Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Плазменный ингибитор агрегации тромбоцитов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ. РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ-ОНКОЛОГИИ И п г *■» р ') „

| О V/ ■ 1 МЕДИЦИНСКОИ РАДИОЛОГИИ

УДК 616-005.1-08

Змачинский Владимир Арнольдович

ПЛАЗМЕННЫЙ ИНГИБИТОР АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ

14.00.29 гематология и переливание крови

■ . | ; ■,

Аэтореферат • .,; м

диссертации-на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Минск 1995

Работа выполнена в НШ гематологии и переливания крови МЗ Республики Беларусь.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

профессор Е.П.Иванов

Офиц .альные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор И.П.Данилов доктор медицинских наук, профессор В.А.Кувшинников

Оппонирующая организация -

Научно- исследовательский институт гематологии и переливания крови г.Санкт-Петербург (Россия)

Защита диссертации состоится " ^" ° ^_1996г.

в _ часов на заседании совета по защите

диссертаций Д.03.12.01 в НИИ онкологии и медицинской радиологии МЗ Республики Беларусь (223052 Минская область. пос. Лесной-2 НИИ онкологии)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии и медицинской радиологии МЗ Республики Беларусь

Автореферат разослан "V3" ^_ 1995

Ученый секретарь совета по защите диссертаций : андидат медицинских нау: ... л

т-г• Милевская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Исследования, проведенные в предыдущие годи

продемонстрировали, что тромбоциты играют одну из ключевых ролей в системе гемостаза . Активация тромбоцитов, происходящая при контакте с тромбогенными поверхностями, такими как поврежденная воспалительным или аутоиммунным процессом сосудистая стенка, оторванная атероскперотическая бляшка, часто приводит к образованию тромба и тем самым к нарушению кровообращения (Falk,1985).

Проведенные рядом авторов исследования ло изучении механизмов активации тромбоцитов показали, что основными агонистами тромбоцитов в организме являются АДФ, коллаген, тромбин, адреналин (Cooler 1990) . Среди известных ингибиторов агрегации тромбоцитов плазмы крови человека основными являются:

эндотелиальный фактор релаксации (Ute,1989), простациклин (Фермилен,1984),тромбомодулин (Flier 1993) и некоторые другие.

Дальнейшее изучение естественных регуляторов

тромбоцитарного эвена системы гемокоагуляции, исследована ',• путей взаимодействия коагуляционно-активных компонентов крови, разработка получения новых биологически активных соединений являются актуальными задачами современной медицины.

Данное исследование посвящено поиску метода выделения и изучению низкомолекулярного ингибитора агрегации тромбоцитов плазмы крови человека, ссылки на присутствие которого в крови и влияние на процесс агрегации тромбоцитов приведены в некоторых научных статьях (Bazilinski, 1985) . В качестве объекта для получения ингибитора использован суперна^ант фракции V Кона -один из конечных продуктов, получаемых при промышленном фракционировании плазмы крови человека по Кону. Работа выполнена в рамках НИР НИИ гематологии и пс. вливания крови МЗ Республики Беларусь .■ о теме "Скрининговый поиск и изучение механизмов действия природных коагуляционно-активных соединений" № гос.регистрации 01.8 6.0017589.

Цель исследования. Целью данной работы являлось выделение из супернатанга фракции V Кона ингибитора агрегации тромбоцитов.

изучение его влияния на процесс гемокоагуляции и некоторых основных характеристик. Задачи исследования :

1. С помощью метода гель-хроматографии разработать способ выделения ингибитора агрегации тромбоцитов, используя в качестве источника супернатант фракции V Кона.

2. Изучить следующие характеристики ингибитора агрегации тромбоцитов: молекулярный вес, спектр ультрафиолетового поглощения, химическую природу, влияние на рН крови, механизм влияния на агрегацию тромбоцитов.

3. Изучить влияние выделенного ингибитора на агрегацию тромбоцитов, индуцированную различными агокистами, адгезию тромбоцитов к коллагену, влияние на плазменную коагуляцию.

Научная новизна полученных результатов Б результате проведенных исследований впервые из супернатанта фракции V Кона выделен низкомолекулярный ингибитор агрегации тромбоцитов.

Также зпервые показано дозозависимое влияние данного ингибитора на агрегацию тромбоцитов и отсутствие такового на плазменное звено гемокоагуляции.

