Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Поиск новых производных 1-этилксантина, влияющих на систему гемостаза

Л}

На правах рукописи

Самородова Альбина Илдаровна

ПОИСК НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 1 -ЭТИЛКСАНТИНА, влияющих НА СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗА

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2015

Работа выполнена на кафедре биологической химии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ и РБ, доктор медицинских наук, профессор

Кямилов Феликс Хусаикович

Официальные оппоненты:

Гуляева Инна Леонидовна доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России, кафедра патологической физиологии, заведующий

Науменко Людмила Владимировна доктор медицинских наук, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра фармакологии, старший преподаватель

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 26 марта 2015 года в 16.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64) и на сайте www.chelsma.ru.

Автореферат разослан «7» февраля 2015 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Ю.С. Шишкова

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ Г)ИП ЛИОТЕКА

is__3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности. По

современным представлениям система гемостаза — совокупность функционально-морфологических и биохимических механизмов, обеспечивающих сохранение жидкого состояния крови, предупреждение и остановку кровотечений, а также контролирующих целостность кровеносных сосудов (Кузник Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии / Б.И. Кузник. Чита : Экспресс-издательство, 2012. 832 е.). Нарушения в системе гемостаза являются промежуточным звеном патогенеза многих заболеваний, характеризующихся повреждением внутренней выстилки сосудов, нарушением взаимодействия эндотелия с клетками крови и плазменными ферментными системами, сдвигами реологии крови. Широкое распространение патологических состояний, проявляющихся тромбогеморрагическими осложнениями (Бышевский А.Ш. Неспецифическая коррекция изменений гемостаза при заболеваниях, протекающих с гиперкоагуляцией / А.Ш. Бышевский, C.JI. Галян, В.А. Полякова и др. II Фундаментальные исследования. 2008. № 2. С. 29-30), требует поиска средств направленного воздействия на гемостаз.

В исследованиях, проведенных за последние десятилетия, показана необходимость и эффективность снижения угрозы тромбообразования с помощью специфических воздействий, в частности, применением антиагрегантов и антикоагулянтов (Баркаган З.С. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза / З.С. Баркаган, А.П. Мамот. Москва : Ньюдиамед АО, 2008. 292 е.). Профилактическое использование антитромботических средств статистически значимо снижает риск тромбоэмболических осложнений, течение и исход основного заболевания (Бышевский А.Ш. Неспецифическая коррекция изменений гемостаза при заболеваниях, протекающих с гиперкоагуляцией / А.Ш. Бышевский, C.JI. Галян, В.А. Полякова и др. // Фундаментальные исследования. 2008. № 2. С. 29-30).

Исследования в области поиска новых средств коррекции системы гемостаза не прекращаются уже много лет. Найдены перспективные вещества среди активаторов фибринолиза (Терещенко С.Н. Тромбозы и тромбоэмболии при хронической сердечной недостаточности и их профилактика / С.Н. Терещенко. Москва : Медицина, 2004. 134 е.), ингибиторов тромбина (Markwardt F. Pharmacology of hirudin, one hundred years afler the first report of the anticoagulant agent in médicinal leeches / F. Markwardt // Biomed. Biochim. Acta. 1985. Vol. 44, № 5. P. 1007-1013), ферментов и специфических моноклональных антител (Максименко А.В. Макромолекулярные ансамбли внешнего и внутреннего фибринолиза. Пути усиления тромболитического воздействия / А.В. Максименко // Химико-фармацевтический журнал. 2002. Т. 36, № 7. С. 56-59), субстратов растительного происхождения (Рогов А.В. Растительные пептиды - перспективный источник создания новых лекарственных средств / А.В. Рогов, Н.Ф. Минеева, Е.В. Колхир и др. // Фармация. 2003. № 6. С. 41-46), пептидных ингибиторов тромбинзависимого превращения фибриногена (Галян C.JI. Внутрисосудистое свертывание крови при введении ингибиторов фосфолипазы / C.JI. Галян, М.К. Умертбасва, Р.Г. Алборов и др. // Вестник ТГМА. 2005. № 2. С. 32-35). Но,

несмотря на успех исследователей и широкий выбор коммерческих препаратов на рынке, срлективных антитромботических средств, имеющих практическое применение, не существует. Применяемые на практике лекарственные препараты, помимо гемостаза, оказывают влияние и на другие системы организма (Тромбоциты (состав, функции, биомедицинское значение) / А.Ш. Бышевский, С.Л. Галян, И.А. Дементьева [и др.] - Тюмень : Тюменская медицинская академия, 1996. 144 с.).

Синтез аналогов и производных применяемых препаратов является одним из современных направлений в разработке новых лекарственных средств. Данная работа является продолжением поиска селективных антитромботических средств среди производных ксантина (Камилов Ф.Х. Поиск активных соединений в ряду производных ксантина, влияющих на сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов и др. // Вестник РУДН, серия «Медицина». 2011. № 1. С. 66-70). Предыдущие исследования подтвердили наличие у ряда производных ксантина выраженной антитромботической активности, эффект которых реализуется путем ингибирования самосборки фибрин-мономеров и блокирования рецепторов тромбоцитов ГП Ilb-IIIa (Самородов A.B. Поиск новых азотсодержащих гетероциклических соединений, влияющих на систему гемостаза : автореф. дис. ... канд. мед. наук / A.B. Самородов. Уфа, 2012. 23 е.).

Результаты этих работ мотивируют дальнейшие исследования влияния производных ксантина на систему гемостаза. Они являлись основой для направленного поиска селективных ингибиторов функциональной активности тромбоцитов среди впервые синтезированных N -замещенных производных ксантина, содержащих этильный радикал в положении N1, и разработки на их основе высокоэффективных, избирательно действующих лекарственных препаратов для коррекции системы гемостаза, превосходящих пентоксифиллин.

Цель исследования. Оценка эффективности и изучение механизма действия на систему гемостаза в эксперименте наиболее активного из впервые синтезированных производных 1 -этилксантина.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг 18 впервые синтезированных производных 1-этилксантина для выявления антиагрегационной и антикоагуляционной активности in vitro.

2. Определить зависимость биологической активности исследованных веществ от характера замещающих радикалов производных 1-этилксантина.

3. Оценить противосвертывающее действие in vitro на донорской крови человека наиболее перспективного из синтезированных соединений.

4. Изучить механизм действия in vivo на интактных животных наиболее перспективного из изучаемых производных 1-этилксантина.

5. С использованием модельных состояний, сопровождающихся повышением адгезии и агрегации тромбоцитов, оценить противосвертывающее действие наиболее перспективного соединения.

Методология и методы исследования. Исследовательская работа проведена в соответствии с рекомендациями «Руководства по

экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005).

Эксперименты в условиях in vitro выполнены на крови 227 здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. Экспериментальные исследования in vivo выполнены на 129 белых беспородных половозрелых крысах-самцах. Изучение профилактического эффекта соединения М-26 и пентоксифиллина при моделировании генерализованного коллаген-адреналинового тромбоза выполнено на 60 белых беспородных мышах-самцах.

