Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние производных 6Н-1,3,4-тиадиазинов на агрегационную способность тромбоцитов и некоторые параметры плазменного гемостаза

На правах рукописи

Логвинова Юлия Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 6Н-1,Э,4-ТИАДИАЗИНОВ НА АГРЕГАЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ ТРОМБОЦИТОВ И НЕКОТОРЫЕ ПАРАМЕТРЫ ПЛАЗМЕННОГО ГЕМОСТАЗА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г я ноя гон

Москва-2013

00554022/

005540222

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении

«Гематологический научный центр» Министерства Здравоохранения России (ФГБУ ГНЦ Минздрава России)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией фармакологии цереброваскулярных расстройств ФГБУ "НИИ фармакологии имени В.В.Закусова" РАМН

Доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН,

заведующий кафедрой молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России

Макаров Владимир Александрович

Мирзоян Рубен Симонович

Шимановский Николай Львович

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России

Защита диссертации состоится »^¿¿({¿у^'Ю 13 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН, по адресу 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

Автореферат разослан « ^ » ^р.Г-^ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Агрегация тромбоцитов является важным звеном в физиологии и патологии человека. Агрегированные и адгезированные к сосудистой стенке тромбоциты служат основой для формирования тромба при повреждении сосуда. В то же время агрегация тромбоцитов является важным этиологическим моментом в патогенезе нарушений кровообращения. Это играет ведущую роль в возникновении сердечно-сосудистых заболеваний (нарушений коронарного и мозгового кровообращения, патологии сосудов конечностей, брюшной полости и др.), в развитии тромбозов после хирургических операций, при нарушении кровообращения на фоне травм и др (Козинец и др. 1997, Панченко и др. 1999, Fukuoka et al. 2011).

В связи с изложенным, поиск средств, тормозящих агрегацию тромбоцитов, является важной проблемой современной медицины. Разработка эффективных антиагрегантов позволит значительно улучшить лечение инфаркта миокарда, тромботического инсульта (данные заболевания являются ведущей причиной смертности в развитых странах), тромбозов конечностей, послеоперационных тромбозов, нарушений кровообращения глаз и др (Fukuoka et al. 2011, Greenhalgh et al. 2010).

Существует ряд соединений, обладающих антиагрегационным эффектом. Тем не менее, реальный выбор препаратов ограничен сложностями, возникающими при употреблении различных антиагрегантов. Основными проблемами являются низкая избирательность некоторых из них, неоднозначность влияния на способность тромбоцитов к агрегации и антиагрегационную активность стенки сосуда, а также ограничения, обусловленные низкой стабильностью при хранении (Varón et al. 2009).

В мире активно разрабатываются антиагреганты нового поколения, обладающие высокой эффективностью и избирательностью действия, и способы их целенаправленного химического синтеза.

В последнее время интерес привлекает новый класс веществ, принадлежащих к группе тиадиазинов. Соединения, принадлежащие к классу тиадиазинов, обладают широким спектром фармакологического действия, которое определяется различными радикалами, включенными в структуру этих веществ (Aaron et al. 2009, Almajan et al. 2010, Bhat et al. 2009, Campillo et al. 1999, El Shehry et al. 2010, Liu et al. 2006) . В отдельных работах показано эффективное антитромботическое действие тиадиазинов как in vitro, так и in vivo (Martinez et al. 1999, Rehse et al. 1998, Scarborough et al. 2001).

Таким образом, работы, специально посвященные изучению фармакологии подобных веществ, являются одними из наиболее перспективных направлений для создания новых противотромботических средств. Однако к настоящему времени влияние этих субстанций на функциональную активность тромбоцитов исследовано недостаточно.

На кафедре органической химии Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н. Ельцина разработана оригинальная методика синтеза 1,3,4-тиадиазинов, позволяющая получать принципиально новые соединения этого класса (Сидорова и др. 2006). Исследование влияния данных веществ на тромбоцитарную агрегацию ранее не проводилось.

Результаты исследований, изложенные в работе, могут способствовать выяснению связи между химической структурой синтезированных 1,3,4-тиадиазинов и характером и силой их воздействия на тромбоцитарную агрегацию. Чрезвычайно важным представляется выявление веществ, которые обладают наиболее сильным антиагрегационным эффектом с целью создания на их основе новых отечественных лекарственных препаратов, регулирующих способность тромбоцитов к агрегации.

Цель работы.

Целью данного исследования явилось выявление соединений, обладающих наиболее выраженным антиагрегационным действием, среди новых оригинальных 2-циклоалкиламинозамещенных 1,3,4-тиадиазинов, некоторых представителей класса пиразолов и тиазолов.

Задачи работы.

1. Изучение влияния новых оригинальных 2-циклоалкиламинозамещенных 1,3,4-тиадиазинов на агрегационную способность тромбоцитов в экспериментах in vitro. Выявление взаимосвязи «химическая структура соединений - антиагрегационное действие».

