Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Разработка и исследование лекарственного препарата на основе новых пептидных ингибиторов агрегации тромбоцитов

гт.

'На прювах рукописи

АЛЕКСЕЕВ АЛЕКСЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ НОВЫХ ПЕПТИДНЫХ ИНГИБИТОРОВ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ

14.04.01 - технология получения лекарств, 14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

28 0КТ 2015

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2015

005563836

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Павлова Людмила Анатольевна - кандидат фармацевтических наук, доцент Королев Вячеслав Леонидович — доктор химических наук Официальные оппоненты:

Ланцова Анна Владимировна — кандидат фармацевтических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации (-далее ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» Минздрава России), НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» Минздрава России, лаборатория разработки лекарственных форм, старший научный сотрудник

Пятин Борис Михайлович — доктор фармацевтических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», руководитель опытно-технологического отдела

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Защита состоится » ÇJUictOjXfi 2015 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119034, г. Москва, Зубовский бульвар, д. 31/1 и на сайте: www.mma.ru.

Автореферат разослан ¿/¿tiCt/j 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.040.09 доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности населения в России [Ощепкова, 2013; Global atlas on cardiovascular disease prevention and control. Geneva: World Health Organization. - 2011. - P. 164]. Доказано, что в основе сердечно-сосудистых заболеваний лежит атеротромбоз - процесс патологического тромбообразования, ведущий к инфаркту миокарда и инсульту [Badimon et al, 2008]. Существуют различные методы профилактики и лечения процессов тромбообразования, включая создание новых эффективных антиагрегационных лекарственных средств, основанных, в том числе, на ингибировании процесса тромбоза. В образовании тромба значимую роль играют гликопротеиновые рецепторы тромбоцитов. Ингибиторы GP IIb/IIIa-рецепторов тромбоцитов являются мощными антитромбоцитарными препаратами [Bussel et al., 2000]. С другой стороны, известно также, что ингибирование процессов тромбообразования происходит под воздействием оксида азота [Radomski et al, 1987]. Один из классов химических соединений, производные которых являются донорами оксида азота- фуроксаны [Feelisch et al, 1992].

Одним из современных направлений создания инновационных лекарственных средств является разработка «гибридных» молекул, в которых в одну молекулярную систему включено несколько фармакофорных фрагментов. Например, в случае лекарственных средств с антиагрегационной активностью это могут быть такие фармакофоры, как антагонисты GP Ilb/IIIa рецепторов тромбоцитов пептидной природы и экзогенные доноры оксида азота на основе соединений фуроксанового ряда.

В настоящий момент на фармацевтическом рынке антиагрегационные препараты на основе пептидов представлены, как правило, в виде раствора для в/в введения. Однако, лекарственные препараты других фармакологических групп могут применяться как в виде лиофилизата, так и в виде суспензии наночастиц для пролонгирования действия лекарственного вещества (например «Бусерелин», «Бусерелин-депо»). Таким образом, разработка и исследование новых лекарственных препаратов на основе пептидов с антиагрегационной активностью как для экстренного воздействия (лиофилизат для приготовления раствора для инъекции), так и с пролонгированным действием на основе наночастиц является актуальной.

Степень разработанности темы исследования. Ингибиторы GP Ilb/IIIa-рецепторов тромбоцитов представлены в клинической практике такими препаратами, как абциксимаб (РеоПро), барбурин, эптифибатид (интегрелин), тирофибан (агграстат), выпускаемыми различными фармацевтическими фирмами [Литвинов, 2004]. Однако, для обеспечения антиагрегационного действия требуются постоянное инфузионное введение указанных препаратов. К настоящему времени доказана генерация азота тринитроглицерином и другими производными нитратов в результате энзиматической биотрансформации [Advald et al., 2002]. Однако их существенным недостатком является возникновение толерантности при длительном применении препаратов этой группы [Thatcher et al., 2004]. Поэтому разработка новых ингибиторов агрегации тромбоцитов обусловливает актуальность диссертационного исследования.

Цели и задачи исследования. Целью работы является получение и исследование новых антиагрегационных соединений на основе пептидных антагонистов GP Ilb/IIIa рецепторов тромбоцитов и имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана, выявление in vitro наиболее активного соединения, а также разработка технологии лиофилизирования этого соединения и создания наночастиц на его основе. Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести компьютерное моделирование пептидных антагонистов интегрин-рецепторов тромбоцитов и оценить возможность использования в качестве ингибиторов агрегации тромбоцитов производных имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана;

2. Выполнить синтез пептидных и гетеромерных пептидных ингибиторов агрегации тромбоцитов на основе имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана;

3. Установить строение синтезированных соединений с помощью физико-химических методов (спектроскопия ЯМР 'Н, масс-спектрометрия и элементный анализ);

4. Исследовать антиагрегационную активность in vitro синтезированных соединений и выбрать для дальнейшего изучения наиболее активное;

5. Разработать технологию получения наночастиц гетеромерного пептида с целью создания его пролонгированной формы;

6. Разработать технологию получения лиофилизата для инъекционного введения и лиофилизата наночастиц гетеромерного пептида;

7. Оценить качество полученного лиофилизата для инъекционного введения и лиофилизата наночастиц гетеромерного пептида и их стабильность.

Научная новизна результатов работы. Научно обоснован спектр соединений для прогнозирования антиагрегационных свойств с помощью математического моделирования. Компьютерное моделирование выполнено для 20 ООО пептидов, 24 производных фуроксана и 48 ООО гетеромерных пептидов, состоящих из двух фармакофорных групп: пептидной и фуроксановой. Синтезировано 40 наиболее активных (согласно прогнозу) пептидов и гетеромерных пептидов, подтверждена их антиагрегационная активность. Разработаны стабильные лиофилизированные формы наиболее активного in vitro гетеромерного пептида: лиофилизат гетеромерного пептида для приготовления раствора для инъекции и лиофилизат гетеромерного пептида в наночастицах для приготовления суспензии для инъекции. Определены показатели качества для их стандартизации. Экспериментально подтверждена стабильность лиофилизатов в течение 2 лет. Приоритет проведенных исследований подчеркивается полученными патентами: РФ №2550223 «Гетеромерные пептиды на основе имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана, ингибирующие агрегацию тромбоцитов», РФ №2549355 «№карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксан, ингибирующий агрегацию тромбоцитов», РФ №2544547 «Н-карбоксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксан», РФ №2502739 «Ы-карб(глутаминил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксан, ингибирующий агрегацию тромбоцитов».

Теоретическое значение результатов работы. Представленный в работе экспериментальный материал может служить теоретической базой для создания и исследования новых антиагрегационных лекарственных средств.

Практическая значимость работы. Получено 40 пептидных и гетеромерных пептидных антиагрегационных соединений. В эксперименте in vitro выявлено наиболее активное соединение, получены стабильные лиофилизаты данного соединения, в том числе в виде наночастиц. В работу лаборатории биологически активных соединений НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России внедрены материалы исследования диссертационной работы (акт внедрения) и лабораторный регламент Fia «Гетеромерный пептид, лиофилизат для приготовления раствора для инъекции 8 мг».