Для решения поставленных цели и задач исследования использовались следующие методы: тромбоэластография, индуцированная агрегация тромбоцитов, стандартные клоттинговые тесты, иммунотурбидиметрический и метод хромогенных субстратов.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.

Достоверность результатов и обоснованность выводов базируется на адекватности экспериментальных моделей in vitro и in vivo, достаточном объеме исследований, использовании сертифицированного оборудования и современных методов исследования, обработке результатов исследования с применением статистического пакета Statistics 10,0 (StatSoft Inc, США).

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: 76-й, 77-й, 78-й Республиканских научных конференциях студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2011, 2012 и 2013 годы), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012 год), 72 научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Медицина и фармация XXI столетия - шаг в будущее» (Украина, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов» (Уфа, 2012 год), III Международной научной конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (Казань, 2012 год), Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию БГМУ «Итоги и перспективы молодежной и фармацевтической науки» (Уфа, 2013 год), IX Всероссийской конференции «Химия и Медицина» (Уфа, 2013 год), Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти профессора Д.М. Зубаирова «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики» (Казань, 2013 год), совместном заседании кафедр биологической химии, фармакологии № 1 с курсом клинической фармакологии, фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии и кафедры лабораторной диагностики ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России (Уфа, 2013 год).

Содержащиеся в диссертации данные получены при непосредственном участии автора на всех этапах работы. Основная идея, планирование научной работы, цели, задач и дизайна исследования, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с научным руководителем д.м.н., профессором Ф.Х. Камиловым. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, инструментальные, лабораторные и экспериментальные исследования проведены,

статистическая обработка первичных, данных, интерпретация и анализ полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях и съездах осуществлялись соискателем лично.

Положения, выносимые на защиту:

1. Среди 18 изученных впервые синтезированных производных 1-этилксантина наиболее активные соединения по положению С8 -циклогексиламмониевые соли, по положению К7, содержащие диоксотиетанильный радикал.

2. Соединение М-26 проявляет более выраженную антиагрегационную активность по сравнению с пентоксифиллином.

3. Антиагрегационный механизм действия соединения М-26 заключается в ингибировании реакции высвобождения тромбоцитов.

Научная новизна. Впервые на основании изучения антиагрегационной, дезагрегационной и антикоагуляционной активности выделены соединения, являющиеся наиболее перспективными среди впервые синтезированных производных 1-этилксантина. Охарактеризована зависимость фармакологической активности этих производных от структуры. Установлено, что наиболее активными среди исследованных производных 1-этилксантина являются соединения, содержащие в положении Ь17 - диоксотиетанил, в частности, циклогексиламмониевая соль 2-[3-метил-1-этил-7-(диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты (лабораторный шифр - М-26). На соединение М-26, превосходящее по действию на гемостаз пентоксифиллин, получен патент (патент РФ № 2504546 от 20.01.2014). По результатам проведенной экспериментальной работы выдвинута рабочая гипотеза о вероятном механизме действия на систему гемостаза соединения М-26, связанным с подавлением реакции высвобождения тромбоцитов.

Теоретическая и практическая значимость. Закономерности, выявленные между структурой производных 1-этилксантина и антиагрегационной, антикоагуляционной активностью позволяют осуществлять целенаправленный поиск и оптимизацию синтеза новых соединений с заданной структурой и уровнем биологической активности. Выраженная антиагрегационная активность производного 1-этилксантина под лабораторным шифром М-26, превосходящая аналоговый препарат - пентоксифиллин, характеризует его как перспективное средство коррекции гемостаза и определяет необходимость его дальнейшего изучения.

Внедрение результатов исследования в практику. Ряд положений теоретического и практического характера, сформулированных в диссертации внедрены в учебный и научный процессы на кафедрах фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии, биологической химии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии ГБОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Публикации. Соискатель имеет 15 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 15 научных работ общим объёмом 3,4 печатных листа, в том числе 6 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и издании для опубликования основных научных результатов диссертаций, из них 1 патент на

изобретение (патент РФ № 2504546 от 20.01.2014). 9 работ опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками, 22 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 82 отечественных и 187 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Объектами исследования являлись 18 новых производных 1-этилксантина, синтезированных на кафедре фармацевтической химии* Башкирского государственного медицинского университета, и ряд лекарственных препаратов, применяемых в практической медицине.

Исследовательская работа проведена согласно дизайну, представленному на рисунке 1.

Эксперименты в условиях in vitro выполнены на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. Общее количество доноров составило 227 человек. Забор крови проводился из кубиталъной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer® (Becton Dickinson and Company, США).

Экспериментальные исследования in vivo выполнены на 129 белых беспородных половозрелых крысах-самцах с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных для экспериментальных животных, правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96, ГОСТР 50258-92) и приказа Минздравсоцразвития России № 708н от 23.08.2010 "Об утверждении Правил лабораторной практики" (GLP). Исследование влияния на систему гемостаза в условиях in vivo проводили при внутрибрюшинном введении крысам изучаемых веществ в эквимолярных концентрациях. Между инъекцией исследуемого вещества и забором крови проходил 1 час. Животных наркотизировали диэтиловым эфиром, фиксировали на препаровальном столике, проводили забор крови из яремной вены. В качестве стабилизатора венозной крови на всех этапах исследования использовался 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1.

Все тесты проводились на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы - при 3000 об/мин в течение 20 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (Россия).

Тромбоэластографию проводили на аппарате TEG 5000 (Haemoscope Corporation, USA). При анализе тромбоэластограмм определяли общую тенденцию коагуляции (ТР1, ТМА), функциональную активность тромбоцитов и фибриногена (MA, Angle), активность фибринолиза (CL30, LY30, CLT) и физико-механические

" Выражаем признательность заведующему кафедрой фармацевтической химии ГБОУ ВПО БГМУ, профессору Ф.А. Халиуллину, предоставившему для исследования впервые синтезированные

производные ксантина.

I этап

Скрининг впервые синтезированных производных 1-этилксантина на антиагрегационную, дезагрегационную и антикоагуяяционную активность в условиях in vitro ч_/

1. Исследование антиагрегационной и дезагрегационной активности 18 производных 1-этилксантина в скрининговой дозе при АДФ-и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов по методу Born на агрегометре «Thromlite-1006A».

2. Исследование антикоагуляционной активности 18 производных 1-этилксантина в скрининговой дозе стандартными клоттинговыми тестами на донорской крови человека на гемокаагулометре Solar CGI 2110.

3. Анализ зависимости биологической активности новых производных 1-этилксантина от химической структуры.

4. Выбор наиболее перспективного из изученных производных 1-этилксантина для изучения механизма действия

Влияние соединения М-26 на тромбоцитарный и коагуляционный компонент гемостаза in vitro

1. Изучение влияния соединения М-26 и пентоксифиллина на систему гемостаза методом тромбоэластографии на аппарате TEG 5000.

2. Изучение влияния соединения М-26 и пентоксифиллина на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, коллагеном, адреналином и ристомицином на лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола 230 LA».

3. Изучение влияния соединения М-26 и пентоксифиллина на реакцию высвобождения тромбоцитов.

