Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Неинвазивное пренатальное определение эмбриональной ДНК для оптимизации ведения беременности при акушерской патологии

На правах рукописи

005045333

ФЕДОРОВА НАТАЛЬЯ ИГОРЕВНА

НЕИНВАЗИВНОЕ ПРЕНАТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ДНКДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ВЕДЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ ПРИ АКУШЕРСКОЙ ПАТОЛОГИИ

14.01.01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 7 ИЮНШ

Москва-2012

005045333

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации во 2-м отделении акушерском патологии беременности

Научные руководители:

доктор медицинских наук ТЕТРУАШВИЛИ Нана Картлосовна

доктор медицинских наук

академик РАМН, профессор СУХИХ Геннадий Тихонович

Официальные оппоненты:

БАЕВ Олег Радомирович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий родильным отделением ФГБУ «НЦ АГнП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России

СЕРОВА Ольга Федоровна - доктор медицинских наук, профессор, главный врач ГУЗ «Московский областной перинатальный центр»

Ведущее учреждение:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н И.Пирогова» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «_» _2012 г. в 13.00. ч. на заседании

диссертационного совета Д 208.125.01 при ФГБУ «Научный цеігтр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «_»_2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

КАЛИНИНА Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Невынашивание беременности представляет собой актуальную проблему современного акушерства. В настоящее время частота самопроизвольного прерывания беременности составляет 20-25%, причем до 80% всех потерь приходится на I триместр. Несмотря на то, что частота привычного выкидыша в популяции составляет лишь 2-5% [Porter T.F., Scott J.R., 2005, Allison J.L., Schust D.J., 2009], обращает на себя внимание возрастающий риск потери беременности с увеличением числа репродуктивных неудач. Установлено, что без проведения терапии беременность прерывается в 38% случаев после двух предшествующих выкидышей [Coulam C.B., Hemenway N.P., 2001, Tang A.W., Quenby S., 2010], при этом акушерская тактика зависит от точного установления причин для правильного выбора терапии.

Необходимость своевременной постановки диагноза при явлениях угрожающего выкидыша с минимальным риском для матери и плода определяет актуальность разработки и внедрения новых методов неинвазивной пренатальной диагностики. Поиск неинвазивных методов диагностики приобретает особую значимость именно при угрожающем выкидыше, так как позволяет минимизировать дальнейшие осложнения и затраты на ведение беременности [Айламазян Э.К., Баранов B.C., 2006].

Поиск информативных маркеров-предикторов осложнений беременности представляет большой научный и практический интерес. К задачам неинвазивной пренатальной диагностики, которые могут быть решены с использованием молекулярно-генетических методов на данный момент относятся: установление пола плода при сцепленных с полом заболеваниях, АГС, резус-фактора плода у резус-отрицательных беременных женщин, прогнозирование осложнений беременности на ранних гестационных сроках [Федченко В.И., Гурьев С.О., 2005, Farina А., 2005, Minon J., 2008, Wright C.F., Chitty L.S., 2009, Lo Y. M., 2010].

Известно, что при неблагоприятном течении беременности в первом триместре происходит усиленный апоптоз клеток трофобласта, отражением которого является повышение уровней ДНК эмбрионального происхождения как в периферической крови матери, так и в отделяемом цервикального канала. Попытки прогнозирования преэклампсии и плацентарной недостаточности по высоким уровням свободной эмбриональной ДНК (сэ-ДНК) в материнский кровоток проводились отдельными группами зарубежных авторов. Было установлено, что уровни сэ-ДНК коррелируют с тяжестью течения преэклампсии на поздних гестационных сроках [Ishihara N., Matsuo H., 2002, Chan K.C.A., Zhang J., 2004]. Проведение подобных исследований при анеуплоидиях

продемонстрировало прогностическую значимость высоких уровней сэ-ДНК в случаях аномального кариотипа плода [Go А.Т., van Vugt J.M., 2010, Evans MI., 2010]. При угрожающем и привычном выкидыше подобные работы в доступной литературе не встречаются.

Цель исследования:

Оптимизация ведения беременности на основании раннего прогнозирования гестационных осложнений молекулярно-генетическими методами неинвазивной пренатальной диагностики.

Задачи исследования;

1 Провести анализ нарушений репродуктивной функции у супружеских пар с привычным выкидышем на основании комплексного клинико-лабораторного обследования.

