Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль нейтрофильных гранулоцитов в регуляции функциональной активности тромбоцитов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Р Г Б ОД

1 0 вд 1925 На пхюах рук™

ТХАЧЕНКО Сергей Борисович

РОЛЬ НЕЙТРОФНЛЫШХ ГРАНУЛОЦИТОВ Б РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ

14.00.16 - патологическая физиология

Аоторссрерат диссертации на соискание ученой степени дсктсра медииокких наук

Томск - 1996

Работа выполнена на кафедре общей патологии и патологической физиологии Российской Медицинской Академии Последипломного Образования Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор А.А.КУБАТИЕВ

академик РАМН И.П.АШМАРИН

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор А.М.ДЫГАЙ

доктор медицинских наук, профессор Ю.Б.ЛИШМАНОВ

доктор медицинских наук, профессор В.С.ЛАВРОВА

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Научно-исследовательский институт общей

патологии и патологической физиологии РАМН (г.Москва)

Защита диссертации состоится " "_1996 г.

в_часов на заседании специализированного совета Д084.28.02

Сибирского государственного медицинского университета (634050 г.Томск, Московский тракт, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Сибирскогс государственного медицинского университета (г.Томск, пр.Ленина, 107

Автореферат разослан " "_1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук,

Н. А. Бражника ва

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОЕДЕТ-Ш. Последняя четзертъ еока характеризуется зрастакнаим вниманием сло/^алиотов к проблемам громбсциторного мостаса (З.С.Баркаган и др.,1909; ЕЙ.Чазов и до.,1991; А.А.Кубати-,1995; К Мeyers,К.J.Warскор, 19 S1). Померз накопления научных фактов ановится все более очевидным, что, помимо гндотелиальных клеток овеносных сосудов и плазменных компонентов кроет, в регуляции фун-ионального состояния тромбоцитов принн^лают кстигноо участие прах-чески все клетки крови, включая езритроциты, полимерфоядерные лейко-пы, лимфо^ты, моноцучы {Н.В.Мапзхова и др. ,1955; F.A.Nicc!¡nj¡etci.,1SS0; S.Sharp et al.,1994).

Показано, что нвйтрофильныэ гранулоциты (нейтрофипы), состгзлшо-лв ведущее звено неспецифической резистентности организма, now/vo •оей основной антиадлкробной функции способны готтаярозать или иига-|ровать агрегацию и секрецию тромбоц^тгоз, вовлекаясь таюш обрггом з эханизмы гемостаза и тромбообразования (К.Вуко\?лз!<а et , 19S3; Р. М. Henson, 199Q; A. J. Mar cus, 19S0). Среди возможных путей блия-1Я нейтрофилов на тромбоциты в литературе рассматриваются пличные продукты их секреции (актагньгв метаболиты кислорода ротеиназы.катионные белки,продукты г/отйболмзг,а эрзхидоновой юлоты,аргинина и другио)(Р^.А.8сИайпег et a!.,1930; A.Zatta ot ,,1990,1991 ;C.LaRosa ©t al.,1994). В то jse врзмя кга&ннзгод слияния ногих из этих веществ на тромбоциты остаются малоизученными.

В последние годы из нейтрофилоз человека и других ¡ллзкогситагацдох »¡делен ряд неизвестных ранее веществ пептидной природа, к котором гносятся дефенсины, протетрины, профенин, FR39X и кзкоторыэ другие ¡.Н.Кокряков и др., 1989,1993,1995;R.I.Lehror et al.,19S0^993;S.Harwig ct .,1995). Основной акцент в исследовании этих ввщэстг делается на кх ггимихробные свойства. Однако практически вне поля зрения кослэде гатей остаются такие проявления биопопеч" с::ай гхтапнзета негьк полн-эптидов, как влияние на клеточно-гуморапьнуе мэхгкязал-» гемостаза. В 1тературэ имеются единичные сведения, касшои^вся кортихостатичос-)го действия дефенсинов, их влияния на функции моноцитов, фибр'/иоли-чческую активность крови, что сгидэтэльстауот о биорзгуг«г,то{зньк сес-п-гвах этих веществ (И. П. Ашмарин и др., 1980,1991; Н. И. Мнсуно и до. ,'1932; .В.Шамова и др.,1993; A.Singft et ai.,1988). В то г.э ера--,;з влияние эфенсинов, протегринов, профзкина, PR39X на тромбоциты кз иоследо-

1лось.

зучение влияния антимикробных полипептидов нейтрофилоз на фуж-иональную активность тромбоцитов прэдетйзляэт интерес из только з

плане выяснения механизмов взаимодействия нейтрофилов тромббцитов.но также для поиска эффективных путей фармакологическс коррекции изменений тромбоцитарной активности. В последние год: описано мно- жество новых природных и синтетических соединений пе| тидной природы, обладающих высокой активностью в регуляции различнь биологичзскмх процессор Р.П.Евстигнеева и др., 1993, 1935; У.Уаглато!

3.Бо^ки, 1993). Результаты недавних исследований показали, что неко* рые из этих ое- цдеств (производные Ьаргинина, низкомолекулярнь имидазолсодержащие соединения, карнозин, карцинин) являются эффе тивныУЕМ регуляторами тромбоцитарной активности (Р.П.Евстигнеева др.,1994,1995). Полу- ченные данные послужили основой для изучен! влияния этих веществ на изменения функциональной активности тромб цигов, стимулированных ан- тимихробныым полипептидами нейтрофило

Выяснение характера изменений функциональной активности тромб цитов под влиянием нейтрофилов, а также их антимикробных полипепт дов, механизмов и путей регуляции является необходимым условием д понимания патогенеза внутрисосудистого тромбообразования, поиска п тей его успешной терапии и профилактики.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНА Л. Целью работы являлось изучен! влияния нейтрофилов и их антимикробных полипептидов на функционал ную активность и метаболизм тромбоцитов, а также поиск новых биолог чески активных соединений, регулирующих изменения функции тромбоц тов, вызванные этими полипептидами.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оценить влияние нэактивированных, а также стимулированных аг кистей нейтрофилов на функциональную активность тромбоцитов чел века.

2. Изучить влияние сушарной фракции дефенсинов, а таюхе ее комл нентов на функциональную активность и метаболизм тромбоцитов челов ка.

3. Провести сравнительную оценку влияния дефенсинов человека кролика на функциональную активность человеческих и кроличьих тромб цитов.

4. Исследовать действие антиг^икробных полипептидов протегринов, про« енмна, РгШХ, а также катепсинав, эластазы, лахтофвррина, ксадлоперс сидазы, выделенных из нейтрофилов человека и других млекопитающих, I функциональную активность и метаболизм тромбо- цитов, сравнить эффекты мэзду собой, а таше с влиянием на эти клетки дефенсинов.

5. Сравнить изолированное и комбинированное влияние на тромбоциты 5Лов©ка антик^исробных полипептидов кейтрофилоз.

6. Выяснить характер морфологических изменений тромбоцитов под 1ИЯНИ8М антимикробных полипоптидов нейтрофилоз.

7. Провести поиск биологически активных веществ в ряду новых нмгко-злвкулярных соединений пептидной природа, рзгулкруюиу^х влип- кке 1тимикробных полипептидов нойтрофилов на функциональную GK- TVÜ3->стъ тромбоцитов человека, и сравнить их эффекты с действием широко этользуемых фармакологических препаратов с антиагрегаци- окнь&ли !ойства?л1.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые представлены сведения о принципиально эвых свойствах антимикробных попипэптидов нейтрофилоз, захлючазо-ихся в регуляции функциональной активности тро?дбоцитоз. Прозедзна денет влияния двфенсинов, протогрина, профонина, PR39X, кате/гся- на , эластазы, лактоферрина и мдалопероксмдазы на структурно-фун- kuvío-зшьные характеристики тромбоцитов человека, а таюке биохкд/ги- чэ«©ю эказатели их активности.

Отмечено сходство в характере влияния дефенданоз человека и про->грина Р6-2 на агрегацию и секрецию троглбоцитоз. Обладая проггре-щионной активностью в высоких концентрациях, эти полипэптоды по-шляют агрегацию и секрецию тромбоцитов в кизккх концентрациях, что :азывает на выраженную дозозависи^тасть эффектов дсфенскнсз и про-)грина на тромбоциты человека.

Впервые проведено сравнительное изучение влияния дефенсикэо че-эвека и кролика на функциональную активность тромбоцитов. Устаноз-зно, что дефенсины человека и кролика вызывают однонаправленные эзозавнсимые изменения функциональной активности трог/.боцэтаз. При гом проагрегационная активность дефенсиноз кролика выражена сипь-эе, чем у двфенсинов человека. Показано, что в реализации проагрэ-«дионных и антиафегационных аффектов на тромбоциты сутоларной фрак-1и двфенсинов человека, состоящей из трех осноенье* компонентов (HNP-2 и 3), ведущую роль играет дефенсин HNP-1. Влияние суг^лэрной ракции двфенсинов кролика (NPs) на троглбоциты также определяется в шовном эффектом изолированного двфонсина NP-1. ыявлены проагрепационные свойства у профэнина и РНЗЭХв отноше- кии ггивированных трогндбоцитов. Установлена повышенная активность этах элипептидов при действии на тромбоциты, стимулированные ЛПС Saírno-з!!а iyphimurium, по сравнению с другими трвмбоцитарныьли г.гок^отг>.;-'..

Бпзрзыэ показано ко&йбинированное влияние на аграгационную г иостъ тромбоцитов одновременно нескольких антимикробных полип дов кайтрофклов. Дефенсикы, протегрин, профенин, РНЗЭХ, катепс властаза. и лахтоферрин способны не только самостоятельно из «л агрегацяонную активность тромбоцитов, но такхсе модулировать трем? тарнью еффееты других попкпептидов из этой группы.

Впервые с применением сканирующей электронной михроскопии коалеко, что дефенскны человека и кролика, протегрин в высоких ког-трациях, а таяке катепсин С вызывают морфологические изменения т боцмтов человека, включая их форияу, характер поверхности, форми? низ псевдолодий, а таохе образование клеточных агрегатов.

Впервые прозедзка ко:лтлексная оценка влияния дефенсинов, пр< рина, пр&фенина, РП39Х, катепсина в и эластазы на метаболизм ара* козой кислоты, уроовкь циклических нуклеотидов, цитоплазматичес кальцля и величину мэмбранного потенциала в неаетизированныхтро; цитйх, а также клетках, стиуг/лмрованных ггонистами. Величина и нал лввность атизс сдвигов определяется используемой концентрацией п пептидов и исходным состоянием клеток.

Продемонстрированы принципиально новые возможности ингибир кия агрегации троеуйоцитов, вызванной дефенеинами, протегрином, ка сином 6, профенином и РП39Х, с использованием вновь синтезировав иизкомолэкулярных соединений пептидной природы. Антиатрегацио)-действие этих соединений на тромбоциты превосходит аналогичные фекты ацетилсалициловой кислоты и селективного ингибитора тромбе тарной щшюоксиганазы ибустрина.

Впэрзые показано, что дефэнемн человека НМР-1, катепсин 6 и РЕ потенцируют агрегацию тромбоцитов, стимулированных природнымпк динсодержащям дкпептидом карнозином. Антиагрегационные свойс протэфина и эластазы проявляются в отношении тромбоцитов, активу ванниЕХ природным тстгминсодержащим дипептидом карцинином, тс дефенсин НМР-1 и катепсин 6, напротив, усиливают агрегацию тром цитов, вызванную отим веществом,

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Получанные в ра те принципиально новые факты о регуляторном влиянии антимикроб! полипептидоз нейтрофилов на функциональную активность тромбоцит их експершлзнтальный и теоретический анализ относятся к фундамента ным патофизиологическим разработкам. Научная значимость работы оп делштся новизной полученных данных и актуальностью проблемы. Решаемая в исследовании проблеяла является обоснованием нового п* спэгсткгного для теоретической и клинической медицины направления

задача которого состоит в изучении биорэгулятормых свойств анти-«ифобных полипептидов нейтрофилоз. Целесообразность развития •того направления обосновывается фактические данные диссертации, ;аидетельствующими о том, что дефенсины, протегрины, профенин, 'ИЗЭХ, катепсин б, эластаза и лактоферрин нейтрофилов человека и *ругих млекопитающих, помимо антимикробных скойстн, участвуют в югуляции функциональной активности тромбоцитов. Результаты проведенных исследований конкретизируют и развивают существующие представления о влиянии нейтрофилов на функции тро**5оцитоа, а также мэ-¡анизмах екутрксосудистого тромбообразованяя. Представленные в ра-гате сведения о влиянии дэфенсинов, протегринов, профенкна, РйЗЭХ, атепсина в, эластазы на метаболизм арахидоновой кислоты, обмен еретических нуклеотидоз, уровень цитоплаз^тичеекого кальция, величину лембранного потенциала, структурные изменения тромбоцитов могут ;лужить основой для понимания и дальнейшего изучения механизмов, ■чгстзугои^чх в изменениях функциональной активности тромбоцитов, 5ыз0онных антимикробными попипептидами нейтрофилов.

Прикладное значение полученных результатов состоит в возлйожности ?чета модулирующего влияния антимикробных полипептидов нойтрофи-юв на функции тромбоцитов при различных патологических состояниях, 5 основе которых лежат нарушения cy.CTe.vb! гемостаза. Результаты исследования могут служить обоснованием причин трембообрззоагнмя при юспалении и других патологических процессах, сопровождающихся лей-социтозом, актватей нейтрофилов и секрецией содержимого их гра-1ул. Важным в практическом отношении фактом является обнаружение неизвестных ранее ингибиторов агрегации тромбоцитов в ряду нопых зинтотических низкомолекулярных соединений пептидной природа, ах-гивных как на фоне классических тромбоцитарных агснистов, тгк и антимикробных полипептидов нейтрофилов, что открывает существенные терспективы для разработки эффективных фармакологических средств с знтиагрегационными свойствами.

Установленные в работе закономерности и мэхгнизмы влияния антимикробных полипептидов нейтрофилов на функции тромбоцитов могут Быть использованы в лекционных курсах на кафедрах медико-биологического профиля ВУЗов, а также в соответствующих пособиях и руководствах.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЗХВМЯ, ВЫНОСИМТЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Нейтрофилы оказывают качественно неоднозначный эффект на функциональную активность тромбоцитов, характер и направленность которого определяется исходным состоянием нойтрофилов и тромбоцитов, а также их количественным соотношением.

2. Антшшкробныэ полипептиды нвйтрофиг.ов модулируют функцио иальиую аогчЕНость тромбоцитов. Величина и направленность влияни: дефенс>:кое, протсгринз и эластазы на тромбоциты характеризуются выра ;хэннэй дозоьаЕ-исимостью с проагрзгаь'иэннои активностью в высоки: концентрациях и антиагрогациокныгии и Ентисекреторными свойствам I низких концентрациях. Катепспн 6, профзнин, РпЗЗХ и лактоферри! вызывают однонаправленное повышение агрэгационной и сэкреторно! аетганости троьлбоцятов.

3. Дефонсикы человека и кролика обладают близкими свойствгшл I рэгуладли функциональной аетмзности тромбоцитов, зависящими от кон центрац'/.и полкпептидоа, исходного состояния тромбоцитов и врз^зш вэак:ло действия дэфексдаов с трс-ч'.боцитауи. В реализации аффекта

фракцж дофепсмноа человека (НЫРе) и кролика (МРв) н; тро^сциты основная роль принадлежит их комтонента*! НЙР-1 и МР-1.

4. Дофе:гх.ны, протегрин, профвнян, РПЗЭХ, катэлеин е, эластаза I лгхтофер-ркн способны не только самостоятельно оказывать влияние н; агрог£ь'»юнку;^ Еисгиа-юсть тромбоцитов, но также ьсодулкрозать троглбоци-тарные сффехты других антимикробных полмпептидов нэйтрофилов. Наиболее значительные сдвиги функциональной активности тромбоцитоз вы-зьгв&от коы'.а'ли.зц!-;,"« дэфэнениов и протегрика.

5. Антиуа-кроЗниэ полипептиды найтрофилов (дэфенсушы, протегрин профенш, РПЗЭХ, катепши 6, ©ластаза) вызывают дозозазисийше изменения [¿этабэшзма арахидэнозой кислоты, уровня циклических нуклеоти-доз. и цитоплазглатичоского кальция, величины мзмораккого потенциапг нвактуширэо&кных или стж>^пмровак;1ьж атомистами тромбоцитов, а также гларфопогечоскиэ изменения этах клаток.

в. Синтезированы новые низком© лекулярные соединения пептидно! природы, икгабируоддое агрзгац/,;о троьйоцитоз, вызванную дэфенсина-т\, протегркном, катепсиком 6, профеникогл, РВ39Х, и превосходящие пс антиггрегацганной гхтианости ацетилсалициловую кислоту и ибустрин. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Матерг-галы диссертации доложены на 12-Международном конгрессе по трогаозу (Флоренция, 1992}; 3-ежегодном заседание Европейского клуба по нейропап7>вда:л(Кем5р>5да,1583); Меходународноу конференции « Клетки и цитокины при легочном воспалении»( Париж, 1963); Международном конгрессе по воспаязнию(Вена, 1993); 52-Международном конгрессе Европейского общества по атеросклерозу (Иерусалим, 1993}; XVII Международном конгрессе по Енатс»1чесхой и клинической патологии (Акапулько, "9ЭЗ}; XIV Конгрессе международного общества по тромбозу и ге;/.оетазу (Н»ю Йорк, 1993); 11-Всемирном конгресса по £;'!тк./.',:,фоБ;-;и';!у1 и противоопухолевом прзпэратамрКенэеа, 1994}; ^»-ежегодном заседании Езропейского клуба по нейропептидам

(Страсбург, 1S94); 6-Конгрессе Европейского общества по юку( Стокгольм,! 994); 2- Научной конференции Европейского общества по лмиотерапии(Коимбра,1994); 6-Всемирной конференции по воспалению, нтирзвматикам, аналгетикам, им?луномодулптораад (Женева, "I9S5). ПУБЛИКАЦИИ. По тегч^е диссертации опубликована 21 печатная работа. ОБЪЕМ И CTFYSOyPÄ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 315 фаницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литэрату-ы, описания материала и методов исследования, шести глаз собственных энных, обсуждения полученных результатов, гызодса и списка использо-анной литературы. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 20 таблицами, казатель литературы содержит 62 отечественных и 380 иностранных сточникоз.