Рисунок 1 - Дизайн исследовании

Влияние соединения М-26 на сосудисто-тромбоцитарный

и коагуляционный компонент гемостаза in vivo

1. Определение острой токсичности соединения М-26 и пентоксифиллина.

2. Влияние соединения М-26 и пентоксифиллина на систему гемостаза при внутрибрюшинном введении крысам методом тромбоэластографии на тромбоэластографе TEG 5000.

3. Исследование влияния соединения М-26 и пентоксифиллина на коагуляционный компонент гемостаза при внутрибрюшинном введении крысам на автоматизированном селективном анализаторе гемостаза STA-Compact.

4. Исследование влияния соединения М-26 и пентоксифиллина на агрегацию тромбоцитов при внутрибрюшинном введении крысам на лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола 230 LA».

5. Влияние соединения М-26 и пентоксифиллина на генерализованный коллаген-адреналиновый

ТрОМбОЗ. Л»

свойства образовавшихся сгустков (А, Е, G). Исследование влияния впервые синтезированных производных 1-этилксантина на агрегацию тромбоцитов осуществляли с помощью оптического агрегометра «Thromlite-1006A» и лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «Биола 230 LA» (г. Москва). В качестве индукторов агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрациях 20 и 5 мкг/мл, коллаген в концентрации 5 мг/мл, адреналин в концентрации 5 мкг/мл и ристомицин в концентрации 10 мг/мл производства "Технология-Стандарт" (Россия, г. Барнаул). Анализ агрегатограмм проводился с использованием программного обеспечения AGGR с учетом следующих показателей: общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая; полная, неполная обратимая, необратимая), значение максимальной агрегации (МА), максимальной скорости агрегации (tg а), средний размер тромбоцитарных агрегатов в относительных единицах (MPА).

Показатели, характеризующие состояние эндотелия, активность коагуляционого звена гемостаза и маркеры процессов тромбообразования и фибринолиза при действии изучаемых веществ регистрировали на автоматизированном селективном анализаторе гемостаза STA-Compact (Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд., Франция) стандартными клоттинговыми тестами (АПТВ, ПВ, ТВ, каолиновое время, рептилазное время), иммунотурбидиметрическим методом (D-димеры, концентрацию фактора Виллебранда) и методом хромогенных субстратов (активность антитромбина III) с использованием оригинальных наборов реактивов производства Roche Diagnostics.

Определение активности фактора 3 тромбоцитов (Р3) проводили по методу V. Rabiner. Разница показателей каолинового времени рекальцификации обогащенной и бестромбоцитарной плазмы характеризует активность фактора Рэ в плазме. Высвобождение фактора Pj в процессе агрегации тромбоцитов оценивали после проведения агрегации АДФ и центрифугирования (Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза / Е.П. Иванов. Минск : Беларусь, 1983. 267 е.).

Определение фактора 4 тромбоцитов (Р4) осуществляли по действию бедной тромбоцитами плазмы на тромбин-гепариновое время свертывания методом Матвиенко Л.А. и Котовщиковой М.А. Высвобождение фактора Р4 в процессе агрегации тромбоцитов оценивали тем же методом после проведения агрегации АДФ и центрифугирования (Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза / Е.П. Иванов. Минск : Беларусь, 1983. 267 е.).

Время свертывания крови регистрировали по методу Сухарева. Для этого надрезом кончика хвоста крысы получали кровь, набирали 20-30 мм крови в капилляр от прибора Панченкова с последующими наклонами капилляра на 4045°. По секундомеру отмечали момент окончания свертывания цельной крови (Кишкун A.A. Руководство по лабораторным методам диагностики / A.A. Кишкун. - Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2002. 346 е.).

Параметры токсичности соединения М-26 и пентоксифиллина определяли на лабораторных крысах по методу Дейхмана и Ле Бланка путем однократного введения веществ с констатацией ориентировочной среднесмертельной дозы (Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ / И.В. Саноцкий. - Москва : Медицина, 1989. 150 е.). Длительность наблюдения за животными составляла 14 дней.

Исследовательская работа, направленная на изучение профилактического эффекта соединения М-26 и пентоксифиллина при моделировании генерализованного коллаген-адреналинового тромбоза, выполнена на 60 белых беспородных мышах-самцах половозрелого возраста. Для определения антитромботического эффекта за 1 час до моделирования тромбоза контрольной группе мышей внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, экспериментальным группам - исследуемые вещества в эквимолярных концентрациях и аналогичном объеме. Моделирование генерализованного тромбоза (DiMinno G.S. Mouse antithrombotic assay: a simple method for the evaluation of antithrombotic agents in vivo. Potentiation of antithrombotic activity by ethyl alcohol / G.S. DiMinno // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1983. Vol. 225. P. 57-60.) проводили введением индукторов агрегации в хвостовую вену мышей. В качестве триггера тромбоза использовали смесь растворов коллагена и адреналина (0,5 и 0,06 мг/кг соответственно). Длительность наблюдения за животными составляла 14 дней.

Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для описания групп использованы медиана и межквартильный интервал. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса (для независимых наблюдений) и Фридмена (для повторных наблюдений). Выживаемость оценивали от времени инъекции в хвостовую вену взвсси коллагена и адреналина до момента гибели или истечение 14 суток наблюдений. Анализ выживаемости проведен при помощи метода Каплана-Мейера. Различия выживаемости между группами оценивались при помощи критерия Вилкоксона. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. По результатам проведенного скрининга установлено, что впервые синтезированные производные 1-этилксантина проявляют антиагрегационную и антикоагуляционную активность (таблица 1).

Соединения под лабораторным шифром М-37, М-4, М-5, М-9, М-10, М-11, М-17, М-71, М-78, М-80, М-81, М-22, М-29 проявили антиагрегационную активность в концентрации 2*10'3 М/л не превышающую 10% при регистрации АДФ- и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов. Антикоагуляционная активность соединений под лабораторными шифрами М-4, М-5, М-10, М-17, М-71, М-72, М-81, М-23, характеризующаяся удлинением показателя АПТВ, в среднем не превышала 5%. Установлено, что влияние изученных соединений на функциональную активность тромбоцитов и плазменный компонент гемостаза зависит от их химической структуры. Увеличение степени окисления серы в тиетанильном цикле приводило к возрастанию как антиагрегационной, так и антикоагуляционной активности у всех производных 1-этилксантина изученного ряда.

По результатам полученных данных ряд активности С8-замещенных производных ксантина выглядит следующим образом: циклогексиламмониевые соли (М-9, М-76, М-26) > морфолиниевые соли (М-5, М-72, М-23) >

трисаммониевые соли (М-10, М-78, М-29) > пиперидиниевые соли (М-4, М-71, М-22). Среди изученных производных тиетанилксантина, содержащих в положении Г<11 этильный радикал, найдено соединение - циклогексиламмонивая соль 2-[3-метил-1 -этил-7-(диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты

(лабораторный шифр М-26), превосходящее по уровню антиагрегационной активности все препараты сравнения.