Методология и методы исследования. При выполнении работы были использованы методы органического синтеза, хроматографии, комплекс физико-химических, биологических методов, методы компьютерного моделирования степени связывания антагонистов интегрин-рецепторов тромбоцитов, прогноза биологической активности фуроксанов, технологических испытаний, математические методы анализа и обработки результатов.

Публикации. По тематике диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них б статей в рекомендованных ВАК изданиях, получено 4 патента РФ.

Степень достоверности результатов. Достоверность полученных в ходе работы результатов обеспечивали определенным набором физико-химических, биологических и технологических методов исследования. Расчетный поиск потенциальных антагонистов интегрин-рецепторов тромбоцитов проводили с использованием современных методов компьютерного моделирования с помощью программы «Апгокомб». Прогноз биологической активности производных фуроксана выполняли с помощью программы PASS Professional 2010.1. Агрегацию тромбоцитов изучали с использованием турбидиметрического метода Борна. Строение синтезированных соединений подтверждали методами спектроскопии ЯМР 'Н (с привлечением методик 'Н/'Н-спектров COSY), масс-спектрометрии и элементным анализом. Для исследования влияния различных технологических факторов на качество лиофилизатов гетеромерного пептида использовали сертифицированное оборудование. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента. Обработка данных производилась с помощью программы Microsoft Excel ХР. Статистически значимыми расценивались эффекты при р<0,05.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на конференции «Новые химико-фармацевтические технологии» (Москва, 2012, 2014); Конкурсе научных инновационных работ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (диплом III степени) (Москва, 2012); Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XVI и XVII Всероссийская конференция «Человек и его здоровье») (Санкт-Петербург, 2013, 2014); III Всероссийской научной конференции с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2013); II Научно-практической

конференции: «Актуальные проблемы фармацевтической технологии и фармации» (Москва, 2013), а также на межкафедральных и лабораторных конференциях на базе НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России.

Личный вклад автора. Данные, представленные в автореферате и диссертации, получены при непосредственном участии автора как на этапах постановки задач и разработки подходов к их выполнению, так и при получении результатов при проведении экспериментальных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций. Диссертация и автореферат написаны лично автором.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формулам специальностей 14.04.01-технология получения лекарств и 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия, результаты проведенного исследования соответствуют областям исследования специальностей, конкретно пунктам 3, 4 паспорта «технологии получения лекарств» и 1,4 паспорта «фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова МЗ РФ «Развитие научных и научно-методических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01201261653).

Основные положения, выносимые на защиту:

- Структуры соединений для проведения компьютерного моделирования: пептидные антагонисты интегрин-рецепторов тромбоцитов и гетеромерные пептиды на основе имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана - донора оксида азота.

- Результаты изучения синтезированных соединений физико-химическими методами: масс-спектрометрией, ЯМР 'Н-спектроскопией и элементным анализом.

- Результаты исследования антиагрегационных свойств синтезированных пептидных и гетеромерных пептидных соединений in vitro.

- Технология получения наночастиц гетеромерного пептида.

- Технологии получения лиофилизата гетеромерного пептида для приготовления

раствора для инъекции и лиофилизата наночастиц гетеромерного пептида для приготовления суспензии для инъекции.

- Результаты качественного и количественного анализа лиофилизатов гетеромерного пептида, изучения стабильности в процессе хранения.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 152 страницах, включает 35 рисунков и 30 таблиц. Список литературы содержит 144 источника.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Компьютерное моделирование антагонистов интегрин-рецепторов тромбоцитов. Моделирование проводили с помощью программы «Алгокомб».

Метод прогнозирования биологической активности фуроксанов. Прогноз для фуроксанов выполняли с помощью программы PASS Professional 2010.1.

Методика синтеза пептидов. Пептиды синтезировали на пептидном синтезаторе ABI 433 A PeptideSynthesizer (Applied Biosystems) по Fmoc-стратегии.

Методика очистки полученных соединении. Очистку осуществляли на высокоэффективном препаративном жидкостном хроматографе PuriFlash 450 (InterChim).

Подтверждение строения соединений. Строение подтверждали методами хромато-масс-спектрометрии (Waters MSD SQD-ESI (Waters)), ЯМР 'Н-спектроскопии (с привлечением двумерных методик 'Н/'Н-спектров COSY) (Brucker Avance 600 mhz (Brucker)) и элементным анализом (CHN-анализатор Perkin Elmer 2400 (Perkin Elmer)).

Определение антиагрегацпонной активности соединений в эксперименте in vitro. Антиагрегационную активность соединений определяли турбидиметрическим методом Борна (Born, 1962) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов/счетчик 230LA-2 (Биола).

Степень включения гетеромерного пептида в наночастицы. Степень включения пептида определяли методом ВЭЖХ в супернатанте, полученным при центрифугировании суспензии наночастиц на центрифуге Beckman L8-60M (Beckman).

Оценка качества лиофилизатов. Качество лиофилизатов оценивали с помощью

методик, описанных в фармакопейных статьях ГФ XII при определении растворимости в воде для инъекции (ч. 1, стр. 92), цветности (ч. 1, стр. 93), прозрачности (ч. I, стр. 98), рН (ч.1, стр.85), остаточного органического растворителя (ч. 1, стр. 115), стерильности (ч. 1, стр. 150), пирогенности (ч. 1, стр. 125), бактериальных эндотоксинов (ч. 1, стр. 128). Для определения потери в массе при высушивании и средней массы использовали методики ГФ XI (ч. 1, стр. 176, ч. 2, стр. 140).

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ РАЗРАБОТКА СОЕДИНЕНИЙ - ИНГИБИТОРОВ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ Пептидные ингибиторы агрегации тромбоцитов Молекулярное моделирование пентапептидов. Моделирование взаимодействия белка интегрин ащ/Рз с пептидами проводили с помощью программы «Алгокомб», модифицированной для учета внутренних нековалентных взаимодействий лиганда и явного учета молекул воды в сайте связывания. Расчет оценки связывания [Ramensky et al, 2007] с белком проводили для пептидов вида «A-B-C-Asp-D», где «А», «В», «С», «D» - L-аминокислотные остатки; «С» - глицин или аланин. Наличие остатка аспарагиновой кислоты положительно влияет на связывание с белком (согласно визуальному анализу), так как он может образовывать ионную связь с ионом магния в активном сайте. Провели докинг 20 000 пептидов. В базе данных PDB представлено 17 комплексов белка интегрин апъ/Рз- Для докинга и расчета оценки связывания были выбраны структуры с идентификаторами «2vdp» и «2vc2», так как комплекс «2vdp» состоит из белка-мишени и октапептида, а комплекс «2vc2» с лигандом близким по размеру к пентапептиду. Для всех рассматриваемых пептидов проведен докинг и рассчитана оценка связывания с конформациями белка ащ/Рз- Для каждой конформации белка выбрано 60 веществ с наилучшими оценками связывания. Оценки связывания при докинге в комплекс «2vdp»: 16,52-13,89; при докинге в комплекс «2vc2»: 10,78-8,04. Большая оценка связывания предполагает лучшую активность лиганда, поэтому результаты рассчитанных оценок связывания демонстрируют, что пептиды лучше располагаются в сайте комплекса «2vdp».