2 Исследовать диагностическую значимость определения сэ-ДНК в периферической крови матери для установления пола плода неинвазивным путем.

3 Изучить динамику уровней сэ-ДНК в периферической крови женщин в процессе нормальной и осложненной беременности.

4 На основании анализа течения и исходов наблюдаемых беременностей провести оценку эффективности раннего прогнозирования гестационных осложнений по уровням сэ-ДНК.

5 Определить диагностическую значимость выделения клеток и ДНК эмбрионального происхождения из отделяемого цервикального канала беременных в первом триместре.

6 Исследовать точность неинвазивного определения резус-D гена плода по крови резус-отрицательных беременных в сроках до 20 недель для оптимизации терапевтической тактики с учетом резус-принадлежности плода.

Научная новизна

Впервые в стране определена сэ-ДНК в периферической крови женщин в первом триместре беременности. Получены данные о динамическом изменении показателей сэ-ДНК при физиологической и осложненной беременности. Определены уровни СЭ-ДНК в динамике первого триместра беременности, при которых повышена вероятность ранних и поздних гестационных осложнений, связанных с апоптозом клеток трофобласта и патологией плацентации. Установлена сильная прямая корреляция между высокими уровнями NK клеток с цитотоксической активностью и сэ-ДНК в периферической крови женщин на ранних сроках осложненной беременности, что указывает на взаимосвязь

клеточной киллерной активности с апоптозом клеток трофобласта. Проведенные исследования позволили расширить понимание патогенетических механизмов, лежащих в основе взаимодействия материнского организма и развивающегося эмбриона.

Впервые выделены и идентифицированы клетки трофобласта из отделяемого цервикального канала методом жидкостной цитологии, что открывает перспективы для использования данного материала в целях пренатапьной диагностики.

Доказана возможность неинвазивного определения резус-О гена плода по периферической крови женщины с 8 недель беременности, что свидетельствует о присутствии эмбриональных нуклеиновых кислот в периферической крови с ранних гестационных сроков.

Полученные данные позволили расширить понимание физиологических и патологических процессов, лежащих в основе течения беременности.

Практическая значимость

В ходе работы оптимизирована тактика ведения беременных с угрожающим и привычным выкидышем в I триместре на основании результатов определения свободных нуклеиновых кислот эмбрионального происхождения в периферической крови матери. Разработан алгоритм обследования женщин с угрожающим выкидышем для отбора пациенток для проведения инвазивной пренатальной диагностики. Установлены основные значения сэ-ДНК, свидетельствующие о наличии нарушений имплантации / плацентации в I триместре. Определены нормативные показатели сэ-ДНК в периферической крови женщины в динамике беременности. Установление пола плода на ранних гестационных сроках позволило оптимизировать дальнейшую тактику ведения беременности, в частности, рекомендовать отказ или проведение инвазивных процедур пренатальной диагностики при заболеваниях, сцепленных с полом.

Выявление клеток трофобласта и ДНК эмбрионального происхождения в отделяемом цервикального канала методом жидкостной цитологии позволило использовать данный материал для неинвазивной пренатальной диагностики.

Оптимизирована программа обследования резус-отрицательных беременных женщин путем определения резус-0 гена плода. Определение резус-отрицательной принадлежности крови плода позволяет снизить затраты на ведение беременности, избежать многократного определения резус-антител, не проводить антенатальную профилактику резус-иммунизации. При ведении беременности у резус-сенсибилизированных женщин определение резус-Э гена плода позволяет избежать ненужных инвазивных диагностических и лечебных процедур при отрицательной резус-принадлежности крови плода. В случаях положительной резус-принадлежности плода

неинвазивное определение резус-принадлежности дает возможность на ранних сроках оценить риск развития гемолитической болезни плода, своевременно начать проведение лечебно - профилактических мероприятий.

Полученные данные позволили оптимизировать комплекс диагностических и терапевтических мероприятий у женщин с акушерской патологией.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Выявление сэ-ДНК в периферической крови беременной до 12 недель позволяет неинвазивно определить пол плода в 99% случаев, что является клинически значимым при сцепленных с полом заболеваниях.

2 Наличие взаимосвязи повышенных уровней сэ-ДНК с осложненным течением беременности позволяет прогнозировать ранние и поздние акушерские осложнения, ассоциированные с плацентарной недостаточностью.