Установлено, что выделенный ингибитор имеет пептидную природу и молекулярный вес около 2000Д.

Выяснено, что ингибирующее действие данного субстрата на агрегацию тромбоцитов, опосредуется блокированием ГП ИЬ/Ша на мембране тромбоцитов.

Практическая значимость полученных результатов Результаты проведенного исследования расширяют

существующее представление об одном из естественных ингибиторов агрегации тромбоцитов плазмы крови человека. Разработанный способ выделения ингибитора может быть использован для получения и последующего применения данного регулятора агрегации тромбоцитов.

Экономическая значимость полученных результатов

Возможность использования низкомолекулярного ингибитора в качестве коммерческого продукта может Сыть осуществлена после его дополнительной очистки и Солее углубленного изучения.

Основные положения диссертации выносимые на защиту

1.С помощью метода гель-хроматографии из супернатанта фракции V Хона можно выделить низкомолекулярный ингибитор агрегации тромбоцитов.

2.Низкомолекулярный ингибитор агрегации тромбоцитов, плазмы крови человека, способен вызывать дезагрегацию спонтанно агрегированных тромбоцитов, дозозависимо ингибировать агрегацию тромбоцитов индуцированную АДФ или коллагеном.

3. Низкомолекулярный ингибитор агрегации тромбоцитов не влияет на плазменное звено гемокоагуляции.

4. Низкомолекулярный ингибитор агрегации тромбоцитов является пептидным соединением с молекулярным весом около 2000Д.

5.Механизмом ингиОиторного действия, выделенного ингибитора, является блокада рецепторов ГП Пв/Ша на мембране тромбоцитов.

Личный вклад соискателя Все эксперименты, приведенные в работе, выполнены лично соискателем или с его непосредственным участием. Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на: 4 съезде гематологов и трансфузиологов Белоруссии (Шнек 1988), Всесоюзной школе молодых ученых (Суздаль 1989), ученом совете НИИ гематологии и переливания крови МЗ республики Беларусь (Минск, 1990,1995).

Публикации

По материалам работы опубликовано 6 научных работ.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста. Состоит из оглавления, перечня условных обозначений, введения, общей характеристики работы, 4 глав, выводов, библиографического указателя, который содержит 197 литературных источников.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследования были использованы : супернатант фракции V Кона, периферическая кровь здоровых доноров, экспериментальные животные - крысы самцы породы Вирстар.

Методы исследования:

Аналитическую гель-хроматографию сыворотки крови и супернатанта фракции V Кона производили на колонке 2,0x70,0см, Sephadex G-15, элюат - буфер 0,05М Трис-HCl, 0,14М NaCI, рН 7,4. Препаративную гель-хроматографию супернатанта фракции V Кона производили на колонке 2,7x70,0см, Sephadex G-15. Элюат -дистиллированная вода. Выделенные субфракции подвергали лиофильной сушке на аппарате КС-30 ("Frigera" ЧССР).

Агрегацию тромбоцитов исследовали по методу Борна (Born,1970) на агрегометре БИАН ATI. В качестве индуцеров агрегации {.ъщи использованы ДЦФ в. конечной концентрации 2,5 ыкМ, коллаген в конечной концентрации 0,11 мг/мл. Изучаемый ингибитор исследовали а конечной концентрации 15 мкг/мл, 30 мкг/мл, 60 мкг/мл. Для сравнения в параллельных сериях добавляли в равном объеме физиологический раствор NaCI или 10% раствор реополиглюкина.

Антиагрегационную активность ингибитора изучали инкубируя его в обогащенной тромбоцитами плазме в течении 1 минуты перед добавлением индуцера агрегации, дезагрегационную

активность изучали добавляя ингибитор спустя 1 минуту с начала процесса агрегации тромбоцитов, индуцированного соответствующим индуцером.

В качестве адгез'ионной поверхности бьш выбран ¿ллаген. Коллаген получали из человечесхой плаценты (R.J.Hill,1985), затем иммобилизировали в ячейках микроплаты "Nunc". Тромбоциты метили изотопом Сг"51. Отмывали модифицированным раствором Тироде. После удаления неадгезированных тромбоцитов и однократного промывания ячеек микроплать' раствором Тироде, адгезированные тромбоциты солюбилизировали 1М NaCI, а затем производили замер гамма излучения Сгл51 на счетчике НК дс 107/Ц.