Синтез пептидов с вероятной антиагрегационной активностью. Синтез 20 наиболее эффективных (по результатам компьютерного моделирования) пептидов осуществляли с использованием Fmoc-стратегии (рис. 1).

полимер

Рисунок 1. Схема синтеза пептидов, где R = остатки аминокислот, Рг. (protected) group = защитные группы аминокислот

Определение антиагрегациоппой активности синтезированных пептидов

in vitro. Проведенные исследования свидетельствует о способности полученных

соединений уменьшать агрегацию тромбоцитов (табл. 1).

Таблица 1. Данные синтезированных пептидов 1-20

№ Пептид Оценка связывания ICjo, мкМ № Пептид Оценка связывания IC5o, мкМ

1 Phe-Ile-Ala-Asp-Thr 15,39 12,53±0,09 11 Lys-lle-Ala-Asp-Asp 15,47 14,68±0,13

2 Lys-His- Ala-Asp-Asp 16,52 11,13±0,25 12 Arg-Ser-Gly-Asp-Arg 15,42 41,95±0,08

3 His-lle-Gly-Asp-Asp 16,20 15,47±0,11 13 Arg-Phe-Gly-Asp-Arg 15,39 26,15±0,09

4 Arg-Val-Gly-Asp-Arg 15,94 17,6010,16 14 Arg-Trp-Gly-Asp-Trp 16,19 70,33±0,09

5 Cys-His-Ala-Asp-Asp 15,92 55,20±0,33 15 Arg-Ile-Gly-Asp-Trp 15,89 50,10±0,08

6 Arg-Phe-Ala-Asp-Asp 15,81 28,23±0,35 16 Arg-Tyr-Gly-Asp-Trp 15,46 32,56±0,09

7 Arg-Tyr-Gly-Asp-Arg 15,64 14,50±0,17 17 Tyr-Leu-Gly-Asp-Asp 15,36 42,59±0,14

8 Arg-Met-AIa-Asp-Asp 15,62 34,52±0,04 18 Leu-His-Gly-Asp-Asp 15,29 79,53±0,07

9 Arg-Phe-Gly-Asp-Asp 15,59 60,79±0,07 19 Arg-His-Gly-Asp-Arg 15,24 57,37±011

10 Met-His-Ala-Asp-Asp 15,58 58,39±0,11 20 Arg-Arg-Ala-Asp-Thr 15,00 68,28±0,09

Полученные результаты показали наличие дозозависимого ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов крови здоровых доноров под действием пептидных ингибиторов GP IIb/IIIa-рецепторов.

Исследование возможности использования имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;

3,4-с']дифуроксанов как ингибиторов агрегации тромбоцитов Одним из классов химических соединений, производные которых являются донорами оксида азота, являются фуроксаны. С помощью программы PASS Professional 2010.1 был выполнен прогноз биологической активности различных имидазо[4,5-е] бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксанов и установлена высокая вероятность проявления ими

антиагрегационной активности. Соединения 21-42 (табл. 2) были синтезированы на кафедре химии ГБОУ ВПО Марийского государственного университета и предоставлены для установления антиагрегационной активности. Для получения соединений, влияющих на генерацию азота различными способами, нами были синтезированы гетеромерные пептиды 43 и 44. Особенностью соединений 43, 44 является то, что имидазо[4,5-е] бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксановый фрагмент, относится к экзогенным донорам оксида азота, а аргинин и глутамин стимулируют эндогенную генерацию оксида азота.

Гетеромерные пептиды 43,44 (табл. 2) получали с использованием Fmoc-стратегии (рис. 2).

Рисунок 2. Схема синтеза гетеромерных пептидов 43 (R = -CH2CH2NHC(NH)NH2, Pr. group (protected group) = Pbf) и 44 (R = -CH2CH2C(0)NH2> Pr. group = Trt).

Турбидиметрическим методом Борна подтвержден сделанный прогноз и доказано, что

соединения 21-44 обладают выраженным антиагрегационным эффектом in vitro (табл. 2).

Таблица 2. Антиагрегационная активность соединений 21-44 in vitro

О "ic^ XT \

№ Rl R2 ICso, мкМ № Я, r2 IC50, мкМ

21 H Н 1,05±0,08 33 снгсн=сн2 н 1,21 ±0,01

22 H сн, 0,41 ±0,01 34 СН:С(0)0С2Н5 н 0,11 ±0,01

23 Н 1,81 ±0,01 35 CH2C(0)0C2Hs сн, 0,30±0,01

24 Н с3н, 0,61±0,01 36 СН;С(0)0С:Н5 c2Hs 0,71±0,02

25 н /с,н, 0,42±0,03 37 СН,С(0)0Н н 1,06±0,07

26 н с„н9 1,12±0,03 38 СН,С(0)0Н CHj 2,42±0,09

27 CHj н 0,71 ±0,01 39 СН2С(0)0Н С2н5 1,55±0,06

28 с,н. н 0,81±0,02 . 40 CH;CN н 0,41±0,01

29 с,н7 н 0,62±0,02 41 н N02 1,81±0,01

30 С,н» н 1,41 ±0,03 42 Н сн2он 0,61±0,01

31 С5Н„ н 0,72±0,01 43 CH,C(0)-Arg н 0,42±0,03

32 С6Н]з н 1,81 ±0,01 44 CH;C(0)-Gln н 1,12±0,03

Таким образом, подтверждена возможность использования производных имидазобензодифуроксана в качестве ингибиторов агрегации тромбоцитов. Выявлено,

проявление более выраженной антиагрегационной активности соединения 43 по сравнению с базовым имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксаном (21). По результатам исследования антиагрегационная активность имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксанов (1С50 0,11-2,42) выше антиагрегационной активности пептидов 1-20 (1С50 11,13-79,53), и следовательно, имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксаны перспективны в качестве фармакофора при создании «гибридных» антиагрегационных соединений.

Гетеромерные пептиды на основе имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с'] дифуроксана и пептидных ингибиторов агрегации тромбоцитов Для создания соединений, обладающих более выраженными антиагрегационными свойствами по сравнению с пептидами, были исследованы вещества с двумя различными механизмами воздействия на агрегацию тромбоцитов, состоящие из двух фармакофорных групп: пептидной — ингибиторы СР ПЬ/Ша-рецепторов тромбоцитов и фуроксановой - доноры оксида азота.

Компьютерное моделирование гетеромерных пептидов. С помощью программы «Алшкомб» выполнили компьютерное моделирование связывания гетеромерных пептидов с белком интегрин осщ/Рз. Расчет оценки связывания с белком проводили для соединений вида «Яг-А-В-С-АБр-О» (табл. 3), где «Яг» - карбоксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1Д-с;3,4-с'] дифуроксан; «А», «В», «С», «Б» - Ь-аминокислотные остатки; «С» - глицин или аланин. Всего было сконструировано 48 ООО молекул. Для докинга из базы данных РБВ выбрали комплекс белка «2у<3р». Докинг начинали с правильного расположения кислотного фрагмента гегеромерного пептвда для учета наличия ионной связи лиганда с ионом магния в активном сайте. В процессе докинга учитывали наличие двух молекул воды в активном сайге белка.