Таблица 1 - Показатели агрегации тромбоцитов и АПТВ в зависимости от ____изучаемых веществ_

№ Шифр я' Я2 Антиагрегационная активность, % ингибирования от уровня контроля, п=7 АПТВ, % удлинения от уровня контроля п=7

АДФ Коллаген

1 2 3 4 5 6 7

Н*\Х___<>' 1 " сн.

1. М-17 8 вСНгСООМа 2,8 (0,9-4,3) 3,9 (3,1-6,2) 3,2 (1,3-5,2)

2. М-11 в ЭСНгСООК 1,8 (0,3-3,2) 3,2 (1,5-4,7) 6,7 (4,2-9,7)

3. М-10 Б 5СН2СОО'*МНз*С(СН2ОН)З 1,7 (0,2-2,9) 1,2 (0,4-2,6) 3,4 (1,2-5,8)

4. М-9 Б ЗСН2СОО" М*НЭ-/ \ 7,6 (1.1-12,3) 10.2 (7,6-13,2) 9,5 (7,2-12,1)

5. М-4 8 ■ ' \ зсн2соо ■ Н2м у 0,8 (0,1-1,9) 1.1 (0,2-2,3) 1,9 (0,1-2,6)

6. М-5 . г л 5СН,СОО* 0 \ / 6,8 (2,7-11,2) 2,3 (1,1-4.2) 4,3 (3,7-5,8)

7. М-81 БО ЭСНгСООМа 3,2 (1,2-5.1) 4,7 (2,7-5,8) 4,4 (2,7-6,5)

8. М-80 во вСНгСООК 2,5 (0,6-4,2) 3,2 (1,2-4,6) 6,3 (4,9-8,2)

9. М-78 во ЗСН2СОО"*МН3*С(СН2ОН)3 3,6 (1,2-5,9) 3,4 (1,5-4,3) 5,2 (3,7-7,1)

10. М-76 во ЗСНдСООМ^Нз—^ ^ 19,3 (16,7-24,9) 3,6 (2,1-4,8) 10,2 (7,8-12,6)

11. М-71 во - ' \ ЗСН2СОО • Н2Ы > 1,8 (0,3-3,2) 2,3 (0,8-3,4) 4,7 (2,4-7,3)

12. М-72 80 . БСН^СОО* Н,Ы 0 2\ У 14,3 (9,5-17,3) 3,6 (1,3-5.2) 4.1 (2,3-6,2)

13. М-38 8(0)2 ЭСНгСОСЖа 10,1 (7,2-13,3) 6,4 (4,2-7,9) 6,9 (5,6-8,3)

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4 5 6 7

14. М-37 8(0)2 ЭСНгСООК 4,6 (3,1-6,3) 7,4 (5,6-9,2) 6,4 (4,5-8,1)

15. М-29 8(0)» ЗСН2СОО"-ЫНз+С(СН2ОН)з 8,4 (6,4-10,7) 4,7 (3,5-5,6) 8,3 (6,9-10,4)

16. М-26 БСОЪ зсн2сооУн3-^ 100,0 (100,0-100,0) 100,0 (100,0100,0) 11,4 (8,9-14,2)

17. М-22 Б(0)2 - ' \ вСНгСОО • Н2М ) 1,3 (0,7-3.2) 3,8 (1,7-5,2) 8,9 (6,8-10,2)

18. М-23 8(0)2 . Г\ ЗСН2СОО* Н^ 0 20,4 (17,5-24,6) 4,6 (3,1-5,4) 4,2 (3.4-5,7)

19. Эуфиллин - - 7,4 (5,6-9,3) 2,5 (0,8-4,2) -

20. Кофеин-бенэоат натрия — 14,7 (10,3-17,9) 5,3 (3,9-7,2) —

21. Аспирин — — 13,7 (10,8-16,4) 0,0 (0,0-0,0)

22. Пентоксифишшн — — 48,4 (42,7-56,5) 0,0 (0,0-0,0)

23. Гвпарли — " 54Л (47,7-60,2)

Дальнейшие исследования направлены на определение механизма действия соединения М-26. Изучать влияние соединения М-26 и пентоксифиллина на систему гемостаза начали с тромбоэластографии. Анализ тромбоэластограмм, полученных на образцах цитратной крови (таблица 2) в присутствии пентоксифиллина, демонстрирует статистически значимое снижение индекса МА, характеризующего функциональную активность тромбоцитов. Данный показатель уменьшается относительно контроля на 25,5% (р=0,0002). Показатель МА в группе соединения М-26 в 2,1 и 1,6 раза меньше, чем в группах контроля (р=0,0001) и пептоксифиллина (р=0,001) соответственно. Показатели прочности сгустка А и Э снижены в группе соединения М-26 в 1,2 (р=0,0003) и 1,6 (р=0,0002) раза в сравнении с пентоксифиллином.

Таблица 2 - Показатели тромбоэластограмм цитратной крови в присутствии __соединения М-26 и пентоксифиллина_

Показатель Контроль п=7 Пеитоксифиллин п=7 Р1 М-26 п=7 Р2 Рз

1 2 3 4 5 6 7

МА, мм 57,3 (51,2-63,2) 42,7 (41,6-44,3) 0,0002 26,8 (23,6-28,4) 0,0001 0,001

ТМА, мин 27,1 (22,3-32,1) 31,9 (29,8-33,1) 0,001 42,6 (41,2-44,7) 0,0001 0,0004

Продолжение таблицы 2

1 2 3 4 5 6 7

TPI, /сек 11,7 (8,5-14,6) 7,9 (6,2-8,3) 0,03 5,7 (4,9-6,3) 0,0002 0,001

А, мм 53,4 (49,6-58,3) 41,2 (39,6-44,2) 0,0004 34,6 (32,4-37,3) 0,0008 0,0003

G, дин/см1 6,7(4.5-8,1) 4,8 (3,9-5,4) 0,004 2,9 (2,3-3,4) 0,0007 0,0002

LY30, % 3,7 (3,1-4,8) 3,1 (2,7-3,3) 0,9 3,3 (3,1-3,9) 0,8 0,3

CLT, мин 38,7 (35,4-42,4) 36,2 (31,2-38,7) 0,6 37,4 (35,7-37,8) 0,7 0,6

Примечание: в этой и последующих таблицах уровень статистической значимости различий: Р1- группы пентоксифиллина в сравнении с контролем, рг- группы М-26 в сравнении с контролем, р>- группы пентоксифиллина в сравнении с группой М-26

На образцах богатой тромбоцитами плазме (таблица 3) в присутствии пентоксифиллина статистически значимо изменяются показатели, характеризующие функциональную активность тромбоцитов. Показатель MA снижается на 16,2% относительно контроля (р=0,004), индекс тромбодинамического потенциала (TPI) снижается на 26,3% (р=0,02), время формирования максимальной прочности сгустка (ТМА) удлиняется на 12,9% (р=0,006) относительно контроля. Показатель MA в группе М-26 в 1,8 раза (р<0,001) меньше, чем в контрольной группе. Значительно изменялись механико-физические характеристики сгустка: снижались показатель расчетной «прочности-эластичности» сгустка (А) в 1,9 раза (р=0,00001) и показатель фактической меры прочности сгустка (G) в 3,3 раза (р=0,00001) в сравнении с контролем. Это статистически значимо превосходит показатели пентоксифиллина. На показатели активности плазменного звена гемостаза и фибринолиза действие соединения М-26 и пентоксифиллина не регистрировалось.