Изучение влияния ингибитора на ' плазменнное звено гемокоагуляции производили на крови здоровых доноров. Согласно общепринятым методикам были выполнены следующие тесты: активированное парциальное тромбопластиновое время, протромбиновое время, тромбиновое время, эуглобулиновый фибринолиз, спонтанный фибринолиэ, ретракция кровяного сгустка .

Исследование в экспериментах in vivo проводили на крысах самцах породы Еирстар массой 180-220г. Внутривенно путем пункции яремных вен вводили в объеме 1,0 мл контрольной группе физиологический раствор NaCI, экспериментальной группе раствор ингибитора 1,0 мг/кг. ЗаОор крови производили через 10 минут после введения препарата. Оценку агрегации производили используя метод Борн (Вогп,1970) по уровню максимальной агрегации индуцированной ДДФ.

Молекулярный вес определяли методом гель-хроматографии на колонке 1,0x70,0 см, Sephadex G-50. Элюцию проводили буфером 0,05М Трис-НСХ, 0,14М NaCI рН 7,4. Калибровку колонки проводили цитохромом С, витамином В12, декстранами с молекулярным весом 5000Д и 12000Д. По данным хроматографии строили график 1дМ-Vr/Vo.

Производили обработку исследуемого ингибитора протеолитическим ферментом прона:. ой Е , который предварительно иммобилизировали с помощью CNBr-Sepharose-4B. Эффективность действия пронаэы оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле обработанных и необработанных ферментом образцов белкового препарата. Электрофорез проводили в прерывистой буферной системе Laemmli в приборе для вертикального электрофореза ("Хийу Калур" СССР). Активность обработанных и необработанных пронаэой Е образцов исследуемого ингибитора, оценивали по степени ингибирования ДДФ индуцированной агрегации тромбоцитов, инкубируя, перед добавлением индучера агрегации в течении 1 минуты в плазме крови богатой тромбоцитами, соответственно обработанные и необработанные пронаэой Е пробы ингибитора.

Изучение влияния ингибитора на- рН крови производили на газовом анализаторе ОР-215 ("RagelJcls" Венгия).

ЖХВД-хроматография изучаемого ингибитора произведена на хроматографе "Весгоап"(США) на колонке "Ultrashere 0DS 4,6x25.

Статистическая обработка данных включала методы вариационноf статистики с определением достоверности по t— критерию Стьюдента-Фишера. Данные в таблицах и рисунках представлены в виде M+ia. Специальные методики, применявшиеся: в ходе выполнения данной pe 'ten, привощйса а соответствующих разделах дассергапии.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сравнительный анализ качественного состава низкомолекулярных соединений сыворотки крови и супернатанта фракции V Кона

В работе для изучения качественного состава низкомолекулярных компонентов сыворотки хр"ви и супернатанта фракции V Кона был использован метод жидкостной гель-хроматографии. В результате были получены пять хромаграфически разделенных пика. На рисунке 1а представлен хроматографический профиль полученный при фракционировании супернатанта фракции V Кона. На рисунке 1С представлены хроматографический профиль полученный при фракционировании сыворотки крови. Хроматографические профили представленные на рис.1 а, О показывают, что состав пула низкомолекулярных соединений сыворотки крови и супернатанта фракции V Кона во многом сходны, т.е. фракционирование крови по схеме Кона существенно не изменяет состав пула низкомолекеулярных соединений плазмы крови. В ходе препаративной гель-хроматографии супернатанта фракции V Кона была выделена субфракция, представленная на рис.2 в виде пика "в", которая как показало тестирование по степени ингибирования АДФ-индуцированноЙ агрегации тромбоцитов, обладала выраженной ингибирующей активностью на агрегацию тромбоцитов.

0,5 А220нм

0,25

70 110 150 190 230

430

Шп

Рис.1а Хроматографический профиль супернатанта фракции V Кона. Колонка 2,0x70,0см, сефадекс 6-15.

Рис.16 Хроматографический профиль сыворотки крови. Колонка 2,0x70,Осм, сефадекс С-15.

• Рис.2 Препаративная гель-хроматография супернаганата фракции V Кона. Колонка 2, 7x70, Ос г, сефадкс в-15.