Таблица 3. Данные гетеромерных пептидов 45-64

№ Пептид Оценка связывания ГС\0, мкМ № Пептид Оценка связывания 1С50, мкМ

45 П/л-РЬе-Ие-Ма-Агр-ТЬг 13,51 1,74±0,01 55 /^г-[_уз-[]е-А1а-Ляр-Азр 14,04 1,95±0,02

46 17,30 ],52±0,01 56 /•»г-А^-5ег-01у-Азр-А^ 6,06 1,74±0,01

47 /?/г-Н|5-11е-01у-АЕр-Л5р 13,30 2,83±0,02 57 Л//"-А^-РЬе-01у-Азр-А^ 7,99 2,13 ±0,02

48 Л/г-А^-Уа1-С1у-Азр-А^ 13,72 2,95±0,02 58 /■!/г-Агу-Тгр-С!у-Аяр-Тгр 10,83 2,65±0,02

49 /г/г-Су5-Н|5-Л1а-Азр-Аьр 13,06 3,28±0,01 59 Лн--А^-11е-01у-Азр-Тгр 13,95 3,35±0,03

50 Г1/г-А^-РЬе-А1а-А5р-АБр 7,72 2,03±0,02 60 /;/г-Агй-Туг-01у-Азр-Тгр 9,64 2,95±0,02

51 ////■-Лгй-Туг-01у-Азр-Л^ 8,11 1,78±0,01 61 У-иг-Туг-Ьец-О^-Азр-Азр 11,19 2,78±0,02

52 /■нг-А^-Мег-АЬ-Азр-АБр 7,52 1,92±0,01 62 9,42 2,81 ±0,02

53 /^г-Лгз-РЬе-СЛу-Аэр-А^р 8,89 2,41±0,01 63 Я/г-А^-Н1з-С1у-Азр-А^ 6,64 2,54±0,02

54 Я/г-М^-Из-Ак-Азр-Агр 9,59 2,26±0,02 64 /'г//--Агу-Агц-А1а-Азр-ТЪг 7,54 2,61±0,01

В результате эксперимента выявлено, что гетеромерный пептид - /•г/г-Ьуэ-! 11э-

Ala-Asp-Asp (46) - имел оценку связывания 17,3, что выше, чем лучший из пептидов, построенных из стандартных аминокислот (16,5). При этом отмечается, что гетеромерные пептиды удачно размещаются в имеющейся на белке полости, а имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксановый фрагмент не мешает связыванию.

Синтез гетеромерных пептидов 45-64 проводили по Fmoc-стратегии.

Определение специфической активности гетеромерных пептидов in vitro. В процессе эксперимента выявлено, что антиагрегационная активность, определенная in vitro, для смоделированных соединений (45-64: IC50 1,52-3,35) намного превосходит антиагрегационную активность базовых пентапептидов (1-20: IC5011,1-79,5). Выявлено, что наиболее активным ингибитором среди гетеромерных пептидов оказалось соединение Fur-Lys-His-Ala-Asp-Asp (46) (IC501,52 мкМ), что соответствует результатам прогноза выполненного математического моделирования.

Исследование растворимости и химической стабильности гетеромерных пептидов. Соединения мало растворимы в воде при 20°С (1:100-1:120), растворимы в воде при 50°С (1:30-1:40) и 70°С (1:20-1:30), растворимы в этиловом спирте (1:20-1:35), легко растворим в диметилформамиде (1:3-1:10), очень мало растворимы в эфире диэтиловом (1:1000-1:1100) и гексане (1:1150-1:1300), практически нерастворимы в хлороформе (1:10000) и дихлорметане (1:10000). Химическую стабильность указанных соединений проверяли в буферных растворах с различными значениями рН, соответствующими средам желудочно-кишечного такта: желудочному соку и соку двенадцатиперстной кишки и тонкого кишечника. Дня этих целей использовали 0,1 М раствор НС1 с добавлением пепсина активностью не более 750 000 Ед/л и буферные растворы с рН 6,8-7,8 с добавлением панкреатина активностью не более 1750 Ед/л. С помощью метода ВЭЖХ выявлено гидролитическое разрушение гетеромерных пептидов (контрольные точки: 1,2,5,10, 30,60 мин) во всех исследованных средах.

Доказательство структуры полученных соединений. Строение соединений 1-20 подтверждали методами хромато-масс-спектрометрии, ЯМР 'Н-спектроскопии (с привлечением методик 'Н/'Н-спектров COSY), элементного анализа. Фуроксановое кольцо в молекуле производных бензофуроксана обладает способностью к таутомеризации в свою вторую форму, содержащую Л'-оксидную группу на другой

стороне цикла азота [Королев, 2003]. Для Ы-карбоксиметилимидазо[4,5-е]бснзо[1,2-с; 3,4-с']дифуроксана возможно существование четырех таутомерных форм. В этой связи вследствие сложности распознавания спектров ЯМР 'Н строение синтезированных соединений 45-64 подтверждали только методами хромато-масс-спектрометрии и элементного анализа. Содержание основного вещества (ВЭЖХ-УФ; ВЭЖХ-МС) для всех синтезированных соединений составляло более 98%.

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗАТА ГЕТЕРОМЕРНОГО

ПЕПТИДА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРА ДЛЯ ИНЪЕКЦИИ Исходя из полученных в экспериментальных исследованиях данных, для создания лиофилизатов и дальнейших технологических исследований был выбран гетеромерный пептид Fw-Lys-His-Ala-Asp-Asp (шифр ИБДФ-П-46), который проявил наибольшую антиагрегационную активность среди гетеромерных пептидов.

Получение лиофилизата гетеромериого пептида. В связи с низкой стабильностью в буферных растворах, соответствующим среде желудочно-кишечного тракта, был выбран парентеральный путь введения ИБДФ-П-46. Обоснование дозы действующего вещества, проводили по литературным данным по аналогии с веществом такой же фармакологической группы: эптифибатид (интегрелин) [Tcheng et al., 1995; Phillips et al., 1997] и на основании собственных исследований in vitro. Для интегрелина (1С500,16 мкМ), доза лекарственного вещества составляет 0,75 мг/мл. Учитывая разницу в 1С5о для ИБДФ-П-46 была выбрана доза в 8 мг/мл.

Принимая во внимание, что гетеромерный пептид мало растворим в воде и его доза мала, была исследована возможность использования при разработке технологии лиофилизирования различных вспомогательных веществ, выполняющих функции структурообразователей и стабилизаторов. Для подбора оптимального состава лиофилизата гетеромерного пептида, удовлетворяющего показателям качества, были приготовлены составы с различным содержанием вспомогательных веществ, традиционно используемых в технологии лиофилизации соединений белковой природы и аминокислот: поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон (ПВП), D-маннитол в концентрациях 15, 20, 30 мг/мл. В ходе проведенных исследований было отмечено, что составы с ПВС представляли собой непрозрачные растворы, содержащие нерасгворившиеся частицы

после интенсивного встряхивания с водой для инъекций в течение 10 мин; данные составы не соответствовали таким показателям, как прозрачность, цветность, растворимость. Растворы ПВП и Э-маннитолом в концентрациях 15, 20, 30 мг/мл были свободны от указанных недостатков. Полученные растворы фильтровали через мембранные фильтры «МР-МППроге» 0,22 мкм в стерильные сборники. Для получения стабильной лекарственной формы растворы пептида лиофилизировали, варьируя режимы замораживания и лиофилизации раствора. По окончании процесса оценивали показатели качества: внешний вид, потерю в массе при высушивании, растворимость в растворителе для инъекций, прозрачность раствора, рН, количественное содержание.