СОДЕРЖАНИЕ. РАБОТЫ

Мате-оуел и t/этогги нссгезяоаякка

В работе использована кровь здоровых донороз-мужчин, а также кроли-ж-самцов породы серая шиншилла массой 2-3 кг. репараты дефенсинов человека и кролика, а та-охе протегрин, профенин, R39X свиньи были выделены из лейкоцитарной фракции хрэвм, очищены охарактеризованы по стр>/,стурно-фун.!сциснапьным свойствам группой •иериканских и российских ученых на базе Калифорнийского университета Ьс-Агекелес) (Т. Ganz etal.,1985; М. ESelsted et al., 1984,1985; V. N.Kokryakov tal,,1993;S.S.L.Harwig etal.,1993,1995). По данным описавших эти вещее-га авторов, дефенсины представляют группу гомологичных пептидов, у»ют молекулярную массу 3,5-4кД и состоят из 29-34 аминокислотных зтат&ов, среди которых много артнина и цистеина. Они способны повреж-зть широкий спектр прокариотических и эукарио гических клеток. Протег--1ны состоят из 16-1S аминокислотных остатков, богаты цистенном и лэ!ЭТ молекулярную массу 2кД. Они сочетают в своей первичной струхту-э признаки дефенсинов кролика и антимикробного вещества из гемоцитоа эрского краба -тахиплезина, обладая антибактериальной, противогриб-)Вой, антигерпетической и ендотоксиннайтрализутощей активностью in [то. Профенин (молекулярная масса дкД) имеот высокое содержание линокислот пролика и фенилаланина, что послужило основанием для его ^звания. Профенин обладает избирательной активностью в отношении coli. PR3SX богат аминокислотными остатками пролина и аргакина и иэет молекулярную массу 4,7кД. Установлены летальные концентрации 339Х против шести грам-отрицательных и четырех грам-положительных адов бастерий. Катепсу-.н G, зпастаза, лактоферрин

лагстоферрин, ьачелопероксидаза были выделе- ны из лейковзвес крови чоловака, обогащенной н а й тро ф и пьн ыми гранулоцитами, и очищень в Отделе общей патологии и патофизиологии ИЭМ РАМН(Санк Потербург)(Л.Н.Краетаи др.,1988;В.Н.Кокрякови др.,1SS2,1908).* Бпро веденных Екслерммэнтах использованы сушларные фракции дефенсино! человека (HNP-1,2 и 3) и кролика {NP-1,2,3a,3b,4 и 5), а также их компонеи ты НМР-1 и NP-1, как наиболее активные по антимикробным свойствам i алектрофорэтической подаижности.

Синтегмчзские и природные низкомолекулйрные соединения пептид ной природы были синтезированы по разработанным в Московской Го су дарственной Академии тонких химических технологий имен! М.В.Ломоносозасхомгхлспривйненизм класса

синтеза с высокими выходами вещества и полностью охарактеризован* физико-хиш1чоскими методами (В.И.Унковский и др.,1982,1986 Р.П.Евстигкоеса и др., 1993).*

Забор крови у доноров производили путем веиопункции. У кролико кровь получали из краевой вены уха методом взносегации. В качает» шткшагулянта использовали 3,8% (0,11) водный раствор лимоннокислого натрия или 0,5 М ЗДТА в зависимости от исследуемого показател?^ Тромбоциты выделяли из крови методом центрифугирования (J.F.Mustar et al.,1972). Для изучения агрегации троглбоцитов использовали фото мэтричэский метод G.V.R.Bom(1952) в модификации J.R.O'Br¡en(1962; Оценку агрегации троглбоцятоа производили на люми-агрегометре «PICA модзль> 330(Chrono-Log Corpcraüon.CLUA), а также даухканальиом arpero штрэ LaborАРАСТ(Германия) с графической регистрацией и автоматичес кой калькуляцией амплитуды (в %) и максимальной скорости агрегации ( %/мин). Агрзгационную активность тромбоцитов изучали как в плазме, та и в суспензии отшитых клеток. В качестве индукторов агрегации тромбоци тов использовали тромбин (0,1 ;0,5 и 1 Ща/мл), коллаген( 1 и 4 шг/мп' элинефрян( 1 и 5 мкМ), липополиегхарид (ЛПС) ©ндотоксина SalmoneB typh¡rnuriisn(100,200 и400 MKr/MLnXSigma), а так- же АДФ(1 и 5мкМ)( Eastman' Мнгибировакив агрегации тромбоцитов осуществляли при помощи ацетил салициловой кислоtbi(Lachema,Чехия) в конечной концентрации 1мМ ибустринг(1!Ндобуфен)(Рагт;Ьа:!а,Саг!оЕгЬа, Италия) в конечной концентра ции 100мкг/мп. _____

* Автор выражает благодарность д.м.н.Кокрякову В.Н. и члену-коррес пондэнту РАН, профессору Еастигнеевой Р.ГТ. за любезно предоставлен ны© препараты антимикробных полипептидов нэйтрофилов и синтезиро ванные низколгалекулярныо соединения пептидной природы.

Выделение нейтрофилов из кров»* осуществляли по методу A.Boyum 1968) в модификации R.Hjorth и др.( 1981} при помощи градиента плотнос-и использовали Percoll(Pharmacia,Uppsala,Швеция). Агрегационную астиз-ость нейтрофилов оценивали фотометрическим методом на агрегомэтрэ aborAPACT(A.Turgiev,A.Kiibatie'v',19S1) В качестве индукторов агрегаиии юйтрофилов применяли N-формил-метионил-лейцнл-фекилалан'лн ФМЛФНЭдта) вконечной концентрации 1мкМифорбол-ь«ристат-ацзтат £>MA)(Sigma) в конечной концентрации 1 ООнет/мл. Характеристика агрега-ограмм осуществлялась по тем же параметрам, что и в экспериментах с грегацивй тромбоцитов.

Секреторную активность тромбоцитов оценивали по выделению этими летками АТФ. Секрецию тромбоцитам АТФ регасгриравалмодноврэмен-ю с записью их агрегации на люминесцентном какало ырегсьгатра при юмощи Chrono-Lume реагента люциферин-люциферазы (Chrono-Log) и стандарта АТФ той же фирмы (R.D.Feinman ©t el.,1935).

Изменение формы тромбоцитов регистрировали с помощью сханирусо-цей электронной микроскопии. Тромбоциты фиксировали 2,5% глутаро-¡ым альдегидом, приготовленным на 0,15М какодилатном буферв(рН 7,2-',4). После фиксации материал подвергали быстрой депадратации в спир-ах восходящей концентрации и окиси пропилена. Образцы напыляли углем, ! золотом по стандартной методике (Л.Д. Крымский и др., 1976). Препараты ipoсматривали на электронном ми!фоскопе JSM-35C.*

Уровень малонового диальдегида (МДА) в тромбоцитах определяли ¡пектрофотометрическим методом, разработанным J.B.Smith идо.(1975).

Метод основан на количественном определении триметинового окра-иенного комплекса, образующегося при высокой температуре в кислой ¡реде в результате реакции МДА с 2-тиобарбигуровой кислотой. Образцы (ютометрировали при длине волны 532 нм на спектрофотометра фирмы Jeckman, модель DU-50 (США).

Количественное определение содержания циклическая нуклеотидов... цАМФ и цГМФ), полученных в результате их спиртовой экстракции из тромбоцитов, проводили методом иммунофврмзнтного анализа при помо-ци специальных наборов реагентов фирмы «Биошмуноген». Метод осно,-5ан на конкуренции между фиксированным цАМФ или цГМФ и свободным в калибровочной пробе или анализируемом образце) циклическими нукло-. этидами за активные центры сзязызания аффинных кроличьих антител к лАМФ или цГМФ соответственно. Оптическую плотность образцов_

"Автор благодарит д.м.н.Филипенко Л.Н. зэ помощь при выполнении электронно-микроскопических исследований.

измеряли на спектрофотометре вертикального сканирования «Microp!at< Reader a dynatech product №Я600»(Англия) при длине волны 492 нм Концентрации цАМФ и цГМФ рассчитывали по калибровочной кривой построенной с использозанием прилагаеммхв наборах стандартов сизвео тным содор^хахием цнхгшческкх нуклеотидов.

Уровень тромбсксака В2(ТХ32), являющегося стабильным метаболита ТХА2, определяли рздгюимздункым мэтодом по W.Hamberg и др.(1975) i жхюльзоеанйзм специальных набороз для радяоим^унного исследован«: i-ThrciTiboxsnQ 82 (Arnersham, Англия}. Радиоактивность образцов опреде ляли с помощью raV;Ma-04ST4KKa(LK3,Швеция). Содержание ТХВ2 в образ цач' рассчитывали по калибровочной кривой, построенной с использовани &1Л прилагаемых к набору стандартов с извэстныгд содврх<анием ТХВ2.

Цитгоплазштич8С5а1ЙСа2+ тромбоцитов (ках базапьный, так и индуцмро вглнкй агонистеш!) определяли флуориметрическим методом (R.Y.Ta en,"iSSI). В качества флуорэсцзнтного кальциевого зонда использовал! ацетокаямзтильный сфир Fura-2 (CalbIocbem,CLUA). Флуоресценцию ре ¡а-;сгрирэзаги1 на слектрофлуориштре «КйасЬ!-3000»(Япания) в твр;лоста тмругкльсс luOEovax при 37 С и непрерывном перемешивании. Длины вол; еозбувдзшя и га-мссии 350 нм и 500 нм.

Потенциал плазматической мокзбраны тромбоцитов определяли с по мощью положительно зар$окенного флуоресцентного зонда 3,3'-дипро пил- 2,2'-теодикзрбоц11анкниодида (dis-C3-(5)}, согласно методике, ото санной pcriso (П.В-Аздонкн и др.,1990; П.В.Авдонин,В.А.Ткачук,1994] Фл7оре.сцанц!.ко регистрировали на спектрофлуоримзтре «Kitachi-3000 (Японии) при длинах волн возбуждения и эмиссии соответственно 650км 575 нка Измерение величины мембранного потенциала проводили п методу, описанному psnee (П.В.Авдонкнидр.,1985). Для этоговсуспекзш гроийоцуггоа добазляли калиевый ионофорвалиномицин (2мкМ), что гцж водило к гшерполяризации мембраны и уменьшению флуоресценци зонда- Затем ступенчато повышали концентрацию KCl в среде, ме- ня таким образом потенциал мзмЗргны. В области от-75 мВ до ОмВфлуорэс ценция практичQC5Ö1 линейно зависела от его величины.

Результата исследований обрабатывали с помощью методов вариационной статистики. Достоверность различий между фуппами оценивала используя 1-крятер»й Стьюдзнта (Н.А.Плохинский,1970) или Т-критери Вилкокссна (БВ.Гублер,! S78).

Результаты crccna?;or;mrdi

влияние нй?пгрсф*шоз на фунщионапьюяо акгйекость

ТРОМБОЦИТОЗ ЧЕЛОВЕКА Для оценки влияния нейтрофилов на функциональную активность тром-¡оцитов проведено три серии опытов. В порзой изучено влияние натизкых юйтрофилов человека на агрегацию донорских тромбоцитов. Во второй ¡ерии оценен эффект активированных агонистздли нейтрофилов на агра газонную активность тромбоцитов. Кроме того, исследовано влияние на ромбоциты супернатанта активированных нейтрофилов, чощ посвящена ретья серия {экспериментов.

Агрегация троллбоцитов в первых двух сериях опытов измерялась пр/. »отношении нейтрофилов с трояЖэоцитали 1:30; 1:80 и 1 :S0 и постоянном ;оличестве тромбоцитов (2,5X10 s 1 г дел). Проведенные исследования юказали, что агрегация тромбоцитов, индуцированная агонистали (колла-ен, тромбин и АДФ), подавлялась в присутствии в исслэдуе'лсой срздэ ¡ейтрофилов. Еыло отмечено, что величина имгнбкрсвания тро^аоцгтпцо-юй активности существенно зависит от вида используемого агонистз, »отношения нейтрофилов и тромбоцитов, а также продолж«- телькости инкубационного периода.

Соотношение нейтрофилов с тромбоцитами, при котором отмечался t£Kболее Еь:рг>:;екный эффект ингибировгния агреггдки тро^-Зоцитоз, ¡ызвгиной коллагенов¿¡лет/мл), составило 1:30. При такой пропорции количества клеток амплитуда idc агрегаоии снижалась в среднем на 63% р<0,01). На фоне дальнейшего уменьшения числа нейтрофилов по отко-иению к тромбоцитам ингибпрование агрегации последних становилось ланее выраженным. Так, в соотношении числа исслздуегмШ клеток 1.50, юдазление агрегации тромбоцитов, вызванной коллагеном, составило в реднем 37%(р<0,05), а при 1:90 - амплитуда агрегации клеток достоверно ю отличалась от контрольной величины (в отсутствии нейтрофилов). При гвеличении времени инкубации клеток(2; 5 и 10 »¿мнут) ингибирующий эффект нейтрофилов на агрэггциенную активность тромбоцитов возрастал. ю сравнению с контролем при всех исследованных соотношениях клеток 1 был максимальным в условиях 10-уинутного периода инкубации. Агрегация тромбоцитов, вызванная тромбином (0,5ЕдД.;л), также подавляюсь в присутствии нейтрофилов. Иигибирующее влияние на агрегацию громбоцитов усиливалось при увеличении числа нейтрофилов. Так, при тзменении соотношения количества нейтрофилов и тромбоцитов от 1:60 Ю 1:30 акстлитуда агрегации клеток снижалась в среднем соответственно 18%(р>0,05) и 37%(р<0,05). В то »е время в присутствии в исследуемой суспензии 1 нейтрофила на 90 тромбоцитов изменения

илчлитуды агрегации не отмечалось. Подавление тромбин-индуцир важной агрегации тромбоцитов в присутствии нейтрофилов в меньш< степени закисало от времени инкубации кпэтох, чем на фоне коллагена, ккгзпо моего nvnîjb при максимальном увеличении числа нейтрофиЛ( (1:30). Е этих уолозиях после 2 и 5 микуг инкубации снижение аалплитуд агрегации состг^мло соответственно 26%(р<0,05) и 35%(р<0,05), а при " минутах кнкубацки вв величина уменьшилась до 51%(р<0,01).

Кшгнбиру.ощий еффзкт нейтрофилов на агрегацию тромбоцитов таге №»;зл ï/.аэто при ¡посл&ддах АДФ. Амплитуда агрегации трог/б

и/лев зависала lauc от соотношения их числа с нзйтрофилами, так арэмэн;1 клеток. ¿хоральный эффект подавления агрегацг

тромбоцитоз наблюдался при ссютношзнш клеток 1:30, составляя в ере, нем С'0%(р<0,01 ). При уменьшении числа нейтрофилов, при котором i cg0thglü0h,.,3 с ТрО-у-социтс*/-! сост23ило 1:60, достоверное сних<0н5 ачети-луды агрегации клеток иалело место лишь в условиях 5- и 1i {/¿.нутиого периода й-»кусгц=ги и было равным соответственно 37%(р<0,0 и 51%(р<0,05). При соотношении нейтрофилов и тромбоцитов 1:90 пода яание сграгацки клеток било достоверным лишь посла 10 &»инутинкубгци составиз 3L"y¿(p<ú,05) по сравнению о контролем. Результаты получение дзнньк позволяют считать, что нэстимулирова ные нейтрофилы обладают анткагрогациоиной актазностью в отношен! агонист-акгп2ироааяньзс тромбоцитов, которая усилиоаэтся при уаелич( кии количества нейтрофилов по отношению к трокйоцитам, а также рос вр-зУйнм инкубации отих клеток. Подавление агрегации тромбоцитов присутствии нойтрофилог выражено сильнее при использовании cna6t тродлбоцитарных атонистоз ( кол лагек,АДФ) по сравнению с сильным (трог бин). Слздовательно, вуслозиах проведения наших экспериментов peani зоеался анти^грзгационный эфф&ет нейтрофилов на агонистиндуцирова; нул ггрзгацию тромбоцитов, на что passe также указывали и другие автор (M.A.Schattner et ai.,1990; F.A.Nicûlini et ai., 1S90), Установленная завися глость ичгиоирующего влияния нейтрофилов на тромбоциты от количо< теэнного соотношения этих клеток, времени инхубации, вида тромбоцита) кого вгониста позволяет дуглать о езязи этого эффекта с действие продуктов секреции нейтрофилов, а тахжа с различия:^ в механизм актигацчи тромбоцитов на фоне разных индукторов. Показано, что t только г юмтрофилы, но и к; супернатант дозозазисимо ингибирует arpen цида и оэ(фзщ'«;о троь'.оои^тоа, на основании чего предполагается проду цик нейтрофилами химически стабильных тромбоцитоактивнь вещес-лз{А.2а10а et ai.,1390). Срзди участников ингибирующего влият нейтрофилов. на функциональную активность тромбоцитов в литератур рассматриваются окись азота(МО), АДФ-аза, шэтаболиты арахидоновс шепоты (10-

НЕТ£,простациклин), некоторые протекназы (М.З.Вгоукгг е1 й.,':ЗС5; 0.8а1узт!га г!.,1389; А.2а1 ¡а е! а!.,1093). В то же пр^-т предполагается влияние на тромбоциты и других кощеста, образующихся в изйтрофивах, природа которых остается в настоящее с.рэмл нэвыясненной (.А-Зс-ЬаНпог о!г1.,1990; А.2зйав1а!.,1990).

Задачей второй сер^и экспериментов кглялось изучение вл'лйкка йтрофилоз, стимулкроаанных ФМЛФ или ФМА, на агрегаииомкую активность тромбоцитов. 8 контрольной группе опытов было показано, что ФМЛФ (1мкМ), а также ФМА (1 :/хг/мл) но вызывали агроггиию тро&дбоци-тов в течение 15 минут инкубации с отертых« клэткаяс-!. 3 то же аромл нзйтрофилы после указанной взщзстзгми проявляли агрэга-

ционную активность, величина которой также служила в каждом опыте з качестве контроля для сценки функциональной гктазнссти нзйтрофилоЕ. При &ктквациЕ1 нейтрофнловФМЛФ г\,тгл-иуда агрегации клетокк 51л;муге эксперимента составила 38,5±4,2% при скорости агрегации 3*,4±5,3%/ мин. В условиях стимуляции нвйтрофипсз Ф&ЯА эта ух& пгргалвтры ггрзга-ции были меньше - соответственно 25,1 ±3,9% и 23,2±

Нейтрофилы, стимулированные ФМЛФ, сыгызали агрегацию 7ромбоц/,-тоз, максимальная величина которой была отмечена при чмслекиагл соотношении нейтрофилсв п тромбоцитов 1:30. По сразнеи:'.о с суммарной величиной амплитуд агрегации трог-лбоц^тоз и кейтрофилоз (контроле) иоопвдаомый параметр угвпичкеапса в успопиах Е-гдкнутной инкубсики клеток в среднем на 100%(р<0,01), а при 1 О-лймн/тной инкубзц^л - на 71 %(р<0,01). Уменьшение числа нейтрофилов по отношений к троьлбсци-тзм до 1:50 ха- растеризовалось менее выраженным усилением! агрзггцж клеток по срг&нению с контролем, состааиз через 2 и 10 мянуг кккусгцш: в среднем ссответствэнко 70%(р<0,05) и 43%(р<0,05}. Пр> дальнейшем изменении соотношения иейтрофилов с тромбоцитам до 1 :ЗС узеличеккэ амплитуды агрегации ¡слеток, стимулированных ФМЛФ, из было достоверным как в условиях 2-минутной, так и 10-минутой инкубации. При стимуляции клеток ФМА направленность изменений их агрзгацгюкной астивности в зависимости от численного соотношения кейтрофилое с тромбоцитами и зрзмгии инкубации была аналогичной результатам ехспе-риментов с ФМЛФ. Так, наиболее оначцмое усиление амплитуды агрегации ФМЛФ-стимулкрованна?х клэток по срггненкю о контрольной агрегацией изолированных тромбоцитов и нэйтрофилозбыло отм9чзно при их соотношении '1:30. В этих услогиях после 2-минутной иккубшим клеток узелиуе-ние г^ллу.п'ды агрегации составило с среднем 103%(р<0,05), а при 10-минутнсй инкубации - 83%{р<0,05). В то же время при уьданьшенки числа нейтрофилов по отношению к тромбоцитам до 1:60 усиленно

агрегации ¡слотов имело место лишь в условиях "¡0-минутной инкубации О сродном на 45%,р<0,05) и достоверно не изменялось после 2 мину ин^-убаиии. В экспериментах, в которых соотношение нейтрофилов » троьйэцитоЕ! составляло 1:30, была отмечена лишь тенденция к усиленик афагационной активности клеток по сравнению с контролем.