Изучение влияния, выделенного из супернатанта фракции V Кона ингибитора агрегации тромбоцитов^ на гемокоагуляцию

При проведении экспериментов по изучению влияния выделенного ингибитора на агрегацию тромбоцитов, оыл выявлен

дезагрегационный эффект на спонтанно агрегированные тромбоциты. Результаты проведенных нами экспериментов представлены в таблице 1, из которой видно, что при конечной концетрации изучаемого ингибитора 15 мкг/мл и 30 мкг/мл дезагрегационный эффект был соответственно 9,2+0,81 и 1С,4+2,6%.

Таблица 1

Дезагрегационный эффект субфракции "в" на спонтанно-агре-'ированные тромбоциты

Дезагрегационный эффект субфракции "в" на спонтанно-агрегированные тромбоциты Система проведения эксперимета

плазыа плазма плазма + плазма +

+ + физ. субфракция субфракция

реополи раствор "в" 15ыкг/мл "в" ЗОикг/ил

глюкии ЫаС1

Уровень дезагрегации тромбоцитов % п»9 Р1 Р2 0 0 9,2+0, $ <0,05 <0,05 16,4+2,6 <0,05 <0, ОГ

Примечание:Р1 и Р2 - достоверность различий по сравнению с контролем.

На следующем этапе исследовалось влияние выделенного ингибитора на АДФ- и коллаген-индуцированную агрегации тромбоцитов. В кг гстве коитролей для сравнения нами был использован физиологический раствор ЫаС1 и 10% раствор реополиглюкина, конечна« концентрация которого в пробе была 10 мг/мл. Как видно из таблици 2, в которой представлены полученные результаты ни физиологический раствор, ни реополиглхж н не имоли статистически достоверного

ингибирующего влияния на процесс агрегации тромбоцитов индуцированный АДФ. В то время как исследуемый ингибитор в условиях предварительной инкубации в плазме крови при АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов снижал уровень

максимальной агрегации с 84,11+1,5% до 65,3+3,8% (при

концентрации 15 мкг/мл) и до 19,6+4,5% (при концентрации 30 мкг/мл), со статистически достоверной разницей (р< 0,05) (п-9) .

Как видно из представленной таблицы 2 похожие результаты выли получены и при агрегации тромбоцитов индуцированной коллагеном. Если максимальный уровень агрегации в контроле составил 85,8+3,3%, то уровень агрегации с присутствием ингибитора в дозе 15 мкг/мл составил 52,7+7,1% (р< 0,05, п-9), а при концентрация ингибитора 30 мкг/мл уровень максимальной агрегации был 6,1+4,25% (р<0,05,п»9).

Таблица 2

Уровень максимальной агрегации тромбоцитов в экспериментах с предварителной инкубацией субфракции "в" перед добавлением в плазму крови индуцера агрегации.

Система проведения эксперимента

Вид агрегации плазма без добавок плазма +' физ.р-р плазма + реополигл ю-кин плазма + ингибитор (15 мкг/мл) плазма + ингибитор (30 ыкг/мл)

ДДФ индуцированная агрегация 87,11+ 1.6" 86,+ 2,Г 77,08+ 4,5 55,3+ 3,8 19,6+ 4,5

п-9 Р1 Р2 - >0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Коллаген индуци;о-.ванная агрегация % 85,8+ 3,3 80,1+ 4,4 16,1+ 5,2" 52,7+ 7,1" 6,1+ 4,25

п-9 Я Р2 - >0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Примечание:

Р1-достоверность различий по сравнений) с плазмой вез добавок,

Р2-достоверность различий по сравнению с плазмой + физиологический раствор ЫаС1. ;

В эксперментах с добавлением ингибитора спустя 1 минуту после начала процесса агрегации тромбоцитов, индуцированного коллагеном, получены также статистически достоверные различия. Если контроль составил 85,8+3,3% , то при уровне ингибитора 15 мкг/мл максимальная агрегация бьиа 73,9+5,6% (р<0,05, п—9). а при концентрации ингибитора 30 мкг/мл

максимальная агрегация составила 51,7+9,3% (р<0,05,п=9) (Табл 3) . При агрегацю тромбоцитов, индуцированной ДДФ, уровень максимальной агрегации снижался до 60,9+3,9% (при концентрации 15 мкг/мл) и до 18,5+6,6% (при концентрации 30 мкг/мл), со статистически достоверной разницей (р<0,05)(п=9) (Табл 3).