Подбор режима замораживаиия. Для исследования влияния режима замораживания на качество лиофилизата варьировали скорость заморозки.

Медленное замораживание (рис. 3) - пептид загружали на полки лиофильной сушилки при +20-К>2°С, охлаждали до -22^-25°С за 1 час и выдерживали 1,5 ч. Далее охлаяедали до -33-К55°С за 1 час и выдерживали 1,5 ч, затем охлаждали до -42-И5°С за 1 час и выдерживали 1,5 ч, охлаждали до -48^50°С за 1 час и выдерживали 5 ч.

Быстрое замораживание (рис. 4) - пептид загружали на полки лиофильной сушилки при температуре +20-К22°С, охлаждали полки за 1-1,5 час до -22-К25°С, за 1 час до -31-К35°С, за 1 час до -40-^-45°С, и за 1 час до -48-^50°С и выдерживали 5 ч.

Полученные лиофилизаты гетеромерных пептидов анализировали с помощью ВЭЖХ. Анализ показал, что в составах с ПВП неудовлетворительное содержание пептида (менее 90%). Лиофилизаты с О-маннитолом, полностью соответствовали всем показателям качества. Концентрация О-маннитола не оказывала влияния на качество лиофилизата, поэтому концентрация 15 мг/мл была признана оптимальной. Поскольку

-1С I

-<с,о -«со

Рисунок 3. Медленное замораживание

Рисунок 4. Быстрое замораживание

режим замораживания не влиял на качество конечного продукта, в качестве наиболее технологичного метода целесообразно использовать быстрое замораживание продукта.

Разработка режима лиофилъной сушки. Для исследования влияния режимов лиофилизации раствор гетеромерного пептида лиофилизировали, варьируя изменение температуры полки лиофильной сушилки (рис. 5-8, табл. 4).

ТенперэтурЛ Темперл^рЛ

Рисунок 5. Температурный режим №1

Рисунок 7. Температурный режим №3 Рисунок 8. Температурный режим №4

Таблица 4. Сравнение режимов лиофилизации растворов гетеромерного пептида

Температура. °С Режим лиофилизации гетеромерного пептида и скорость нагрева полки лиофильной сушилки (°С/ч)

№1 (рис. 5) №2 (рис. 6) №3 (рис. 7) №4 (рис. 8)

-50 Выдержка в течение 5 часов при давлении 0,01 мБар

от -50 до-10 8 4 5

от-10 до 0 4 5

от 0 до +20 5 4 3 2

+20 Выдержка в течение 4 часов при давлении 0,01 мБар

Анализируя результаты эксперимента, необходимо отметить, неудовлетворительное качество (по тесту прозрачности растворов) лиофилизатов, полученных при использовании режима №3. Показатели качества лиофилизатов, полученных при использовании режимов №1, 2 и 4 соответствовали нормам для инъекционных лекарственных форм. В целях экономии электроэнергии было признано целесообразным использование режима №1.

На основании проведенных исследований составлена технологическая схема получения лиофилизата, которая состоит из следующих этапов: приготовление раствора пептида, стерильная фильтрация раствора, наполнение ампул, лиофилизация, фасовка, упаковка и маркировка готового продукта (рис. 9).

ВР-1.1. Получение воды очшиенноП

ВР-1.2, Подготовка вентиаяцнонного воздуха. сжатого воздуха

ВР-1.3 Приготовченнедет растворов

ВР-1.4. Подготовка помоцпненнн н околдования

ВР-1Л Подготовка персонлпа и спецодежды

IBP-1.6. Подготовка стеклотары,

укупорочных и вспомогатстъньгс _материалов_

ВР-1. Подготовка прошв о дета я -*| Сточные воды в канат nam по J

ТП-1. Подготовки сырья и материалов

ТП-2.1.Напатненне ампул по 2 ш раствором пептида

|тП-2.2.Лнофшп>ная сушка

ТП-1.1.Прнготовленне рлстеора пептз«

ТП-1.2.СТеритьняя фнтьтряши раствора мстила

ТП-2. Получение г

лнофилшята гшпида

УМО-3.1. Запайка аылул

YMO-3.2. Просмотр готовой ' 1 юд^та и □ 1

VMO-З.фасовкя, упаковка и ипркировка

I УМО-3.3. Маркировка н утоковкя I

Рисунок 9. Технологическая схема производства лиофилизата ИБДФ-П-46

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗАТА НАНОЧАСТИЦ ГЕТЕРОМЕРНОГО ПЕПТИДА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУСПЕНЗИИ ДЛЯ ИНЪЕКЦИИ

Для пролонгирования фармакологического эффекта в настоящее время используется, среди иных, такой технологический прием, как включение биологически активного соединения в наночастицы. Кроме пролонгирования, этот технологический прием позволяет изменить фармакокинетический профиль соединения за счет изменения профиля терминального участка кривой [Блынская, 2010]. Для соединений пептидной природы, и, в частности, пептида антиагрегационного действия, этот факт является очень важным, позволяя избежать резких колебаний вещества в крови.

При разработке технологии включения ИБДФ-П-46 в состав наночастиц принимались во внимание физико-химические свойства пептида и требования к носителю: отсутствие токсичности, его биодеградируемость. Поэтому для создания наночастиц был выбран сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA 50/50). Учитывая растворимость ИБДФ-П-46, в качестве метода создания наночастиц был выбран метод двойного эмульгирования, используемый для лабильных соединений, при котором обеспечивается диффузия органического растворителя в водную фазу. Учитывая низкую токсичность и низкую температуру кипения, в качестве органического растворителя для PLGA использовали дихлорметан.

Подбор концентрации PLGA 50/50. К 9,6 мл раствора PLGA в дихлорметане добавляли по каплям 8,40 мл водный раствор ИБДФ-П-46 (концентрация 0,029 мг/мл) при

перемешивании на магнитной мешалке IKA RST basic (IKA). Влияние PLGA на включение гетеромерного пептида в наночастицы исследовали в диапазоне соотношений -ИБДФ-П-46: PLGA 50/50 (табл. 5), при этом соотношение 1:4 отмечено как оптимальное.

Таблица 5. Результаты исследования соотношения ИБДФ-П-46 и PLGA 50/50

Соотношение 1:0,25 1:0,5 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

Степень включения, % 4,1 ±0,2 4,3±0,1 5,5±0,2 6,1 ±0,2 8,5 ±0,3 25,0±0,2 9,5 ±0,2 9,2±0,1

Получение первичной эмульсии типа «вода/масло». К 9,6 мл раствора полимера PLGA 50/50 (концентрация 0,10 мг/мл) в дихлорметане добавляли по каплям 7,20 мл водный раствор ИБДФ-П-46 (концентрация 0,029 мг/мл) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке IKA RST basic (IKA). Продолжали перемешивание погружным гомогенизатором IKA Ultra-Turrax Т-25 при 24 тыс. об./мин. В процессе приготовления эмульсии варьировали скорость перемешивания магнитной мешалки и режим перемешивания погружного гомогенизатора (табл. 6). Готовность эмульсии определяли по образованию пенистой массы белого цвета и под микроскопом. Наиболее технологичным признан режим №3, так как время получения однородной эмульсии наименьшее, а размер наблюдаемых частиц в среднем составляло 250±3,7 нм.