Таблица 3 - Показатели тромбоэластограмм обогащенной тромбоцитами плазмы в _ присутствии соединения М-26 и пентоксифиллина_

Показатель Контроль п=7 Пентоксифиллин п=7 Pi М-26 п=7 Р2 L Р3

MA, мм 72,4 (70,4-74,2) 60,7 (57,4-63,2) 0,004 39,3 (37,4-40,2) 0,0005 0,0001

ТМА, мин 25,6 (23,7-26,4) 28,9(26,7-30,1) 0,006 33,8 (31,1-35,4) 0,0001 0,0003

TPI, /сек 15,6 (14,6-17,2) 11,5 (10,6-12,3) 0,02 8,9 (8,1-9,4) 0,0007 0,0003

А, мм 73,8 (73,2-75,9) 60,9 (58,6-63,2) 0,0001 39,8 (39,5-42,3) 0,00001 0,0001

G, дин/см2 8,8 (8,1-9,2) 6,7 (6,1-7,2) 0,001 2,7 (2,2-3,0) 0,00001 0,00006

LY30, % 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) - 0,0 (0,0-0,0) - -

CLT, мин 36,4 (35,6-37,2) 35,7 (33,1-37,4) 0,6 34,6 (31,6-35,8) 0,7 0,7

Результаты исследования влияния соединения М-26 и пентоксифиллина на индуцированную агрегацию тромбоцитов представлены в таблице 4. Установлено, что соединение М-26 превосходит препарат сравнения - пентоксифиллин как по уровню, так и по спектру антиагрегационной активности. При этом в присутствии соединения М-26 в концентрации 4x10"3 М/л (р<0,0001) полностью подавляется агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ. В концентрациях 2><10"3 и 10"3М/л отсутствует вторая волна агрегации тромбоцитов.

Таблица 4 - Влияние пентоксифиллина и соединения М-26 на показатели ___индуцированной агрегации тромбоцитов_

Антиагрегационная активность, % ингибирования от уровня контроля

Вещество Соединение М-26 11=7 Пентоксифиллин п=7

Концентрация, М/л 4x10'J 2х 10'1 ю-1 4» 10"1 2* Ю'1 10

АДФ, 20 мкг/мл 100,0 (100,0-100,0) рз<0,0001; р3<0,001 80,7 (36,2-100,0) р,=0,002; Рз=0,0001 29,8 (25,6-31,2) Р2=0,0003; рэ«0,001 63,7 (58,9-9,2) р,<0,0001 48,4 (42,7-56,5) р, <0,00005 12,7 (10,5-15,6) р,<0,006

Вторая волна агрегации тромбоцитов -АДФ, 5 мкг/мл — — — + + +

Коллаген, 5 ыг/мл 100,0 (100,0-100,0) р2<0,00001; Рз<0,00001 100,0 (100,0-100,0) р2<0,00001; Рз<0,00001 20,4 (16,7-24,1) р2=0,001; р,=0,0007 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0)

Адреналин, 5 мкг/мл 30,8 (27,4-33,5) р2<0,001; р3<0,0001 23,7 (19,6-26,5) Рг<0,0001; р3<0,0001 12,1 (9,8-14,5) Рг=0,002; рз=0,003 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0)

Ристомицин, 10 мг/мл 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0)

Следующим этапом определили активность факторов Р3 и Р4 в присутствии соединения М-26 и препарата сравнения - пентоксифиллина (таблица 5). В присутствии пентоксифиллина в концентрации 2x10'3 М/л показатели активности Рз и Р4 тромбоцитов остаются на уровне контрольных значений. Полученные экспериментальные данные полностью соотносятся с механизмом действия и биологической активностью пентоксифиллина (De Sanctis М.Т. Treatment of retinal vein thrombosis with pentoxifylline: a controlled, randomized trial / M.T. De Sanctis, M.R. Cesarone, G. Belcaro et al. // Angiology. 2002. № 53. P. 72-73). В присутствии соединения М-26 активность тромбоцитарных факторов Р3 (р=0,004) и Р4 (р=0,001) статистически значимо снижается. При действии агониста агрегации тромбоцитов АДФ активность Р3 (р=0,3) и Р4 (р=0,4) остается на уровне исходных значений. Это свидетельствует о нарушении высвобождения Р3 и Р4 в процессе агрегации тромбоцитов. При коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, регистрируемой в присутствии соединения М-26, отмечается выраженное удлинение lag-фазы (р<0,001). В присутствии пентоксифиллина эффект удлинения lag-фазы не регистрируется (р=0,3).

Таблица 5 - Влияние пентоксифиллина и соединения М-26 в концентрации 2x10'' _М/л на показатели реакции высвобождения тромбоцитов_

Показатель Контроль п=7 Пентоксифиллин п=7 Р М-26 п=7 Р

Рз, % 81,7 (77,4-86,2) 79,8 (76,4-83,5) Р.=0,3 67,9 (64,5-73,2) pi=0,004 р2=0,005

Рз, % после АДФ 91,7 (87,3-96,2) р-,=0,01 87,8 (83,5-92,3) рз=0,02 Pi=0,4 68,1 (65,4-70,2) Рз=0,3 pi =0,001 Р2=0,002

Р4,С 2,4 (2,2-3,4) 2,6(2,3-3,1) Pi=0,7 1,6 (1,1-2,0) pi=0,001 рг=0,002

Pi, с после АДФ 3,2 (2,9-3,1) р3=0,06 3,6 (2,8-3,9) рз=0,07 р,=0,7 1,7 (1,1-2,4) Рз=0,4 pi=0,0002 р2=0,0001

Lag-период, с (индуктор коллаген) 61,3 (59,7-64,1) 62,8 (61,4-66,7) 0,3 86,3 (77,4-91,5) р,<0,01 р2<0,001

Примечание: р>- уровень статистической значимости различий признаков в сравнении с контрольной группой; Р2- уровень статистической значимости различий признаков групп пентоксифиллина и М-26; рэ- уровень статистической значимости различий признаков групп при агрегации до и после внесения АДФ

Таким образом, при изучении влияния соединения М-26 на систему гемостаза в условиях in vitro установлено отсутствие второй волны агрегации тромбоцитов, индуцированной малыми дозами АДФ, удлинение lag-периода при коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, а также снижение доступности и высвобождения тромбоцитарных факторов 3 и 4. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о действии соединения М-26, как потенциального ингибитора реакции высвобождения тромбоцитов.