Сравнительный анализ усиления агрегации тромбоцитов в присутствш активированных нейтрофилов е зависимости от вида индуктора пс- казал что при соотношении клеток 1:30 эффекты потенцирования агрегации н; фон» ФЫЛФ и ФМА существенно не отличались между собой как после < минут инкубации, так и чзроз 10 минут. Однако в опытах с ФМА 2-минутнш инкубация нейтрофилов с тромбоцитам* в соотношении 1:60 оказалась недостаточной док достоверного роста амплитуды агрегации по сравнений с контроле?.!, тогда как на фоне ФШ1Ф увеличение исследуемого параметрам техжэ условкяхпрзЕышало контрольный урозень на 70,0,1 %(р<0,05) При соотношение нейтрофилов с тромбоциташ1 1:90 усиление агрегацион-ной активности клеток не было достоверным и не зависело от вид; используемого индуктора {ФМЛФ или ФМА}.

Для выяснения механизмов активирующего влияния нейтрофилов н; тромбоцита была проведена третья серия Бксперг«ментов, в которой оценивались оффекгы супернатанта нейтрофилов, стимулированных ФМЛЗ или ФЫА, на афзгацкокиуго активность тромбоцитов. В контрольны? опытах супорнатант нвстимулировакных агонистамн нейтрофилов, инкуби-рованньк в среде Хенкса (рН 7,4} в течение 10 минут, не вызывал агрегации тромбоцитов. В то же время добавление в суспензию тромбоцитов супер натапанейтрофилов.стамулированнькв течение! ш(нутыФМЛФ(1мкМ) приводило к развитию агрегации клеток, амплитуда которой к 5 минут4 эксперимента в среднем составляла 48,3*5,2% при скорости агрегац^ 57,6±7,3%/мин. Супернатант нейтрофилов, стимулированных в течение того ?,се времени ФМА также вызывал афегацию тромбоцитов

амплитудам скорость которой были меньше, чем в экспериментах с ФМЛФ состааиа в среднем соответственно 31,4*4,8% и 40,2±5,3%/шн.

Агрегация тромбоцитов в присутствии нейтрофилов, стимулированньс ФМЛФ или ФМА, была выражена дальнее, чем на фоне супернатанта эти) клеток, а/стизмрованных теми же индукторами. Так, амплитуда агрегацт тромбоцитов, индуцированной супернатантом ФМЛФ-стимулированны) найтрофилов (10 клеток в 1 мел), была в среднем на 36,1%(р<0,05 меньше, чем при активации клеток в смешанной суспензии тромбоцитов ъ нейтрофилов. В равной мере, при стимуляции нейтрофилов ФМА амплитуда агрегации тромбоцитов, вызванная супернатантом, снижалась н£ 31,4%(р<0,05) по сравнению с условиям стимуляции нейтрофилов тем же индуктором в присутствии тромбоцитов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что нейтрофилы, акти-¡ированные ФМЛФ или ФМА, вызывают агрегацию тромбоцитов, которая осиливается при увеличении числа нейтрофилов по отношению к тромбо-<итам и зависит от вида ислользуешго активатора нейтрофилов, а таге- хда времени совместной инкубации клеток. При актмзации нойтрофилов ФМЛФ s части экспериментов (соотношение нейтрофилсв и тромбоцитов 1:60) )азвивалась более выраженная агрегация тромбоцитов, чзмиа фене ФМА, iTo, вероятно, связано с различные механизмам активация нейтрофилов 1>МЛФ и ФМА (A.J.Rossi et al.,1988; M.Baggiolini, P.Kernan,1992). Как ;ледует из собствзнныхдгнньа, проафегациенная актиансстъ стомулмро-!анных нейтрофилов в значительной степени связана с действием продухов их секреции, поскольку отмеченное влияние на троксбоциты сокргнлет-яя тгзгхо мусупэрнатанта клеток, апигиройгиных ФЬ'ШФ или ФМА. Однако шияние супэрнатанта активировакньос нейтрофилов на функциональную наивность тромбоцитов было выражено в 1\г;еньшей степени, чем натагных клеток, стимулированных ts.vei же гговистадеи, что поззоляэт думать о ¡имической нестабильности продуктов секреции кейтрофилоз, участвую-цих в активации тромбоцитов. Данные о проггрзгациокном влиянии на ромбоциты активированных нейтрофилоз тгдзке пригодятся в работах s.M.Henson (1990), V.&mngeiista и др. (1931), C.Cerletti и др.(18S2). Актиаи-зующеэ влияние нейтрофилов на тромбоциты авторы чаще всего езязмза-эт с действием метаболитов кислорода (R.I.Handin et al.,1377; D.Salvamini >t al.,1989), протеиназ (катепсин G ,эластазс:)(5CBylicvrcka et al.,1583,1985; '.Renesto,M.Chignard,1993), метаболитов арахидоновой кислоты ТХА2,простагландины, лейкотриекы)(P.Mehta et al.,198S;A.J.>v5arcus et d.,1989), ФАТ(ЕСовШвг etal.,19S7; P.Renesto etaJ.,1992).

Таким образом, нейтрофилы оказывают качественно кэод* ¡означкыэ гффекты на тромбоцита, обладая проафегационной или антизгрегацмон-юй активностью в зависимости от исходного состояния этих клеток, (арактер и величина влияния нейтрофилов на функциональную активность ромбоцитовтагсхе во многом определяется количественным соотношэни-)м этих клеток, временем инкубации, а также видом ггонистов тромооцитоз j нейтрофилов. Представленные собственные, а также литературные дан-1ые свидетельствуют об участей продуктов секреции нейтрофилов в роа-5изации влияния этих клеток на функциональную активность тромбоцитов, но послужило основой для дальнейшего изучзвия тромбоцитзрных эффектов этих веществ, в частности, антимикробных полипептидов нейтрофилов, чему посвящены последующие разделы работа.

■Ч ЕЛЯ8ИИЕ АЬТПШ1.<Р05НЬ1Х ПОЛИПЕПТИДОЗ НЕЙТРОФИЛОВ НА ФУН-

ЩШИАЯЬНЮ активность к структуру тромбоцитов

Для оценки влияния дэфенсинов на функциональную активность тром-боцитоа использовали суммарную фракцию полипептидов, а также их отдельные коййтсненгы, выделенные из нейтрофилов человека и кролика. Су;Л'.;зр;10я фракции дефенсиноз человека (дзфенсины) исследовалась в диапазоне концентраций от 0,1 »лег/мл до 200гл<г/мл. В небольших концентрациях^,1-40,0 мкг/мл) дофенсима не вызьззали агрегацию тромбоцитов в суспензии или плазма крови в точении 15-,минутной инкубации. При увеличении концентрации полипэптидов до 100&кг/мл отмечена незначительная кгрзгадая трозлЗсцятоз в суспензии, аютлитуда которой достигала мс&сжлапькых величин в среднем к 10 минуте исследования, составляя 10,3±2,1%. Дефенсины, добавленные в суспензию тромбоцитов в концентрации 200мхг/м.г8, выз&гапивырзженную агрегацию тромбоцитов с амплитудой 55,0±6,8% и ь&хеишльной скоростью 30,2г:4,8%/мин.

Прздзарпт&льнйя инкубация тромбоцитов с дефенсинами в низких концентрациях приводила к снижению агрегационной активности, индуциро-езнной тромбином, коллагеном и АДФ. Наиболее выраженный ингибирую-щкй еффэкт дофенсиноз человека е концентрации 40,0йжг/мл отмечался на фенз тромбмка(0,5!зд/мл). Амплитуда згрегации при этом составила 48,2а: 6,1 %(р<0,01). При гкткз&цим тромбоцитов коллагеног44мкг/мл} или АДФ {5мхЩ снмскокиэ амплитуды гарегации клеток после их инкубации в течаниз того же времэни с дефенсинагии было менее значительным -соотзэтстеэнко 24,3^2,9% (р<0,01) к 30,5±4,2%(р<0,01). Снижение концентрации дофенсинов от40,0 ькг/млдо 0,1 мзег/мл сопровождалось уменьшением их кнтбирующего эффекта на агрегацию тромбоцитов на фоне тромбина, коллагена« АДФ. Подавление агонист-индуцированной агрегации тромбоцитов в присутствии дэфенсинов было максимальным после их инкубации в течение 5 м^нут. Уменьшение времени инкубации до 2 минут, а Тгж;-© его увеличение до 10 или 15 минут приводило к снижению величины ингмбирутощ&го влияний дефзнсинов на агрегацию тромбоцитов не- зави-сл.йо от Езда используемого индуктора. Полученные данные свидетельствует о зависимости антиагрэгационного действия дефенсиноЕ человека на тромбоциты от концентрации полипептида и времени его взаимодействия с клэткал-ы.

Подавление дэфонсин&л! человека агонист-индуцированной агрегации тромбоцитов сопровождалось уменьшением секреции клетками АТФ. Количество АТФ, высвобо>здзэмое из гранул тромбоцитов в процессе их тромбин - и колпаген-индуцированной агрегации, в присутствии дефенсинов (40,0ысг/мл) снижалось соответственно на 45,7±4,8%(р<0,01) и

21,1 i2,6%(p<0,01}. При этом вместе суменьшениемабсолютного количества АТФ дефенсмны вызывали и замедление скорост» реакции выскюбож-аония. составив в опытах с троенном 37,3%(р<0,05}, а на фоне коллагенз • 24,4%(р<0,05). Однако в вхслеримзнтах, sкоторых тромбоциты елтиеиро-зались АДФ, дефенсины в той же концентрации достоверно не изл«жяли соличество и скорость сакреиии клетками АТФ.

С целью выяснения роли отдельных компонентов суммарной фракции зефенсинов человека на агрегацию тромбоцитов был изучен эффект эчищенногодефенсина HNP-1. Направленность изменений аграгацконной истинности тромбоцитов под действием HNP-1 была в целом аналогичной гффекту суммарной фракции ©тих полйпэптидов. S концентрациях от I Омкг/мл до ЮОмкг/мл HNP-1 вызывал прямую дсзозав»симух> Erparam-'iO громбоцитое. В то время, какнафоне Юмхг/лял НМР-1 амплитудаатреггигет громбоцитов через 10 минут инкубация составляла лишь 13,7*2,2%, г,о-юльзонакио более еысоких концонфаций полипептэда приводило к раэ-!ити!0 выраженной агрегации клеток. KNP-1 в концентрации 50мхг/шз и ! ООмхг/мл вызывал афегацию тромбоцитов с амплитудой со- ответственно S1,4±4,5% и 68,1 ±5,7% при скорости 35,5^4,0%/^^ и 51,4±4,8%/мин. Следует отметить, что незначительная Ефегация тромбоцитов под злияии->м HNP-1 в концентрации 1Омкг/мл существенно усиливалась после прэд-¡зрительной инкубации клеток с ЛПС {400игт/нг,}. Величина а."/лл:-:тудс! 1фегации тромбоцитоз в этих условиях находилась в прямой зависимости >т Бремени их инкубации с ЛПС, достигая после 20-гл?нуткоЯ инкубации ¡начений 65,2^0,2%, мывших место лишь при использовании высота« :онцентраций WNP-1 ( 100мхг/мл).

■1КР-1 в низких концентрациях (0,1 ;1 мкг/мл) подавлял афегацию и секретно АТФ тромбоцитов, индуцированные тромбином, коллагеном и АДФ. Лахсимальный эффект ингибирования афегации клеток на фоне еоох юпользованных индукторов отмечался при Ю-мкнутмсй инкубации тром-юцитов с дефенсином в концентраиии 0,1 мкг/мл. Наиболее Еыражонное юдавлонио агрегации тромбоцитов HÏ4P-1 (0,1 мкг/мл} иадзпо место при [«пользовании в качестве индуктора тромбинг(48,7%,р><0,С5} и в меньшей тепени коллагена и АДФ(соответственно 23,2%,р<0,05 и 31,4%, р<0,05}. Снижение секреции клетками АТФ на фоне тромбина, коллагена и АДФ в тих условиях составило соответственно 48,8%(р<0,01 ); 29,7% (р<0,0ь) и 7,2%(р<0,05}. Уменьшение времени инкубации тромбоцитов с HNP-1 от 0 до 2 минут сопровождалось синением ингибиpyiо щ® го эф- факта ¡ефенсина на агрегацию клеток после их стимуляции тромбином, коллзге-ом или АДФ. Следует отметить, что все отмеченные проггрэг аил'.онныо и нтиафегационные эффекты дефенсииов человека были отмечены

только к суспензии ошьггых тромбоцитов и отсутствовали в плазк крови.

Рег-ультзты полученные с помощью сканирующей электронной микро! копия, показали, что при активами тромбоцитов дефенсинами человека высоких концентрациях были отмечены структурные изменения этих кл* ток. В контрольной серии Експериментов (в отсутствии полипептидо! вьщеленны© из крови тромбоциты имели дисковидную, овальную, ре» округлую формг/, со слегка волнистыми контурами и небольшими складкам поверхности. Около 40% тромбоцитов формировали 1-2, реже 3 коротки округлых отростка. Агрегация тромбоцитов наблюдалась относительн редко и выявлялась в еидэ скоплений из 3-7 прилегающих друг к доу* клеток. В опытной серии под влиянием суммарной фракции дефенсинс человека (1 ООмхг/мл) или дефзнсина НМР-1 (1 Омкг/мл) имели место измс нзу.иэ формы троийоцитоа с днсковмдаой на полигональную, усилвнм складчатости их поверхности, появление множественных коротких и длие ных псевдоподий, а также повышалась частота выявления аграгированнь тромбоцитов. Под влиянием дефенсинов НМРз и НЫР-1 в более высок* концэнтрациях, соответственно 200мкг/мл и 50мхг/мл), тромбоциты обр« зовыаали множество псевдоподии, имели полигональную форму и форь» рогали,скопления из нескольких десятков тесно прилагающих друг к друг клеток. Особенно сильную активацию тромбоцитов вызывал дефенси НЫР-1 в концентрации ЮОжг/мл. В этих експерименгах практически вс наблюдаемые тромбоциты находились в состава крупных тромбоцитарнь агрегатов. Следовательно, агрегация и секреция тромбоцитов, вызванна высокими концентрациями дефенсинов сопровождается структурными и; мзнзниями этих клеток.

Дефенсины кролика в вада суммарной фракции в высоких концентрация также индуцировали развитие агрегации отбытых тромбоцитов человек; Амплитуда агрегации этих клеток под влиянием дефенсинов в концентр» ции 200мкг/ьлл составила 74,9±5,6%, в то время как на фоне 150мхг/мл лишь 31,2+4,1%. При использовании высоких концентраций дефенсино крэлика(200мхг/мл) агрегация тромбоцитов была выражена сильнее, че на фоне тех же концентраций дефенсинов человека. В отличие от дефеь жнов человека, кроличьи дефенсины в диапазоне кон- центраций 0,1 100мкг/мл не оказывали достоверного ингибирующого влияния на агрегг цин> тромбоцитов человека, индуцированную тромбином, коллагеном ил АДФ. Дефенсины кролика были более активны в отношении кроличьи тромбоцитов, чем человеческих. Е концентрации 20шх/мл эти полипепти ды существенно подавляли амплитуду и скорость агрегации тромбоците кролика, индуцированные тромбином и коллагеном. Дефенсины кролика концентрации 10Оглсг/мп потенцировали агрегацию тромбоцитов

вызванную ЛПС^ООют/мл), которе-Л с рпотом

времени инкубации клеток о по« нпеп ткдами. О иысоклх

тромбоцитов, амплитуда которой з среднем 5 г - -¿ф посте ¿'обааш-кия полипептидов соотгзипа соотзэтот^зио 49,7*3,4% и 8$,1*3,0%. Полученные величины прзсьаааяк зъзш-'луду агрзгазга трс^сбоцнтсз. чвлоьо-ка, вызванную теми по аоктжщщоз, а среднем ссатгот»

отгенно в 1,6 и 1,2 рзза.

Эксперименты, з которых еыяснялос*» ьггданкэ ке'/зтоне«та ¡ЯР-1 су» маркой фрг^идгфенсетсс кролика иа трег-'Задетъ» чгязевха, кж&азяя, что этот пояипегтзд сблзд^от тольхэ прогг^г^еккен эхг/г^гг.е^«», выэызгя ггреггцтео отагт-хс клзтежз мзньшж жкцйитзкхп«-*, «^«яркая фракция дэфскскна* крогеса. Аиллят^йй ефггк^к-? посла кхкккубации с КР-1(£й>дхг/ш) в твчфкйэ 5 и^пут иготазмла ££//¿1 ¿¡-.'а, анафонэпелипоптидасЯ^ж/ып-45,'¡±5.С/;с. □ л: К?-1 на тромЗоциты кро/шгз, юз: и а йхепвр^еитаз: о фрэядегёЗ хралкчьях дефшемиоа, бмло бс-яо© вффекпгэд.'ж, 'яь? кх д<?;"ст-::«з ио 7ро&с2сцита чолозокй. 3 б?йсс»сс концентр эдэт) НР-1 едокздп рзгеиткз ш*'ра:5екнсй ггрзгад-/а-1 гсродмчи«* гроь&вдноз, г'¿л^ луда которой на 47,б±3, 1 %(р<0,С5) прэеиаггла этот г?с?хз£угпь из фокз ~-гл концентрации погсгтггт'Ийав опытах с трег.йо^'пэл« ч.ысаъяз. При сюсжз» кки Еюицектрацкл КР-1 дэ 1шгДвп олпл^туда вгрегс;1«м :-:л-тгс:.г «о 4 регъ:-шала в сродная 14,1 ±1,9%. Однгхо поело прэдэнг^гельной {гнк^Садти фэг/бсцитоо с ЛПСПОО^кгДлл) и< атрзтеиги» зкгтгелько уепл^&йлгадь, соотазиз по гшлтудэ 81,5*3,9% (р<0,00?) прч гэдр^сгн сгр-тгедш

На фок© ;сйй1Х гшнцантр^а К'Р-1 {О.ОБастЛгп) подааггенмз агси^ст-Е'эдуцирозшкой агрэгад-в* тромбоцитсгшолу^сг было цостсвбрним лишь при ахтизгцим клзтек АДФ <5зл'?М) »'на £7%,р<0,05). ~ладоватв;?ьн0, дефономны аблэдгзот раз;« ё*;р£>.:ои-г&;х.1 дозогоднек* здм гякякием на тро:й5оцяты, еыэызая гтреггцжо клеток згг-;оо.т/ас хенцятра-^илх и подгзпяя ее а к:лг»лх иекцонтргчд'т. Дозсгг^'.оиглдй ззфенскксБ чзлогека на функциональную актгса-юсть ?.<2оно ц'^тов ;<рс ои V"1'3 Зыл описан ранее (Н.й.Мисуно и др.,1892; А-А/гО^Ззу о! п}.,1В93). Про-гольху а пу5л:^ац$!пх отс\тстзу:от озодонугй об зффэ-сто: дефэнсикоз на •роь<ЯЗоцитъ1, то судить, о путях и мохгкпгккисс ка о ш клетки ?/лг.з-;о

тшь на осносгмии гаггвратуркьк о фтжо-ж^дчвечмх я стру;стур-

ьк свойствах полипаггтцдов, а такжо осСствнких результатов. По цмнум ряда авторов, дофоися'.ны, попадая к крозн, сг.«тэн-.»г!Отоя с гльФа?.« гг??>0ГГ|0бул^НЕис-1 м плгакы, образуя кзг:сг/!вкы9 otv.ii лексы,