2. Исследование влияния предполагаемых метаболитов некоторых 1,3,4-тиадиазинов (класса пиразолов) на агрегацию тромбоцитов в опытах ш vitro.

3. Изучение наиболее активных 1,3,4-тиадиазинов на агрегацию тромбоцитов кроликов в экспериментах ex vivo. Выявление взаимосвязи «химическая структура соединений - антиагрегационное действие».

4. Изучение действия наиболее активных 1,3,4-тиадиазинов на показатели плазменного гемостаза.

5. Предполагаемая оптимизация химической структуры 1,3,4-тиадиазинов для улучшения антиагрегационных свойств веществ.

6. Исследование антиагрегационной активности представителей класса тиазолов в экспериментах in vitro.

Научная новизна исследования и теоретическая значимость работы.

В работе впервые установлено наличие антиагрегационного эффекта у новых оригинальных 2-циклоалкиламинозамещенных 1,3,4-тиадиазинов. Выявлена антиагрегационная активность некоторых предполагаемых метаболитов 1,3,4-тиадиазинов, относящихся к классу пиразолов.

В работе впервые изучено влияние наиболее активных оригинальных 2-циклоалкиламинозамещенных 1,3,4-тиадиазинов на агрегационную способность тромбоцитов кроликов в экспериментах ex vivo и показатели плазменного гемостаза.

Проведен сравнительный анализ эффектов новых 2-циклоалкиламинозамещенных 1,3,4-тиадиазинов и препаратов сравнения (ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля).

Показана взаимосвязь между химической структурой соединений и их антиагрегационной активностью. Также предложена оптимизация структуры 1,3,4-тиадиазинов для улучшения их ингибирующих свойств.

Впервые исследована антиагрегационная активность представителей класса тиазолов в экспериментах in vitro и показана взаимосвязь между их химической структурой и способностью ингибировать агрегацию тромбоцитов.

Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований выявлены новые перспективные представители класса 2-циклоалкиламинозамещенных 1,3,4-тиадиазинов, обладающие наиболее выраженным ингибирующим влиянием на агрегационную способность тромбоцитов. Данные соединения могут быть использованы в качестве основы для создания новых лекарственных препаратов, ингибирующих тромбоцитарную агрегацию.

Апробация работы.

Основные результаты и положения диссертации были представлены на: научно-практической конференции «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению», Москва 2009 г.; на Научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики и лечения венозных и артериальных тромбозов», Санкт-Петербург 2010 г.; на III Сибирской научно-практической конференции гематологов «Баркагановские чтения», Барнаул 2010 г.; на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва 2010 г.; на конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», Санкт-Петербург 2010 г.; на IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии», Казань 2012 г.

Публикации.

Основные положения и результаты работы отражены в 9 научных работах, в том числе: 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций, 6 тезисов - в материалах российских и международных конференций и симпозиумов.

Личный вклад соискателя.

Автор самостоятельно выполняла анализ современной литературы по теме исследования, проводила необходимые эксперименты, получала и анализировала результаты, проводила статистическую обработку полученных данных и формулировала выводы. По результатам работы при непосредственном участии автора подготовлены публикации.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа объемом 184 страницы машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов,

результатов собственных исследований, заключения, выводов и библиографического списка использованной литературы, включающего 170 источников, из них 40 отечественных и 130 зарубежных. Работа содержит 64 таблицы и 30 рисунков.

Положения, выносимые на защиту.

1. Изученные новые оригинальные соединения класса 1,3,4-тиадиазинов оказывают антиагрегационное действие в экспериментах in vitro. Наиболее активно ингибируют тромбоцитарную агрегацию вещества, содержащие остаток морфолина во 2-ом положении тиадиазинового и 4-хлорфенил и остаток остаток тиофена в 5-ом положении.

2. Предполагаемые метаболиты тиадиазинов, принадлежащие к классу пиразолов, обладают незначительным антиагрегационным эффектом.

3. В экспериментах на кроликах ex vivo одними из самых сильных ингибиторов агрегации тромбоцитов являются морфолинсодержащие тиадиазины с тиенилом-3 в 5-ом положении тиадиазинового кольца.

4. Наиболее активные тиадиазины не оказывают выраженного действия на показатели плазменного гемостаза.

5. Оптимальными заместителями во 2-ом положении тиадиазиновго кольца являются остатки морфолина и тиоморфолина, а 5-ом положении -тиенил-3 и этоксифенил.

6. Среди тиазолов наилучшими антиагрегационным свойствами обладает соединение с остатком морфолина во 2-ом положении и этоксифенилом в 4-ом положении тиазольного кольца.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Эксперименты по изучению влияния 1,3,4-тиадиазинов и их производных на функциональную активность тромбоцитов in vitro проводились на венозной

крови здоровых доноров. Объектом исследования являлась богатая тромбоцитами плазма (PRP). В качестве контроля использовалась бедная тромбоцитами плазма (РРР) (Самаль и др. 1990).