Таблица 3

Уровень максимальной агрегации тромбоцитов в экспериментах с добавлением исследуемого субстрата через 1 минуту после начала

процесса агрегации тромбоцитов

Вид агрега-ции плазма без добавок плазма + фиэ.р-р плазма + реополи-глюкин плазма + ингибитор (15 ыкг/мл) плазма + ингибитор (30 мкг/мл)

Ш> индуцированная агрегация » п-9 Р1 Р2 87,11+ 1,5" 84,4+ 3,3" 84,2+ 2,6" 60,9+ 3,9" 18,5+ 6,6~

— >0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Коллаген индуцированная агрегация 65,8+ 3,3" 30,4+ 2,4" 86,6+ 4,4" 73,9+ 5,6" 51,7+ 9,3~

п-9 Р1 Р2 — >0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Примечание: Р1- достоверность различий по сравнению с плазмой без добавок,

Р2-достовериостъ различий по сравнению с плазмой + физиологический раствор НаС1.

При изучении влияния исследуемого ингибитора на адгезию тромбоцитов к коллагену было установлено, . что исследуемый ингибитор обладает умеренно выраженным ингибируотим действием на процесс адгезии тромбоцитов к коллагену. Если гамма сче-гчик зафиксировал в контроле уровень радиактивкости равный М+в 1977+67,7 (п»27), то при добавлении ингибитор- в конечной концентрации 30 мкг/мл уровень радиактивности составил 1649+84,55 {п-27). <р<0,05). В представленной системе эксперимента степень ингибирования адгезии тромбоцитов к коллатену составляет 17%.

При изучении влияния исследуемого ингибитора на плазменное звено гемокоагуляиии (Табл. 4) установлено что, добавление ингибитора в плазму крови не вызывало изменений в

процессе протромбиназообразования , тромбинообраэования, а также что ингибитор не обладает антикоагулянтными свойствами и не влияет на процесс фибринолиза.

Таблица 4

Изучение влияния исследуемого ингибитора на плазменную

коагуляцию

коагуляционныа тесты плазма + ингибитор плазма + фиэ. раствор

АПТВ, (сек) п=9 Р 42 ,6 + 1,07 >0,05 42,8 + 1,1

Протромбиновое время (сек) п=Э Р 16,5 +0,18 >0,05 16,7 +0,21

ТромСиновое время (сек) п=9 Р 14,18 + 0,21 >0,05 14,2 + 0,2

Ретракция кровяного сгустка (%) , п-9 Р 60,3 + 3,1 >0,05 62,1 +2,2

Спонтанный фибринолиз (%) п-9 Р 14,2 +0,22 >0,05 14,15 + 0,18

Эуглобулиновый фибринолиз (мин) П-9 р 192 +7,а >0,05 194 + 7,8

Примечание: Р - достоверность различий по сравнению с контролем (физиологическим раствором NaCl)

Эксперименты in vivo Оали выполнены на 12 белых крысах самцах кассой 180-220г. (6 животных а опытной серии, б - в контрольной), Результаты представлены на рисунке 3 Уровень максимальной агрегации тромбоцитов в контрольной группе (М+т) был 49,5+3,7%,а а опытной группе соответственно 27,1+3,7%. Данное различие максимальной агрегации тромбоцитов является статистически достоверным (р<0,05), что указывает на высокую активность ингибитора в экспгг-гдовтах in vivo.

Уроммь пчх »фегации %

Рисунок 4 Изучение влияния субфракции "в" на агрегацию тромбоцитов in vivo .

Итак, выполненные эксперименты показали, что выделенный из супернатанта фракции V Кона ингибитор оказывает дезагрегирующее действие на спонтанно агрегированные тромбоциты, дозозависимо ингибирует АДФ- и коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов, оказывает умеренно ингибирующее действие на адгезию тромбоцитов к коллагену, не влияет на плазменное звено гемокоагуляции.

Изучение некоторых основных • характеристик ингибитора агрегации тромбоцитов, выделенного из супернатанта фракции V Кона

Спектр поглощения в ультрафиолетовой (УФ) области представляет интерес с точки зрения химической структуры соединения. В нашей работе спектр был снят с помощью . спектрофотометра СФ-26 (СССР) в диапазоне от 210 до 300 нм. Максимум светопоглощения изучаемого ингибитора приходится на 210 нм. Данный профиль характерен для соединений пептидной прчроды.