:ом объясяяотсп г?одазг<«н>59 цугготоксгмаскоЧ и ¿•г.^гах «'."лдоз расгкэноо» и при озедокии атес полипоп-педоз з фозь(А.УсЬЬ

спай&г ©28,1238; Вероятно, о указанные

с. огкц.!Д»гл былоеаязгко гасшотеуютаио прог^рэгацчонныхи антиаграга допгзьс; £*рфс:суси дйфзнсмлоз в отз-йзшзкми троиЁзцятов в условия вереей. Однзхс в г>мто«зэтур>э раоататржгэтси возглоясность роали оаайл еффсотоа дефонсинга на кшга-з бэз ж контакта с влемэнтгго плазма крае« ей£].,1&23). Авто

с-кг-:^. ч^о кзйтрсф^яу образуют ■га ,<; детали сгкрудясно пронкя-ю з©дао птеизяных проте-

м:-»з о йая&яуюзюоЯ кассой бояоэ 8С000 И, к которьа» откосится тазяа

■а.-, тагаш офогсад, ьйсмйг йй-агазжатъой в условияхек контахга с нэйтро-^•■палсл сти лэк^олреюдагготох

Ссгл£ско<«^з»*ш, «088), {,Л.Е.Ев!з1бс1»'

К.'ЛеЬгаг и ч^редозакио в долезулах дофенсиноЕ

^•л--;^»?, г. учгатязз с пщргф^Зкьм*, благодаря ватсому содэриса-

з »-ж; зддогооджэтадо естаткоз грпглйка и ткрэзкна, далаэт их иш&и поиогеа-5оо7«о гэтм&кьаяг гздцвспвамп. С отжи характеристика-г&торы ©¿«газ-ггэт начальные &тглы жвгажедпвйствия с г егл;тфостатмческо«л прэтгксенки пошядошь-каз^^мн&кышге^пголдовткдавк^

ъмиХрън, С; тьяяу» лрсжждкявегя лафзксиноз чэрэз лкпидаый бхслой я>?.здаглчг«эгс мембраноЗраасгажвм с них потен- цг'гал-регулируемьк ямздсв (ЯЛЫдог «к В.1.Кгдап &1.,1250). Собственные

я важную роль кгтк»кньк свойств двфенссдооз в

ргалкзгздг* ^ трэд£оцкт£?к&вс еффееяоз. Дэфенсины кролика в равных «онцдатрацкпх с дзфенсълалм чйло&еха обладают более выраженными

тп&ал в отношении тромбоцитов. По данным Р..14_атггаг а до. ("ШЭЗ), дефексша кролика, имея ГЧХ.Н отрскэдж о дафвио•лн&.н чепогока, яапяготся более катионны-«и. 3 та даякьаз гвгсолкат что проагрзгвцконная актик-юсть де-

и сыссхих кз*-;цзнтргцж< а большой степени обусловлена пол-ЗарЯДРМ их молекул, Хг^сгг-р влияния НМР-1 на агрегацию и секрецию АТФ тромбоцитов, а тг^хс. з-;х отрух «урнио моютнзкия в це г.о:чз отракаат аналогичные аф- факты фрахцяи дофеко;лков чэлогока. Совпадение направленности агрггационной акте^аноотя трэигбсцитов тагсжо было ус- тгнов-шно в отношен«« суммарной фрсвгу/^дофоисинов кроли:<а и его изолиро-^¡исго ;изгл-.с»-#зьта Однако более дзтальньзй а^гализ кон- центрами» омской са«а.и!Ости алкчн-чя дофенскмов на функциональную активность яскггал, что кошонаить: дэфонс«нов человека и кролика

HNP-1 и NP-1 в меньших концэнтраципх, чем ж суммарные фргг.?««, вызывают одинаковые по величине эффекты на тромбоциты, Слэдзаата/а-ко, врэализсгл'ли трс^даоцитгрньк еффохтоз суыг.<ерньг< фращий дефемсн-нов человека и кроякга наибольшее участие прини^жот их сет/понеи'ш НМР-1 и МР-1. Полученные результаты согласуется с да-сныгли, в которых папппопти,оы HNP-1 « WP-1 были «гжЗэлзэ a прэдстазителйга свойства дэфенскноз че/тозека и кротка «as по йлзк-трофорэтической подписгаости, тахи штк^скробкьем csosb гзам(ГЛ.СЛ"егтйо et <d.,1£R.9; FULchrsr et ri. ,1503).

Согласно дакккм R.I.Leîirsr и др.{ 1ЁЭЗ), наиболее вьграяэкмоо проявление антимикробных и (детотохсичесямх csoícrs д®Ф&ноинсз бьгло отмечено в кокцетрацияк 1Ошг/ш-1 ООмссг/ш. В преевдемкьл £,э-фекоикы s ©«газоне атак :т концентргцбй? охазыззли ьад/лкр^о^эа влияние на функциональную активность трсмбтадегоз. Тгяэз соггпзденке кон- цэнтрацкй, при етторьсс реализуются штиьозхрсбимз и тро?л8ошгтз?-ныэ еффекш дефзнсиноз указьзает ка ежккмф ро/ь стг-гх попилзтцдеа таоае ошхадагамгк зкут^осеудистого 1роб^ос£ргйез2шя, воотогэ которого лежит прзкмущвотзБнкоэ иарушенкэ агсг/знсоти тромбоцитов.

Злязниз протегииоз (FG), выделенных йз кейтрйфипозна егрстэ-ционнуо к секреторную активность трсмбсцятов ôwr.Q кзучеко на ггу.-слгсэ очищенного PQ-2, юдеющзго, по данккм огахглшах зш пояуктттает заторов, промежуточную степень ахткзноста по ерзаненкго о pjpjcvsoi соытюнентелзд ¡©г еуалмгрной фракция (PS-1 и Р6-3)> оцененную по от<зп?км злв!арофорзтмчасхой подвижности (¥.fë. ¡fckr/akov oí a!.,1933}. С&бстаен-•!ые исследования показали, что PS-2 обладает очень бпкгдем характером злияиия на ггрегэд*онную активность троьйоцитоа по ерг&ченм ю с дефен-»íHavsi. Однако в отличие от дефеменнов человека и крэлкха влияние ■гротефкна на тромбоцита проявляется кгге s суспзнгдаг от- л-ьетых клеток, гак и в обогащенной тромбоцитами плазме. В сысоясс дондопрадох 100;200г^сг/мл) протогрин вызывал агрегацию тромбоцитов, зссторзя быка »гпьноэ в богатой тромбоцита?-.« плазме, чем s суспензии отмытых клеток, 'ах, при одинаковых концентрациях претегринэ амплитуда гйр-эгеади тромбоцитов в ппагдо превышала таковую в суспензии отмытых клэток ta» '0%(р<0,01 )(PG-2,10Ошг/мл)и 40%(р'<0,05){PG-2, Хршэ vero,

¡a фоне Рб-2(100ьжгДлл) имело место увеличон^э пг;г-пвсмодй агрэга^и пмытых тромбоцитов по сражению с ©тим пгрг^гатром, итг-юреикч)» в (пазш крови, а среднем на 0,5 мин. Агрегация трокбоцитоз, ннягуцкрова^-®я высохнем концентрациями протегрина, сопрозо^дала«» сэкрецм^й леткам АТФ, состазиБ в среднем 350нМ/10 клеток се плазг/в и 1 75h£v1/1 0

кг.зтох с суслокгки. Лда иэ юооледоызншх кокцентрацм

протефкн^200{жг/мп) c&Kppwn АТФ в плазглэ лрешшала таковую i а/итамзйи с сродном на 53,5%(р<0,0;5).

С немец?.»;» окгкиру*зи;зй алэхгромной (лккроскопии было установлена что вместе с страгац'лой и сгкрсця&й трзм&кдотог, индуцированных про vsrpwü ом, ргзкж-алиоь дазсз£»1си.\ък8 игм&ионмя отруктуры ©тих клаток. I ЧОС&нг/Ьял протегриг-з а^сзьсгш изменение формы оттлыты: троу.5аф;тов с д^ошагцмой на полигональную, a тегсзэ образование не or.cr¡лояий из S-15 пластинок, прилегаюи^ьг друг к другу псэздо ПО/^'-ЛУЛ ипя КС посрздотезгс-к) КЛЭТОЧКОЙ ПОгарХШОТЬЮ. Ka фоке боле« здозиой ш-^гдадаи (ЗООикт/мл) протегрина тромбоциты, кайзющк; ншрсйкпькую по.гтгог-салшук> форзлу, сбрагоаьгзапи афегать; m несссоль s&ct дэсятхоа тг<й-50 прил-згаседсс друг к друry mrro& Какболао вмргэйэн и&.\» ¡сг^опэ;-;^ грог/хкщмтсц 0ьши отмечены в присутствии протзгрина i аонцйнт^хцч! £00ккг/мл г» пл&з&гэ s&r¿m. В очих наблюдениях пргхтичзсаз ese тромбоциты уч&згсосапи в фср&фовдним крупных тромбоцитариы; афсгатов.

Прат&г^зкз с яролжсуточкой кокцйнтр315ик{1Сйдсг/;«'л} не сшыгал arpe зромйшитов в точгшо 10*йс:нутного ш^Зецжзнкого периода Одн^о з атсй кзнцзлград^л протогрмн усшвшл афзгвцкю клэток, инду цдаг&чн^э аталхэ сааь:зал &фзгацщ> тромбоцитов, стиму

ЛШДОгаЮДОЛПСООДЛмГ/^П)* АМПЛОТУДЗ м скорость СТрЭГСДОИ троглбоци roz, г&ытрз&ыяа'А яосиз мкхубгции с PQ-2 увеличивались i

сродном соотаотставнж> na45%(p<0,0S) и29%{р<0,05}. Амллитудо arpera if.iv? трозйбсцигш иа фоно протегрииа былаболыш

при Э-имкутном гюрлодэ na cpssaotmo о 2-мж/тшм, ооставиз

32,5-Н,7%. SoapaorsíW® кг«усэд«нного пуриодаспротвфиномот2до К .»¿якут ü опытах тромбоцитам, напротив, вызы

ьалс. скихсенгоэ г-жплтуды их афзг&цди.

?to;s ohwííohs'W юкцзнтргвдеи протсф-дна до О.Ч-Чьссг/мл прокзлялжа ¡5í"o м.чг/.йиру:ощж> csgc-ícyüí в орошении агокмст-отгалулиров&нньк тром бацптоз. В дайлазано отих концентраций PG-2 подавлял агрегацию тром бортов, а таску с-окрец; по клоткз&т АТФ, которые были индуцировань тро}^ко?40,55с|/мл), коллагако^кьсДУ!) или гпинвфрином{5мхМ). Пр» згой на фон» про тегр'лиа отменено уменьшение как й'осолюткых значений •ja:? к скорое»; сгрзгагд Аи и сокрзц?«1 еисгазн^йаиными тром^оцита?й1 АТФ Сг^уэт ofwsiHTb, что описанной- еффехш протогрина были гырахоны i CTorsow; поело клоток тро^:но»д и иаяэли ме- сто ¡

бол^з ширг-уо.« о&лазоко ко^мдентраций полипэтгеда, чем в условия; ОГ/.Х?уГ.Г.ЦГ(й г^'ог'лсоцитов ¡соллс.г€..чом илл 0П»Квфр»г{0}Д.

Следовательно, протэфин Р6-2, ргкио как « дефсиозды, в цкрс-;г.?.| Я^ёгкаск« концентраций шрулкрует и ¡МЕгзатсркдо rxz-v*

кость Tpo«ÂÎoâJï-îT03, а таете учгетзу&т »■> я&хстг. том'&к'згздоег: з. vmmetr никх сздтятры ©тгазс клеток, p®amr/>? œ-сн ¡¿уф-ггта m¡ r^cfeiSess.'íw только о отдашэг-а®? ошших клзтш:, на к s шзгл» кро«». -г

¿¡¡$ККЬ26, £ TSC?» СЭбОТЗЭКНЫг pSW^aMTSTÄf чт:?, о

одной старскы, осо&гккзст« струггуру г- фигя^хпюнгшю; тех грзтзгрдаю'з пр«г.:гге?зу.от кзчаст^бгяндо »ттаг гюпйя&гп'щде (хч^п&кэн "¡sum плазмы крэзи (V.M.Kbfcryckcv et &<.,1 О^лугсЯ старика, ~<5>.w kív ЦУ.Д Tpow5oiifîTS|BiîfK аффекте« яротегрж;® i отнздвмии ©тьи-ик .-«к се<дэ*(Шй8отеу$т сб оте>(Г«пгеки y-œciwR г, екх ииамсю-йлс квелок»*?,^ Дкк^^обнач гфотофдео? » отрепьям tLál-sriarror.u ■

CfendsfesSífcem ^я^отг^зогл).?:-« ¡лх тцзггфадезк 5-50€> кгл i íV-fí.3rxfóy¿<cy et 5лкгг-ж-з глотапк^гг -pïî&fxtpïiV. xv.y

•-¿scvo з дкспаг-ако vsx v. чти •yuix^wi îis ^¿íví^^í

V -аотлз етяя »ЖД re ^ r;

oc^íssí¿нйЗ, з&глшккык н ч-;:'-? ф-глгда.

/'J-пVл^T.-fо- г.алшг5гш<да прг<У г'ПЙ,. уолтемыэ ¡c¿ ф*<лз>гсжнь&?, акзизгяп па ?>* ШЫ-У.:.-

ген» ?грсгацУ'Онкей sscTKCKOsra ¿.-слудогамо 4sro ош p?cc-,&Y»

{V«Si07CS EMSnt». Г.^ЗЗфсКК'Гг. «5 в-Л-ЁГ^ЛСК/КС

vpcfcibwWTcrî чеяс&еха 1«соледс«аг^е!;. з 0,1!; Ч и 10 c/x'/te.

С-чт.д'.'сс;,. что ¿даетазтьа^з йъ^ЖчР'.скоф ея&-.йккснгке^/гг

«зенкую tpowisö'^wwa, míswj мял тйл,

префекта г vyicSittOH» хс^^тзг.-л:^ t г« с

з шн з а гв.чениз

п-арсадад KHiCj^feti^K. Профенин гаже) mo 0wKt;s£.!¿ вляздая на car?xreu+so х c9i{fMi.'i¡tc» упс^збоц^тов, Ар.^Н 'î ¡мдС'Д},

>3wr,i<s фр^челД \ h£á</¡ ) м коллег £ 7 sea ). Однгххо пр ф-

arpârîiç^a- Tpo?.'.'dctvr»c-s, arMiïi&vv&jHxœt ЛГ.С. Иъттю '"■ сугоскгк» ^ ссс-г^нтраиг-си 'i

черзз 5 -:>лн'/т посла ЛПС (200físr/«»n} раз'гАгллэ йфэпздч-.?

а йх;.плитудей 85±5% s сред нем к 12 ^гну.тг >t ьокя^гыгей

s-xopoovK01 s то врешхах

!"!r¡G txj snseraui-a-> .xx:rc VÍ/ÍCIÍ^ÜX.

fpouî£oi^TOS, г«йй&ккая scc»*ig«s-äЛЯС га профан»«.

Ks- большей WSTC-SV-ÍI S-V.rí HÍJ

rpo.víoЦ'-ггоч). з^с^чиулх» ГПС лсоло

г© глгаь^гло ап^гац^ч khstolc кгй1, с-э^ро^-л «uw АТФ. 7<гх>,

/г<ш) уси/жзагг дейстг-йе s-va îpn^îîfâ. Src

5рг>~.5ЛРУ-)ОСЬ

показателя максимальной охорооти агрегации тромбоцитов

иаддогрсгдо* ной 1рсг/йино»д а концентрации 0,51зд/мл, и составил! 12.СЫ 'i c,(i/hvvn, о бшо 8- средаедлна 44%(р<0,05}больше, чем в контроле

Иг>;£олое сф~ Фестиангя и-окцзитргц'ля профегес-са, в которой он усиливал ирзгй.',тро.ч'«5оц'пто0, ожлу;й:роа2нньа;.ИПС кпи трамЗинсм, состагил: 'гНыт/ш. 3болееиизюз*га ^чситссцйяхпрофеимнаотплаченные оффегог зиргахсну. и какьщей гтепаня мт отсутотзогаш.

Пслипегтоде FRS3X з кокцэктрацдос 0,1; 1; 10 к 20 мят/мл, как i прсфгшк, вьгаасал втдогсдов тра^бацлтоз в твчзнкэ 20 ш;нутинкубации Е плаило «лк суспз: ошьгськ клеток. Одагхо PRS9X потенцировал стлаутрааешьсс ггзккэтагж. Тасс, пост к^дагрятэ/ькой я;-зсуо£У«'<:тра^йо^тов о спим пзлилзлтещоьй arparais; хпэтсх, кчд^фзезгдегя t-uw коллагеном (1»ДСГ/6ЙЛ). ус»:«!»«»** НоэЗсяс« Е;-;ачнтзп:.-и:ге усилен;/» атрггацим трослбоцлтов, рзк тра^-аи»:, тахм «еллзгеком, было отточено при кокцзн-грацяге: РпгЯК'С-гст/мя г. 2&£гг/мн. Оптелальное вреайя инкубации тро:^ fiaua.«; г РйЗЗХ, которое аффект усиления ггрзгацш тромбоцитов сьу? ьжа&'АЗЛь»;» здрг&ят, состегало в опытах с трзаймнагл с среднем £ ■г..•-••'Ti.:, а о ком&гчмакй ~ 5 ьй-.нуг. Достоверно® узол/.чекис количества saKpo-.K^jíüV.irtí ЛТФ оп;;л-№<роган1'й)ай1РВ32Х,6ьшовкяз-лоно толу« а ora; ¿a* с коллагенов s? составило £0±3%{р<0,05) по сразке-

РйЗйй, г..гсг:с ¡сак м ггрофаккн, вазьвал азрегадрво троглЗацятоа, прэд-адтгггоодю OTrirÁ/JT/cpOtfuJKKX Л ПС. Аглллйтуда агрзгад©! тро&боцнтов по©-х;2 t'x отг5.\С1МУ1Ц!.-;:; ЛПС (200!^/№л)у^ллчиааяая> сдаогрэадзкно о рос- том хонцсгдргцчг. атсго пол.хгггтулд. На фон© ¡-лахокшяькой ш псслэдозан-кых поицеитрачий Рй55Х{аС;»;:гДгп) аь/лпитуда агрзгадаи ЛПОотиййулиро-ва; и грэлг&хдотои cao i ssj «л -¿ в среднем 35%, а ее максимальная скорость - 3%/.v,/;h. 'íoiíirN'&oTCíi ATO', оз.'фо-л;рузмае тромбощпааи в этих sxcnepw-1^нтк.ч&ию а с--рэдкэ%лй7б>:дД/Ю трожюцятог. Sos отвлеченные аффекты >\oi тодгс&жхя 'лрегаиу-ль^ой и с-зярзтернзй зктм&юсти троадбоцятов тгмг,&п\чф,ом PR3SX rar,Lfr¡sj-íb! только з суспэнзки отшггых клеток и отсутотазгаяи s плак« кроаи.