Следующим этапом оценили показатели острой токсичности и специфическое противосвертывающее действие соединения М-26 и пентоксифиллина на интактных лабораторных животных. В ходе экспериментальной работы, проведенной по методу Дейхмана и Jle Бланка, установлено, что летальный исход при внутрибрюшинном введении пентоксифиллина регистрируется в дозе 250 мг/кг. Согласно методу Дейхмана и Ле Бланка ЛД50 пентоксифиллина составляет 250 мг/кг. Внутрибрюшное введение крысам соединения М-26 в нарастающих дозировках не приводило к гибели животных в концентрациях, превышающих ЛД50 пентоксифиллина. Считая дальнейший поиск ориентировочной среднесмертельной дозы соединения М-26 для сравнения с аналоговым препаратом нецелесообразным, констатируем последнюю исследуемую концентрацию - 600 мг/кг. Таким образом, соединение М-26 как минимум в 2,4 раза менее токсично по сравнению с пентоксифиллином и относится к IV классу опасности (малотоксичные) при внутрибрюшинном введении по классификации К. К. Сидорова.

Показатели агрегации тромбоцитов при внутрибрюшинном введении крысам соединения М-26 и пентоксифиллина представлены в таблице 6. Анализ

показателей агрегации тромбоцитов демонстрирует аналогичный этапу in vitro спектр антиагрегационной активности. Инъекция соединения М-26 интактным крысам приводит к ингибированию АДФ- (р<0,0001), коллаген- (р<0,0001), адреналин-индуцированной (р=0,007) агрегации тромбоцитов. При стимуляции агрегации данными индукторами отмечается статистически значимое уменьшение скорости агрегации и средних размеров тромбоцитарных агрегатов. При анализе агрегатограмм выявлено статистически значимое удлинение lag-периода (р=0,0005) при агрегации тромбоцитов коллагеном, отсутствие второй волны при применении АДФ в концентрации 5 мкг/мл и ранняя дезагрегация тромбоцитарных агрегатов.

Таблица 6 - Показатели агрегации тромбоцитов при внутрибрюшинном введении

крысам соединения М-26 и пентоксифиллина

№ Показатель Контроль п=7 Пентоксифиллин п=7 Pi М-26 п=7 P

1 Тромбоциты + 1<?/п 724,4 (703,4-741,8) 723,8 (707,1-734,5) 0,7 719,4 (701,3-738,1) Р2=0,7 Рэ=0,5

2 Коллаген, мм 55,9 (53,6-58,2) 51,6 (49,4-54,3) 0,6 5,8 (5,4-6,5) р2<0,0001 рз<0,0001

3 lag-период, сек 62,7 (61,4-64,3) 64,8 (62.4-66,7) 0,3 106,5 (101,6-109,8) р2=0,0005 р3<0,001

4 МРА кол., o.e. 6,5 (5.3-7,2) 5,8 (4,9-6,2) 0,4 1,5 (1,2-1,9) р2=0,0008 Рз=0,0007

5 tg а кол., сек 38,5 (36,9-40,2) 37,6 (35,8-39,1) 0,7 46,8 (44,7-48,7) р2=0,002 Рз=0.0001

6 АДФ, мм 52,4 (47,9-54,3) 28,6 (24,5-31,6) 0,03 17,8 (14,6-18,3) р2<0,0001 рз<0,001

7 МРА адф, o.e. 6,7 (5,2-7,4) 4,2 (3,7-4,8) 0,01 2,1 (1,8-2,7) р2=0,07 рэ=0,004

8 tg а адф, сек 44,7 (41,2-45,4) 46,2 (44,7-48,6) 0,2 54,8 (51,8-56,3) р2=0,03 рз=0,007

9 Адреналин, мм 49,8 (47,6-51,3) 47,6 (46,7-48,4) 0,3 29,4 (27,8-30,6) pj=0,007 Рэ=0,0004

10 МРА адрен., o.e. 4,8 (4,1-5,3) 3,1 (2,7-3,8) 0,01 2,8 (2,4-3,2) рг=0,0005 Рз=0,007

11 tg а адрен., сек 34,1 (32,7-36,5) 38,9 (36,7-40,2) 0,05 47,8 (43,5-48,7) р2=0,0003 Рз=0,002

12 Ристомицвн, мм 57,3 (56,4-59.3) 55,6 (53,7-59.2) 0,7 54,2 (52,5-57,4) р2=0,4 Рз=0,3

13 МРА рист., o.e. 6,2 (5,7-6.6) 4,7 (4,1-5,3) 0,3 5,1 (4,3-6,2) р2=0,5 Рз=0,8

14 tg а рист., сек 47,5 (45,2-49,3) 44,6 (43.2-46,9) 0,6 46,8 (44,7-49,3) р2=0,3 Рз=0,4

Результаты исследования показателей тромбоцитарных факторов Р] и Р4 при внутрибрюшинном введении крысам М-26 и пентоксифиллина в эквимолярных дозах представлены в таблице 7. Из приведенных данных видно, что при внутрибрюшинном введении соединения М-26 статистически значимо снижаются показатели активности тромбоцитарных факторов 3 (р=0,0004) и 4 (р=0,00004).

Таблица 7 - Влияние соединения М-26 и пентоксифиллина при внутрибрюшинном _введении крысам на показатели активности Рд и Р« _

Показатель Контроль п=7 Пентоксифиллин п=7 Р М-26 п=7 Р

Рз, % 83,7 (81,4-85,6) 84,9 (82,3-85,7) Р.=0,7 47,9 (45,6-49,1) pi=0,0004 р2=0,0005

Ps, % после АДФ 89,5 (87,5-92,1) рз=0,001 91,4 (89,5-93,7) рз=0,003 р,=0,6 46,6 (44,3-47,8) рэ=0,3 р1=0,0004 р2=0,00003

Ра, с 2,1 (1,9-2,7) 2,3 (2,0-2,8) р,=0,5 1,1 (0,4-1,4) р 1=0,0007 р2=0,00002

P4.C после АДФ 3,4 (3,1-4,2) рэ=0,003 2,9 (2,5-3,6) р, =0,0001 pi=0,4 1,3 (0,6-1,7) рз=0,2 р1=0,00004 P2=0,00002

Активность таких показателей как AT III, ф-р Виллебранда, а также концентрации D-димеров и РФМК изменений не претерпевали, как и показатели, характеризующие коагуляционный компонент гемостаза (таблица 8). Об этом свидетельствуют и данные тромбоэластографии образцов цитратной крови крыс, получивших внутрибрюшиныо соединение М-26 (таблица 9).