В экспериментах по изучению влияния некоторых 1,3,4-тиадиазинов на агрегацию тромбоцитов ex vivo и параметры плазменного гемостаза использовали кроликов массой 3,0-4,6 кг. Кровь для исследования собирали методом свободного падения капель.

Исследуемые вещества в различных дозах вводили в центральную вену уха, либо перорально. В качестве растворителя использовали стерильный физиологический раствор (при внутривенном введении) или дистилированную воду (при пероральном введении). Пробы крови забирали до введения вещества (использовали как контроль), через 1 час, 2 часа, 3 часа и 4 часа после введения.

Агрегацию тромбоцитов изучали методом светорассеяния, предложенным G. Born на агрегометрах фирмы "CHRONO-LOG CORPORATION" (США) и "BIOLA" (Россия) (Born G. 1962). О степени агрегации судили по максимальной величине падения оптической плотности после окончания реакции (Атах) по сравнению с исходной величиной. В качестве проагрегантов использовали АДФ (Boehringer Mannheim, Австрия) в конечных концентрациях lxlO"5 М и арахидоновую кислоту в конечной концентрации lxl О"3 М. Арахидоновая кислота (АК), свободная от продуктов окисления, была предоставлена сотрудниками лаборатории оксилипинов (зав. -д.х.н. В.В.Безуглов) Института биоорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН.

Для оценки функционального состояния плазменного звена системы гемостаза было проведено определение числа тромбоцитов по методу, предложенному B.Walkowiak (Walkowiak et al. 1989) на спектрофотометре фирмы «Аквилон». Для этого образец богатой тромбоцитами плазмы разводили в 10 раз 0,01 М фосфатным буфером, содержащим 0,14 М NaCl (рН=7,3) и

измеряли оптическую плотность в пластиковых кюветах при длине волны 800 нм против разведенной таким же образом бедной тромбоцитами плазмы. Исходное число тромбоцитов (контрольный опыт) было принято за 100%.

Определение активированного частичного времени проводили с использованием набора «АЧТВ-тест» («Технология-Стандарт», Россия). Оценка протромбинового времени осуществлялась по методу A.J.J. Quick (Quick 1935) с использованием набора «Техпластин-тест» («Технология-Стандарт», Россия). Тромбиновое время и концентрацию фибриногена по Clauss (Clauss, 1957) измеряли с использованием наборов «Тромбо-тест» и «Тех-фибриноген-тест» («Технология-Стандарт», Россия) соответственно. Все измерения проводились на коагулометре «Минилаб-701М» («Юнимед», Россия).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистической программы «Microsoft Excel».

Гетероциклические соединения класса 1,3,4-тиадиазинов и их производные были синтезированы сотрудниками кафедры органической химии Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н. Ельцина под руководством академика О.Н. Чупахина. Всего было исследовано 71 соединение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все исследованные соединения были разделены на 3 класса: тиадиазины (разделенные на 5 подгрупп в зависимости от заместителя в 5-ом положении тиадиазинового кольца), тиазолы и пиразолы.

На первом этапе работы нами была исследована антиагрегационная способность веществ и некоторых их предполагаемых метаболитов в экспериментах in vitro при использовании в качестве проагрегантов АДФ (1x10" 5 М) и арахидоновой кислоты (1x10° М). Наиболее активные в опытах in vitro соединения были изучены во второй части работы на кроликах в экспериментах

ex vivo. Антиагрегационная способность исследуемых тиадиазинов в исследованиях in vitro и ex vivo и их влияние на параметры гемостаза сравнивались с таковыми при применении известных лекарственных препаратов (ацетилсалициловая кислота («Аспирин» Байер Битгерфельд, Швейцария) и клопидогрель («Плавике» Санофи Винтроп Индустрия, Франция)). По полученным результатам выявлялись наиболее активные соединения, обладающие выраженными антиагрегационными свойствами.

В экспериментах на донорской плазме ацетилсалициловая кислота и клопидогрель во всех исследуемых концентрациях приблизительно в равной степени снижали агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ. В максимальной исследованной концентрации 1,0 шМ тромбоцитарное взаимодействие падало в 1,6-1,8 раза относительно контрольных значений. Отсутствие выраженного антиагрегационного эффекта у клопидогреля в опытах in vitro можно объяснить отсутствием активного метаболита, который образуется в организме в печени. В случае АК-индуцированной агрегации наиболее активно проявила себя ацетилсалициловая кислота, полностью блокируя клеточное взаимодействие в диапазоне концентраций 1,0 шМ - 0,05 шМ. В то время как клопидогрель ингибировал агрегацию тромбоцитов, индуцированную АК, лишь в 1,7 раза в максимальной исследованной концентрации 1,0 шМ.