3 Идентификация клеток трофобласта и ДНК эмбрионального происхождения в отделяемом цервикального канала методом жидкостной цитологии позволяет использовать полученный материал для пренатальной генетической диагностики.

4 Неинвазивное пренатальное определение резус-Э гена плода способствует выбору правильной терапевтической тактики с отказом от инвазивных процедур и профилактики резус-иммунизации в случаях резус-отрицательной принадлежности крови плода.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения

Результаты настоящего исследования и вытекающие из них рекомендации внедрены и используются в работе 2-го отделения акушерского патологии беременности ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России при обследовании и лечении женщин с привычными выкидышами и резус-отрицательных беременных. Практические рекомендации легли в основу подготовки образовательных программ для врачей, проходящих обучение в отделениях Центра.

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации и результаты работы доложены на Форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011), Научно-практической конференции 2-го отделения акушерского патологии беременности «Невынашивание беременности: социальная проблема, медицинские решения» (Москва, 2011). Работа обсуждена на межклинической конференции сотрудников 2-го отделения акушерского патологии беременности ФГБУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 27 декабря 2011 г. и

е

заседании аиробационной комиссии ФГБУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 20 февраля 2012 г.

Личное участие автора Автором самостоятельно проведен сбор и анализ клинического материала, коллекций биологического материала, обследование и лечение пациенток с привычными выкидышами и резус-сенсибилизацией, статистическая обработка полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 -«акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в т.ч. 4 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки России.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из ведения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, содержит 39 таблиц, 24 рисунка. Библиографический указатель включает 164 литературных источников, в том числе 34 отечественных и 130 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования В соответствии с поставленными задачами, неинвазивная пренатальная диагностика проводилась двум категориям пациенток. Первая часть диссертационной работы посвящена определению ДНК эмбрионального происхождения (в периферической крови и отделяемом цервикального канала) и оценке ее прогностической значимости у пациенток с привычным выкидышем и у женщин с неосложненным акушерским анамнезом. Во второй части работы сэ-ДНК изучена у резус-отрицательных женщин, беременных от резус-положительного партнера. В этой части исследования определение резус-О гена плода проведено для оптимизации ведения беременности с учетом известной резус-принадлежности плода.

Первичное обследование проведено 390 женщинам, из них в исследование вошли 345 пациенток, отобранные на основании критериев включения и исключения. Основную группу составили 122 женщины с привычным выкидышем, контрольную - 103

беременных с неотягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом. У 28 беременных женщин в I триместре беременности произведен забор цервикального отделяемого для выявления клеток и ДНК эмбрионального происхождения. Резус-отрицательные беременные от резус-положительного партнера (120 пациенток) были поделены на группы в зависимости от наличия или отсутствия резус-иммунизации.

Критерии включения в основную группу: срок беременности от 6 до 8 недель от первого дня последней менструации, нормальный кариотип партнеров, привычное невынашивание беременности (наличие в анамнезе 2 и более ранних и /или поздних потерь беременности от одного и того же партнера), информированное согласие женщины на проведение исследования.

Критерии исключения: наличие генетических факторов привычных потерь беременности, аномалии развития матки у женщины, наличие хронических инфекционных и системных аутоиммунных заболеваний.

Критерии включения в контрольную группу: срок беременности от 6 до 8 недель от первого дня последней менструации, физиологическое течение беременности на момент обследования, неосложненный акушерский и гинекологический анамнез, информированное согласие женщины на проведение исследования.

Критерии исключения: наличие хронических инфекционно-воспалительных и системных аутоиммунных заболеваний, тяжелые экстрагенитальные заболевания.

Для определения резус-фактора плода по периферической крови матери в исследование были включены 120 резус-отрицательных беременных женщин согласно следующим критериям включения: срок беременности от 8 до 20 недель, резус-положительный фактор отца будущего ребенка, информированное согласие женщины на проведение исследования. Критериями исключения являлись: наблюдение пациентки по месту жительства и отсутствие доступа к данным о течении и исходе беременности.

Всего из обследованных резус-отрицательных беременных, 45 были первобеременные несенсибилизированные - 37,5% (I группа), 41 - повторнобеременные несенсибилизированные - 34,2% (II группа), 34 повторнобеременные резус-сенсибилизированные женщины 28,3% (П1 группа).