Таблица 6. Режимы получения эмульсии типа «вода/масло»

Режим №1 Режим №2 Режим №3

Скорость перемешивания магнитной мешалки, об/мнн 250 250 500

Дискретность перемешивания погружного гомогенизатора Перемешивание в течение 4 мин 3 раза по 30 сек - перемешивание, 2 раза по 30 сек - перерыв 3 раза по 30 сек - перемешивание, 2 раза по 30 сек - перерыв

Время приготовления 25 мин ± 10 сек 20 мин ± 10 сек 12 мин ± 10 сек

Выбор стабилизатора для вторичной эмульсии. В качестве стабилизаторов эмульсии, на основании данных литературы, были выбраны для исследования такие вспомогательные вещества, как: ПВС, метилцеллюлоза (МЦ), ПВП в соотношениях ИБДФ-П-46: стабилизатор - 1:1, 1:3, 1:5. В результате было выявлено, что оптимальным является использование ПВС при соотношениях 1:3 и 1:5, размер частиц эмульсии при этом не превышал 300±2,5 нм. В дальнейших экспериментах было использовано соотношение 1:3.

Получение вторичной эмульсии типа «вода/масло/вода». К 144,0 мл 0,5% водного раствора ПВС добавляли по каплям 16,8 мл первичной эмульсии при перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 мин. Варьировали скорость и время перемешивания магнитной мешалки (табл. 7). Далее при помощи погружного гомогенизатора 1КА 1Л1га-Тштах Т-25 при 24 тыс. обУмин получали двойную эмульсию. Режим перемешивания: 3 раза по 30 сек с двумя перерывами по 30 сек. Время получения эмульсии

Таблица 7. Режимы получения эмульсии типа «вода/масло/вода»

Режим №1 Режим №2 Режим №3

Скорость перемешивания магнитной мешалкн, об/мин 350 700 1000

Время перемешивания на магнитной мешалке 20 мин ± 10 сек 14 мин ± 10 сек 14 мин ± 10 сек

режимами №2 и 3 одинаковое, поэтому был выбран режим №2 как наиболее технологичный. Получали эмульсию, в состав которой входили частицы размеров: от 350 до 2010 нм.

Дополнительное диспергирование. Для повышения устойчивости эмульсии проводили дополнительную гомогенизацию ультразвуком (УЗ-гомогенизагор Bandelin Sonopuls HD 3100 (Bandelin) с рабочей частотой 20 кГц) в течение 10 минут. Дополнительная гомогенизация за счет уменьшения размера крупных частиц позволила повысить однородность эмульсии и, как следствие, устойчивость эмульсии возросла до 20 минут.

Далее дихлорметан упаривали на роторном испарителе IKA RV-10 (IKA) при 40°С. Вторичную эмульсию фильтровали через стеклянный фильтр 40 мкм. Фильтрат собирали в круглодонную колбу на 250 мл с водным раствором 3,20 мл D-маннитола (концентрация 0,15 мг/мл) и перемешивали в течение 15 мин. Полученную смесь лиофилизировали.

Подбор реотта лиофилизации. Использовали режимы, в которых варьировали изменение температуры полки лиофильной сушилки во времени (рис. 10-12, табл. 8).

Температура, С

мВНЯЗМ!

Врем*.,

* i t lo и u ;o

Рисунок 10. Температурный Рисунок 11. Температурный Рисунок 12. Температурный режим №1 режим №2 режим №3

Таблица 8. Сравнение режимов лиофилизации гетеромерного пептида в наночастицах

Температура, °С Режим лиофилизации и скорость нагрева полки лиофильной сушилки (°С/ч)

№1 с быстрым замораживанием | М'2 с быстрым замораживанием | №3 с медленным замораживанием

-50 Выдержка в течение 5 часов при давлении 0,01 мБар

от-50 до-10 5 5 5

от-10 до 0 4 4

от 0 до +20 3 3

+20 Выдержка в теченне 4 часов при давлении 0,01 мБар

По окончанию процесса лиофилизации оценивали влияние режимов по следующим показателям оценки качества лиофилизатов: внешний вид, рН, потеря в массе при высушивании, размеры частиц, суспендируемость, количественное содержание ИБДФ-П-46. В результате эксперимента было выявлено, что при использовании режимов

№1, 2 получался лиофшшзат наночастиц удовлетворительного качества. При температурных режимах №3 наблюдалось разделение фаз. В результате исследований наиболее технологичным оказался режим лиофилизации №1.

Получение наночастиц подтверждали с помощью анализатора частиц Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 (Malvern Instruments Ltd.). Размеры частиц: 304,5±4,20 нм.

Технология получения лиофилизата наночастиц ИБДФ-П-46. Лиофилизат наночастиц получали в асептических условиях в стерильных боксах. На основании проведенных исследований разработана технологическая схема получения лиофилизата наночастиц (рис. 13), которая состоит из следующих этапов: приготовления растворов ПВС, пептида, полимера PLGA 50/50, D-маннитола; получения первичной и вторичной эмульсий, дополнительного диспергирования, удаления органического растворителя, фильтрования реакционной смеси, смешивания с D-маннитолом, наполнения ампул, лиофилизации, фасовки, упаковки и маркировки.

Таким образом, в ходе экспериментальных исследований разработаны и оптимизированы технологии получения наночастиц гетеромерного пептида и лиофилизата наночастиц гетеромерного пептида ИБДФ-П-46 для приготовления суспензии для инъекции.

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЛПОФИЛИЗАТОВ ГЕТЕРОМЕРНОГО ПЕПТИДА Изучение физико-химических свойств. Внешний вид - все образцы представляли собой массы белого цвета. Средняя масса для лиофилизата ИБДФ-П-46 -0,023±0,002 г/амп, для лиофилизата наночастиц ИБДФ-П-46 - 0,08±0,005 г/амп. Отклонения от средней массы не превышали ±10%.

Прозрачность, цветность и растворимость лиофнлизата ИБДФ-П-46. При добавлении к содержимому ампулы воды для инъекций и встряхивании в течение 3 мин образовывался прозрачный раствор. По показателю цветности раствор был бесцветным. При растворении лиофилизата в воде для инъекций значение рН составляло от 6,5 до 7,0.

Определение размеров наночаспищ Для определения размеров наночастиц использовали анализатор частиц Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 (Malvern Instruments Ltd.), а также субмикронный лазерный спектрометр Coulter N4MD (Coulter Electronics) (табл. 9, рис. 14).