Таблица 8 - Влияние М-26 и пентоксифиллина на систему гемостаза при _внутрибрюшинном введении крысам__

№ Показатель Контроль п=7 Пентоксиф. п=7 Pi М-26 п=7 Р2 Рэ

1. Время свертывания по Г.В.Сухареву, сек 94,2 (91,3-95,3) 98,8 (96,3-99,4) 0,2 117,3 (115,6-119,8) 0,001 0,001

2. Каолиновое время, сек 81,4 (80,3-82,4) 83,2 (81,5-84,7) 0,6 82,1 (80,9-83,5) 0,7 0,4

3. АПТВ, сек 23,1 (21,6-24,7) 23,4 (22,7-24,8) 0,7 21,9 (20,3-24,2) 0,6 0,7

4. ТВ, сск 27,2 (26,4-28,9) 28,3 (27,5-29,6) 0,2 27,8 (26,3-28,9) 0,8 0,3

5. ПВ, сек 12,4 (11,5-13,9) 12.9 (11,5-14,3) 0,3 13,2 (11,5-14,7) 0,4 0,3

6. Фибриноген, сек 24,3 (22,5-26,7) 25,9 (24,7-26,3) 0,2 23,8 (22,3-24,8) 0,8 0,5

7. Рептилазыое время, сек 19,8 (17,5-20,5) 18,6 (16,5-19,9) 0,14 19,1 (17,5-20,4) 0,3 0,2

8. РФМК, г/лх10"2 3,1 (2,7-3,6) 2,9 (2,1-3,2) 0,38 2,3 (2,1-2,6) 0,7 0,7

9. AT III, % 95,4 (94,7-97,5) 97,2 (95,3-98,2) 0,4 96,7 (94,6-97,1) 0,8 0,5

10. D-димеры, мкг/мл 2,2 (1,7-2,6) 3,0 (2,7-3,2) 0,2 2,4 (2,1-2,4) 0,6 0,8

П. Концентрация ф. Виллебранда, МЕ/дл 78,0 (75,4-79,6) 77,4 (75,6-78,9) 0,1 77,9 (77,3-78,4) 0,6 0,7

Показатели тромбоэластограмм крыс, получивших соединение М-26 аналогично группе пентоксифиллина, демонстрируют снижение функциональной активности тромбоцитов - показатель МА снижен в 1,7 раза (р=0,00001) по сравнению с контролем. Это приводит к статистически значимому смещению гемосгатического потенциала в сторону гипокоагуляции. Показатель ТМА удлиняется на 20,5% (р=0,0005), а ТР1 сокращается в 4,4 раза (р=0,00003) относительно контроля.

Таблица 9 - Показатели тромбоэластографии при внутрибрюшинном введении

Показатель Контроль п=7 Пентоксифиллин п=7 Pi М-26 п=7 Р2 Рз

MA, мм 55,9 (51,2-57,8) 49,6 (46,7-52,3) 0,003 31,5 (28,4-33,2) 0,00001 0,0001

ТМА, мин 35,4 (32,4-38,5) 33,4 (32,5-37,3) 0,8 42,5 (38,5-43,8) 0,0005 0,0001

TPI, /сек 15,1 (13,2-17,1) 7,7(7,1-8,6) 0,001 3,4 (2,7-4,1) 0,00003 0,003

А, мм 52,7 (48,6-55,4) 40,7 (36,5-43,1) 0,004 32,4 (31,7-34,5) 0,0004 0,001

Q, дин/см^ 6,3 (5,7-6,4) 4,6 (4,1-6,3) 0,01 2,7 (2,2-3,4) 0,00008 0,0001

LY30, % 0,6 (0,2-0,9) 0,0 (0,0-0,0) 0,8 0,0 (0,0-0,0) 0,3 0,8

CLT, мин 36,9 (32,4-38,3) 36,5 (33,1-38,4) 0,3 34,4 (30,1-36,5) 0,2 0,1

Таким образом, вероятным представляется антиагрегационная активность соединения М-26 в условиях in vitro и in vivo, реализующаяся путем блокирования / ингибирования реакции высвобождения тромбоцитов.

Результаты профилактики коллаген-адреналинового тромбоза при внутрибрюшинном введении изучаемых веществ интактным крысам представлены в таблице 10 и рисунке 2.

Таблица 10 - Показатели выживаемости при моделировании системного коллаген_ адреналинового тромбоза, М±5Р__

Соединение Контроль Пентоксифиллин М-26 Р2

Время жизни, часы 2,0±1,8 165,8±157,6* 236,9±155,2* <0,0001

Примечание: *- уровень статистической значимости различий признаков контрольной и опытной групп (р|<0,01); р2- уровень статистической значимости различий признаков групп, получавших пентоксифиллин и соединение М-26 при 5^=33,1

В группе контроля инъекция взвеси адреналина и коллагена приводила к гибели всех животных в течение 3 суток. При этом более 50% мышей погибло в течение первого часа эксперимента. Легкие, извлеченные после гибели животных, были темно-красного цвета, по всей площади наблюдались множественные тромбы.

Пентоксифиллин статистически значимо (р[<0,01) снижал летальность мышей по сравнению с контролем. Выживаемость в группе пентоксифиллина на 14 сутки наблюдения составила 58,3%. Основной падеж пришелся на первые сутки после введения индукторов тромбоза. Макроскопическая оценка извлеченных легких демонстрирует значительное снижение зоны тромбоэмболического поражения.

В экспериментальной группе животных, получивших соединение М-26, гибель статистически значимо меньше в сравнении с контролем и препаратом сравнения. На 14 сутки эксперимента показатель выживаемости при внутрибрюшинном введении соединения М-26 составил 75,1%. Основная гибель лабораторных животных пришлась на первые сутки наблюдения. Легкие животных, которым вводили соединение М-26, имели нормальную окраску с минимальными точечными потемнениями.

Мс

Рисунок 2 - Показатели легальност и по Каплану-Мейеру при моделировании системного коллаген-адреналинового тромбоза, п=20

Выживаемость животных в группе, получавших соединение М-26, значимо превышала таковую в контрольной группе и на 25% - в группе у животных, получавших пентоксифиллин.

Таким образом, соединение М-26, как средство профилактики генерализованного коллаген-адреналинового тромбоза, эффективнее пентоксифиллина.

Выводы:

1. Впервые синтезированные производные 1-этилксантина проявляют антиагрегационную активность.

2. Увеличение степени окисления серы в положении М7 приводит к увеличению ангиагрегационной активности изученных производных 1-этилксантина. Активность С8-замещенных производных 1-этилксантина снижается

в следующем порядке: циклогексиламмониевыс соли (М-9, М-76, М-26) > морфолиииевые соли (М-5, М-72, М-23) > натриевые соли (М-17, М-81, М-38) > трисаммониевые соли (М-10, М-78, М-29) > калиевые соли (М-11, М-80, М-37) > пиперидикиевые соли (М-4, М-71, М-22).

3. Антиагрегационная активность соединения циклогексиламмониевой соли 2-[3-метил-1-этил-7-(диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио] уксусной кислоты (лабораторный шифр - М-26) в экспериментах in vitro на донорской крови человека превосходит показатели аналогового препарата - пентоксифиллина. На это указывают статистически значимые изменения показателей тромбоэластограмм, снижение агрегации тромбоцитов, активированных основными индукторами.

4. Более выраженное антиагрегационное действие, по сравнению с препаратом сравнения - пентоксифиллином, соединение М-26 проявляет и при внутрибрюшинном введении экспериментальным животным. Полученные данные при изучении действия соединения М-26 и пентоксифиллина in vivo сопоставимы с результатами исследования в условиях in vitro: снижаются показатели функциональной активности тромбоцитов и проявляются маркеры реакции высвобождения тромбоцитов - нарушается высвобождение факторов Pj и Р4, удлиняется lag-период при коллаген- и отсутствует вторая волна при АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.

5. Соединение М-26 эффективнее пентоксифиллина как средство профилактики адреналин-коллагенового тромбоза и как минимум в 2 раза менее токсично.