Для подтверждения предположения о пептидной природе исследуемого ингибитора мы подвергли его обработке

протеолитическим ферментом проназой Е, после чего проверили антиагрегационную активность. В эксперименте по влиянию на агрегацию тромбоцитов изучаемый ингибитор исследовался в конечной концентрации 60 мкг/мл. Обработка проназой Е приводила к значительному снижению ингибиторной активности на процесс агрегации тромбоцитов индуцированный АДФ (Табл. 5).

Таблица 5

Изучения влияния на агрегацию тромбоцитов, обработанных и необработанных проназой Е проб субфракции "а" (М+то1

Система проведения эксперимента

Плазма + буфер М+га Плазма + буфер' М+т Плазма+ необработанный Проназой ингибитор Плазма + обработанный проназой ингибитор

Уровень максимальной агрегации ВДФ 2,5 мкМ 82,8+ 1,5 80,8+ 1,5 0 54+2,3

Р п-6 >0,05 <0,05 <0,С^

Р - достоверность различий по отношению к контролю

буфер - Трис-НС1 0,05М, 0,14М ИаС1, рН 7,4

буфер' - Трис-НС1 0,05М, 0,14М ЯаС1, рН 7,4(из флакона с проназой).

Молекулярный вес был определен методом гель-

хроматографии. На основании данных калибровочных разгонок соединениями с известным молекулярным весом был построен график 1дМ-Ч/г/Уо. Искомый 1дМ составляет 3,3, что соответствует молекулярному весу примерно 2000Д.

Фракционирование с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления было произведено с целью изучения однородност состава ингибитора, выделенного из супернатанта фракции V Кона. Хроматографический профиль изучаемого ингибитора , полученный с помощью ЖХВД, состоит из трех пиков, близких по молекулярному весу настолько, что превышает разрешающие возможности метода гель-хроматографии. Преобладающим, в представленном хроматографическом профиле,

является пик 3, который более чем в 2 раза преобладает над пиками 1 и 2 в совокупности.

Известно, что одним из факторов, влиющих на процесс агрегации тромбоцитов, является рН среды в которой происходит процесс агрегации. После добавления в кровь физиологического раствора рН s контрольной группе составляла (M+raj 7,559+0,0005 (п=9), а в группе с добавлением ингибитора (30 мкг/мл) соответственно 7,555+0,0007 (п=9),данная разница не является статистически достоверной (р>0,05). Таким образом, проведенные в работе эксперименты не выявили влияния ингибитора на рН крови.

Как известно при воздействии высоких доз АДФ, агрегацию тромбоцитов можно Стокировать только с помощью блокады рецепторов отвечающих за процесс агрегации тромбоцитов т.е. ГП IIs/HIa (Coller, 1990) . С целью выяснения механизма ингибиторного действия изучаемого субстрата мы инкубировали в плазме крови обогащенной троОоцитами в течении 1 минуты исследуемый ингибитор агрегации тромбоцитов в конечной концентрации 60 мкг/мл, а затем добавляли 'АДФ в конечной концентрации 20 мкМ, которой достаточно для инициации процесса агрегации тромбоцитов при полном блоке пути метаболизма арахидоновой кислоты (Coller,1990). Эффект исследуемого ингибитора на процесс агрегации тромб цитов в данном эксперименте аналогичен эффекту, производимому моноклональными антителами к рецепторам, ответственным за агрегацию тромбоцитов (ГП Пв/Ша) т.е. исследуемый ин!лбитор полностью блокирует агрегацию тромбоцитов, уровень максимальной агрегации равен 0%, в то время как без добавления ингибитора агрегации тромбоцитов уровень максимальной .агрегации тромбоцитов равен 100% (п=6, р<-0,05).

Итак, проведенные исследования показали, что с помощью метода гель-хроматографии из супернатанта фракции V Кона можно выделить ингибитор агрегации тромбоцитов с молекулярным весом примерно 2000Д, пептидной природы. Выделенный ингибитор обладает выраженной способностью вызывать дезагрегацию спонтанно индуцированных тромбоцитов, дозозависимо препятствовать агрегации тромбоцитов индуцированной АДФ и коллагеном. Способность бл9кировать агрегацию тромбоцитов при

индукции свервысокой дозой АДФ (20мкМ) говорит, что механизмом действия выделенного ингибитора является блокада ГП Ив/Ша на мембране тромбоцитов. Метод ЖХВД позволяет улучшить результаты фракционирования супернатанта фракции V Кона.