Таблица 9. Основные численные данные размеров наночастиц ИБДФ-П-46

№ Основные численные данные анализа*

Т, °С Диаметр частиц, нм Индекс полидисперсиостн d1, нм d"*, нм d', нм S , % SJ, % S , %

1 25 301,7±1,4 0,212±0,02 325,2±2,3 4462± 12,4 0 95,4±1,1 4,6±0,1 0

2 25 306,4±2,1 0,181±0,01 384,5±1,7 0 0 100±1,5 0 0

3 25 305,5±1,7 0,2±0,01 331,4±2,1 5005±17,3 0 97,8±1,2 2,2±0,1 0

* Т - температура образца при анализе; с1 , d , d - средние значения диаметров для основного пика, для 2-го по величине пика и для 3-го по величине пика при максимуме ннтенсивностн светорассеяния; Б1 — площадь под кривой основного пика; 5" - площадь под кривой 2-го по величине пика; Б3 - площадь под кривой 3-го по величине пика.

15

н ю fr

I i

О

0 1 I 10 100 1000 10000

Sii*(dJvn)

| Rggoiq 1 ................ ReooiTJ 2 Record 3 |

Рисунок 14. Распределение размеров наночастиц ИБДФ-П-46 по интенсивности светорассеяния Суспендируемость. К лиофилизату наночастиц добавляли 1 мл воды и визуально

наблюдали образование однородной суспензии. Суспензия устойчива не менее 20 мин.

Подлинность. Подлинность лиофилизатов гетеромерного пептида подтверждали

методом ВЭЖХ. Хромагограммы и масс-спектр для гетеромерного пептида ИБДФ-П-46

представлены на рис. 15-17.

Рисунок 15. Хроматограмма: спектрофотометрический детектор

Рисунок 16. Хроматограмма: масс-спектрометрический детектор

ж.

га 240 900 Э50 400 «» 400 $80 ООО 650 700 7»

Рисунок 17. Масс-спектр [М+ Н]+ 859,45; [М+ 2Н]2+ 430,33 (Ц. 2,20 мин) Количественное определение ИБДФ-П-46. Определение проводили методом

ВЭЖХ по градуировочному фафику (зависимость площади пика на хроматограмме от

концентрации пептида). Количественное содержание гетеромерного пептида в

наночастицах определяли в надосадочной жидкости. Пробоподготовку осуществляли

следующим образом: к содержимому ампулы добавляли 2 мл диметилформамида (ДМФ) и

переносили в мерную колбу на 10 мл, объем доводили до метки и проводили интенсивное

перемешивание на магнитной мешалке. После этого отбирали 1 мл смеси, разбавляли в три

раза раствором вода: ДМФ (2 :3) и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 3 мин.

Количественное содержание гетеромерного пептида в лиофилизатах: 0,0079 - 0,0081 г/амп.

Определение содержания посторонних (химических) примесей. Определение

проводили методом ВЭЖХ. Для исключения влияния Б-маннитола на результаты

анализа, его анализировали отдельно. На хроматограммах протонированный

молекулярный ион не проявлялся, а депротонированный регистрировался в мертвом

объеме (^д. 0,40 мин), поэтому О-маннитол не мешал анализу пептида (1уд 2,20 мин).

При анализе установили отсутствие химических примесей (фрагментов пептида).

Определение остаточного органического растворителя. В процессе получения

наночастиц гетеромерного пептида использовали дихлорметан, относящийся ко 2 классу

(негенотоксичный) растворителей. Исследование проводили на хроматографе Кристалл

2000 М (Хроматэк) с капиллярной колонкой фирмы НР-РРАР 50м х 0,32мм, используя

дозатор равновесного пара. Время удерживания (дозатор равновесного пара, нагретый до

80°С; температура испарителя 160°С; детектора 200°С; газ-носитель - азот; время

испарения 1б,0мин) составило 5,4 мин. Содержание дихлорметана не превышало 600 ррш

(предельно допустимое содержание).

Потери в массе при высушивании. Показатель определяли сушкой

лиофилизатов в вакуум-сушильном шкафу над Р205 при комнатной температуре и

остаточном давлении 5 мм рт.ст. до постоянной массы. Потеря в массе не превышала 3,0%.

Механические включения. В лиофнлизатах механических включений не обнаружено.

Стерильность, пирогенность, бактериальные эндотоксины. Стерильность определяли методом прямого посева. Пирогенность изучали по изменению температуры тела у кроликов до и после инъекции. Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводили с помощью ЛАЛ-реактива. 10 серий полученных лиофилизатов стерильны, апирогенны; бактериальных эндотоксинов обнаружено не было.

Изучение стабильности и установление сроков годности. Лиофилизаты гетеромерного пептида соответствовали всем показателям качества через 6, 12, 18 и 24 месяца (срок наблюдения). На основании полученных данных был установлен предварительный срок годности - 2 года.

Таблица 10. Показатели качества лиофилизатов гетеромерного пептида ИБДФ-П-46

Полученные данные

Показатели Лиофилизат ИБДФ-П-46 Лиофилизат ШЩФ-П-46 в наночастицах Методы анализа

Внешний вид Масса белого цвета Масса белого цвета Визуальный метод

Растворимость и время растворения в Прозрачный раствор после _ ГФ XII, часть 1, с. 92

растворителе (вода для инъекций) интенсивного встряхивания с растворителем в течение 3 мин

Подлинность Хроматограмма соответствует раствору стандартного образца ВЭЖХ

Средняя масса и 0,023±0,002 г/амп 0,08±0,005 г/амп ГФ XI, часть 2, стр. 140

отклонение от средней массы ±10% ±10%

Прозрачность раствора Прозрачный раствор — ГФ XII, часть 1, стр. 98

Цветность Бесцветный раствор — ГФ XII, часть 1, стр. 93

рН (потенциометрически) 6,5 - 7,0 ГФ XII, часть 1, стр. 85

Посторонние (химические) примеси Не обнаружено ВЭЖХ

Количественное содержание 0,0079-0,0081 г/амп ВЭЖХ

Размеры частиц (диаметр), нм — 304,5±4,20 Метод динамического светорассеяния

Суспендируемость — Удовл., устойчива 20 мин. Визуальный метод

Потеря массы при высушивании Не более 3% ГФ XI, часть 1, стр. 176

Остаточный органический растворитель — | Не более 600 ррт ГФ XII, часть 1, стр. 115

Механические включения Не обнаружены РД 42-501-98

Стерильность Стерилен ГФ XII, часть 1, стр, 150

Пирогенность Апирогенен ГФ XII, часть 1, стр. 125

Бактериальные эндотоксины Не содержит ГФ XII, часть 1, стр, 128

Хранение В сухом защищенном от света месте при температуре -20°С.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С применением программы «Алгокомб» и PASS Professional 2010.1 впервые выполнено компьютерное моделирование ингибиторов агрегации тромбоцитов: 20 000 пептидов, 24 производных фуроксана и 48 000 гетеромерных пептидов.

2. С использованием автоматизированного пептидного синтезатора ABI 433 PeptideSynthesizer по Fmoc-стратегии синтезированы 40 наиболее активных (согласно

компьютерному моделированию) пептидов и гетеромерных пептидов.

3. Строение синтезированных пептидов подтверждено с помощью методов спектроскопии ЯМР *Н (с привлечением двумерных методик 'Н/'Н-спектров COSY), масс-спектрометрии и элементного анализа; гетеромерных пептидов с помощью масс-спектрометрии и элементного анализа.

4. Турбидиметрическим методом Борна подтверждена антиагрегационная активность синтезированных соединений in vitro и выявлен наиболее активный гетеромерный пептид - Fi/r-Lys-His-Ala-Asp-Asp.