ü отпмчка от дофен«.;ноз и протегрина, у профонит и PR33X orcyroraysr а;н;типгрггац>;онное влияние на тром£ог#ггы, а их проаг-йффа.оъ: П[:я>.:йле;->тс?! ллшь и отношении агонуют-стимули* poo.:HKLK клэтск. П4эоагрсгад-;онкая aícrb^ooti» PR38X несколько шире, чоь-'.у на тромбоциты, оп«лулиро- ван№>ю на

тоглко ЛПС и тром&лно,;/., но и коллагвяоад. Отсутствие слияний профенина t-. РЯЗЗХ на iprjwSoai'JTsi 2 г«л?змo ¡^oos'.i салательотвует о существовании с e«rí»'¿-i3y¡a кгхакиаглоз, огранк'чи-заощмх дайотою ©tvsx

полкпептидов на клетки. Повышенная гэтиеность профэку-та и FR3SX s концентрации катзпсииа G сокоа».«эд хпоткаш! АТФ сундвственко уменьшалась, oooT2ssî3 отношении тра&йкзцитоз, оттуякрсег«кьес,ППС, асроятко, была сгязана с измзивниаадм трог/Зо^тгрных гдэьсЗраи, m струхтуркг-й дезорганизацией, гвксрадой тргюздзд^хзюого '.¡отй^ад-ала, cSpascsia-нкои потвкциало£Е:«»»»ы>с искиьк какало:*, что дглало -фом&чдою боп-гв ч^тзитвльикш к дейоттоко аниаглхрсбнкх полжагп-фов ÍA.3.2wxr'j-poa и др.,1938; З.Т.ЯДигзрСЕа,1929). Подтверждением эт/К данкьос язяядатсз результаты ооботевнкьо: иослодо®гк-;еЧ о рзалигягэзз прсагрзггг^сч-яс;" акткзности профенина и PRS9X голызэ rain еогдг^стй да. грэ?.<Лс1?пи, r439,t^5MTQíH»HO сп^улярозгикко ЛПО. ftïAvssro4:KKbf3 ямтс-раг/рг&гз дахкыэ о сссйотзах профзмжэ и ГЯЗЗл nos зонда-ат думать, что кзядадоцЗ характер их ?лол«хул w у rw«?o фг-бкьк'г-'/лзтеса етрхкот

роль воффсктгх этих полкгезптэд.сака vpctäz ь^ты ( 2.А-£згЬзгй1 et d, * яг1 ; S.LHar'Äig ot al.,1585). По дтс&з шпкрззшя*,я гектаров, ташентгадел грсфонодам РЯ39Х, Í^íox^o

были значительно hjc?» тех &№ц«к»рзцк-3, нря кота$зьэс кя

гнткб£Ктс-р:-1£/Егная атл/г^-поть. Попученчмо ДДУ.:-Х--Э П-хаопйгот л^здгбл* охсить, что профонян к PRSSÎÎs кскцантр^ж, s готсгык f.*aa.«ioy.üK>$s iä шттккробкыа ефф?ктъ$, ызгуг «э тошсо потекдетсзап», ко и огкосчса-только екзызать Солгв £?риггил:о и ояфзцкй YpOMÛotçiTor,

чзм в прозодэ:-(к&х ояспсрю-жтж.

Влйянхэ катепскка 6 «a агрзгздгео « оегрзцк» АТФ троиЗецйтов было

оценено аконцентрациям 0,1 ; 0,5; 's : 10 щ20 В дагяазонз коспедова-}-Kfcst концактргц&зй кателскк G сисснгз&п дозезгвмшмузо > оп^л

отелытых тро?/л5оцитоа. При ксаол^зозгжи <3 в kchU'íhtp'í-j^'.i.»

tí вьгшо егрогацкн трокбсц^тоз рагсяголасъ через 10-15 о поояэ добазлокия пол;зп9Гггеда. в болеэ км&сой кснцэнтрацки хатепожа СОДбыасЗД) лгг-пвр1*од аг-зепацда кпгток есстге'-т з ерздкач 30 с. Н'>. фон.» катепсша в s кокцэжргц*и 0,'i r.ixf-.î Ерклд качалаагрегации тромбоимтсз после их стимуляции по липвлтздрм Оъгло ргазко в средкэгл 60 о, азднлкг/да и 5«гкс«»йаяьнгя скорость сеотаотот&а:~п-5с 51,3% г. Й6,2%/?<ин. ^тепскн G излкзтся ownbkbs<ï индукторо;«: агргггих« трос/соц-лтса. о ксни.ентреи'.ч 1 этотполе':п5лтид 2^5кз£у? ггрйп??4'-:;о тромбоцитоз, которая по фор^пэ фи&ой, вэпт'лн'мл и была Йлизка к

агрегацяи клэтогс, другим 1ро'/.ссиитзр-гсь::'л ггонис-

TQ.VI - трог/.5иксм (1 йд/кгп). Апрсгада трси'йо14итов, ^звг^гчай icoí !Ц6нтсйц-лп>м катепшна 3{1;1 Oav^MI, ccr¡p-3so:tta»m.ob гл!0£>«энний сок-роцкей клетксг.-и АТФ, ico торг:-', кгчккалгсъ » среднее чеоэз 7,0 с-noo.ne aro внесения в суспенз^о тромбоцитов. При сн;г/-:еь""<и

фзьч» С,б .''-.к?'/- полдазпт«г:д1 вэлкедну приблизительно в 3 раза меньшук

'■о..! rfái îO&acâS католскма G. .Пэт-период начала сг»фец«:

дэ 50 о. й шкгклэ «pos? каттсмн S в диапазон •.•âv.iÇTwpv;.?!^ >::; ськ&ззм srpereqpo эроайбоыгйтоа и се^рздеэ

:<"лД1 /-¡'У*•£■ G. Гл> ьъ&уг ib^ií^zí.

iis'-'iïWXfi.-vj ^¡гк^Гй^, сц-кзокаш o ггоиоэщиф CiíiHwpyvo

ш^^-лтл«, ît'iw c-tisttssühfa» г;од епнй-!лзлл кгядой и--«йЯ'гэдсг-.'мньл к^гапсчи'а 6. В экки^ектра^и ко толжс

'}0.\-:Л\; лIÍV'V,;;!^^ítóSrVíiTi^a'KG^&usanB^^

г£:с<лй-,.<,чс гл'лгоч:-ßi.woöjXs;я-кугпуЗ-

iv.úYic.-vhïï-Wi ii^c^mcстл к сэглшага кся1«83г»Ей к агрегаты tra TpowíSoi&iToa.

Па>: й л Ас^й.гтг1, ссгллс-гйгса ^ летератдаайМ р&тжа о про« -лелеет« sjriurutf'waО коткс-шгнга ipowSot^voc, ©згхр-г-vj>r<;co ели а^зольшж кйсйотм с cg-

/îi.j'ï^tîUilî.Fi'-tvyi'ido ór Влда^лта кетепз^^ G на трсгл»

-V.F.tî:,* oÔu?rKXiCirtsiÂ4£ïS.4Kor.çoTor3 гсзет^зп'щза со

ï» йггсл* гот»« к шэювдзд; на GK-oresí/ мемЛр^Гг« «í. eí.^SSiO; C-Ä.Laivssa et S3..1&S4). gjz&sm

мжгш^'-зщда: 0,1 ; 0,S; i Зяастазав

& ау^й йлыйхчтй огягкгдздог пздазлм«".э

мчг'я« пгрепз.7,** k- осурецжа е'Л^тьк тромбоцитов. При

po^ï.? ллг'гггдй; язк^ч^-^ SAvir^Ty^: Й жор^етл ьтрэг&ц^гк

i/ai). «^xœwKii/ cbr-ofr вувдгавзднко» чом на фоне мягкж хощв;-г»рац:'Д

i-îoae.'îcsc^iiv'j едаота?.» e Imîî/I

ул.йш-5 ян^гарйс дг ¿гр&гехяи tpo»m3oí4^itos

C-i3áfjí<ü,05} m с ло;ч\т.опги oxiaoïssu), a rçsw

с-penaos xr.3T«s: скяхвелал, er ïT^^C.OS) й-шмутней к;«суЗгцли до прл tO-»««»^^ KKSïôalLyji. lííí'/^aHüe ЕИ^ЙЯН^ гластазк а Г;,in. трег^-бад-.-.ч-кг, 3rfScc.SHV%0 АДФ{1

bK>n«;í-£ííci,!<'¿ í-i .v&T/un} ил!-з »п1гн&ф?ш-гом ( 1 ыВхлЩ, КЗСЫЙВМЛО

cíc^xjctk sr^-srsiiH:; тромбедипев, a

Г'? ркр/, ^.ге^^гоз стшчь;-1а слоообность элгетггм вызывать

rî I^Ä^iVüü К ПГгЬ^гО В &1Ж Crt-iTs.X &ГрСГ£Ц!-?а Тролгбо-

имэла шсто лишь при высокой концантрадяя апастагы (йдхй) о; ссо гаталэ в среднем 54% для амплитуда и ЙВ%/мин дня окорсст» ¡спето*.

Брома начала агрегации тромбоиитоз & плазма составляло в ср^дкс^ 3 шмугы после дсбазланиа в среду юоолэдуеойато потапеггада. Сг-кргц^з :слотка:л» АТФ при атом Была очень низкая.

Следовательно, ©яаотага о заЕкзкадости от одедзитрзцки я геволэдзуа-мой среда ко5хет обладать как здтизгрегадоонкс&, так и проюрвгадоскксй гктданостыо а отношении тромбоцитов. Получакказ результаты ссгг&дэ* к>т о литературные данкьшя об шгкбкруизщем вшянки аласткзы- на

е"с а!.,193»; М.8.Вгои*зг £1,1935). Азщза объясняют от еАф^хгы уаездь-шенюем под влишшм алаотеги учгстаее на •урозлЗовдта*, яа-

сзязывакке оаголзкулаая троьгбкна, и сграниченио>Л1га»?«к-&з гротооп&а кеьг.браикьвс гпккопрэте'/аоа. Одкгко в кослэдйааи'лях 'СВуЬй^гка и др.( 1985}, А. М.ШсМ и 5СШ©1шгёззп(1885) еластаза по- дгшига агрг гэди» тромбоцитов., »мдущзжзгшуго да только трс^й^нсы, из тгяие калкагаиом и фактором Виллэбранда, что не согласуется о даккьаа» с сэпсятсскосто гагиогфуяидего влмдоия этого попипзпгдда на трои&и^фги^зк^иу» агрегацию клеток. По данным литературы, влияние аяаотгсы на трзйсци-ты ео снегом определяется содержанкам а исоладусуай сред* фибриногена, а также плазменных кнгаСиторое, напри- гвзр альфа1 -антитрелсл й (ЕСВуко'л&а <г>\ а!.,1ЭЯ5^.Н.№14епз е4 г]., 1992). Показано, что элаотгга способна сьггыгать скошзэдсз на тромбоцитах ахпгаиьгк учзслгсса, еггзщих фкбруя-гаген, что прпзодит к фибршсген-инд^рэзаиноС* агрзга-цкл клоток(Е.Котами е1 с!.,"8 31*3}. На оснозгнки этих да-икх мокато предположить, что раззптее агрегации трс&йбоцитос под шашя эластааы лишь а части проведешь« экспериментов, вероятно, было ежзако с качественные состазом плазма кро т а кагдем конфеткам исследссжки.

ЛактрФс»ра>7н

Влияние лактоферрана нзйтрофилоз человека на агрегоцш и се'/рэдцг.;о тромбоцитов оценивалось в кзнцентрадаях 0,1; 1 и 10 мкМ. Опыта показали, что в концентрациях 0,1 адхлЯ и 1 мхМ лактофзрряч не вызывает агрегацию и секрецию АТФ тромбоцитов в течение 20 мккут инкубации, Й этихже концентрациях лахтоферркн из оказыазл л/зстоееркого злкякия на агрегационну:о и секреторную ахтаюсть тромбодитез, отш^адроЕанных тромбкном(0,1 и 1 £ц/?лл),коллггеном(1 к •'¡глег/глл), ЛДФП а тг;с;;э

ЛПС(100 и 40Скйкг/мл). 8 максимальной из иоолодо£:-аннь!к-концентрац»й(1 ОихЩ лаетоферрин выгывал раззятио агрип-д^ж трскбо-цитоз з плааш крови, сяторая, однако, ?.о всех проведек!-й-5С опыта;; згга об- ратикадй хгцэактер. Длетлитуда /«а^тфе-ррач-издшрозаннсД аграгн.?1'«

тро&йбоцмтск2 Сыла небольшой и составила в среднем 39+5% при схороотс ¿щзагацки 14+г%/|.ш<. Следует отметить, что для развития агрегации тромбоцчтоз а пр$:оутотвии ласгоферрина необходим был длительный период уп¡ху^ЗДМ клеток с пэ^гюитцдозд составляющие в разных охспе-Р№Я6".-;тйкот5 до £ Саарафал тродсоцгггши АТФ на фоне лахтофер-ркне. отг.-ачймо ко было.

СлоАсвага1к,но, лактофоррин нгйгрофмло» человека лишь в высоки» кенцегпр&цшх сьвдгваэг агрегация» тро?л8оцитоз, для чего нзобкодкзло плазмы краги. Иг. вогаашоогп» влияния лгистофоррхна на трзх^идозд т&оке укаглагали Аналога и ¿25.(1 Э50), обнаружившие сущее» теоз^й ¡е даух тйпзе рацоптороь х лгктофзррииу з втек клгтсах. Ка осноза-кии со5с*&гкньзг результатов о вдажка лглшферркна в еьюетх ко-нир&ц/зфж на а твхжз лгтэрэтурньк данных о существенном

•/мякчонкк овдэр&гкия отего пота-к-шгдав плагмз крови при септицемии и ендэтсхеомег (Т.Л.вы&е&ан'д «йе!., 1938) кзжно предположить его участие ь. оояс-хмз:-:^ «Ери указанных состояниях.

Фун,з#;знал£: кзэт а;атданоотъ тром&идетоз на фоне миелопэрскоцдазы кэйтрофялоз чол-люка оцжатйзлаоь при (ознцзятрацлйх фермента 0,1 шМ;

и ЮмЗД. !3 отличмз от других, описанных выше, антимикробных псгскзептгздоа найтрскфилсз, ^элглорокездаза человека в диапазоне кеоледс&зд ¡нык концентраций из е&зьазада раасктие агрегац,'©] и секреции (сцзно«-:оГ» по уровня АТФ) трм^г^втоа ОДвдюлгрояоидедо таохе нэ эяж&епа дйсу«^р;-:ого на ггрзшлгвокк^о и секретарило акта*

ко от;- аго»гот-стк:4т/«?<розакквас клеток. 3 качестве ггонистов бмли ио> пашгоагики трои-Зли (0.1; 0,5 и 1 Цц/мл), коллаген (1 и4мя/мп), ДДФ(1 и агашефр^С I и ), а тыаез ЛПС( 100 и 400 шг/ш). Варьирование в разньк опыта* Бдоасзди икху$ации т^кжбоцитов с ферглентом от 1 до 30 минут, гшй-гнеку.е среду инкубация (шм ш суспензия), а также добезлендаз» а ср&ду окиелителя (Н2Ог а концентрациях 1 или Юа/кМ) и г&пэада ь концентрациях 10 и ЮОжМ) не оказывали влияния на егр&гацию и езкрецяй АТФ тро|«боцк'»шаг<р.1суто'шии миелоперокоедазы. В литературе »«кается едидаг-й&ге сведения о секреторной активности трог/.5оцитоз в гфисугетедо мнолоперскс^дазной система! (миелоперокси-даза +МгОа+галойд), оцононкой по уровню серотонина и адвнмна (В./*Х1^!с>&.Л.К!зЬапо1?,1379,1880). Однако развития агрегат«» тромбоцитов йстар^ тсхе не отмечали.

Сладогзгелъно, к»ошл*-роксида2£, разно как и лаетоферрин, является г/ллсоффе&тегньзд ьоадотвом а регуляции функциональной активности

тршЗоцчгой ш с др^тк^ гнтм^лкробныда полипептидами

нойтрофилов (дефеисины, протегржы, профеюгн, РЯЗЗХ, гжепзкн '3, олгстаза).

1вИТрОфИЛОЗ на (ftVH'XtBîOi-fpPHF^TO Г "'<"■• fTQV.iXWîW АхТИВКрОЗСКНЫО нейтрофилы СЗКрЗТОДОГ&Т ОДНСгрэУ-СННО ХО»-ПОН0Н?Ы как азурофильнш, так и специфкчгкгж гранул, что приводит к понглэдало в фаголизосошх или Енегслоточногл прссгсракстзо рпзтчньк продуктов нэйтрофилов, кооперативно реализукэдкх антимккробны-э 'л дзутг» эф» фезпыней1рофилсв(ААПалы&:н,1г£8; BJií<o^Rcca,19£3,13í;S; OJ.lVc&s, 1991). Поэтов, юучиз влкзиио отдальк-'-Х ®гсшг«рсйа>з: ror snâtrwqc-c нойтрофилов на фунгцкснгльнуто ехгизкоэть тро^-х^тг^г, 6\у>з сдзнгка попытка оценить характер ггрзгацког-лой г^Л'.пкхпгз vjbowGo»

цятов под действом одоовродзнно ко«хсол-»гаос да osn-cc гг&^-стг. Срздм

кцкокальну» зсговнооть 'грог/.боцктсз, двфшгглнь и ; кс íSoneo

часто обладал» способность» модолировзп& эффекты кг отл илзгки дауп-гя: полипоптидавквйтрофмлов. Блеешь дэфвнет^озка^!^-:'!..^ тос: л'ссщ-г-тов в комбинации с другилси, изучзкмьа.'и с работе, подупзгпцсзк.« с- oíItíc-фнлов существенно зависало от их к»н1$знтрадяг,ч и сцрогсй прягодла??' нооти. Tax, дефоксины человека в вида фракц".^ й шззш

кокцзнтрациях (20лгяг/асл) подселяла гтрзгздед трсг/Г-эц^тсз, ванну» катепоккогл 6, з среднем на в1%{р<0,01). Небольшая •агр-огга&гп тровйбоцитаз, вызванная дефскекиамч человека а яокдс'/етрг^-кл ЮОюг/ мл, усиливалась в присутотвш профеккиа с 12±3% до (p<0,ö5J.

Протвф^н, напротив, кнтбкрсззл srpetmçso кязтсу, дофонсйна«^ человека в высокой кснцоктрзцки (ЙООуггг/лгл), я ерэ.г>«~й5 f ía 35%(p<0,05). Афегвцкя троыгбоцитов, вызванная сушкраой фракций дефснсиноз ¡фолкка (SOCf^T/átn), к значительной к'.зрэ тах>:;з по.с-2злял20& эластазой. Величина сшжэкия аьячлитуды агрегации клэток в st« gtchs-рузлгнтах составила 75±1ö%(p<0,05). Однако дафзкста? крояи-

:са NP-1 в нишх хонцэнтргциях (Южг/мл) в (Од&шгзди с »сялотройя-'»-г^эой вызывал раззмтоэ вфзгацкм тромбоцитов сауплитудс-й S2=S%, я то 2рзш юйс на фонэ изо- лированного NP-1 отот похаэатол» составляя Î 3±4% (р<0,05).

Эценка афегацюонной ахтизности тромбоцитов под еливкив'д протегркка г, комбмнации о другою* продуктами нойтрофилов показала, что s высокой сонцвнтргцим (100деаг/мп) этотполияегтодусмлюзал яфепагдо тромбоцитов в плазма крови, индуцированную лактоферркноИ'Ои'зс&Д) к »лаотазой(5^(М), ооотаэтотвонно на 39% (р<0,05) и 20% <р<0,05), В 1ро«0жуточной концентрами« (Югот/мл) протпгр:н a fjoei^-Kaw» о пр^-1>0нином вызывал афвгаци;о тромбоцитоа с а^апл-лтудой 3S±S%, тогда шс

код;.;:,vi ю STyií пегтачдэа с отдельности но еа-щуффозгл агрегация ««»•оз. П^отсгрин в tus кой юндонтргида (0,1 ¡¿зг/ьап) лодззлял агрегации трог/^аау/ггоз, зыэ'зёдо-сугэ кгт^пшжшй. Инпгшруоддой эффект протегрн на е -гткс опсгтгк ссстгзлак 42±G% (р<0,(?1).