Данные препараты сравнения были исследованы на кроликах в экспериментах ex vivo при внутривенном введении в дозах 10 мг/кг и 20 мг/кг и при пероральном введении в дозе 100 мг/кг.

Внутривенное введение ацетилсалициловой кислоты в дозах 10 мг/кг и 20 мг/кг и пероральное введение в дозе 100 мг/кг приводило к полному ингибированию только АК-индуцированной агрегации тромбоцитов. Взаимодействие тромбоцитов, индуцированное АДФ, не изменялось во всех временных интервалах взятия крови. Среди параметров гемостаза изменялось

только АЧТВ (снижалось в 1,5 раза спустя 240 минут после введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 10 мг/кг).

При внутривенном введении клопидогреля в дозе 10 мг/кг максимальный антиагрегационный эффект наблюдался через 3 часа (АДФ-индуцированное тромбоцитарное взаимодействие снижалось в 2,3 раза относительно контроля). При использовании в качестве индуктора АК способность тромбоцитов к агрегации падала на 120 и 180 минутах в 1,4 и в 1,2 раза соответственно. При этом тромбиновое время удлинялось в 1,3 раза на 120-240 минутах. Остальные параметры не изменялись.

При введении клопидогреля внутривенно в дозе 20 мг/кг и перорально в дозе 100 мг/кг наблюдалось снижение агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ. Максимальный антиагрегационный эффект был на 180 минуте эксперимента. Достоверное удлинение тромбинового времени в среднем в 1,2 раза происходило во временном интервале 120-240 минут при пероральном введении клопидогреля в дозе 100 мг/кг. Остальные параметры гемостаза достоверно не изменялись.

Как и следовало ожидать, ацетилсалициловая кислота как в экспериментах in vitro, так и в экспериментах ex vivo эффективнее ингибировала АК-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Клопидогрель же в опытах ex vivo больше действовал на тромбоцитарное взаимодействие, индуцированное АДФ.

Влияние класса тиадиазинов на агрегацию тромбоцитов in vitro и ex

vivo.

Наиболее активными тиадиазинами, содержащими в 5-ом положении тиадиазинового кольца фенильные радикалы, в случае АДФ-индуцированной агрегации оказались соединения с остатком гексаметиленимина (L-52, L-59) и остатком морфолина (L-58) во 2-ом положении тиадиазинового кольца (тромбоцитарная агрегация снижалась на 50% в концентрации препаратов 1,0

шМ). Тиоморфолиновый тиадиазин L-36 показал выраженную активность в случае АК-индуцированной агрегации тромбоцитов (максимальный натиагрегационный эффект наблюдался в концентрации 0,025 шМ, при этом тромбоцитарное взаимодействием снижалось в 2,1 раза). Замещение данных радикалов на другие не приводило к более сильному антиагрегацио иному эффекту. Несмотря на наличие антиагрегационных свойств вещества L-17 в экспериментах in vitro (максимальное снижение взаимодействия клеток в 1,6 раза происходило в концентрации 1,0 шМ), в испытаниях на кроликах данный тиадиазин не показал ожидаемых результатов (при внутривенном введении в дозе 80 мг/кг и пероральном введении в дозе 100 мг/кг).

Наиболее активные соединения, с 4'-гидроксифенилами в 5-ом положении тиадиазинового кольца, содержали остатки пирролидина (L-77) и морфолина (L-20). При индукции АДФ тромбоцитарное взаимодействие падало в 2 раза в конечной концентрации 0,5 шМ (L-77) и в 1,7 раза в концентрации 1,0 гпМ (L-20). В случае АК-индуцированной агрегации наиболее выраженное действие показал морфолинсодержащий тиадиазин L-20.

При внутривенном введении L-20 в дозе 20 мг/кг агрегация тромбоцитов не изменялась.

Тиадиазины, содержащие дигидроксифенилы, проявили выраженные антиагрегационные свойства только при наличии во 2-ом положении тиадиазинового кольца остатка мофролина, а в 5-ом положении тиадиазинового кольца - З'.б'-дигидроксифенила (А-38). В конечной концентрации 1,0 шМ А-38 достоверно снижал АДФ-индуцированную агрегацию в 2,7 раза. Полное блокирование АК-индуцированного тромбоцитарного взаимодействия наблюдалось при использовании А-38 в концентрациях 1,0 - 0,1 шМ. Оптимальный достоверный антиагрегационный эффект тиадиазина А-38 наблюдался в концентрации 0,05 шМ. Наличие ОН-групп в других положениях фенила (3',4-дигидроксифенилы и 2',5-дигидроксифенилы) не усиливали

антиагрегационного действия соединений. Введение тригидроксифенила в 5-ом положении (А-46) также не способствовало существенному усилению эффекта.

При изучении антиагрегационного действия А-38 ex vivo, ингибирование АДФ-индуцированной и АК-индуцированной агрегации наблюдалось только при внутривенном введении больших доз препарата (80 мг/кг). Однако падение тромбоцитарного взаимодействия было незначительным (в среднем в 1,2 раза относительно контроля).