5. Разработана технология получения наночастиц гетеромерного пептида методом двойного эмульгирования с диффузией органического растворителя в водную фазу.

6. Разработаны технология получения лиофилизата гетеромерного пептида для приготовления раствора для инъекции и лиофилизата наночастиц гетеромерного пептида для приготовления суспензии для инъекции.

7. Определены показатели качества для стандартизации лиофилизата гетеромерного пептида и лиофилизата наночастиц гетеромерного пептида. Установлено сохранение показателей качества в течение 2 лет на серии лиофилизатов гетеромерного пептида.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алексеев, A.A. Пептидные и модифицированные пептидные ингибиторы агрегации тромбоцитов: математическое моделирование и синтез / A.A. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, А.Ю. Лизунов, H.A. Батуев, Л.А. Павлова // Сб. докл. научно-практической конференции «Новые химико-фармацевтические технологии»-Москва. -2012. - С. 178-182.

2. Алексеев, АЛ. Пептидные ингибиторы агрегации тромбоцитов: математическое моделирование, синтез и oueiu<a специфической активности новых соединений в условиях in vitro / АЛ. Алексеев, М.И. Брьиев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, А.Ю. Лизунов, Е.А. Батуев, Л.А. Павлова // Бутлеровские сообщения. - 2012. - Т.32, №11. - С. 96-100.

3. Патент 2502739 Российская Федерация, МПК C07D 498/14, А61К 31/4245, А61Р 7/02. N-карб(глугаминил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксан, ингибирующий агрегацию тромбоцитов / A.A. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, Е.А. Батуев, Л.А. Павлова, H.H. Белушкина; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. -№2012146266/04; заявл. 31.10.2012; опубл. 27.12.2013, Бюл. №5. - 7 е.: ил.

4. Алексеев, A.A. Пептидные ингибиторы агрегации тромбоцитов / АЛ. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, А.Ю. Лизунов, Е.А. Батуев, Л.А. Павлова// Ученые записки. Электронный научный журнал Курского государственного университета.-2013. -Т.2, №3 (27). - С. 32-37.

5. Алексеев, A.A. Исследование ингибиторов агрегации тромбоцитов пептидной природы / A.A. Алексеев // Сб. докл. 80-ой Юбилейной Всероссийской Байкальской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицины». - Иркутск. - 2013. - С. 374-375.

6. Алексеев, A.A. Синтез и изучение биологической активности новых аитиагрегационных пентапептидов / A.A. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, Л.А. Павлова // Сб. докл.

Первой Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы разработки новых лекарстве!шых средств». - Москва. -2013. - С. 5.

7. Алексеев, A.A. Гликопротеиновые GP НЬ/Ша рецепторы тромбоцитов - потенциальная мишень для антиагрегационных препаратов / A.A. Алексеев, В.Л. Королев, Л.А. Павлова // Сб. докл. VI Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов. -2013.-№1.-С. 160-161.

8. Алексеев, АЛ. Молекулярное моделирование, синтез и оценка биологической активности новых антагонистов GPIIb/HIa рецепторов тромбоцитов / A.A. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, АЛО. Лизунов, Е.А. Батуев, Л.А. Павлова //Молекулярная мед1щииа.-2013. -№5.-С. 61-63.

9. Алексеев, A.A. Синтез антитромбоппеских пептидов / A.A. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, А.Ю. Лизунов, Е.А. Батуев, Л.А. Павлова // Вопросы медицинской, биологической и фармацевтической химии.-2014. - №6. - С. 22-25.

10. Алексеев, A.A. Разработка технологии получения лиофилизата гетеромерного пептида для приготовления раствора для инъекции. / A.A. Алексеев, Л.А. Павлова, В.Л. Королев // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2015. -№3 (12). - С. 72-79.

11. Алексеев, A.A. Математическое моделирование антитромбических пептидов / A.A. Алексеев // Сб. докл. III Всероссийской научной конференции с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - Санкт-Петербург. - 2013. - С. 4.

12. Алексеев, A.A. Разработка антитромбических пептидов / A.A. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, Л.А. Павлова // Сб. докл. 1 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновация в здоровье нации». - Санкт-Петербург. -2013. - С. 83-84.

13. Алексеев, АЛ. Новые гетеромерные пептиды с имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с'] дифуроксановым фрагментом - ингабигоры агрегации тромбоцитов / АЛ. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, ДС. Лоторев, А.Ю. Лизунов, Н.И. Зайцева, Л.А. Павлова, В.П. Ившин // Сб. докл. научно-пракпмеской конференции «Новые юашко-фармацевпиескиетехнологии». - Москва-2014. -С. 143-145.

14. Алексеев, A.A. Математическое моделирование новых антитромбических гетеромерных соединений на основе Ы-карбоксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана и пентапептидов / A.A. Алексеев // Сб. докл. Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых «Фундаментальня наука и клиническая медицина» (XVII Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»). - Санкт-Петербург. - 2014. - С. 14-15.

15. Алексеев, A.A. Разработка новых антнагрегационных гетеромерных пептидов с имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксановым фрагментом / A.A. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, А.Ю. Лизунов, Л.А. Павлова, В.П. Ившин, О.Ю. Домашева // Бутлеровские сообщения. -2014. -Т.38. №4. - С. 16-19.

16. Патент 2544547 Российская Федерация, МПК C07D 498/14. Ы-карбоксимепшимидазо[4,5-е] бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксан / В.Л. Королев, В.В. Топоров, В.М. Дшшленко, В.П. Ившин, A.A. Алексеев, Л.А. Павлова; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. -№2014105524/04; заявл. 17.02.2014; опубл. 20.03.2015, Бюл. №8. -4 е.: ил.

17. Алексеев, A.A. Разработка технологии получения готовых лекарственных форм гетеромерного пептида / A.A. Алексеев, Л.А. Павлова, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев // Современные проблемы науки и образования.-2015. -№1. - Режим доступа: http://science-education.ru/125-19778

18. Патент 2549355 Российская Федерация, МПК C07D 498/14, А61К 31/4245, А61Р 7/02N-карб(арп1Нил)окс1шетнл1Ш1щазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксап, ингибирующий агрегацию тромбоцитов / A.A. Алексеев, М.И. Брылев, В.Л. Королев, Д.С. Лоторев, Е.А. Батуев, Л.А. Павлова; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. - №2014105523/04; заявл. 17.02.2014; опубл. 27.04.2015, Бюл. №12. -7 е.: ил.

19. Патент 2550223 Российская Федерация, МПК С07К 7/06, C07D 498/14, А61К 38/08, 31/4245, А61Р 7/02. Гетеромерные пептиды на основе им1шазо[4,5-е]беюо[1,2-с;3,4-с1диф>роксана, ингибирующие агрегацию тромбощггов / В.Л. Королев, В.В. Топоров, В.М. Дашшенко, В.П. Ившин, A.A. Алексеев, Л.А. Павлова; заявшель и патентообладатель ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. -№2014116844/04; заявл. 28.04.2014; опубл. 10.05.2015, Бюл. №13. -9 е.: ил.

Подписано в печать: 12.10.2015 Тираж: 100 экз. Заказ № 1437 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д. 74 (495) 790-47-77 www.reglet.ru