агрсг&-дож£к вктоздость троулоцятов, откмулироеанньк ег0ну2ст£№

тахх» подвергалась шэдулядаи н; фсче ксоодэкаэд: п&пялттздоа. Так, подгвлэняэ тромбин

кндудордедошой агрогз^и тромбоцитов протегрином{ 1 «scr/юл) » np-s i« с^здродэкком использования было оыраженс в с^д'Кйй на 51%(р<0,01> «хйпн-зе, чом под дейотвяг^: кзсэдого иг втею кощ-зкгс с, зчдглмовчк. Ксм^г-гсед'.я НММ (0,1(&г/Ш1) и протегрмнг (0,1 мят/мп) тежг г.отелцу42огадг саалоетсятегднсэ пнгобирукмцее влия-кк,о í'Vr.."; трсмЗзцитов, аигзгинуя» коллггеноад(4им7

ыл), c-Dcn^'i'.íri S5%íp<Q,0S}. не оказывая са:лостоятвль-

по дог,тсг:"а-с-;<сгс- ка гг^&гадоонкул акнкнссть трогябоцктов, оти-

рл2>»я }, ¡¿.те жо ьрэш подавление дефенсот*

Hfcm Ч'с- з кчд® к.-й фракция ('I Омхг/мл) агрегации троейзоця-

тс© и ср-уьеи н& 67%(р<0,05),

Пс^-^кж^ да-йГйС» о?едотольотз^от о том, что большинство анткадлх-пзлет^пгподг^ к&йтрофялез способна ко только самостоятельно ггрчк^птй. V3.CAV.& в рзгуляцдо фунэджк&пьнэй активности тромбоцитов, ко также к&дулмрзвгзь сп:-п:иь',е на шт»! др^шх пошпепщдез из стой

Тйгчмой^агсгА, 5_'е.;£улькгты, i*ww»©w:b!® вданиоай разделе, позволили уога-ж-.-iтс> -жл фаст м s¿í«cmy«> уопозяя бгегдзкекий ггрешдокной и »«^íOTciJjsoíi й.пгг^^ои:« тргздЗсздетс», а т&вш и« структуры под влиянг.згд дефенемноз, т!ротбгрг<зна, профеикнг, FR39X, катепскна G, оластазы, лак-тоферржв i'; нзйтрофшюз. Эти данные представляют

ззбоГ< пергу» ксличеетзеи;*?*» дор&огсркстокуизшкений функциональной

сызаая-й.-»? Еиглужробньгмм пелипгптидами нг-йтрофипоз. удогеддо&одй предусматривали изучить биохи-

«мчэспка доходке й основе едш^гоаагрэгаи^юнной гкткзноо-

Ti'i тром^хдчгоа на фоне здшАуисро&дех полипептидов нейтрофилов.

вдюовздчбсюе изигкгкда s теогя&смитх при действий на

ъш ытыш&ътш колйпшгидов к^ггрОФШюа ü.sfii-rD saiKUJocb изучение характера и величины 6woxi«&i-

чесш'-: сдвигов з HossKTsuy/i^eBaHHKíc, а тгдахе ггониот-сткмутровгмных

г.рсгегря;-{ОМ, профонином, PR39X, '¿Xi-S'.íObMGwt G и алаотагой. изменения в тромбоцитах были

оценена пе покгзггеля^, далее»»;-«« которых прздйотся ведущая роль в

механизмах активации стих клеток (метаболиты арзхидоновой шслош, циклические нуклеотиды. цитоплазматичвс^й Са2+.С.Габриелян, С.Э.Акопов,1985; М.Н.Кга11,А.1.3сЬаГег,193Э; М.ЕНоззЛЭЗЗ). В отом же разделе работы было проведено измерение величины потенциала плазматической мембраны тромбоцитов в присутствии анти№!!фобных полипептм-дов нейтрофилое, который является важной елехтрофизиологическсй характеристикой функционального состояния тромбоцитов (П. В.Авдонин, В.А.Ткачук, 1594).

Уровень малонового днапьдепша (ЫДА) в тооалбоиитзх

Базапьный уровень МДА в контрольной серим опытов в отмытых тромбоцитах человека составил 0,6±0,2нМ/10 клеток. При оценке содержания МДА в несткмулированных агонистаки троьлбоцитгх исследуеллые полипептиды нейтрофилоз были использованы в концентрациях, потенцировавших максимально выраженный эффект агрегации клеток. Достоверное увеличение уровня МДА в тромбоцитах вызывали дефенсины человека НМРз и НМР-1, протегрин Р6-2 в высоких концентрация«, а также катепеим в, составив соответственно 80%(р<0,01), 86%(р<0,01), 57%(р<0,05) и 87%(р<0,01} от базальной величины. Под ашкклем профэкика и РПЗОХ была отмечена лишь тенденция к росту зтого показателя в тромбоцитах.

Продукция МДА в тромбоцитах, индуцированная тромбин0,5Ед/мл), достоверно уменьшалась после предварительной инкубации клеток с д&-фенсинами человека НЫРе(40мхг/мл) и НМР-1{0,1ша-/мл), протегрином РС-2(0,1г«хг/мл), а также эластазой( 1 мкг/мл). Белизна снижения зтого показателя для дефенсинов НЫРз и НМР-1 составила 43%(р<0,05) и 51% (р<0,05), а протегрина и еластазы - 57%(р<0,01) и 49%(р<0,05) соответственно. РЯ39Х(20лвт/мл) и профзнин{1 Омхг/мл), напротив, усиливали образование в тромбоцитах МДА в условиях стимуляции клеток трокзбинам на 33%(р<0,05) и 23%(рС0,05>.

Налрааленность сдвигов уровня МДА в тромбоцитах, стимулмрованньгх ко л лаге н о ^мкг/мл}, под влиянием исследуемых полипептидов в целом соответствовала таковой на фоне тро?лбина. Дефенсины человека НМРз и Н№-1 в низких концентрациях подавляли то л л аген- имдуциро ванный рост содержания МДА в тромбоцитах в среднем на 41 %{р<0,05} и 59%(р<0,01),. а протегринна 44%(р<0,05). В то же время увеличение уровня МДА, вызванное коллагеном, на фоне оластазы(1г»к!Л) достоверно не отличалось от контрольной величины. После инкубации тромбоцитов с РКЗ&Х или профенином отмечалась лишь тенденция к росту содержания МДА. в клетках, стимулированных коллагеном. Однако последние два.полипептида вызывали достоверный рост величины исследуемого параметра в тромбоцитах, стимулированных ЛПС(200ма-/мл}. На фоне РНЗЗХ подъем уровня МДА составил 47%(р<0,05). а профенина - 57%(р<0,СП).

Следовательно, под слиянием антикэ-чхробных по липептидов нейтрофилов пгргллэльно со сдаигалди агрэгацмонной активности тромбоцитов из-ьсаняется содержание с них МДА, величина и направленность которого существенно зависит от б яда используемого вещества, его концентрации, а та-око исходного состояния клеток. При этом в условиях потенцирования полип£птндам>1 агрегации тро:лбоцитое. поплчестао МДА в клетках возрастает и с-1-гл;;«_отся при кнгибирозании агонист-индуцированной агрегации трс«<5оцлтоЕ. Полученное д£ннь:е свидетельствуют в пользу участия мета-болктоа арахидоновой кислоты, одним из которых является МДА, в механизмах реализации еффектоз антимикробных полипептидов нейтрофилов на функциональную активность троьлбоцитоЕ.

Сояепасание тсюг^Зоксана В?. (ТХВ2> в тромбоцитах

Влияние антилвикробнах полипептидов нейтрофилов на образование ТХВ2 в тромбоцитах человека было изучено как в нестимулированных клетках, т£лх и на фоне издукторов агрегации. Исследуемые вещества использовались с експериментах в концентрациях, при которьос были выявлены из.уюнання уровня МДА е тромбоцитах.

В контрольной серии опытов количество ТХВ2 в отмытых тромбоцитах составило 3.8±0,5пг/10 клеток. Наиболее значительное (р<0,001 )увеличе-ние содержания ТХВ2 отмечено в тромбоцитах, стимулированных высокими концентрация^! дефенсинов человека НМРз и ИМР-Т, а также катепсином <2 (соответстгенио на 84%, 82% и 85% от базального уровня этого метаболита). В меньшей степени количество ТХВ2 возрастало в отмытых тромбоцитах на фоне протегрина Рй-2(1 ООмкг/мл), составляя в среднем 41 %(р<0,05). Однако под слиянием этого полипептида в той же концентрации содержание ТХБ2 в тромбоцитах в плазме крови составило 11,8±1,4пг/ 10 клеток, что было в среднем на 54%(р<0,01) больше, чем в кснтроле(5,4ё0,6пг/10 клеток), и на 46%(р<0,01) больше, чем в суспензии отмытых тромбоцитов. На фоне профенина(10.\«г/мл) и РР.39Х (20к«сг/мл) отмечалась лишь тенденция к росту ГХВ2 в тромбоцитах соответственно на 9% и 27%.

Дефенсины человек Н(\!Рз(40мкг/мл), К№Р-1(0,1м.<г/мл), протегрин Р6-2(0,1м:;г/мл}, а также-еластаза(1мкМ) снижали уровень ТХВ2 в тромбоцитах, активированных тром5ином(0,5Ед/мл). Величина уменьшения количества исследуемого вещества по сравнению с его контрольным уровнем составила на фоне НМР5-39%(р<0,05), НЫР-1-54%(р<0,01), Р6-2-24%{р<0,02) и 8ластазы-33%(р<0,05). Полипептид РЙЗЭХ, напротив, уси-лива^тромбин-индуцмрованвов образование ТХВ2 в клетках в среднем на 25%(р<0,0'3). Дэфенсины НЫРв и НЫР-1, а также Р6-2 в низких концентрациях уменьшали образование ТХВ2 б тромбоцитах, индуцированное также коллаг&ном{4сясг/мл). Подавление тромбоксзн-синтезиругащей активноо-ти

тромбоцитов под влиянием етих полкпептмдоз было выражено прибпи-ите льнов равной мере, сесташвЗЗ%(р<0)05} на фоне НМРз,33%(р<0,05}-МР-1 и 32%(р<0.С5)-Рв-2. Профенин и РЙ39Х существенно усиливали бразсзаниеТХВ2 а тромбоцитах, которые предварительно были откмули-озаныЛПС{200мхг/мл). Содержание в тро£'.!боцмтакксследузглогоБвщео-за увеличивалось на фоне этих пошпептмдое при&трно на одинаковое еличину и составило для профонина 53%(р<0,0о), а для РЙ39Х -6%(р<0,05).

Следовательно, антимикробные полезтептиды нейтрофилов бразовакме ТХВв в тромбоцитах человека, направленность сдзкгоз кото-ого при одинаковых условиях експзримента г целом совпадает с кзменэ-иам содержания МДА в этих клетках. Литературные данные о авдуэдзй олиТХА^ стабильным ыгэтабо литом которого является ТХВ^ амэханигмзх стизацки троЕ.сбоцитов(М.Н.1й"с!1,А.1.8<^1а?ег(1589; Р.6геое!е,1992), г так-:е собственные результаты позаолгеот рассматривать тромбсксан акачес-го метаболита арахидсновой ¡сколота, прп участии которого реализу ется 35с проагреггционные эффекты ант&шкробньгс полипептидоз иейтрофн-ов на тромбоцита, тек и их актмагрегзциенные саойства в отношения "онист- стимулированных троь^бсцитсг.

Уровень циклических нуклеотипо^ц АМФ и цГИФ} г- тоо.убс^лгзх

Среди основных а^утржпеточнькмзхак^зьбоз, улгзньша;сщ:о< или пр-?д-твращающих егонист-га-уг/цкрованную активацию троу.бепттоз, в литера-,грв рассматривается смотеш циклических нуклеоткдов (Э.С.Ггбриелг.к, .Э.Акспоз,1935; М.Н.Кгс!!,А.1.3с5-1г?ег,19£9; 1.3а5дап!оо?Г эг а].,1992}. В гязи с этим было изучено влияние гнтг^'Кробньлх полмпепгдцав нентро-илоа на содержание цАМФ и цГМФ в неахтивдрозанньо;, а также агонист-гимулировгнных тромбоцитах. Бззапькый урозень циклических кукяеоти-эв в тромбоц итах человека составил для цАЕИФ 2,*Ы), ЗпМ/Ю.сслетохи для ГМФ - 0,9±0,1пМ/10 клеток. Нзиболее выраженные сдвиги содергканкя ШФ и цГМФ в тромбоцитах вызывал протегрин (Р2-2). В присутствии РЗ-в низкой концентрации (0,1м;<г/мл) образование цАМФ а тромбоцитах зевышало его базальнкй уровень в сред- нема 2 рзза(р<0,001}. Однако эдержание цГМФ в етих условиях достоверно не отличалс-сь от контроля, ри этом коэффициент цАМФ/цГМф был, в среднем на 120%(р<0,001} ш его базальной величины. Увеличение концентрации протегомна до Э0?лкг/кл сопровождалось менее значительным подъемом урогня• цА;\1Ф тромбоцитах, превышая контрольные значения в среднем на70?о(р<0,05}. дноерек'юнно с цАМФ на фоне высоких концентраций прстегрика сущес->енно возрастал и урозень цГМФ (на 130%}. Коэффициент цАМФ/цШФ этих экспериментах составил 2,3. что было на 30%{р<0,05} меньше его жтрольной величины.

Изменение содерзкания циклических нуклеотидов в тромбоцитах вызывали также катенсин 6 и эластаза. Под влиянием катепсина 6 (1мкМ) достоварно(р<0,С01} увеличивалось образование цГМФ в клетках в среднем на 200%, тогда как в отношении цАМФ отмечена лишь тенденция к его рос1уна28%. Коэффициент цАМФ/цГМФ на фоне катепсина 6 уменьшался в среднем на 60%(р<0,01) по сравнению с его контрольной величиной. Зластаза(1мхМ), напротив, усиливала образование цАМФ в нестимулиро-санных тромбоцитах (на 82%,р<0|001), не приводя к достоверны.»! сдвигам уровня цГМФ. Увеличение коэффициента цАМФ/цГМФ в этих опытах составило 30%(р<0,01) по сравнению с контролем.

Дефонсины НМР2 и НЫР-1 в высоких или низких концентрациях, а так- же профенин и РР.39К не вызывали достоверных изменений содержания циклических нуклоотидов в неактивирозанных агонисталда тромбоцитах.

Направленность одзигов уровня цикличесясих нуклеотидоз в тромбоцитах, ста'йулирсванных гтониотгмм, на фоне исследуемых веществ отличалась от таковых в нэ&ктивироЕанных клетках. В присутствии агонистов дэфенсины НМР&(40глкг/ш1) и НМР-1(0,1 ют/мл) усиливали образование цА!»1Ф в клетках. В тромбоцитах, стимулированных тромбином(0,5Еда/мл), уровень цАМФуйелич^?залсясоответственно на39%(р<0,05) и62%(р<0,01}. При воздействии на клетки коллагена(4ййкг/мл) на фоне. исследуемых поянпептидоз содержание в нж цАМФ возрастало приблизительно на ту же величину и составило 47%(р<0,05) и 68%(р<0,01). Уровень цГМФ в тромбоцитах, стимулированных как тромбином, так и коллагеном, не изменялся или имел тенденцию к снижению по сравнению с контролем.

В активированных тромбоцитах протегрин(0,1 мкг/мл) усиливал образование цДМФ, величина которого, однако, была меньше, чем в интактных клетках. На фоне тромбина рост уровня цАМФ составил 82%(р<0,001), а коллагена - 74%(р<0,01) по сравнению с контролем. В тромбин-стимулированных тромбоцитах в присутствии протегрина увеличивалось также и содержание цШ Ф( на 32% ,р<0,05), тогда как под влиянием коллагена была отмечена лишь тенденция к росту количества этого вещества на 23%. Коэффициент иАМФ/цШФ на фоне протегрина возрастал в экспериментах с тромбином на 30%(р<0,05), а с коллагеном - на 35%(р<0,05). Направленность сдвигов содержания циклических нуклеотидов в тромбоцитах, активированных агонистами, в присутствии эластазы не отличалась от таковой в опытах с нестимулированными клеткам. Эласта- за(1мкМ) увеличивала содержание цАМФ в тромбоцитах, стимулированных тро!^би-ном, на 53%(р<0,01}, а коллагеном-на 38%(р<0,05) по сравнению с контролем. В то же время уровень цГМФ на фоне коллагена в присутствии эластазы также достоверно увеличивался (на 30%,р<0,05), вследствие чего коэффициент цАгу1Ф/цГМФ не отличался от контрольной вели- чины. Отсутствие

достоверных сдвигов содержания цГМФ в клетках, активированных трог/г бином, под влиянием эластазы, напротив, приводило к возрастанию этого коэффициента на 25%(р<0,05) выше контрольной величины.

В тромбоцитах, стимулированных ЛПС(200?лхгДгл), достоверное изменение уровня циклических нуклеотидовбыло отмечено лишь под влиянием профенина и РЙ39Х. Так, образование цГМФ в клетках в присутствии профенинаООшг/мл) увеличивалось на 67%(р<0,01), а на фона РР.39Х (20мкг/мл)-на 52%(р<0,05). Однако содержание цАМФ в тромбоцитах в этих опытах достоверно не изменялось. Вследствие отмэченкь« сдвигов коэффициент ц&МФ/цГМФ снижался под влиянием профзнина на 45%(р<0,05), а РРШХ-на 40%(р<0,05) по сравнению с контрольным уровнем.

Следовательно, дефенсины, протегрины, профоник, РЯЗбХ, кзтепсин 6 и эластаза нейтрофилов оказывают влияние на уровень цАЭДФ и цГМФ в тромбоцитах, количественное соотношение которых определяет проагро-гационные или антиагрогационныэ свойства эй« полипептидов. Преимущественный рост в агонист-стимулированных тромбоцитах содержание цАМФ, которое/ придается ведущая роль в механизмах, препятствующих активации клеток, на фоке дефенсинов и протегрина в низких концентрациях, а также эластазы можзт указывать на активацию полнпо-гггидами фермента аденилатциклазы или ингибпровачиэ фосфодиэтеразы цАМФ(К.М.1.агеае1а].,1987; 1„8а!дап|'со1? е1а1.,1992). Агрегация тромбоцитов, вызванная протегрином в высокой концентрации, катэпскном 6, а таюхе профенином и РЯЗЗХ в ЛПС-стемулкроеанкых клетках сопровождается более выраженным увеличением уровня цГМФ по сравнению с цАМФ, что свидетельствует об участии цГМФ в механизмах активации троййоци-тов, вызванной этими полипептида^и.

Уровень питоплазматического кальция в кхялбоиятах

Согласно литературным данны?л одним из основных путей регуляции диклическими нуклеотидаш1 активности тромгбоцитов является »ее влияние 4а Са2+-зависимые реакции в этих клетках (Л. Епсит" е! а1.,1987; 6.СЛ¥Ше е! а1.,1995). Исходя из этого было изучено влияние антимикробных полкпеп-гидов нейтрофилов на содержание цитоплазматичоского Са2+ ([Са2-г]й>)т} в тромбоцитах человека.