В случае галогенсодержащих тиадиазинов наибольшую активность проявило соединение, имеющее в своем составе 4-хлорфенил в 5-ом положении тиадиазинового кольца и остаток морфолина во 2-ом положении (L-19). Оптимальный антиагрегационный эффект наблюдался в конечной концентрации 1,0 шМ. АДФ-индуцированное взаимодействие клеток падало в 1,7 раза, АК-индуцированное - в 2,3 раза относительно контроля. Замещение атома хлора на атом брома (Н-18) или фтора (L-31, L-91) не вызывали выраженного антиагрегационного действия. Замена остатка морфолина на остатки пирролидина (L-37) и морфолинпропиламина (L-87) также не способствовало улучшению свойств антиагреганов. В экспериментах на кроликах ex vivo незначительное падение как АДФ-индуцированной, так и АК-индуцированной агрегации наблюдалось только при внутривенном введении L-19 в дозе 20 мг/кг. Пероральное введение вещества в дозе 100 мг/кг, как и внутривенное введение в дозе 10 мг/кг, не приводило к достоверным изменениям агрегации и параметров гемостаза.

Среди веществ, содержащих метокси- и этоксифенилы, наиболее активным в экспериментах in vitro было Н-69 с остатком морфолина во 2-ом положении тиадиазинового кольца и этоксифенилом в 5-ом положении. При индукции агрегации тромбоцитов АДФ максимальный эффект был зафиксирован в конечной концентрации 1,0 шМ, при этом тромбоцитарное взаимодействие падало в 2 раза. В случае АК-индуцированной агрегации

снижение способности клеток к взаимодействию в 2 раза наблюдалось при действии Н-69 в конечной концентрации 1,0 шМ.

Тиадиазин Н-48, не проявивший выраженного антиагрегационного действия in vitro, был исследован на кроликах при внутривенном введении в дозе 30 мг/кг и показал ингибирующее агрегацию тромбоцитов действие. Агрегация тромбоцитов снижалась на 180 минуте опыта. При этом АДФ-индуцированная агрегация падала в 1,4 раза относительно контрольных результатов, а АК-индуцированная - в 1,5 раза. Незначительные изменения параметров гемостаза было только у тромбинового времени. Удлинение тромбинового времени происходило спустя 120 и 180 минут после введения. При этом значения увеличивались в 1,1 и в 1,4 раза соответственно. Вместо остатка морфолина Н-48 содержит остаток тиоморфолина.

3 тиадиазина, содержащие метилфенилы, в случае АДФ-индуцированной агрегации показали схожие результаты. Максимальный эффект был при исследовании веществ в концентрации 1,0 шМ. При использовании в качестве проагреганта АК наиболее активными были тиадиазины L-40 и L-41, содержащие 4-метилфенил и остатки морфолина и тиоморфолина соответственно. Введение метальной группы во 2-ое положение фенильного кольца (Н-16) снижало эффект на АК-индуцированную агрегацию.

1,3,4-тиадиазин Н-65, содержащий в 5-ом положении тиадиазинового кольца остаток тиазола и во 2-ом положении тиадиазинового кольца остаток морфолина, проявил антиагрегационное действие только в случае АДФ-индуцированной агрегации. При этом максимальный эффект наблюдался при действии вещества в концентрации 1,0 шМ (тромбоцитарное взаимодействие падало в 1,7 раза). На АК-индуцированную агрегацию тромбоцитов Н-65 сильного воздействия не оказывало. Таким образом, введение остатка тиазола во 2-ое положение тиадиазинового кольца не вызывало выраженного антиагрегационного эффекта в экспериментах in vitro.

Группа 5-тиенилзамещенных- 2-циклоалкиламинозамещенных -1,3,4-тиадиазинов была разделена на 2 подгруппы. Все соединения в 5-ом положении тиадиазинового кольца содержали производные тиофена.

Подгруппа 5-(тиенил-2)- замещенных- 2-циклоалкиламинозамещенных -1,3,4-тиадиазинов содержала 11 веществ. Наиболее активными соединениями данной подгруппы оказались вещества, содержащие в 5-ом положении тиадиазинового кольца тиенилы без каких-либо атомов галогенов, а во 2-ом положении - остатки морфолина (Н-29), пирролидина (Н-32) и пиперидина (Ь-83). Добавление в остаток тиофена атомов галогена и замена остатков морфолина, пирролидина и пиперидина на другие не приводило к выраженным антиагрегационным свойствам веществ. При этом тиадиазин с остатком пиперидина (Ь-83) показал лучшие результаты в экспериментах на донорской плазме (таблица 1).