ВЫВОДЫ •

1. В составе супернатанта фракции V Кона присутствует низкомолекулярный фактор, ингибирующий агрегацию тромбоцитов.

2. Разработана схема 2-стадийной очистки, с помощью которой из супернатанта фракции V Кона выделена субфракция, обладающая способностью иигибировать агрегацию тромбоцитов.

3. Молекулярная масса ингибитора агрегации тромбоцитов составляет примерно 2000 Д.

4. Данный ингибитор обладает выраженной активностью в отношении АДФ- и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов. Ингибитор способствует не только предотвращению процесса агрегации тромбоцитов, но и обладает активностью по отношению к уже агрегированным тромбоцитам, как спонтанно агрегированным , так и вступившим в агрегацию под действием АДФ или коллагена.

5. Механизмом антиагрегационной активности данного ингибитора является блокада ГП Пв/Ша на меибраке тромбоцитов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Роль молекул средней массы в формировании гемостатического потенциала крови/ Сятковский 0.А.,Василенко Л.П., Змачинский В.А. и др. // Актуальные проблемы гемомаэа в клинической практике: Тез. докл.конф. - Москва, l'ee"?»» C.S1

2. Сятковский В.А., Змачинский В.А., КИМ О.Й. Биологическая активность компонентов среднемолекулярной фрахдаи сыворотки крови 1 / К .териалы IV республика некого съезда гематологов и трансфузиологов БССР. Тез.докл.- Минск,1988.- С.56

3. Гемостатический потенциал и динамика накопления молекул средней массы в консервированной , крови/ Василенко Л; П .> Сятковский В. А., Змачинский В.А.,Ким О.И. // II республиканская научно-практическая конференция научного

общества гематологов и трансфузиологов Литовской ССР. Тез.докл.

- 1988.- С.76.

4. Роль молекул средней массы в изменении гемостатического потенциала и процессе микросгусгхообразования в хранимой крови / Сятковский В.Л.,Василенко Л.П.»Змачинский В.А. и др.// II республиканская научно-практическая конференция научного общества гематологов и трансфузиологов Литовской ССР. Тез.докл.

- 1988,- С.81.

5. Влияние молекул средней массы на механизмы гемокоагуляции / Сятковский В.А.,Змачинский В.А., Василенко Л.П.,Ким О.И. // Гематология и трансфузиология.- 1989,Вб.- С.45-48.

6. Змачинский В.А. Плазменный ингибитор агрегации тромбоцитов // Зрав.Вел. - 1993,№4. - С.26-28.

Автор выражает сердечную благодарность:

дмн В.А.Сятковскому - за выбор темы диссертации и помощь в неоднократных обсуждениях. Автор считает В.А.Сятковского вторым руководителем диссертации;

кмн Л.П.Василенко, кмн Л.А.Азаровой, О.И.Ким, кмн С.В.Шелегу -за помощь в проведении экспериментов;

кмн В.Н.Гапановичу - за помощь в неоднократных обсуждениях.

17

РЕЗЮМЕ

Змачинский Владимир Арнольдович Плаамешшй ингибитор агрегации тромбоцитов Ключевые слова: пептиды плазмы крови, ингибитор агрегации тромбоцитов.

В эксперименте с использованием гель-хроматографии на колонке с Sephadex G-15, была разработана 2-х стадийна- схема выделения из супернатанта фракции V Кона компонента, ингибирующего агрегацию тромбоцитов. В 384 экспериментах in vitro и на 12 лабораторных животных изучено влияние выделенного ингибитора на тромбоцитарное и плазменное звенья гемокоагуляции и его основные характеристики.

Установлено, что выделенный ингибитор имеет пептидную природу и молекулярный вес около 2000Д. Показано дозозависимое влияние выделенного ингибитора на АДФ и коллаген

индуцированную агрегацию тромбоцитов. Дезагрегационный эффект на спонтанно агрегированные тромбоциты проявляется при внесении раствора исследуемого ингибитора в обогащенную тромбоцитами плазму крови, кроме того дезагрегационное действие ..роявляется при внесении ингибитора в плазму крови спустя 1 минуту после начала процесса агрегации тромбоцитов, индуцированного АДФ или коллагеном, а также в экспериментах с предварительной инкубацией ингибитора в плазме крови перед внесением АДФ или коллагена. Антиагрегационная активность исследуемого ингибитора сохраняется и в экспериментах in vivo. Изучено влияние

выделенного ингибитора на адгезию тромбоцитов к коллагену, плазменное звено гемокоагуляции. Показг::о, что механизмом действия выделенного ингибитора является блокада ГП Ilb/IIIa на мембране тромбоцитов.