6. Результаты экспериментальной работы в условиях in vitro и in vivo свидетельствуют о преимущественном действии соединения М-26 как ингибиторе реакции высвобождения тромбоцитов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Камилов, Ф.Х. Поиск активных соединений среди производных 2-[3-метил-1-этил-7-(диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио1уксусной кислоты, влияющих на систему гемостаза / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова, Д.З. Муратаев, Ф.А. Халиуллин // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 9. - С. 254-256.

2. Самородова, А.И. Поиск активных соединений среди производных ксантина, влияющих на адгезивно-агрегационную функцию тромбоцитов / А.И. Самородова, Д.З. Муратаев, Г.А. Тимирханова, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин // «Вопросы теоретической и практической медицины». Материалы 76-й Республиканской научной конф. студентов и молодых ученых, Уфа. - 2011. - Т. 2. -С. 110-111.

3. Гильманова, А.Г. Синтез и антикоагуляционная активность солей 5-бром-2-(тиетанил-3)-1,2,4-триазол-3-она / А.Г. Гильманова, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова, Е.Э. Клен, Ф.А. Халиуллин, Ф.Х. Камилов, Н.Ю. Макарова // Башкирский химический журнал. - 2012. - Т. 19, № 1. - С. 7375.

4. Камилов, Ф.Х. Влияние новых солей З-метил-1-этилксантина на систему гемостаза / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова, Ф.А.

Халиуллин, Д.З. Муратаев // Современные проблемы науки и образования. -2012. - № 6; URL: http://www.science-education.ru/106-7873.

5. Камилов, Ф.Х. Исследование влияния новых производных 2-[3-метил-1-этил-7-(диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова, Д.З. Муратаев, Ю.В. Шабалина, Ф.А. Халиуллин // XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Сборник материалов, Москва. - 2012. - С. 383.

6. Камилов, Ф.Х. Поиск потенциальных антиагрегантов среди производных солей 2-[3-метил-1-этил-7-(оксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова, Д.З. Муратаев, Ф.А. Халиуллин // «Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов». Материалы Всероссийской молодежной конференции, Уфа. -2012.-С. 81-82.

7. Самородова, А.И. Исследование влияния производных З-метил-1-этилксантина на функциональную активность тромбоцитов / А.И. Самородова, Д.З. Муратаев, Г.А. Тимирханова, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин // «Вопросы теоретической и практической медицины». Материалы 77-й Республиканской научной конф. студентов и молодых ученых, Уфа. - 2012. - Т. 2. - С. 152-153.

8. Самородова, А.И. Исследование влияния новых производных 2-[3-метил-1-этил-7-(диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты на коагуляционный компонент гемостаза in vitro / А.И. Самородова, Д.З. Муратаев, Г.А. Тимирханова, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин // «Медицина и фармация XXI столетия - шаг в будущее». Материалы 72 научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, Запорожье. -2012. - С. 223-224.

9. Самородова, А.И. Поиск соединений, влияющих на систему гемостаза, среди производных солей З-метил-1-этилксантина / А.И. Самородова, Д.З. Муратаев, Ю.В. Шабалина // «Итоги и перспективы молодежной и фармацевтической науки». Материалы Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию БГМУ, Уфа. - 2012. - С. 314-316.

10. Камилов, Ф.Х. Антиагрегационный эффект производных З-метил-1-этилксантина / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова, Д.З. Муратаев, Ф.А. Халиуллин // «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». Материалы Ш Международной научной конференции, Казань.-2013.-С. 141-142.

11. Камилов, Ф.Х. Поиск зависимости «структура-активность» производных тиетансодержащих гетероциклов в отношении коагуляционного звена гемостаза / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова, АР. Халимов, Е.Э. Клен, А.Р. Валиева, Ф.А. Халиуллин // Тезисы докладов IX всероссийской конференции «Химия и Медицина», Уфа. - 2013. - С. 274-275.

12. Камилов, Ф.Х. Характеристика гемостатнческой активности циклогексиламмониевой соли 2-[3-метил-1-н-пропил-7-(1Д-диоксогистанил-3)ксангинил-8-тио] уксусной кислоты / Ф.Х. Камилов,

Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова, Ф.А. Халиуллин, РА. Губаева // Казанский медицинский журнал. - 2013. - Т. 94, № 4. - С. 549-552.

13.Камилов, Ф.Х. Антиагрегацнонная активность новой диклогекснламмониевой соли на основе 1-этилксантина на систему гемостаза в условиях in vitro / ФХ. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова, A.B. Самородов, Ф.А. Халиуллин, ДЗ. Муратаев // Казанский медицинский журнал. - 2013. - Т. 94, № 5. - С. 692-695.

14. Самородова, А.И. Влияние солей 2-[3-метил-7-(оксотиетанил-3)-1-этил-ксантинил-8-тио]уксусной кислоты на систему гемостаза в условиях in vitro / А.И. Самородова, Д.З. Муратаев, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин, Г.А. Тимирханова // «Вопросы теоретической и практической медицины». Материалы Российской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием, Уфа. - 2013. - С. 101-104.

15.Пат. 2504546 РФ Циклогексиламмониевая соль 2-[3-метил-7-(1,1-дноксотиетанил-3)-1-этилксантинил-8-тио]уксусной кислоты, проявляющая антитромбоэмболическое действие / Ф.А. Халиуллин, Д.З. Муратаев, Ю.В. Шебалина, Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова. - Уфа, 2014. - 5 с.

Используемые сокращения:

АДФ - аденозинди фосфат

АПТВ - активированное парциальное тромбопластиновое время AT III - антитромбин III ЛД50 - 50% летальная доза ПВ - протромбиновое время

РФМК - растворимые фибрин-мономерные комплексы

Соединение М-26 - циклогексиламмонивая соль 2-[3-метил-1-этил-7-

(диоксотиетанил-3 )ксантинил-8-тио] уксусной кислоты

ТВ - тромбиновое время

ТЭГ - тромбоэластография

ГП ИЬ-Ша - гликопротеин ПЬ-Ша

Р3иР<-тромбоцитарные факторы 3 и 4

МА - максимальная амплитуда - характеризует функциональную активность тромбоцитов, максимальную прочность сгустка

ТМА - время формирования устойчивого сгустка до максимальной прочности G - фактическая мера прочности сгустка А - расчетная прочность или эластичность сгустка TPI - индекс тромбодинамического потенциала

LY30 - процент, на который уменьшается величина сгустка в течение 30 минут после достижения МА. CLT - время лизиса сгустка

На правах рукописи

Самородова Альбина Илдаровна

ПОИСК НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 1-ЭТИЛКСАНТИНА, влияющих НА СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗА

14.03.06-Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2015

Лицензия №0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 17.01.2015 г. Бумага офсетная. Отпечатано методом ризографии. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Уч.-иэд.л.1,5. Тираж 100 экз. Заказ №008

Типография ГБОУ ВПО «Башгосмедуниверсктет» Минздрава РФ 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3

1 5-- 1 878

2014356832