Таблица 1

Влияние 5-(тиенил-2)-замещенных-1,3,4-тиадиазинов на агрегацию тромбоцитов человека, индуцированную АДФ (1 х 10'5 М) in vitro (А^, %)

Исследуемое вещество Контроль Конечная концентрация, тМ

1 0,5 0,1 0,01 0,001

Н-29 73,3±1,7 50,0±2,9 * 56,0±3,3 * 57,9±3,4 * —

Н-32 52,9±2,1 29,3 ±2,0 * 32,9+1,6 * 34,6±1,6 * 38,5+1,3 * 40,2±1,7*

Н-33 58,4±2,9 34,3±2,8 * 36,4±2,6 * 38,2+2,4 * 42,3±3,1 * 44,4±2,5*

L-44 53,4±2,2 29,8±3,0 * 32,6±3,б * 36,6±2,2 * 40,4±2,3 * 41,2±1,9*

Н-45 62,7±3,9 46,9±2,6 * 47,0±2,5 * 52,5±2,5 * 53,3±2,1 55,8±2,3

Н-67 60,5±2,7 39,2±2,4 * 42,6±1,9 * 43,3±2,1 * 44,8±1,6 * 43,6±1,7*

L-82 52,9±2,1 29,3±2,0 * 32,9+1,6 * 34,6+1,6 * 38,5±1,3 * 40,2±1,7*

L-83 57,6±1,5 24,9±1,2 * 33,1±1,7 * 37,2±2,7 * 41,6+2,0 * 42,1±1,7*

Н-84 53,4±2,2 29,8±3,0 * 32,6±3,6 * 36,6±2,2 * 40,4±2,3 * 41,2±1,9*

*- достоверно по отношению к контролю (р<0,05)

Однако при исследовании данного вещества на кроликах незначительный антиагрегационный эффект наблюдался только при внутривенном введении вещества в больших дозах (80 мг/кг). АДФ-индуцированная агрегация падала в 1,2 раза спустя 240 минут после введения соединения кроликам. АК-индуцированная агрегация не изменялась. Наибольшей антиагрегационной активностью в опытах ex vivo обладал тиадиазин, содержащий остаток морфолина (Н-29). Максимальный эффект при индукции тромбоцитарного взаимодействия АДФ наблюдался на 240 минуте эксперимента при внутривенном введении Н-29 в дозе 20 мг/кг (агрегация снижалась в 1,6 раза). АК-индуцированная агрегация также ингибировалась через 240 минут в 1,4

раза относительно контроля. При пероральном же введении в дозе 100 мг/кг агрегация, индуцированная АДФ, снижалась в 1,2 раза спустя 4 часа после введения препарата. Изменение АК-индуцированного взаимодействия на протяжении всего эксперимента не наблюдалось.

Пирролидинсодержащее вещество (Н-32) не показало выраженного эффекта при внутривенном введении.

Исходя из экспериментальных данных, 5-(тиенил-3)- замещенный- 2-циклоалкиламинозамещенный -1,3,4-тиадиазин с остатком морфолина (L-79) показал хорошее антиагрегационное действие на донорской плазме в данной подгруппе веществ. Так, в максимальной конечной концентрации 1,0 mM L-79 ингибировал АДФ-индуцированную агрегацию практически в 2 раза. АК-индуцированное взаимодействие снижалось в 1,9 раз при изучении соединения в конечной концентрации 0,025 шМ. Замещение остатка морфолина на остаток пирролидина (Н-80) незначительно снижало антиагрегационный эффект на АК-индуцированное взаимодействие клеток (агрегация падала в 1,5 раза в конечной концентрации 0,025 шМ). Добавление в остаток тиофена двух атомов хлора (Н-94, Н-95, Н-96) не вызывало эффекта на агрегацию, индуцированную АК.

По результатам исследования in vitro среди 5-(фурил-2)-замещенных-2-циклоалкиламинозамещенных-1,3,4-тиадиазинов ни одно соединение не оказало выраженного ингибирующего действия в совокупности и на АДФ-индуцированную, и на АК-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Поэтому введение остатка фур ила в 5-ое положение тиадиазинового кольца не приводило к положительным результатам в экспериментах на донорской плазме.

В группе 5-(1-метоксиимино)-замещенных -2-

циклоалкиламинозамещенных-1,3,4-тиадиазинов было изучено 3 соединения. При индукции агрегации тромбоцитов АДФ исследованные соединения показали схожий эффект. Так в максимальной концентрации 1,0 шМ тромбоцитарное взаимодействие падало в среднем в 1,4 раза относительно

контроля. В случае АК-индуцированной агрегации наиболее активно проявило себя вещество Н-46 с остатком морфолина во 2-ом положении тиадиазинового кольца. Ингибирование взаимодействия клеток в 2,3 раза было зафиксировано при изучении Н-46 в концентрации 0,01 шМ. Замещение остатка морфолина (Н-46) на остатки пиперидина (Н-35) и пирролидина (L-47) не усиливало антиагрегационных свойств тиадиазинов.