Все пациентки, включенные в исследование, прошли обследование по специально разработанной схеме, включавшей: подробный сбор анамнестических данных, объективный осмотр, гинекологический осмотр, ультразвуковое исследование матки, оценка фето-плацентарного комплекса в динамике беременности, скрининг на наличие инфекционно-воспалительных заболеваний, гемостазиологическое исследование, иммунограмму, определение аутоиммунных антител.

а

Специачьные методы исследования включали:

- определение сэ-ДНК в сыворотке периферической крови беременных женщин методом ПЦР в режиме реального времени с использованием комплекта реагентов «Проба-ГС» (ДНК-технология, Россия);

- определение клеток и ДНК эмбрионального происхождения из отделяемого цервикапьного канала беременной в I триместре методом жидкостной цитологии на приборе Cell Prep Plus (Корея);

- иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови на проточном цитофлуориметре Facsan «Becton Dickinson» США.

Статистическая обработка материала

Все полученные анамнестические данные, анализы и исследования были обработаны с помощью компьютерной программы Statistica for Windows v 8.0.

Для количественных показателей были определены: среднее значение (М), стандартное отклонение (5), ошибка среднего (т), 95% доверительный интервал, медиана (Me), интерквартильный размах, а для номинальных значений рассчитаны частоты (%).

Полученные данные были проверены на соответствие нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка. При сравнении средних значений между группами применяли параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Анализ показателей, изменяющихся в течение беременности, производился с помощью парного t-критерия Стьюдента (при нормально распределенных значениях) или с помощью непараметрического аналога - критерия Вилкоксона.

Сравнение распределения показателей (частот) между группами осуществлялось с помощью критерия Хи-квадрат с построением соответствующих таблиц (2x2 или 2x3) или с помощью t-критерия Стьюдента для долей с поправкой Бонферони.

Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Определение зависимости между показателями осуществлялось с помощью корреляционного анализа Пирсона (г) или непараметрического критерия Спирмена (R). Для выявления значимости показателей применялся ROC-анализ, логистическая бинарная регрессия.

Результаты исследования и их обсуждение Для решения поставленных задач был проведен тщательный анализ анамнеза пациенток исследуемых групп, включавший сопоставление основных факторов, оказывающих воздействие на течение беременности - возраст, социально-экономическое положение, наследственность, экстрагенитальная и гинекологическая заболеваемость, характер менструальной функции, репродуктивный анамнез.

Женщины исследуемых групп были сопоставимы по возрасту: средний возраст женщин основной группы составил 29,2±3,9 лет, контрольной группы 28,6±4,2 лет, в группе резус-отрицательных беременных женщин - 28,9±3,9 лет (р>0,05). При анализе соматической заболеваемости значимых отличий в частоте встречаемости заболеваний между пациентками с привычным выкидышем, резус-отрицательными женщинами и контрольной группой не отмечено.

При изучении гинекологической заболеваемости, обращает на себя внимание высокий процент хронических ВЗОМТ у пациенток с привычным выкидышем - в анамнезе у каждой третьей женщины эндометрит и/или сальпингит, оофорит, что достоверно превышает частоту воспалительных заболеваний в контрольной группе и группе резус-отрицательных беременных женщин - 31,1%, 13,6%, 11,7% соответственно (р<0,05). Средний возраст менархе в группах не различался (13,2±1,3 лет, 13,0±1,3 лет, 12,8±1,8 лет - р>0,05). У подавляющего большинства пациенток с привычным выкидышем - 82,8% (101) менструальный цикл был регулярным, длительностью 28,6+1,5 дней, у женщин контрольной группы 28,2±1,1 дней, у резус-отрицательных беременных женщин 28,1±1,2 дней что свидетельствует об отсутствии грубых нарушений овуляторных процессов.

При анализе репродуктивной функции установлено, что подавляющее большинство женщин основной группы 80,4% (98) имели в анамнезе по 3-4 самопроизвольных выкидыша, 14,8% (18) - 5-7 самопроизвольных прерываний беременностей, лишь 4,9% (6) женщин - 2 самопроизвольных выкидыша. Необходимо отметить, что 3 женщины (1 в основной и 2 в контрольной группе) являлись носительницами генов, ответственных за реализацию сцепленных с полом заболеваний -миодистрофии Дюшенна, гемофилии, Х-сцепленного иммунодефицита. В 2-х случаях это привело к рождению детей с миодистрофией Дюшенна и Х-сцепленным иммунодефицитом в исходах предыдущих беременностей, дети умерли в возрасте 5 и 11 лет. Выкидыши в анамнезе у женщин исследуемой группы в основном приходились на первый триместр, которые составили 96,7% от числа всех самопроизвольных потерь. Поздние выкидыши регистрировались относительно редко в 3,3% случаев. В анамнезе у женщин основной группы не было своевременных родов, то есть речь идет о первичном привычном выкидыше. Пациентки с первичными нарушениями состояния репродуктивной системы - наиболее сложный контингент беременных женщин, представляющих группу риска по реализации, как ранних, так и поздних гестационных осложнений в виду реализации плацентарной недостаточности [Макаров О.В., 2009; Серова О.Ф., 2010, Баев О.Р., 2011, Сагр I., 2007]. Ю

При анализе репродуктивной функции у резус-отрицательных беременных женщин установлено, что в анамнезе была 191 беременность, из них 119 приходилось на 34 сенсибилизированных женщин (в среднем 3,5 беременностей на женщину), 72 беременности на 86 женщин без резус-сенсибилизации (0,8 беременностей на пациентку). Таким образом, число беременностей в группе сенсибилизированных женщин было достоверно выше (р<0,05). Из сенсибилизированных женщин преобладали женщины с 2-5 беременностями в анамнезе - 92,7%, тогда как у несенсибилизированных женщин в 52,3% случаев в анамнезе беременностей не было, а у 29,1% отмечена лишь одна беременность.

Полученные результаты согласуются с данными литературы о факторах, предрасполагающих к резус-сенсибилизации. Это, прежде всего, беременности резус-положительными плодами, при этом риск иммунизации в течение первой беременности составляет 1-1,5%, после родов возрастает до 10% [Савельева Г.М., Курцер М.А., 2004].

У 34 повторнобеременных сенсибилизированных женщин в анамнезе было рождение ребенка с ГЕН различной степени тяжести. Тяжелая ГЕН, повлекшая за собой гибель ребенка после рождения, отмечена в 13 наблюдениях, антенатальная гибель плода в сроках до 28 недель беременности в 4 случаях, после 28 недель в 7 случаях. Таким образом, резус-сенсибилизацией было обусловлено 11 потерь беременности на поздних гестационных сроках и 13 случаев гибели детей после рождения от гемолитической болезни. Определение резус-фактора плода у данной сложной категории женщин имеет большое практическое значение, так как влияет на тактику ведения беременности и, в частности, на необходимость проведения инвазивных диагностических и лечебных процедур.

Все беременные женщины были обследованы в Научно-поликлиническом отделении Центра. При возникновении осложнений женщины были госпитализированы во 2-е отделение акушерское патологии беременности для проведения терапии. Проведен анализ течения беременностей по триместрам с сопоставлением частоты возникающих осложнений и оценкой их исходов для матерей и новорожденных.

Уточнены причинные факторы невынашивания беременности у женщин исследуемых групп. Из эндокринных факторов привычного выкидыша - СПКЯ диагностирован у 9,8% (12 женщин), субклинический гипотиреоз у 9,0% (11 случаев). Акушерский АФС отмечен в 16,9% (20) наблюдениях, однако ни в одном случае не было системного аутоиммунного заболевания, тромбоза сосудов или тромбоцитопении. Совместимость супругов по антигенам НЬА II класса (3 и более аллелей) была отмечена у 18,0% (22) пар. Инфекционно-воспалительные и дисбиотические процессы влагалища выявлены у 72,1% женщин основной группы, тогда как нормоценоз отмечен лишь в 27,9%

11

случаев. Нормоценоз влагалища выявлялся достоверно чаще у женщин контрольной группы в 76,6% наблюдений (р<0,05).

Нами проводилось определение сэ-ДНК (генов Y-хромосомы SRY и DYS-14) в периферической крови женщин основной (п=122) и контрольной групп (п=103) в первом триместре беременности. Подтверждение пола проводилось после рождения фенотипически, а в случаях неразвивающихся беременностей - кариотипированием. Измерение уровней сэ-ДНК в динамике с интервалом в 2 недели до 20 недель беременности проведено у 24 женщин основной и 20 пациенток группы контроля. В связи с возможностью определять сэ-ДНК только у беременных, вынашивающих плодов мужского пола, в случае отсутствия выявления генов Y-хромосомы в нескольких образцах на разных сроках беременности у части беременных исследование было прекращено.