Предложенный метод выделения низкомолекулчрного ингибитора агрегации тромбоцитов может служить базовым для будущей работы по разработке технологического регламента получения

естественного ингибитора агрегации тромбоцитов из плазмы крови доноров.

IS

РЭЗЮМЭ

Змачынска Уладз1м1р Арнольдаь1ч Плазмакы inri6iTap агрэгацьи трамбацьггay Ключавыя словы: пяпц!ды плазмы крыв!, 1нг1б1тар агрэгацы1 трамбацытау.

. У эксперыменце з ужываннем гель-храматаграфИ на калонце з Sephadex G-1S, разпрацована 2-х стадийная схема выдзяления з супярнатанта фракцы! V Кона кампанента, 1нг101руючага агрэгацьпо трамбацытау. У 384 экспериментах in vitro i на 12 лабараторных жывелхнах вывучана уплыванне вьщэяленнага iHriOiTapa на трамбацытарнае i плазь' ннае звення гемакаагуляцьа i яго асноуныя характэрыстык!.

Вызначана, што выдзялены 1нг1б1тар мае пяпц1дную прыроду i малекулярнаю вагу каля 2000Д. Пакаэана дозазав!с1мае уплыванне вьщэяленнага iarieiTapa на АДФ и калаген 1ндуцыраванную агрэгацыю трамбацытау. Дезагрэгацыйны эфект на спантанна агрэгхраваныя трамОацыты праяуляецца пры унясенн! раствора даследуемага iHri6iTapa у аОагашчонную трамбацытам1 плазму крыва, акрамя таго дэзагрэгацыйнае дзеянне праяуляецца пры унясенн! iari6iTapa у плазму Kpuai праз 1 ха!л1ну пасля пачатку працэса агрэгацы! трамбацытау, 1ндуцыраваннага АДФ ц! калагенам, а таксама у экспериментах с папярэдняй ¿нкубацыяй iHriCiTipa у плазме крыв! перад унясеннем АДФ ui кат гена. Антыагрэгацыйная актыунасць даследуемага iHri6irapa эахаваецца i у экспэрыментах in vi\ . Вывучана уплыванне выдзяленнага iHri6iTapa на адгез!ю трамбацытау к калагену, плазменнае эвяно гемакаагулящЛ. Пакаэана, што механ!змам дзеяння выдзяленнага iHri6iTapa з'яуляецца блакада ГП Ilb/XIIa на мя :бране трамбацытау.

Прапанавакы метад выдзяления н i з камале кулярка га 1уг1б1тара агрэгацыа трамбацытау моха быть базавым для будучай работы па падрыхтоуцы тэхналаг!чнага рэгламенту атрымання нагуральнага inriflirapa агрэгацыа трамбацытау з плазмы Kpuni донарау.

19

Abstract Zmatchinski Vladimir Platelets aggregation inhibitor of blood plasma Key words: aggregation, platelets, peptide, inhibitor.

Double stage method using gel-chromatography suggested to receive of the component which inhibit of platelets aggregation from supernatant Kone fraction V. to influence of this inhibitor on coagulation and its main characteristics was studded in 384 experiments in vitro and in experiments on 12 lab animals.

It was determined that this inhibitor has peptide nature with molecular weigh about 2000. It was shown dose dependent influence of the inhibitor on ADP and collagen' stimulated platelets aggregation. Desegregation activity of the inhibitor showed in rich platelets blood plasma and after 1 min of ADP or" collagen aggregation beginning and in experiments with preliminary incubation in blood plasma of the inhibitor before introduction of ADP or collagen. Antiagregant activity of the inhibitor is determined in vivo as well. It was determined that mechanism of action of inhibitor is GP Ilb/IIIa receptors block on platelet's membrane.

Suggested method of receiving of the inhibitor can be use as a base of future work connected with development of technology of obtaining of low molecular weigh inhibitor of platelets aggregation.