В последнюю группу 5-(пиридил-3)- замещенных-2-циклоалкиламинозамещенных-1,3,4-тиадиазинов входило одно соединение, обладающее достаточно мощным эффектом. Так агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ и АК, ингибировалась практически в 2 раза при действии соединения L-97 в конечной концентрации 1,0 шМ и 0,05 шМ соответственно. Следует отметить, что во 2-ом положение тиадиазинового кольца у вещества L-97 был присоединен остаток пиперидина.

Влияние класса тиазолов на агрегацию тромбоцитов in vitro.

В класс тиазолов входило 3 вещества. Учитывая результаты исследования данных соединений, наиболее активно себя проявил тиазол Н-89. При изучении влияния данного вещества на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитарное взаимодействие падало практически в 2 раза в концентрации Н-89 0,5 шМ. АК-индуцированная агрегация ингибировалась в 1,3 раза в конечной концентрации 0,025 шМ. В 4-ом положении тиазольного кольца у соединения Н-89 расположен 4-хлорфенил, а во 2-ом положении - остаток морфолина. Замена 4-хлорфенила (Н-89) на 4-фенил (L-90) или 4-нитробензол (L-85) и остатка морфолина (Н-89) на остаток пиперазина (L-85) не вызывали ингибирующее агрегацию действие.

Как видно из результатов экспериментов на кроликах, исследованные ех vivo соединения снижали агрегацию тромбоцитов на 180-240 минутах опыта. Можно предположить, что отсроченный антиагрегационный эффект связан с

образованием в организме активных метаболитов, которые непосредственно снижают тромбоцитарное взаимодействие. Поэтому целесообразно было исследовать предполагаемые метаболиты данных тиадиазинов. Все предполагаемые метаболиты принадлежали классу пиразолов.

Влияние класса пиразолов на агрегацию тромбоцитов in vitro.

В классе пиразолов было исследовано 2 предполагаемых метаболита тиадиазина L-17. Оба метаболита в 3-ем положении пиразольного кольца содержали остатки морфолина, а в 5-ом положении - фенил, но один из метаболитов является гидробромидом (L-60), а другой - гидрохлоридом (L-61). Оба пиразола проявили практически одинаковый по силе антиагрегационный эффект. Хотя гидрохлорид L-61 оказался сильнее гидробромида L-60, но не существенно.

Следует отметить, что все исследованные в нашей работе соединения более эффективно ингибировали агрегацию тромбоцитов, индуцированную АК по сравнению с АДФ-индуцированной.

Как видно из результатов, некоторые тиадиазины при исследовании их на кроликах оказывали воздействие на показатели гемостаза, таким образом, вещества обладают незначительной антикоагулянтной активностью.

ВЫВОДЫ

1. В ряду изученных соединений 2-циклоалкиламинозамещенные 1,3,4-тиадиазины, содержащие остаток морфолина во 2-ом положении тиадиазинового кольца, проявляли наибольшую антиагрегационную активность в экспериментах in vitro на донорской плазме в диапазоне исследуемых концентраций (0,001 шМ - 1,0 шМ при индукции агрегации аденозиндифосфатом; 0,0001 шМ - 1,0 гпМ при индукции агрегации арахидоновой кислотой).

2. Введение в 5-ое положение тиадиазиновой молекулы 4-хлорфенила или тиенила-3 усиливало антиагрегационные свойства соединений в экспериментах на донорской плазме in vitro в диапазоне исследуемых концентраций (0,001 шМ - 1,0 шМ при индукции агрегации аденозиндифосфатом; 0,0001 шМ - 1,0 шМ при индукции агрегации арахидоновой кислотой).

3. Исследованные предполагаемые метаболиты тиадиазинов, принадлежащие классу пиразолов, незначительно ингибировали тромбоцитарное взаимодействие, индуцированное аденозиндифосфатом (на 35% в конечной концентрации 1,0 шМ) и не оказывали влияния на арахидонат-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

4. Среди всех исследованных 1,3,4-тиадиазинов наиболее выраженную антиагрегационную активность проявило морфолиновое соединение с тиенилом-3 в 5-ом положении тиадиазинового кольца (Н-29) при внутривенном введении в дозе 20 мг/кг в экспериментах на кроликах ex vivo.

5. Изученные тиадиазины не оказывают эффекта на параметры плазменного гемостаза.

6. Наиболее оптимальными заместителя для дальнейшего синтеза соединений активных соединений с антиагрегационной активностью являются остатки морфолина и тиоморфолина во 2-ом положении тиадиазинового кольца и тиенил-3 и этоксифенил - в 5-ом положении тиадиазинового кольца.

7. Среди тиазолов наиболее выраженными антиагрегационными свойствами обладает соединение с остатком морфолина во 2-ом положении и этоксифенилом в 4-ом положении тиазольного кольца в диапазоне исследуемых концентраций (0,001 шМ - 1,0 шМ при индукции агрегации аденозиндифосфатом; 0,001 шМ - 1,0 шМ при индукции агрегации арахидоновой кислотой).