5азальный уровень (котроль)[Са2+ЗйИтвтрок',боцит2хсостаЕил "¡27±9нМ. Под влиянием дафенсинов человека НК'Рз (ЮОмкг/мл) отмечалоеь.повы-иание [Са2+]^, которое к 3 мм нуте их инкубации с тромбоцитами превышало исходные величины в среднем на 43%(р<0,05). Увеличение концен-грации НМРз до 200мкг/мл вызывало более выраженный подъем [Сз2-г}ци, г тромбоцитах (на 98%,р<0,001 по сравнению с контролем}. Дефенснн 4ЫР-1 в высокой концентрации П ООглхг/мл} также вызывал

существенный рост уровня цмтоплазг/атичоского Са2+ в тромбоцита> ссстас-ив в среднем 2£0%(р<0,01) от контрольной величины, что н £6%{р<0,01) превышало сффект той хш концентрации суммарной фракци! двфэнемнов. Другим индуктором роста [032+]^ в тромбоцитах был протег рин. Однако выраженный подъем величины исследуемого параметра ( среднем в 2 раза, р<0,001) был отмочен лишь на фон© высокой концентра и;«<! втого полппоптнда (ЯООмзг/мл). Наиболее сильный рост [Са2+]щ;т тромбоцитах вызывал катзпскн 6. Под его влиянием в концентрация [С22+]иит в клетках возрастал до 240%(р<0,£Ю1) по сравнению с контролем Увэличение концзнтрации катопсина С до ЮмкМ или ее снижение д

0.5?,гс?/! существенно на изменяло величину роста [032+]^, состав« соответственно 210%(р<0,001) и 250%(р<0,001) выше базального уровн? Набольшоз утали-гок;)« [Са2+]ц.[; в нвахтивированных агонистами троыйо ц'^тасвыз^валитакйсолрофаздгниРПЗЭХ. Под влияниемпрофгнина(10?ла-мл) был отмзчен непродолжительный я обратимый подъем [0-32+]^ среднем на 43%{р<0,05), а на фоне РП39Х(20г/гчг/мл) - лишь тенденция увеличений етого параметра.

Наиболее широким спектром икгибмрующего влияния на увеличэни [С,?2+]цт в тромбоцитах, индуцированное различные агонистами, облава Л1', дэфйноу:нь! человека. Н!чРе(1Сгл<г/мл>, а также КМР-1 (0,1 ихт/мл) при блнзитапзко в разной степени подавляли рост [032+]^ в тромбоцита* вызванный тромбином, АДФ или ЛПС. Изменение времени инкубаци; дефенспноз с тро^хюциттэлл от 2 до 5 минут не оказывало влияния н величину подавления полнпбптидаш4 подъема [Са2+]икг, индуцкрозанноп трамбиноаХО.бд/'ллл). Снихсение дефеноздами роста [¿32+]^, вызванной АДФ кли ЛПС было выражено в меньшей степени, чвгл на фоне тромбина Погашение уровня цитоплаздотическего Са2+ в клетках под действие! АДФ в 70% "експэриментов имело двухволновый характер. Влияние до фзнедаоз (ИМРз и } на рост [Са2+]виг, индуцированный АДФ, I

основном проявлялось в подавлении второй волны флюоресценции I среднем соответственно ка 41 %(р<0,05) и 57%(р<0,05). При угеличени! времени инкубации тромбоцитов с дефенсинами от 2 до 5, минут и ^нгкбирующез влияние на ЛПС-индуцированный подьом [Са2+]цж снижа лось до 16%{р<0,05) в опытах с НМРз и 19%(р<0,05) под действием НМР

1.

Подавление дефамскнаигл агонист-индуцированного повышений Сз2+ ! цитоплазм тромбоцитов независимо от вида использованного игщуктор позволяет предположить, что, с одной стороны, под действием разны индукторов на фоне дефенсинов реализуется общий механизм влияния н рост [Са2+]ш11, а с другой, что ингибирующий эффект полипептвдов ка это показателе трэмбоцитарной шггивности осуществляется несколькими пу тя^и. Д&фенсины, не оказывая влияния на первую Еолну АДФ-

индуцированного увеличения {Сй.2-1-]^ в тромбоцитах, подавляли г то >хе вре?ля вторую, что, вероятно, свидетельствует об отсутствии влияния этих полипептидов на высвобождение шэглбраносггззсннсго Са2+. По данным Р.А.СПагр и др.(1988}, дефансикы человека язля:отся сильны- и специфическими ингибиторами протеинкиназы С {Г-КС). По согргисзнным представлениям РКС в трсг-.'боиптах активируется под вп^янизгл дпация-глицерола и участвует в фосфорилировании белков, регулирует мобилизацию Са2+, ?йэтаболизм арахидоновой кислоты, опосредуя таким образом агрегацию и секрецию тромбоцитов (ЗЛ.Лейтин и др., 1989; У.№*тш«ка,1984,1986; Ь!.Н.Кго!1,А.1.8сЬагог,1989). Эти данные-позволят думать, что иншбирсвгние РКС является важным звеном в механизмам подавления дефенсинами увеличения [Сз2+1Ы1Г в тромбоцитах.

Протегрин РС-2 в низкой концентрации (0,1.\«сг/мл), а также элаотаз£(1мкМ) селективно подазляли увеличение [Са2+]клт в трог.тбоци-тах, вызнанное тромбдаом, соответственно на70%(р<0,001) и 30%(р<0,С5}, не оказывая достоверного влияния на этот параметр в опытах с АДФ илиЛПС(200мкг/мл). Возрастание врег/ени инкубации тромбоцитов с элгс-тгзой от 2 до 10 минут усиливало подавление роста [Сг2+]„ет в среднем до •Ф0%(р<0,05), чего не было отмечено в опытах о протзгр^ком.

РЯ39Х в концентрации ПОьст/мл, налротиз, усиливалувеличение в тро5лбоцитах, вызванное тромбином или ЛПС, соответственно на 33%(р<0,05) и 54%{р<0,С5}, величина которого в опытах с обоими агоннс-та\-?и не зависела от изменений п-зр'лода инкубации в пределам: 2-5 минут. Профекин(1 Омкг/мл) также усиливал рост уровня ирпоплазматтеахого Са2+, вызванной тромбином или-ЛПС. соответственно на 51 %(р<0,С5) п 83%{р<0,01}.

Следовательно, в результате проведенных исследований установлено, что дефенскны, протегрины, профенин,- РПЗЭХ, катепсин С, оластаза иейтрофилов оказывают модулирующее влияние на уровень цитоплазма-тического кальиия в тро^<5оцитах, что является одним из механизмов их влияния на афегациож-гую активность тромбоцитов.

Величина мембранного потенциала тромбоцитов . •

Потенциал плазматической мембраны нзакткзирозанных трэглбоцитов человека составил -6Сь5мЗ. Оценка влияния антимикробных полипептидов иейтрофилов на величину мембранного потенциала тромбоцлтов по- юза-па, что достоверные сдвиги с то го показателя в клетках, нестимулирован--!ых агскистгл/м, вызывали лишь дзфенсины к катепсин В присутствии . зефенсинов человека КДОзи НМР-1 в высоких концентрациях наблюдалась эыстрая и обратимая деполяризация плазматической ывь/йрамы тромбсцн-гов. Величина снижения меь*5ранкого потенциала на фоне НМРз(20Скш"/ . •ил}, а также НЫР-1 (1ООмкг/мп) была выражена !

приблизительно вравной степении составила соответственно Ь,4~0,7м8 и 11,2з:0,0мВ. Врзмя восстановления потенциала плазматической мембраны тромбоцитов как в опытах с ИМРв, так и с НМР-1 равнялось в среднем 2 ¡■¿¿■иг/там. Катепоин твюко сызызал деполяризацию плазматичес-

кой мембраны тромбоцитов на 1 Восстановление мембранного

потенциала клеток после воздействия катопсина 6 происходило несколько дольше, чем в опыта* с д&фенсин&лл, составив в среднем 3 минуты. Полученные результаты согласуются с литературными данньл.ад о реализации начального этапа влияния дзфенсинов на клетки путем образования потонциалзазиекмых ионных каналов (ВЛ.Кадап о! а1.,19&0: А.исп1епз12!п,1291). В то же еремя развитие быстрой и обратимой деполяризации треюбоцитарной мембраны под влиянием дефенсинов и катопсинг 6 свидетельствует, что эти полипаптида на повреждали клетки, а вызывала лишь еро.\;©ннь;е сдаиги ил злзктрофизиологичоских характеристик.

Другие полипзптиды (протегрин, профенин, РЯЗЭХ, ©ластаза) вдиапа зонэ иослздуегдгк концентраций, а тагзко дэфвнеины и катепсин 6 в боле« низких концентрациях нз вызывали деполяризацию или гиперпо ляризацик плазматической мембраны нестимулированных тромбоцитов.

Величина деполяризации плазматической мембраны тромбоцитов, вы званная тро:/.5ино>4 0,5Ел/мл), уменьшалась после предварительной инку байки клеток с протсгриноьл(0,1мхг/мл} или еластазой(1мсМ). Изменена ьгзмбранного потенциала на фоне протегрина было выражено сильнее, чел в опытах с сластазой, и составило соответственно 60%(р<0,01) 1 <0%{р<С,05} по сравнению с эффектом тропима без предварительно! инкубации с отг"*/.и полилептидами. Под влиянием протегрина и аластазь была также отмочена тенденция к уменьшению врзг/ани восстановлени: вяличинымоглбрЕнного потенциала тромбоцитов. Полученные данные сви детельствуют о мо&т5ранопротэкторикх свойствах этих полипептидов.

Набольшая деполяризация плазматической мембраны тромбоцито имела ЬпЗсто в присутствии профенина( 10г^хг/г/л) и РЯ39Х(20мкг/мл) посж предварительной инкубации клэтоксЛПС(200клкг/мл). В этих условиях раз Бизалось обратимое уменьшение величины мембранного, потенциала быстрым восстаноовлением его до исходного уровня в пределах 2 кялну!

Следовательно, дзфансины, протегрин, профенин, РИЗОХ, катепсин * и оластазз. оказыезют модулирующее влияние на величину мембранног потенциала тромбоцитов.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов дают основани заключить, что продукты адетаболизглаарахидоновой кислоты, циклически куклеотиды, уровень цитоплазштического кальция, а также величин ькялбрзнного по тенцкала играют важную роль в регуляции сдвигов функци ональной активностм тромбоцитов, вызванных антимикробными

толипептидами нейтрофилов, и имеют сущестзекнсэ значение для понимания биохимических мэхгниззлов формирования этих изменений.

ВЛИЯНИЕ KOSbK НйЗШМ0ЛБС/Л-КР«Ы}( СМНТЕГМЧЭЗ/ОЖ

соединений пшгадкой породу, а. шсха иассторьгй ф^рмаколотчвсжих прэтрйтов с аюодгршщмонкьдои свойствами ил пзвшвмя Фмоодеммльной активности

трсг.550ц£?т08, ВЫЗаМ-иые дг'ггйшкр05нкййи полк п ктгйдайй'я кейт;?сф:шов

С целью поиска эффективных путей фармакологической коррекции вменений тромбоцитзрной активности, обусловленных зпияннем нэйтро-}>илов, было проведеко изучение новых веществ, регулирующих влияние »тимихробкьзх полипзптидав нейтрофилов на тромбоциты. Для этого 5ыли выполнены дае сзрил экспериментов. Б перзсй из них была прсведе--sa скрикикгсвая оценка влияния на агрзгацкснную активное гь трогйбоцк-гов вновь синтезированных низкомолекулярных веществ пептидной ■5рйродь5(производные L-аргмкина, гистагллна, гистидина), которые, по тредварительным данным, являются эффективными рзгулпторалли треглбо--¡лтарной активности {Р. П. Еэстпгнаова и др.,1994,1855). В результате 1роееденнь!Х опытов были выязлены 3 веществ, оказывающих влияь'на функциональную активность тромбоцитов, 4 которых обладают актиаг-зегационны?Я1 свойствами.

Гидрохлорид пептида Зос-6iy- Pro-Arg-О ¡^(вещество 1} в концентрации 1 sv:M селективно кнгибирозал агрзгэдж) тромбоцитов, вызванную тромбином (0,5Ед/с/л) и епинэфритог^Бк'к?-.1!). Подавление опинефрин-«ндуцированной агрегации тромбоцитов было вырагжно г большой степени, чем на фоне тромбина, составив в среднем соответственно 5S%(p<Q,01) л 47%(р<0,01) для амплитуды агрегации и 7G%(p<0,05) и 5б%{р<0,05) для максимальной скорости агрегации.

Друп«м ингибитором агрегации тромбоцитов оказался метилоеый ©фнр L-гистидина дихлоргидрата(L-His-О'Л е2НС!)(вощзстьо 2}. Его эффект прокалился в разной степени на фоне всех исследованных агонистов. Добавление вещества 2 в концентрации 1 мМ в богатую тромбэцита-ли плазму за 5 умнут до их стимуляции агоииста-Аи практически полностью подавляло агрегацию клэток, вызванную АДФ(5жМ} или.апинефриноь^бмкМ}, соответственно на 76% (р<0,01 }и 84% (р<0,01 ), оценочную по амплитуде агрегации. Амплитуда и максимальная скорость агрегации тромбоцитов, вызванной тромбином (0,5Ед/мл), на фене ввщестса 2 снижались s сред- нем на 51%(р<0,05) и 42%(р<0,05) соответственно. Тромбин-миду-цированная афегация тромбоцитов в условиях инкубации с исследованным

соединением имела двухволновую форму в отличие от одноволновой с контрольной серии экспериментов.

Подавление агрегации тромбоцитов в присутствии вещества 3(Вос-Н1е(ОМР)-ОН) имело место только в условиях активации клеток коллагеном(4мхг/мл). При использовании этого соединения в концентрации 1 мМ амплитуда а-рзгации тромбоцитов снижалась на 30%(р<0,05), а ее максимальная скорость-на 45%(р<0,05). Изменение времени инкубации с веществом 3, а также уменьшение его концентрации до 0,1 мМ не отражались на величина ингибировання агрегационной активности тромбоцитов.

Гистамин, ацилированный по аминогруппе остатком лауриновой кислоты (1ли-НА){вещество 4), в концентрации 1мМ в богатой тромбоцитами плазма достоверно (р<0,05) уменьшал амплитуду и максимальную скорость агрегации клеток, вызванную АДФ(бмкМ), соответственно на 30% V 21%.

Следовательно, в первой серии опытов были выявлены четыре новьо синтетических низкомолекулярных ингибитора агрегации тромбоцитов вызванной классическими агонмстами.

Задача второй серии экспериментов состояла в изучении влияния етго ингибиторов агрегации тромбоцитов на функциональную активность тромбоцитов, стимулированных антимикробными полипептидами нейтрофилое сравнив их с аналогичными эффектами хорошо известных веществ I антиагрегационными свойствами, ацетилсалициловой кислотой и ибустри-ном. Исследования показали, что ацетилсалициловая кислота в концентра' ции 1мМ уменьшает агрегацию тромбоцитов, вызванную лишь дефенсина ми человека с высоких концентрациях, не оказывая существенного влияни! на этот показатель тромбоцптарной активности на фоне других полипепти дов нейтрофилов. Диапазон антиагрегационной активности ибустрина бьи несколько шире. В концентрации 1 ООмхг/мл он подавлял агрегацию тром боцитов, индуцированную дефенсинами, протегрином и катепсином в Гистидин- игистаминсодерхсащие синтетические ингибиторы Вес- Н!в( ОМР} ОН и 1аиНА обладали близким к ибустрину характером влияния на агрега ционнуга активность тромбоцитов. Использованные в концентрации 1 мМ они подавляли агрегацию тромбоцитов, вызванную дефенсинами и катеп сином 6. Антиагрегационная активность аргининсодержащего пептид; Вос-61у-Рго-Агд-ОМе НС!(1), а в особенности гистидин- содержащей соединения ЬНв-ОМа 2НС!(2) была выражена сильнее. Вещество 2 инги бировало агрегацию тромбоцитов, индуцированную практически всем исследованными полипептидами нейтрофилов (дефенсинами, протегри ном, профенином, РИЗЭХ, катепсином 6). Аналогичными эффектами обла дало вещество 1. Однако его влияние на тромбоциты не было отмечено опытах с РН39Х. Следовательно, агрегация тромбоцитов

тромбоцитов, индуцированная дефенсинами человека и катепсином б, :ыла наиболее подвержена ингибиругощеалу влиянию 'исследованных ве-л<оств.

По данным литературы, некоторые низкомолэкулиркъю аргининсодер-чжцие пептиды, образующиеся в процессе фибриногонолиза, обладают гначительными антикоагулянтныш1 свойствами (KTakags et г!., 1379). Была m/ечена важность фрагмента Pro-Arg для проявления их амткхоггулянтно-"о действия и найдены наиболее активные пептиды, устойчивые к действию Зольшинстза протеаэ и пептидаз{М.Т.Петросян и до.,1033}. Пептид с тоследовательностью Arg-Gly-Acp-Ser-Pro интобировал также агрегацию громбоцитов, индуцированную катепсином G(M.Mo!ino et ai., 1S92}. Была остановлена важность аминогруппы в данном процессе, поскольку блокирование N-конца пептида защитные группам приводило к отсутствию атгикоагулянтных свойств. В химической структуре пептида Boc-6ly-Pro-ijg-OMe HCl N-конецпептида был защищен Вос=(-СН3}.СОСО, ацетильная рупла Ме блокировала его С-конец. Однако, несмотря на ©ти особенности! ¡иьдаческой структуры, пептид проявлял выргочонную амтиarpsг ационкую устивность в отношении тромбоцитов, стимулированных дефенсинами, 5ротегрином, профенином и катепсином G. Блокирование в структуре наследованного аргининсодержащего пептида активных С- и N-концевых 'чаотков молекулы делало t/алозероятным еозг,ложность значительного связывания пептидом ангиг^кробкых полипептидов. Кропта того, реализация ингибирующего влияния пептида не только в плазмэ, но и в суспензии пъамтых клеток, а также подавление агснистнндуцированной мобилизации дитоплазштического Са2+( Р. П. Евстигнеева и др.,1594) скидота льстауют > непосредственном влиянии пептида на тро^сцить'.

Согласно данным ряда исследователей, в тромбоцитах, как и во многих других клетках организма, обнаружен метаболический путь образования жиси азота(Ш} из L-aprMHHHa(M.W.Radoms!<i et eJ.,1990). Показано также, (то влияние L-аргинина на активированные коллагеном трок^боциты связа-10 с образованием в клетках N0, которая, поеышая уровень цГМФ в. тромбоцитах, препятствует ихагрегадчи. Наличио в структуре исследсвак-юго пептида L-аргинина, а также его влияние только на активированные ромбоцмты позволяют предполагать участие Eoc-GSy-Pro-Arg-OMe KCí в механизме образования N0 в качестве донатора L-арглнина. Селективное ингишроеание агрегации тромбоцитов, вызванной дефенсн-1еми и катепсином G, пептидами Lau-НА и Boc-Kis(DNP}-OH, могло быть >бусловлено избирательным связыванием етих антимикробных по липепп юз в среде инкубации. Аналогичные данные об ингибирующем эффекте на ;атепсин G-индуцированную агрегацию тромбоцитов .других веществ гепарина и дерматансулъфата авторы связывают с их электростатическим взаимодействием в исследуемой срэде(Р.Ferrer-Lopez

et a!., 19S2; G.Eazzoni ot al.,1923). Кромз того, в тромбоцитах были обнаружены специфические рецепторы для катепсина G, а также связанные с ними мембранные гликопротеины Gplb и Gpllb-Ula, на которые могло быть направлено действие исследованных синтетических пептидов (№.A.Se!ak,J.B.£mríh,l990; М.Molino et al.,1993).

Наиболее широкий спектр антиагрогационной активности соединения L-HisQMs 2HC¡ в отношении классических агонистов (тромбин, АДФ, епи-нофрин), а также всех исследованных полипептидов нейтрофилов с проаг-рэгационной активностью'дефзнсины, протефин, профенин, PR39X, ка-тепсин 6), вероятно, был обусловлен его влиянием на общие для всех агонистов механизмы активации тромбоцитов.

Сравнительный анализ влияния на агрегацию тромбоцитов, вызванную ант/икробныштолипептидами нейтрофилов, новых синтетических ингибиторов с ацетилсалициловой кислотой и ибустрином показал существенные различия в спектре их антиагрегационной активности. По данным литературы, в присутствии нейтрофилов снижается способность аспирина мнгибировать агрегацию тромбоцитов (S.Akopov et al.,1991). Аспирин также не оказывал влияния на увеличение концентрации цитоплазматического Са2+ в тромбоцитах, вызванное катепсином 6 нейтрофилов(М.МоНпо et a!., 1SEJ2). Другой ингибитор циклооксигеназы тромбоцитов индобуфен, являющийся аналогом ибустрлна, ©ффекти&чо подавлял агрегацию тромбоцитов, вызванную адреналином, не оказывая подобного влияния в присутствии активированных нейтрофилов(ВАЛюсов и др.,1993). Результаты собственных исследований показали, что ацетилсалициловая кислота ин-гибирует агрегацию тромбоцитов, вызванную лишь дефенсинами, а ибус-трнн дэфенсинам/i, протефином и катепсином G, не обладая антиагрегационной активностью в отношении других агонистов. Вероятно, снижение ингмбирующего влияния аспирина и индобуфена на агрегацию тромбоцитов в присутствии нейтрофилов было связано с отсутствием аффекта этих фармакологических препаратов на активацию тромбоцитов, вызванную антимикробные полдаетидами нейтрофилов.

Среди соединений, исследованных в первой серии экспериментов, были обнаружены два вещества: тстидинсодержащий пептид карнозин OS-Ala-Hls) и гистаминсодвржащий пептид карцинин (/?- Ala-НА), обладающие про-агрегационной активностью и присутствующие в организме человека и других млекопитающих (А.А. Болдырев, 1985,1992; Р.П.Евстигнеева и др.,1933). Карнозин(1мМ) селективно потенцировал агрегацию тромбоцитов, вызванную тромбином, а также вызывал агрегацию клеток, стимулированных ЛПС. Карцинин, в отличие от карнозина, самостоятельно Еызывал агрегацию нестимулированных тромбоцитов. Наиболее вы- раженная агрегация тромбоцитов имела место в суспензии

при использовании максимальной из исследованных концентраций арцинина(1мМ} и состасила 34,6±о,1% для амплитуды агрегации и 0.8±5,7%Ддин для ее к<акси>/лльиой скорости.

Антт/икробные полипептиды нейтрофилов оказывали модулирующее лияниа на функциональную активность тромбоцитов, стимулированных арнозином и карцинином. В присутствии кернозина( 1 мМ) дефенсин чело-екаНЫР-1(10ызег/мл), а также РНЗЭХСЙОлйкгДчл) вызывали агрегацию трогл-оцитов, тогда как самостоятельно эти полипептиды нейтрофилов не риводмли к развитию агрегации клеток. Изменения агрегации тромбоци-ов, индуцированной карцинином, под влиянием антимикробных полмпеп-едов нзйтрофилов имели различную величину и направленность в зави-имости от используемого полипэптида и его концентрации. Протогрин 0-2(0,1 ютг/мл), а таюхеэластаза(1ь«М} уменьшали амплитуду агрегации эомбоцитоа, вызванную квриинино?»5(1мМ),сюответстввннона40%(р<0,05} 55%(р<0,01}. Нэбольшоеумзеньшвние агрегации клеток, индуцированное грцикином, было отмечено в присутствии ибустрина (100мкг/мл)(на 0%,р<0>05 для амплитуды агрегации). Другой ингибитор - ацегилсалици-эвая кислота(1мМ} - в тех же условиях нэ оказывал подобного ингибиру-■щего влияния. Воздействие на тромбоциты катепсином6(0,5?жМ) после < инкубации с карцинином приводило «увеличению а?,<плитуды агрегации теток на 33%(р<0,05). Такую же направленность изменений функциональ-ой активности тромбоцитов после их стимуляции карцинином вызывал эфенсин человека НЫР-1(10шг/мп}, Однако этот эффект был выражен в еньшей степени, чемвопытах скатепсжиом 6и составил лишь 17%(р<0,05) 5 сравнению с контролем.

о данным литературы, карнозин известен как антисксидант, который тособен не только предотвращать накопление окисленных продуктов, Зразующихся в процесса перекисного окисления липидов биолотческих вобран, но также и препятствует развитию самого перекисного сисленип(Й.КсИеп е1а].,19В8). В тоже время было показано, что карнозин эмулирует функциональную активность клеток крови и, в частности, гкрофаги к'ьпшЭДМ.В.Онуфриев и др.,1992). Следует отметить, что по-1нцированио карнозиномагрега^итрокбоцитоз, стимулированныхтром-1Ном и Л ПС, а также антиьздсрсбны&йи полипептид аш НМР-1, РИ39Х и пепсином 6, имело место в тех ухо концентрациях, что и в опытах с з!шиными макрофагг»л<1, составляя 0,1-1,0мМ. Отсутствие влияния карно-1на на тромбоцмты в плазме крови, вероятно, связано с его рас- щепле-ш.м ферментом карнозиназой (А.А.Во1<Зугеу,З.Е8е¥епп,1990). Показано, о карнозин ингибирует активность растворимой гуанилатциклазы чело-веских тромбоцитов(И.С.Северина,О.Г.Бусыгина,1992). В свою очередь анилатцихлаза катализирует биосинтез цГМФ, играющего ключевую >ль

в рвп/ляции функциональной активности тромбоцитов (М.Н.КгоН, A.I.Schafer,198S). На основании этих данных можно предположить, что влияние карнозина на функции тромбоцитов реализуется через сдвиги в метаболизме циклических нуклеотадов.

Карцинин активировал тромбоциты как в плазме, так и в суспензии, что может указывать на непосредственное влияние пептида на эти. клетки. Кроме того, отсутствие достоверного роста уровня МДА в тромбоцитах, стимулированных карцининам(Р.П.ЕЕстигнбеза и др.,1994), свидетельствует о том, что пзракисное окисление липидов не является ведущим звеном в механизмах актизации клеток в этих условиях, а модулиру ющее влияние антимикробных полипептидов нейтрофилов связано с их зффзктом на альтернативные пути актизации тромбоцитов.

Полученные результаты раскрывают новые свойства природных ди-пептидов карнозина и геарцинина, связанные с их активирующим влияни ем на тромбоциты, а также показывают возможность модуляции этих эффектов в присутствии антимикробных полипептидов нейтрофилов. Кг иззэстно, активированные тромбоциты секретируют большое количеств биологически активных веществ, в том числе факторы роста, стамулиру ющиэ пролиферацию wi3T0K(C.N.Chesterman et al.,1979). Активирующее влияние на тромбоциты карнозина и карцинина, а также их регуляция антимикробные полипэптидами нейтрофилов, вероятно, могут,играть важную роль при стимуляции oimt/i пептидами регенераторньос процессов в тканях. Однако наличие у карнозина и карцинина проафегацноннь свойств, особенно усиливающихся под влиянием антимикробных: полипептидов нейтрофилов, необходимо учитывать при попытках применен» этих веществ в лечебных целях.

Обобщение материала собстванных експериментов позволяет заклга чить, что полученные в работе результаты восполняют существовавши? пробел е исследования влияния нейтрофилов на функциональную актиЕ иость тромбоцитов, связанный с действием дефенсинов, протегриноз, профенина, PR3SX, катопсина G, еластазы, ла5Стоферрина, миелопзрок-сидазы, и свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения влияния антимикробных полипептидов нейтрофилов на функции тромбе цитов в норме и при патологии. Установленные в работе прлнципиальн новые факты о регуляторном влиянии антимикробных полипептидов нейтрофилов на тромбоциты указывают на полифункциональность этих веществ в организме. Развитие этих исследований наиболее актуально для понимания патогенеза внутрксосудистого тромбообразования и поиска путей его успешной терапии и профилактики.

вывода

1. Нейтрофилы крови обладает антиагрэгационнымси сзопстег.?/.:! в отношении тромбов то в. Активированные егокистеащ нейтрофилы оказывают проагрегационный эффект на тромбоциты. Характер -л величина влияния нейтрофилоа на тромбоциты определяются колмчэстзен!-;!,-:^ соотношением этих клеток, временем их соатастной игесубаози, а таю.да видом клеточного агониста.

2. Дефенсины человека, а также протегрин оказывают сыргкекмео дозозазиюшое влияние на функциональную активность тром5оцитоз. 3 высоких концентрациях эти полипептиды еызыззют агрзгаци» и cc:spoür.;D трт^боцитов, подавляя их в низких концентрациях. Агрегация и секреция троглбоцитов, индуцированные дзфексииг:л1 и протепу/.но«1., сопрззахэда-ются структурными изглененийглч этих клеток, включая фер^.у, состояние поверхности, образование псевдоподий, а также агрегатов трс8/«боцитсз, что подтверждает их гкткзацгао под действием этих полипептидоз. Проаг-регационная активность претегрина выражена сильнее зуслозиях богатей тромбоцитам плазмы, чем в суспензии отаытых клеток, тогда ках аналогичный эффект дефенсиноз реализуется только в суспензии.

3. Дефенсины человека и кролика вызывают однонаправленные изменения функциональной- активности тромбоцитез, обладая проагрегацисн-ной активностью в высоких концентрациях и икгэтбируя ее и низких концентрациях. Проагрзгационная активность дефенедаоз кролика в отношении тромбоцитов выражена сильнее, чем у дэфенсинсз человека. В реализации эффектов сушйгрных фракций дефенскноа че лоз.бка и кро лика на тро.\<гбоциты оснсзная роль принадлежит их компонента;,"., соотвзтогеон-но HNP-1 и NP-1. ■ ■

4. Профенин и PR3SX усиливают агрегацию и секрецию тролйЗсцитоа, стимулированных агониста&да. Проагрегационная активность как поофени-на, так и PR39X наиболее сильно выражена на фоне ЯПС Salmonera iyphimurfum и тромбина по сравнению с друпдали агонкстами.

5. Сериновые протекназы нейтрофилоа человека, катепелн G и эласта-за, оказывают модулирующие эффекты на функциональную активность тромбоцитов. Катепсин G является сильным тромбоцитгрным aro киотом, сравнимым по величине эффекта с тромбином, и вызывает примыё дозезз-висимые агрегацию и секрецию тромбоцнтоз, сопровогдакяциося изменением их форгуЫ, образованием псевдоподай к скоплением е агрегата. Эластаза селективно ингибирует агрегацию и секрецию тромбоцитов., активированных троенном, усиливаясь с рос- тсьлкокцэнтраиииполипеп- , тида и времени его инкубации с этими клеткам.

6. Влияние лахтофоррина и илиолопероксидазы нейтрофилов человек-, на функциональную активность тромбоцитов является малоэффективные. Лишь лактоферрин в высоких концентрациях вызывает обратимую агрегацию троь^боцитов в условиях плаз:/ы крови.

7. Комбинированное действие на тромбоциты одновременно несколь ких антимикробных полипептидов нейтрофилов, включая дефенсины протегрин, профенин, PR39X, катепсин G, эластаэу, лактоферрин, со-проЕохздаотся изменением величины агрегации тромбоцитов, вызван- hoí изолированны!.« еощоствагля из этой группы. Под влиянием ком- бинациС полипзптидов нейтрофилов, в состав которых входят дефенсины и протег-рин, сдвиги агрогационной активности тромбоцитов наиболее существенно отличаются от тромбоцитарных еффоктов изо- лированных. веществ

8. Изменения афзгационной и секреторной активности тромбоцитов вызванные анту.?л/;крабиы!л1 полипептидами нейтрофилов (дефенсины протегрнн, профенин, PR3SX, катепсин G, еластаза), сопровождают es характерны:^ для каждого из ©тих веществ дозозависимыми сдвигаш метаболизма арахидоновой кислоты, уровня циклических нуклеотидов » цитоплазматического кальция, атагахе величины мембранного потенциала Отмеченные избиения биохимических показателей и мембранного потен цкала тромбоцитов свидетельствуют в пользу реализации тромбоцитар них аффектов антимикробных полипептидов нейтрофилов через эти меха

S. Агрегация тромбоцитов, вызванная дефенсинами, протегрином, ка тепсином G, профениногл и PR33X, ингибируется новы№1 синтетическим низко.у.олекулйрныгЛ'? соединениям пептидной природы, эффект ко торы на клотки превосходит антиагрзгационноо действие ацетилсапицилово! ¡3".ело ты и кбустрина.

10. Дефенсин человека HNP-1, катепсин G, а также PR39X потенцирую агрегацию тромбоцитов, стимулированных гистидинсодержащим пепти дом кзрнозином. Антиагрегационные свойства протегрина и эластазь проявляются в отношении тромбоцитов, активированных гистаминсодер >:<ащим пептидом карцинином, тогда как HNP-1 и катепсин G, напротив усиливают агрегацию клеток, вызванную этим пептидом.

СПИСОК FASOT, ОПУБЛИКОВАНИЕ ПО f.l\TEWvTAM ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние дефенсина на функциональную активность тромбоцитов// >юл. эксперим. биол. и »лед. - 1993. - N 1. - С.23-25. Соазт. И.П.Ашк".арин, 1.А.Рудько, ЕА.Корнева, В.Н.Кокряков, А.А.Кубатиев.

2. Defensin modulates functional activity of platelets//Neuropop- tides -993. - Vol.24. - N4. - P.2AS. Co-auihors: I.Rudko, EKorneva, V.Kckryakov, Ashmarin, A.Kubat'ev.

3. Defensin-induced response of peripheral biood monocytes in bronchial sihma: a new diagnostic test//Proceed. of Conf. «Cells and cytokines in lung lflammation», Paris-1993. -P.99. Co-authors: A.KLibaiiav, O.Fesenko, LGembitski.

4. Дефенсин нейтрофипоз человека модулирует функциональную ак-ивность моноцитов//Бюл. зкспермм. биол. и мед, - 1993. - N11.- С.474-•75. Соавт. О.В.Фесенко, ЕА.Корноеа, И.П.Ашмарнн, А.А.КубатибЗ.

5. Влияние дзфенсиноз человека на содержание цитсплазматичзсксго ia2+ в тромбоцитах//Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1994. - N 12. - С.600-03. Соазт. В.Н.Кокряков, И.П.Ашмарин, С.В.Грачев, А.А.Ку5атмез.

6. Defensins of human neutrophils inhibit agonist-induced intrapiaielat alcium increase//Neuropeptides - 1S94. - Suppl. -N4- P.36. Co-authors: P.Ashmarin, A.iCubatiev, EKorneva, V.Kokryakov.

7. Regulation of monocyte functional activity by defsnsin from human iGutrophils in patients wiih bronchial asthma//Rev. Mexicans ds PatologiaQinica 1994. - N1. - P. 15-19. Co-aulhors: AAKubatiov, EV.Gembjfeki, O.V.Fesenko.

8. Antimicrobial proteine of neutrophils аз regufaiors of pJatetet activity// Yoceed. of 11 Interdisciplinary World Congress on Antimicrobial and Anticancer >rugs - Geneva, 1994. - P.27. Co-authors: .V.N.Kokryakov, LA.Kbrneva,I.P.Ashmann,A.A.KL!bat!sv.

9. Гидрохлорид пептида Boc-Gly-Pro-Arg-OM© - селзктизный интбитср ромбин- и зпинефрининдуцированной агрзгации тромбоцитсз//ДАН -.337. -N 5. - С.680-682. Соавт. Р.П. Евстигнеева, А.А. Кубатаев, .А^<елтухина.

10. Antimicrobial proteins of neutrophils as rogu!ator3 uf piaislst £cinfiiy//inL . Immunotherapy -1994,-Vol. X.-N4.- P. 159- 162. Co-authore: V.N.Kokryakov, P.Ashmarin, A.A.Kubatiev.

11. Human defenses as regulators of peripheral blood monocyte aciivity//in: : Scientific meeting European Society of Chemotherapy - Ccimbra, 1994. - P.62. io-authors: V.N.Kokryakov, Z.T.Yadigarova. A.A.Kubatiov.

12. Pharmacological aspects от ir.nifci'ior, <;5 i_PS-r.ducod platelet 355; eya-tion//in: 2 Scientific meeting European Society ol Chemotherapy - Coimbra 1594. -P.63. Co-authors: Z.T.Yadigarova, S.V.Grachev, A.A.KLbatiev.

13. Влияние карнозина и карцинина на функции тромбоиитов//ДАН -1S94. - T.33S. - N5. - С.687-689. Соавт. П.Евстигнеева, АА-Кубагисз, ЕА.Рожкова, Г.А.Желтухина.

14. Новью имидазолсодвржащие ингибиторы катепсин G-индуцирован-ной агрегации тромбоцитов//ДАН - 1995.-T.34Q. - N2.-C.260-262. Соавт. Р.П.Евстигнеева, А.А.Кубатиев, ЕА.Рожкова, Г.А.Желтухина

15. Protegrins of porcine leukocytes - a new class of platelet regulators// Proceed, of 6 interscience world conference on Inflammation, analgesics, immunomodulators- Geneva, 1995. - P.114. Coauthors:V.Kokryakov, lAsbmarr» A.Kubatiev.

16. The rola of defensins from human neutrophils in regulation of LPS' stimulated platelet response//Proceed. of 6 Interscience world conference or Inflammation, analgesics, immunomoduJators - Geneva, 1995. - P.115. Coauthors: A.Kiubatiev, i.Ashmarin, V. Kokryakov, Z.Yadigarova.

17. New imidasol-containing inhibitors of cathepssn G-inducod platele aggregation//Proceed. of 6 Interscience world conference on Inflammation analgesics, ¡mmunonoduJators - Geneva, 1995. - P.117. Co-authors R.B/stigreova. A.Kubatiev, ERozhkova, G.2hettuhina.

18. Ratelet-Ieukocyt© interactiion: role of defensins, protegrins and PR39X /Proceed, of 6 Interscience world conference on Inflammation, analgesics immunomocMalors- Geneva. 1995. - P.118. Co-authors: AKubafev,V.Kokryakov I.Ashmarin.

19. Pharmacological aspectsoiLPS-induced platelet aggregation// Proceed of 6 Interscience world conference on Inflammation, analgesics, immunomod uiators - Geneva, 1995. - P.119. Co-authors: 2.Yadigarova, A.Kiubatiev S.Grachev.

20. Протегрины - новое семейство пептидов лейкоцитарного происхо» дзния, модулирующих функциональную активность тромбоцитов// ДАН 1998. - Т.347. - N 1. - С.126-128. Соавт. В.Н.Кокряков, И.П.Ашмарин А.А.Кубатиез.

21. Профенин и PR39X - новые анти£Л«кробные пептиды лейкоцитоЕ регулирующие функциональную активность тромбоцитов//ДАН - 1996. ( печати). Соазт. В.Н.Кокряков, И.П.Ашмарин, А.А.Кубатмев.

Подписано в печать 24.04.96 Тип. РМАПО Зак. 289 Тир.120 з:сз.