съезд фармакологов России «Инновации в современной фармакологии»: Материалы конференции. - Казань, 2012. - С. 147

30. Semina, I. The possibilities of using calyx[4]resorcines as drug delivery systems /1. Semina, I. Pashina, A. Baichourina, R. Mustafin // Proc. Annual World Meeting on AAPS, Chicago, U.S.A., 2012. - Abstr. M1273.

Список использованных сокращений

ИК - спектроскопия — инфракрасная спектроскопия

JIB — лекарственное вещество

ЛС - лекарственное средство

УРПИ - условная реакция пассивного избегания

УФ - спектрофотометрия - ультрафиолетовая спетрофотометрия

ФАГ - фосфорилацетогидразиды

ФБ - фосфабензид

ЦНС - центральная нервная система

ЯМР - спектроскопия — ядерная магнитная резонансная спектроскопия

Подписано в печать 14.02.2013 г. Формат 60x84'/i6. Печатных листов 1. Бумага офсетная, тираж 100. Заказ К-18. Отпечатано в

г. Казань, ул. Муштари, 11, тел. 259-56-48. E-mail: meddok200S@mail.ru