8. Среди всех изученных соединений самыми сильными ингибиторами тромбоцитарного взаимодействия оказались тиадиазины Н-29 (с остатком морфолина во 2-ом положении и тиенилом-3 в 5-ом положении тиадиазинового кольца) и Н-48 (с остатком тиоморфолина во 2-ом положении и 4-этоксифенилом в 5-ом положении тиадиазиновлого кольца).

Практические рекомендации.

1. Для усиление антиагрегационного действия рекомендуем синтез новых оригинальных 1,3,4-тиадиазинов с наиболее активными заместителями (во 2-ом положении тиадиазинового кольца - остатки морфолина и тиоморфолина; в 5-ом положении - тиенил-3 и этоксифенил).

2. Рекомендуем синтез и поиск активных метаболитов, принадлежащих к классу пиразолов, для проведения фармакологических испытаний в экспериментах ex vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Логвинова, Ю.С. Влияние 4'-хлорфенил-, 4'-бромфенил-, 4'-фторфенил-1,3,4-тиадиазинов на агрегацию тромбоцитов in vitro и ex vivo, индуцированную АДФ и арахидоновой кислотой, а также на плазменные параметры гемостаза [Текст] / Ю.С.Логвинова, Т.М. Васильева, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В. Л. Русинов.// Материалы Всероссийской конференции «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению», 26-28 ноября 2009 г., Москва, С. 63.

2. Логвинова, Ю.С. Влияние новых соединений класс 1,3,4-тиадиазинов на агрегацию тромбоцитов in vitro и ex vivo [Текст] / Ю.С. Логвинова, Т.М. Васильева, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.Л. Русинов // «Экспериментальная и клиническая фармакология». — 2010. — Том 73, №8.-С. 21-25.

3. Логвинова, Ю.С. Влияние 2-морфолино-5-(тиенил-2)-6Н-1,3,4-тиадиазин гидробромида на параметры гемостаза in vitro и ex vivo [Тексту / Ю.С. Логвинова, Т.М. Васильева, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.Л. Русинов // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики и лечения венозных и артериальных тромбозов», - Санкт-Петербург, 2010. - С. 45.

4. Логвинова, Ю.С. Антиагрегационные свойства 5-тиенильных производных тиадиазинов [Текст] / Ю.С. Логвинова, Т.М. Васильева, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.Л. Русинов // Труды III Сибирской научно-практической конференции гематологов «Баркагановские чтения». - Барнаул, 2010. - С. 173.

5. Ю.С. Логвинова, Т.М. Васильева, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.Л. Русинов. Влияние 2-морфолино-5-(тиенил-2)-6Н-1,3,4-тиадиазина, гидробромида на агрегацию тромбоцитов ex vivo и параметры плазменного гемостаза [Текст] / Ю.С. Логвинова, Т.М. Васильева, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.Л. Русинов // Тезисы докладов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 12-16 апреля 2010 г., Москва. - М., 2010. - С. 666.

6. Логвинова, Ю.С. Антиагрегационные свойства тиадиазина Н-29 in vitro и ex vivo [Текст] / Ю.С. Логвинова, Т.М. Васильева, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.Л. Русинов // «Медицинский академический журнал». - 2010. - Том 10, №5. - С. 165.

7. Логвинова, Ю.С. Антиагрегационные свойства 2-тиоморфолино-5-(4-этоксифенил)-6Н-1,3,4-тиадиазина в экспериментах ex vivo [Текст] / Ю.С. Логвинова, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.Л. Русинов // Материалы IV Съезда фармакологов России «Инновации в

современной фармакологии». 18-21 сентября 2012 г., Казань. - Казань, 2012. -С. 119.

8. Логвинова, Ю.С. Антиагрегационное действие 2-морфолино-5-(тиенил-2)-6Н-1,3,4-тиадиазин гидробромида в экспериментах in vitro и ex vivo. [Текст] / Ю.С. Логвинова, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.Л. Русинов //«Экспериментальная и клиническая фармакология». -2013.-Том 76, №2.-С. 13-16.

9. Логвинова, Ю.С. Антиагрегационное действие 2-циклоалкиламино-5-фенил-1,3,4-6Н(С2Н5)-тиадиазинов в экспериментах in vitro [Текст] / Ю.С. Логвинова, Т.М. Васильева, В.А. Макаров, О.Н. Чупахин, Л.П. Сидорова, Н.М. Перова, В.Л. Русинов // «Гематология и трансфузиология». - 2013. - Том 58, №2.-С. 37-40.

Список сокращений

АДФ - аденозиндифосфат АК - арахидоновая кислота

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

PRP — богатая тромбоцитами плазма РРР - бедная тромбоцитами плазма

Подписано в печать: 11.11.2013 Тираж: 100 экз. Заказ № 1019 Объем: 1,0 усл.пл. Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru