Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Разработка автоматизированного метода определения группы крови и резус-фактора с применением ультразвука

?ГВ ОА ^ * СЕН 1939

На правах рукописи ¿¡<0 0

КАЛАНДАРОВ Рахман Самиевич

РАЗРАБОТКА АВТОМАТИЗИРОВАННОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУППЫ КРОВИ И РЕЗУС-ФАКТОРА С ПРИМЕНЕНИЕМ УЛЬТРАЗВУКА.

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА, 1999

Работа выполнена в Государственном некоммерческом учреждении "Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук", г. Москва.

Научный руководитель - Доктор медицинских наук

С.И.Донсков

Официальные оппоненты - Доктор биологических наук, профессор

Ф.И.Атауллаханов Доктор медицинских наук Р.П.Манишкина

Ведущее учреждение - Российский НИИ гематологии и трансфузиологии

Защита диссертации состоится " " 1999 г. в час.

на заседании диссертационного Совета Д 00t.45.01 в Гематологическом научном центре РАМН (125167, г. Москва, Новый Зыковский пр., д. 4-а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра.

Автореферат разослан" " 1999 г.

Ученый секретарь В.Д.Реук

диссертационного совета кандидат биологических наук старший научный сотрудник

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. АГК - анализатор групп крови.

2. БСОЙ - блок считывания и обработки информации.

3. ГНЦ - Гематологический научный центр.

4. ОС-6М - индекс центрифуги.

5. РАМН - Российская академия медицинских наук.

6. СБ - смешиватель вибрационный.

7. СПК - станция переливания крови. |0 ¡^ Зу

8. УРР - устройство розлива реагентов.

9. УРРП - устройство розлива и разведения проб.

Актуальность проблемы.

В последние десятилетия одним из важных направлений в развитии иммуногематоло-гии стала автоматизация серологических исследований, в частности, автоматизация определения групповых факторов крови. В настоящее время в систему практического здравоохранения многих стран внедрены автоматические анализаторы серологических реакций - приборы систем Групаматик и Техников (McNeil, Sturgeon, 1965; Matte, 1969 и др.). Практика показала, что применение автоанализиторов эффективно при проведении массового исследования групповой и резус-принадлежности крови доноров и больных (Гаврилов О.К, Донское С.И. и др., 1979; Р.А.Авдеева и др., 1982, С.И.Донское и др., 1985 и др.). Эти приборы обеспечивают максимально точное и объективное выявление антигенов эритроцитов и ангиэритродитарных антител и при этом позволяют осуществлять за короткий промежуток времени значительное количество исследований. Поскольку в нашей стране на станциях и в отделениях переливания крови ежегодно проводится определение группы крови системы ABO и резус-фактора у сотен тысяч доноров, причем, как правило, в непрерывном потоке в стационарных и выездных условиях, то становится очевидным, что разработка новых и совершенствование существующих автоматизированных методов серологических исследований и их внедрение в практику работы учреждений службы крови является актуальной проблемой.

В основу создания анализатора нами был положен алгоритм манипуляций, применяемый при определении группы крови системы ABO и резус-фактора общепринятыми серологическими методами. На первых этапах исследований представлялось целесообразным автоматизировать те манипуляции, которые являются наиболее ответственными: разведение пробы, раскапывание реагентов в заданном соотношении, оценка результатов реакции и их интерпретация. \

Вместе с тем, во время работы было учтено и то обстоятельство, что возможности совершенствования автоанализаторов серологических реакций в настоящее время далеко не исчерпаны. Процесс специфической агглютинации эритроцитов сам по себе изучен недостаточно. При осуществлении реакции агглютинации, по-видимому, меняется целый ряд параметров реагирующей смеси (химических, электрических, термических и др.). С другой стороны, на процесс агглютинации могут влиять различные внешние факторы. В этой связи поиск новых физических принципов, которые позволили бы повысить чувствительность автоанализаторов, например, при выявлении слабых, трудио-определяемых эритроцитарных антигенов и противоэритроцигарных антител, также весьма актуален, поскольку эти принципы могут быгь положены в основу создания более совершенных и экономически более рентабельных анализаторов серологических реак-

ций. В этом плане большой интерес представляет своеобразное влияние ультразвука на взвесь эритроцитов и на реакцию специфической агглютинации эритроцитов. Поэтом; наряду с разработкой анализатора групп крови АГК-01 мы провели исследование возможности применения ультразвука для автоматизированного определения групповых факторов крови, что, как представляется, является новым направлением совершенств вания автоматизированных методов серологических исследований. Поскольку способ проведения и регистрации реакции агглютинации включает как использование ультр; звуковых волн, так и фогометрирование, то он получил название оптико-акустическог способа.

Целью настоящей работы явилось создание автоматического анализатора групп кр ви и разработка оптико-акустического способа проведения и регистрации реакции агглютинации эритроцитов.

Задачами работы являлись:

1. Разработка медико-технических требований к анализатору групп крови АГК-01

2. Разработка принципов конструирования АГК-01.

3. Адаптация методов определения группы крови системы ABO и резус-фактора к работе на АГК-01.

4. Лабораторные к клинические испытания АГК-01.

5. Конструирование оптико-акустического устройства.

6. Изучение влияния ультразвука на взвесь эритроцитов и на реакцию специфичесю агглютинации эритроцитов.

7. Установление оптимальных параметров проведения реакции агглютинации в yci виях ультразвукового воздействия.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований создан первый отечественный анализатор групп крови - АГК-01. Впервые предложен принципиально новый, основанный на ис пользовании ультразвука способ проведения и регистрации реакции агглютинации -оптико-акустический способ.

Научно-практическая значимость работы.

Анализатор групп крови АГК-01 и оптико-акустический способ проведения и реги рации реакции агглютинации могут быть положены в основу конструирования принц пиально новых автоматических анализаторов серологических реакций.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены:

- На Всероссийской конференции "Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация" (ноябрь 1995 г.).

- На итоговой научной конференции ГНЦ РАМН (апрель 1996 г.).

Получен патент на изобретение нового способа ускорения седиментации эритроцитов в реакции антиген-антитело.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 70 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 4-х глав, заключения, выводов и списка литературы. Текст включает 5 таблиц, 14 графиков, 10 рисунков. Список литературы содержит 70 источников, из которых 12 на русском и 58 на иностранных языках.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Анализатор групп крови АГК-01 эффективен при массовых исследованиях групповой и резус-принадлежности крови доноров.

2. Оптико-акустический способ проведения и регистрации реакции агглютинации эритроцитов может быть использован для определения групповых факторов крови.

Пути практической реализации.

На основе разработанных нами медико-технических требований и принципов конструирования созданы опытные образцы АГК-01, прошедшие клинические испытания на станциях переливания крови. Получен патент на изобретение нового способа ускорения седиментации эритроцитов в реакции антиген-антитело, основанного на применении ультразвука.

Работы по созданию первого отечественного автоматического анализатора групп крови АГК-01 и эксперименты по проведению и регистрации агглютинации с использованием ультразвука были проведены наш в лаборатории стандартизации групп крови ГНЦ РАМН совместно с рядом сотрудников научно-исследовательского и конструкторского института медицинской лабораторной техники (Н.Н.Князьков, А.Н.Алипов, Э.Н.Завьялов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалы.

1) Одноразовые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций.

2) Опытный образец анализатора групп крови АГК-01.

3) Оптико-акустическое устройство - ультразвуковая установка.

4) Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки системы ABO 0«р(1), Ар(11), Ва(Ш)

производства СПК ГНЦ (46 серий).

5) Цоликлоны анти-А, анти-В производства фирм 'Тем" и "Гематолог" (25 серий).

6) Стандартные эритроциты 0(1), А(11), В(Ш) - для определения группы крови доноров перекрестным способом.

7) Моноклональные неполные антитела анти-D производства фирмы "Гематолог" (7 серий).

8) Растворы протеолигачесхих ферментов - бромелина и папаина (производство "Calbiochem"), протеазы С (производство ВНИИА).

9) Цельная свежая (без признаков гемолиза) кровь доноров, стабилизированная небольшим количеством консерванта (700 образцов).

10) Взвеси отмытых донорских эритроцитов (500 образцов).

Методы.

1) Метод моделирования - для разработки медико-технических требований и принципов конструирования АПС-01 и разработки оптико-акустического устройства.

2) Методы, положенные в основу конструирования АПС-01:

а) Оптический способ регистрации реакции агглютинации;

б) Метод центрифугирования;

в) Метод автоматического встряхивания планшетов с реагентами.

3) Методы, положенные в основу конструирования оптико-акустического устройства:

а) Метод воздействия ультразвуковой волной на взвесь эритроцитов;

б) Оптический способ регистрации агглютинации.

4) Методы серологических исследований:

а) Перекрестный способ определения группы крови системы ABO;

б) Ферментный метод определения резус-фактора;

в) Метод отрицательного контроля (взаимодействие исследуемых эритроцитов с фи зиологическим раствором, т.е. исследование с заведомо отрицательным результа том для исключения неспецифической агглютинации) .

5) Метод статистической обработки результатов исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Настоящая работа включает 2 раздела:

I. Создание анализатора групп крови АГК-01.

Анализатор групп крови АГК-01 создавался как полуавтоматическая система, пред-

назначенная для определения группы крови системы ABO и резус-фактора (D) при массовых исследованиях крови доноров и включающая ряд автоматических устройств и вспомогательных приспособлений. Конструктивной основой прибора стали выпускаемые отечественной промышленностью одноразовые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций, в которых при работе на АГК-01 непосредственно осуществляется пробоподготовка (применительно к работе с этими планшетами разрабатывались все устройстсва и приспособления прибора). В основу медико-технических требований и принципов конструирования АГК-0) был положен составленный нами алгоритм операций, необходимых для определения групповой и резус-принадлежности крови. Этот алгоритм включает следующую последовательность действий:

1. Заготовка исследуемых образцов крови доноров.

2. Доставка заготовленных образцов в лабораторию.

3. Центрифугирование образцов исследуемой крови с целью разделения плазмы и эритроцитов (для последующего определения группы крови перекрестным способом).

4. Автоматическое раскапывание серологических реактивов в лунки планшета для иммунологических реакций.

5. Автоматическое раскапывание плазмы исследуемой крови, а также автоматическое приготовление взвеси исследуемых эритроцитов и ее раскапывание в лунки планшета.

6. Автоматическое встряхивание планшета (перемешивание реагентов).

7. Центрифугирование планшета для усиления реакции агглютинации.

8. Повторное встряхивание планшета для ресуспендирования осадка в лунках. (ГГри этом ресуспендирование эритроцитов из агппотинатов не происходит, в отличие от не-агтлютинированных эритроцитов, поэтому в лунках, где агглютинация не произошла, образуется однородная взвесь эритроцитов и оптическая плотность среды резко возрастает, в то время как в лунках, где произошла реакция, надосадочная жидкость остается прозрачной. Это обстоятельство дает возможность регистрировать агглютинацию оптическим способом).

Э.Учет и интерпретация результатов реакции (измерение оптической плотности в лунках планшета).

10. Выведение результатов исследования на печать.

В соответствии с данным алгоритмом была разработана принципиальная схема (модель) АГК-01 (рис. 1).

В комплект прибора входят следующие устройства и вспомогательные приспособления:

1. Для заготовки, транспортировки и центрифугирования исследуемых образцов крови нами разработано вспомогательное устройство - специальные кассеты, содержащие

плоские пластикатные кюветы, плотно закупоренные резиновыми пробками. В одной кассете устанавливают 12 кювет.

1-й этап:

И-й этап:

Заправочная Кассета для Планшет с реагентами

кювета разведения проб

Рисунок 1. Принципиальная схема и алгоритм работы АГК-01.

2. Для того, чтобы обеспечить транспортировку большого числа образцов, нами предложены специальные контейнеры доставки проб. В каждый контейнер устанавливают до 10 кассет с исследуемой кровью, то есть в одном контейнере можно перевозить 120 образцов донорской крови.

3. Д ля раскапывания серологических реактивов в планшет для иммунологических реакций мы разработали автоматическое устройство разлива реагентов (УРР) и вспомогательное приспособление к нему - заправочную кювету, емкость которой разделена продольными перегородками на 8 каналов, в каждый из которых заливают определенный реактив.

4. Для раскапывания плазмы исследуемой крови и последующего приготовления и рас-капывания взвеси исследуемых эритроцитов разработано автоматическое устройство

разлива и разведения проб (УРРП) и вспомогательное приспособление к нему - кассета с двумя рядами емкостей по 12 емкостей в каждом ряду. Емкости первого ряда предназначены для приготовления взвеси эритроцитов, емкости второго ряда - для промывания дозаторов УРРП после каждого рабочего цикла.

5. Для встряхивания планшетов с реагентами также было применено автоматическое устройство - смешиватель вибрационный СВ-1, позволяющий встряхивать планшеты в разных режимах и менять эти режимы.

6. Для центрифугирования кассет с исследуемой кровью и планшетов с реагентами используется центрифуга ОС-6М. Эта центрифуга позволяет центрифугировать одновременно 4 кассеты с исследуемой кровью или 2 планшета для иммунологических реакций.

7. Для автоматической оценки и интерпретации результатов реакции в состав прибора введен фотометр (блок считывания и обработки информации), снабженный компьютером. Фотометр регистрирует реакцию агглютинации путем измерения оптической плот-ности в лунках планшета (то есть оптическим способом).

8. Для выведения полученных результатов на печать было сконструировано печатающее устройство.

Таким образом, АГК-01 позволяет автоматизировать важнейшие этапы определения группы крови и резус-фактора. В то же время мы не ставили задачу создать полностью автоматизированную систему. Поэтому отдельные устройства прибора функционально не связаны между собой. Ряд манипуляций производится оператором вручную приготовление взвеси стандартных эритроцитов, разведение сывороток, разлив серологических реактивов в заправочную кювету и установка ее на УРР и т.д.).

Работа на АГК-01 включает 2 этапа.

1-й этап - заготовка (на выезде или в условиях СПК), транспортировка и центрифугирование образцов исследуемой крови:

- Кровь доноров заготавливают в пластикатные кюветы, куда предварительно заливают небольшое количество консерванта (1 мл).

- Кюветы закупоривают резиновыми пробками.

- Кассеты с кюветами устанавливают в контейнеры доставки проб.

- После доставки контейнеров в лабораторию кассеты с исследуемой кровью центрифугируют на центрифуге ОС-6М с целью разделения плазмы и эритроцитов.

И-й этап - проведение исследований на АГК-01:

- В заправочную кювету наливают серологические реактивы (по определенному реактиву в каждый канал).

- Устанавливают заправочную кювету н планшет для иммунологических реакций на УРР.

- УРР автоматически набирает серологические реактивы из заправочной кюветы и разливает их в лунки планшета.

- Планшет переносят на УРРП.

- Снимают пробки с кювет с исследуемой кровью, кассеты с кюветами устанавливают на УРРП.

- В первый ряд емкостей вспомогательной кассеты к УРРП наливают раствор протео-литического фермента, во второй ряд - дистиллированную воду. Кассету устанавливают на УРРП.

- УРРП автоматически набирает плазму исследуемой крови и раскапывает ее в лунки планшета, содержащие стандартные эритроциты, затем набирает исследуемые эритроциты, перемешивает их с раствором фермента в первом ряду емкостей вспомогательной кассеты и раскапывает получившуюся взвесь в лунки планшета, содержащие сыворотки и физиологический раствор. После этого дозаторы УРРП промываются дистиллированной водой во 2-ом ряду емкостей.

- Планшет с реагентами встряхивают на вибрационном смешивателе СВ-1.

- Планшет центрифугируют на центрифуге ОС-бМ для усиления реакции агглютинаци1

- Планшет повторно встряхивают на СВ-1 для ресуспендирования осадка.

-Планшет устанавливают в фотометр (блок считывания и обработки информации).

Фотометр автоматически регистрирует результаты реакции и оценивает их.

- Печатающее устройство распечатывает результаты на специальной ленте.

Прн неопределении группы крови прибор не дает ответа, т.е. выдача неверного резуль тата практически невозможна. Рабочий цикл прибора (от начала работы до выведения данных на печать) составляет 15 мин, что соответствует мировым стандартам для автоанализаторов.

В соответствии с разработанными нами медико-техническим требованиями и принципами конструирования был изготовлен опытный образец АГК-01, который стал объекте дальнейших исследований. В ходе этих экспериментов были адаптированы к работе на приборе серологические методы определения групповых факторов крови, установлены оптимальные параметры (соотношения и концентрации реагентов), обеспечивающие мак симально эффективное проведение реакции агглютинации (таблица 1).

Кроме того, были разработаны оптимальные режимы работы устройств АГК-01 (таб. 2).

Таблица !.

Оптимальные параметры проведения реакции агглютинации на АГК-01.

Параметры определения групповых факторов крови Значения параметров

1. Концентрация взвеси эритроцитов. 1%.

2. Разведение сывороток системы ABO. В 3-5 раз.

3. Разведение цоликлонов анти-А и анти-В. В 8-Ю раз.

4. Разведение анти-D антител. В 1,5-2 раза.

5. Концентрация раствора фермента. 0,1-0,2%.

6. Время энзимирования эритроцитов. 3 мин.

Всего по нашим разработкам были сделаны 5 опытных образцов АГК-01. Все они успешно прошли клинические испытания в ГНЦ, на Московской городской станции переливания крови и на Санкт-Петербургской городской станции переливания крови. Ошибок при определении групповой и резус-принадлежности не было. АГК-01 правильно определил фактор во всех случаях со слабыми вариантами антигенов А и D. Таким образом, прибор может быть использован в учреждениях переливания крови при массовых исследованиях крови доноров на группу крови системы ABO и резус-фактор.

II. Разработка оптико-акустического способа проведения и регистрации реакции агглютинации.

Для проведения экспериментов было сконструировано специальное устройство - ультразвуковая установка (рис. 2), обеспечивающая генерирование ультразвуковых волн и

проведение их на кювету, содержащую взвесь эритроцитов, а также измерение оптической плотности среды до и после ультразвукового воздействия.

Таблица 2.

Оптимальные режимы работы устройств АГК-01.

Операции устройств АГК-01. Значения режимов работы устройств АГК-01.

1. Центрифугирование кассет с исследуемой кровью. 2000 об/мин в течение 5 мин.

2. Центрифугирование планшетов с реагентами. 1000 об/мин в течение 2 мин.

3. Встряхивание планшетов с реагентами. 2500-3000 качаний/мин в течение 15-20 сек.

4. Фотометрирование планшетов с реагентами. а) Верхний уровень оптической плотности, соответствующий положительному результату. б) Нижний уровень оптической плотности, соответствующий отрицательному результату в) "Промежуточная зона" 0,55 единиц оптической плотности. 0,65 единиц оптической плотности. 0,1 единицы оптической плотности

Сначала было изучено влияние ультразвука на взвесь эритроцитов. Для этого ультразвуковую волну подавали на кювету со взвесью по вертикальной оси (снизу вверх). В течение 10-15 сек после начала ультразвукового воздействия отмечалось визуально различимое расслоение взеси в горизонтальной плоскости (рис. 3). Эритроциты концентрировались в горизонтально расположенных слоях, чередовавшихся с участками жидкости, в которых эритроцитов практически не оставалось. По мере продолжения воздействия ультразвуком расслоение становилось все более отчетливым. Максимальная концентра-

ция эритроцитов в слоях достигалась примерно через 1 мин. Затем начиналась быстрая седиментация эритроцитов вплоть до полного осаждения. Средняя скорость оседания

1. Генератор ультразвука.

В сеть 2. Трубка - проводник УЗ-волн.

3. Кювета со взвесью эритроцитов.

4. Лазер.

5. Миллиамперметр.

1_{и

+ 3 1 Н20 2 1

-ь

Рис. 2. Оптико-акустическое устройство (принципиальная схема).

примерно 80% эритроцитов составляла более 1 см/мин. При этом светопроницаемость ^верхних слоев взвеси резко возрастала, а светопроницаемость нижних слоев вследствие скопления эритроцитов снижалась практически до 0. В случае отключения ультразвука до полного оседания эритроцитов седиментация их быстро затухала, значительная часть эритроцитов оставалась во взвешенном состоянии, и оптическая проницаемость верхних слоев взвеси существенно не увеличивалась. Необходимо отметить, что расслоение взвеси не сопровождалось образованием агглютинатов или каких-либо конгломератов эритроцитов, т.е. ультразвук не обладает собственным агглютинирующим действием. При ультразвуковой обработке смеси эритроцитов с сывороткой, не содержащей анти

Ультразвук а) б)

Рис. 3. Влияние ультразвука на взвесь эритроцитов.

а) Взвесь эритроцитов во время ультразвукового воздействия.

б) Взвесь эритроцитов при отсутствии ультразвукового воздействия.

тела против данных эритроцитов, агглютинация отсутствовала. Это также подтверждает, что ультразвук не вызывает неспецифической агглютинации.

Далее было изучено влияние ультразвука на реакцию специфической агглютинации эритроцитов. Для этого взвеси эритроцитов смешивались с соответствующими групповыми сыворотками или моноклонами. При ультразвуковом воздействии наступало расслоение реагирующей смеси, и одновременно с концентрированием эритроцитов в слоях происходила их агглютинация. Ультразвук резко ускорял реакцию специфической агглютинации. Затем начиналась седиментация агтлютинатов, которая протекала в 2-3 раза быстрее, чем седиментация неагглютинированных эритроцитов. Но главная особенность заключалась в том, что седиментация агтлютинатов, в отличие от седиментации неагглютинированных эритроцитов, после отключения ультразвука не прекращалась до практически полного оседания. При этом значительно возрастала оптическая проницаемость верхних слоев реагирующей смеси, что позволяло регистрировать агглютинацию путем фотометрии.

Ускорение агглютинации под влиянием ультразвука, на наш взгляд, обусловлено двумя факторами:

1) при расслоении реагирующей смеси эритроциты концентрируются в слоях, т.е. в малом объеме;

2) эритроциты в слоях совершают визуально неразличимые колебательные движения, т.е. фактически происходит микроперемешивание.

В результате создаются благоприятные условия для протекания реакции агглютинации.

Тот факт, что седиментация агглюгинатов происходит намного быстрее седиментации неагглютинированных эритроцитов и не прекращается после отключения ультразвука, связан, очевидно, с тем, что у агглютинаты имеют большую относительную плотность, чем отдельные эритроциты.

Ранее при изучении воздействия ультразвуковых волн на взвесь корпускулярных части!; всеми авторами (Андреев B.C., 1973; Князьков H.H., 1982 и др.) ультразвук всегда подавался вертикально (снизу вверх), что было связано с техническими условиями экспериментов (проводником ультразвука служила вода). Мы решили воздействовать ультразвуком. на эритроцитарную взвесь не по вертикальной, а по горизонтальной оси (сбоку), изучить возникающие при этом явления и сопоставить их с теми, что были отмечены при вертикальной подаче. Оказалось, что при подаче волны по горизонтальной оси расслоение взвеси происходит не в горизонтальной, а в вертикальной плоскости. Образуются вертикальные "столбики" эритроцитов, между которыми располагаются участки прозрачной жидкости. Вслед за концентрированием эритроцитов в этих "столбиках" начинается осе-

дание эритроцитов. Здесь была отмечена важная особенность. Седиментация как эритроцитов, так и агглютинатов при этом ускорялась в 2-3 раза по сравнению с седиментацией при подаче ультразвука в вертикальной плоскости. Этот эффект связан с расслоением взвеси в вертикальной плоскости. В вертикальных эритроцитаркых "столбиках" верхние слои давят на нижние, ускоряя тем самым оседание. То есть седиментационный эффект ультразвука усиливается гравитацией. Получен патент на изобретение нового способа ускорения седиментации эритроцитов, который заключается в воздействии ультразвуком на взвесь эритроцитов по горизонтальной оси.

В ходе дальнейших исследований были установлены оптимальные условия определения группы крови системы ABO и резус-фактора (D) с применением ультразвука. Для этого было изучено влияние на выраженность реакции агглютинации ряда параметров. Важнейшие из них:

!) Концентрация взвеси эритроцитов.

а) Зависимость агглютинации от концентрации взвеси эритроцитов при определении группы крови системы ABO представлена на графике I. НА?

................................................1

.и

200 ISO 100 50

IV Концентрация — III эритроцитов (%)

2 4 6 8 10 12 14 16 График I. Влияние концентрации ззвеси эритроцитов на выраженность реакции агглютинации при определении группы крови системы ABO. Положительный вариант (реакция агглютинации произошла): I - цоликлоны, II - стандартные сыворотки. Отрицательный вариант (реакция агглютинации отсутствует): III - цоликлоны, IV - стандартные сыворотки.

При взаимодействии эритроцитов со стандартными сыворотками максимальная выраженность агглютинации была отмечена при 3-4% концентрации эритроцитарной взвеси (светопроницаемость надосадочнон жидкости-125 мА). По мере роста концентрации эритроцитов выраженность агглютинации постепенно уменьшалась (при 6%-ной концентрации оптическая проницаемость составляла 100 мА, при 16%-вой-лишь 5-10 мА). Более эффективным оказалось применение моноютональных реагентов анти-А и анти-В.

При увеличении концентрации эритроцита ой взвеси с 1%до 16% выраженность агглютинации практически не менялась, причем оптическая проницаемость достигала 200 мА. Это позволяет оценить моноклональные антитела как высокоактивные.

б) Зависимость агглютинации от концентрации взвеси эритроцитов при определении резус-фактора (О) показана на графике 2,

При взаимодействии монокяонального анти-Б реактива со взвесями резус-положительных эритроцитов различной концентрации во всех случаях показатели оптической проницаемости соответствовали положительным результатам при максимальной величине (100 мА) для 15-16% взвеси. Учитывая возможность слабой выраженности антигена Б, когда эритроциты при низкой концентрации взвеси могут не прореагировать с реактивом,

НА,

200 150 100 50

II Концентрация

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 эритроцитов (%)

График 2. Влияние концентрации взвеси эритроцитов на агглютинацию при определении резус-фактора.

I - положительный вариант (реакция агглютинации произошла);

II - отрицательный вариант (реакция агглютинации отсутствует).

а также учитывая тенденцию к некоторому ослабению выраженности агглютинации при увеличении концентрации взвеси, наиболее эффективной следует считать 10-20%-ную концентрацию эритроцитной взвеси (в среднем 15-16%).

Как следует из приведенных данных, для синхронного определения группы крови и резус-фактора с применением ультразвука целесообразно использовать моноклональные антитела.

2) Разведение серологических реактивов.

а) Зависимость агглютинации от разведения стандартных групповых сывороток и цо-ликлонов показана на графике 3.

Наибольшая выраженность реакции отмечалась при разведении стандартных групповых сывороток в 2-3 раза, При этом оптическая проницаемость над-осадочной жидкости была максимальной и составляла, в зависимости от

активности сывороток, I! О-190 мА. При разведении сывороток в 4-8 раз и более оптическая проницаемость постепенно снижалась.

2 4 S 16 32 реактивов График 3. Влияние разведения стандартных сывороток и цоликлонов на

реакцию агглютинации.

Положительный вариант (реакция агглютинации произошла): I - цоликлоны, II - стандартные сыворотки. Отрицательный вариант (реакция агглютинации отсутствует): III - цоликлоны; IV - стандартные сыворотки.

На активности цоликлонов анти-А и анти-В разведение даже более чем в 8 раз практически не сказывалось, светопроницаемость, как и при использовании неразведенных цоликлонов, оставалась равной 200 мА. Эти данные также подтверждают высокую активность моноклонов.

б) Разведение моноклональных анти-й антител.

Полученные данные представлены на графике 4. В первых четырех разведениях (в 2, 4, 8, 16 раз) выраженность агглютинации практически не отличалась. Начиная с разведения 1:32 отмечалась тенденция к снижению светопроницаемости. Вероятно, в этом случае начинало проявляться ингибирующее влияние протеолитического фермента на

НА

200 150

I

200 150 100

50

11 Разведение

2 4 S 16 32 анти-D антител

График 4. Влияние разведения моноклональных анти-Б антител на агглютинацию: I- положительный вариант (реакция агглютинации произошла); II - отрицательный вариант (реакция агглютинации отсутствует).

моноклональные антитела. В качестве оптимального было выбрано разведение в 2-4 раза.

3) Концентрация раствора протеолитического фермента. В наших экспериментах применялась протеаза С (ВНИИА, активность -1,8 ед/мг). Использовались растворы протеазы 2%, 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%-ной концентрации. При низких концентрациях фермента агглютинация резус-положительных эритроцитов не происходила (график 5). Наилучшие результаты были получены при 8-10%-ной концентрации. При дальнейшем увеличении концентрации раствора фермента отмечалось резкое снижение оптической проницаемости среды до значений, соответствующих отрицательным результатам реакции. Таким образом, при высоких концентрациях фермент ингибирует агглютинацию (вероятно, вследствие разрушения антител сыворотки). При взаимодействии с резус-отрицательными эритроцитами все результаты были отрицательными. Следовательно, для определения резус-фактора целесообразно использовать 8-10%-ные растворы протеазы. цА' 200 150 100 50

Концентрация раствора протеазы (%)

2 4 6 8 10 12 14 16 1$ 20 22 График 5. Влияние концентрации раствора фермента на реакцию агглютинации.

I- положительный вариант (реакция агглютинации произошла); П - отрицательный вариант (реакция агглютинации отсутствует).

4) Определение оптимального времени обработки эритроцитов ферментом.

Эксперименты показали, что при эизимировании резус-положительных эритроцитов в течение 5 мин реакция агглютинации на оптико-акустическом устройстве регистрируется как положительная. Максимальная выраженность реакции была достигнута после 15-минутной экспозиции (график 6). В го же время при взаимодействии резус-отрицательных эритроцитов с ферментом в течение 1-20 мин при последующем определении резус-фактора оптико-акустическим способом были получены отрицательные результаты (не более 10 цА). Однако по мере увеличения периода ферментной обработки резус-отрицательных эритроцитов светопроницаемость среды после проведения |>е<ус-

ции неуклонно возрастала и после 25-иинутного энзимирования соответствовала положительному результату. То есть при увеличении продолжительности экспозиции эритро-ЦА 200 150 ¡00

50 ^--------II Время ферментативной

обработки эритроцитов, мин

2 4 б 8 10 12 14 16 /<? 20 График б. Влияние продолжительности энзимирования на реакцию агглютинации:

I - положительный вариант (реакция агглютинации произошла);

II - отрицательный вариант (реакция агглютинации отсутствует).

цитов с ферментом начинает проявляться воздействие фермента на эрлтроцитарную мембрану, ведущее к неспецифической агглютинации. Таким образом, оптимальным временем обработки эритроцитов протеазой следует считать 15 мин, так как при этом обеспечивается наиболее эффективная регистрация реакции агглютинации и исключается возможность неспецифической агглютинации под влиянием фермента.

5) Определение оптимальных режимов ультразвуковой обработки.

При непрерывном ультразвуковом воздействии на смесь эритроцитов с сывороткой, содержащей антитела против данных эритроцитов, максимальная светопроницаемость среды достигается уже через 60-90 сек и при дальнейшей обработке (цо 5 мин) уже не меняется (график 7). При непрерывном воздействии на взвесь эритроцитов или на смесь эритроцитов с несоответствующей сывороткой (т.е. при отсутствии агглютинации) оптическая проницаемость растет значительно медленнее из-за более поздней и более медленной седиментации эритроцитов. Эритроциты полностью оседали только к 5 мин, в связи с чем светопроницаемость возрастала до тех же величин, что и при положительной реакции агглютинации. Аналогичные результаты были получены при двукратном озвучивании с интервалом в 10 сек с той же суммарной продолжительностью. Далее были проведены опыты с различными режимами озвучивания смеси реагентов. Установлено, что при дискретной подаче ультразвука в течение короткого времени (по 5 сек 10 раз с интервалом между озвучиваниями 10 сек, по 10 сек 5 раз с интервалом 10 сек и т.д.) выраженной концентрации эритроцитов в слоях не происходит, седиментация не успевает начаться, и, следовательно, светопроницаемость остается низкой. Оптимальные результаты были получены при однократном или двукратном озвучивании с суммарным

цА"

200 ¡50 100 50

_^ Время ультразвукового

воздействия,сек

45 90 135 ПО 225 270 315 График 7. Влияние продолжительности ультразвукового

воздействия на реакцию агглютинациии: Положительный вариант (реакция агглютинации произошла): I - цоликлоны; II - стандартные сыворотки. Отрицательный вариант (реакция агглютинации отсутствует): III - цоликлоны; IV - стандартные сыворотки.

временем озвучивания 50-60 сек. При этом в случае двукратного озвучивания оптимальный интервал времени между озвучиваниями составлял 15-40 сек. Самым эффективным режимом ультразвукового воздействия оказался режим двойной пробоподго-товки: воздействие ультразвуком на смесь реагентов в течение 30-35 сек, затем интервал 30-35 сек, после этого повторное озвучивание в течение 30-35 сек, отключение ультразвука и через 30-35 сек учет результатов реакции (за это время агглютинаты почти полностью оседали, а седиментация неагглютшшрованных эритроцитов приостанавливалась).

Отмеченные выше оптимальные параметры представлены в таблице 3.

Итак, в ходе исследований был разработан новый способ проведения и регистрации реакции специфической агглютинации эритроцитов, названный оптико-акустическим спс собом. Оптико-акустический способ проведения И регистрации реакции специфической агглютинации эритроцитов может быть положен в основу разработки принципиально новых автоматических анализаторов серологических реакций. Использование ультразвука позволит существенно упростить конструкцию автоанализаторов, так как позволит, в частности, отказаться от такого громоздкого оборудования, как центрифуги. Таким образом, в результате проведенных работ создан первый отечественный анализатор групп крови АГК-01 и разработан оптико-акустический способ проведения и регистрации реакции агглютинации. Внедрение АГК-01 в систему практического здравоохранения, а также создание автоанализаторов нового поколения на основе использования ультразвука позволит службе крови более эффективно обеспечивать быстрое и правиль-

Таблица 3.

Оптимальные параметры проведения реакции агглютинации на оптико-акустическом устройстве.

Параметры определения групповых факторов крови Значения параметров

1. Концентрация взвеси эритроцитов 10-20% (в среднем -15-16%).

2. Разведение стандартных сывороток. В 2-3 раза.

3. Разведение цоликлонов анти-А и анти-В. В 8-10 раз.

4. Разведение моноюгонзльных анти-й антител. В 2-4 раза.

5. Концентрация раствора протеолити-ческого фермента (протеазы С). 8-10%.

6. Время ферментативной обработки эритроцитов. 15 мин.

7. Ультразвуковое воздействие. Двойная пробоподготовка: непрывное воздействие 30-35 сек, пауза - 30-35 сек, повторов воздействие - 30-35 сек, пауза -30-35 сек и учет результатов.

ное определение группы крови ABO и резус-фактора крови доноров при массовых исследованиях и тем самым повысить безопасность гемотрансфузий.

ВЫВОДЫ

t. Изучено влияние ультразвуковых волн на взвесь эритроцитов. Установлено, что ультразвук обладает своеобразным седименгационным эффектом - вызывает расслоение взвеси в плоскости, перпендикулярной направлению волн, концентрирование эритроцитов в слоях и затем их ускоренную седиментацию.

2. Изучено влияние ультразвука на реакцию агглютинации. Показано, что ультразвук ускоряет специфическую агглютинацию эритроцитов, не вызывая при этом неспецифической агглютинации.

3. Впервые установлено, что подача ультразвуковой волны в горизонтальном направлении позволяет ускорить в 2-3 раза седиментацию эритроцитов по сравнению с подачей ультразвука в других плоскостях (патент на изобретение № 2072102 от 20 января 1997 г.).

4. Сконструировано оптико-акустическое устройство для проведения и регистрации реакции агглютинации.

5. Установлены оптимальные параметры проведения и регистрации реакции агглютинации при определении группы крови и резус-фактора оптико-акустическим способом (режим ультразвукового воздействия, соотношение реагентов, их концентрации и ДР-).

6. Обоснована перспективность использования оптико-акустического способа регистрации агглютинации эритроцитов для создания эффективных анализаторов серологических реакций.

7. Сформулирована концепция анализатора групп крови как полуавтоматической системы, предназначенной для определения группы крови и резус-фактора крови доноров при массовых исследованиях и состоящей из ряда автоматических устройств и вспомогательных приспособлений.

8. Разработаны медико-технические требования и принципы конструирования анализатора групп крови, в соответствии с которыми созданы опытные образцы анализатора групп крови.

9. Проведены работы по адаптации серологических методов определения групповых факторов крови применительно к работе на анализаторе групп крови.

10. Проведены медицинские испытания анализатора групп крови, которые показали эффективность его использования для определения группы крови системы ABO и резус-фактора при массовом исследовании крови доноров,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. 1. Алипов А.Н., Завьялов Э.Н., Войхонский С.И., Князьков H.H., Каланда-ров P.C., Голубев А.Т., Донсков С.И. Первый отечественный анализатор групп крови АГК-01. В кн. Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореа-билитация. Тезисы докл. Всероссийской конференции 23-24 ноябр. 1995 г. - Москва. -1995.-с. 42-43.

2. Доносов С.И., Каландаров P.C., Князьков H.H., Сахаров P.C., Голубев А.Т. Изучение феномена седиментации эритроцитов под действием ультразвука. В кн. Иммунологический мониторинг патологических состояний и ммуно-

реабилитация. Тезисы докл. Всероссийской конференции 23-24 ноябр. 1995 г. - Москва. -1995.-с. 94-95.

3. Донсков С.И., Князьков H.H., Каландаров P.C., Сахаров P.C. Способ седиментации эритроцитов в реакции антиген-антитело. Патент на изобретение N 2072102. - Москва. -1997.

4. Каландаров P.C., Князьков H.H., Донсков С.И.. Оптико-акустический способ регистрации реакции гемагглютинации и его применение для определения группы крови (предварительное сообщение). Проблемы гематологии и переливания крови, 2/97. -Москва. -1997. - с. 5-8.

5. Каландаров P.C. Автоматизированные методы серологических исследований (обзор литературы). Проблемы гематологии и переливания крови, 3/98. - Москва. - 1998. - с. 4044.