Из 122 образцов периферической крови беременных женщин в первом триместре сэ-ДНК была выявлена в 72 случаях, при этом пол плода интерпретировался, как мужской.

В основной группе был один случай несовпадения результатов, когда в периферической крови матери были выявлены гены Y-хромосомы, тогда как пол ребенка, родившегося в гестационном сроке 30 недель, был фенотипически определен, как женский. Кариотипирование цитогенетическим методом дало результат 46ХХ. Однако, тестирование крови новорожденной повторно выявило гены Y-хромосомы SRY и DYS-14. Вероятно, речь идет о присутствии генов Y-хромосомы в хромосомном наборе девочки, по-видимому, в неактивном состоянии. Информация передана наблюдающим ребенка педиатрам. На данный момент продолжается наблюдение за развитием ребенка.

В двух других случаях по данным сэ-ДНК пол плода был определен, как женский, тогда как, пренатально по данным УЗИ и после рождения фенотипически и кариотипически пол был определен, как мужской. По-видимому, имела место недостаточная чувствительность метода в данных наблюдениях, вызванная чрезвычайно низким уровнем сэ-ДНК. В последнем перечне, обобщившем данные 23 подобных исследований, было показано, что ложно-положительных результатов можно избежать, тогда как, предотвращение ложно-отрицательных результатов, до сих пор представляет собой довольно сложную проблему [Avent N.D., Chitty L.S., 2006].

Анализ качества диагностических методов неинвазивного определения пола плода в первом триместре беременности показал, что чувствительность методики составила 99,2%, специфичность 98,9%, точность 99,1% (Рис. 1).

Проведенный ЯОС анализ показал, что площадь под ЮС-кривой в случае определения ОУБ-М составила 0,989±0,007, в случае определения 0,988±0,008, что соответствует отличным моделям.

ROC Curve

ROC Curve

~l-i-1-Г

0,0 02 0.4 0,6 0,3 1,С

1- Specificity 1-Specificity

Рис. 1. Чувствительность и специфичность методов неинвазивного определения пола плода (ROC анализ).

Полученные данные согласуются с мировым опытом подобных исследований. В Великобритании точность определения пола плода составила 97,6 % [СЫйу Ь.Э., 2010, №11 М., 2011], по данным итальянских авторов 99,4% [Са1Ыай Э., 2005].

При определении уровней генов У-хромосомы в сроках 6-8 недель беременности было выявлено, что показатели достоверно отличаются в основной и контрольной группах. В основной группе показатель БУБ-И составил 1021,0±660,6 копий/мл, в контрольной группе 172,4±56,8 копий/мл. Следовательно, средний показатель ОУЭ-И в основной группе в 5,9 раз превышал аналогичный показатель в группе контроля (р<0,01) (Рис.2).

Аналогичные показатели получены и по данным гена ЭЯУ: в основной группе средний показатель в 2,7 раз превосходил уровень БЯУ в группе контроля и составил 124,4±48,3 по сравнению с 45,3±21,6 копий/мл (р<0,01) (Рис.2).

Рис. 2. Уровни генов ОУ8-14 и БЯУ у женщин основной и контрольной групп в первом триместре беременности (6-8 недель).

Полученные результаты, вероятно, указывают на апоптотические процессы, происходящие в трофобласте у женщин с ПНБ в первом триместре. Гены сэ-ДНК, выявляемые в периферической крови матери, возможно, имеют апоптотическое происхождение, следовательно, в случаях осложненной беременности их уровни повышаются.

Проведен корреляционный анализ уровней сэ-ДНК с показателями клеток с цитотоксической активностью у женщин основной группы. Установлена сильная прямая корреляция между уровнями МК клеток с цитотоксической активностью и сэ-ДНК в периферической крови женщин на ранних сроках осложненной беременности (коэффициент корреляции для БУБ-М составил 0,83, для БЯУ - 0,87).

Несмотря на то, что заболевания, сцепленные с полом, встречаются редко, в группе обследованных женщин выявлено 3 случая, когда акушерская тактика оптимизирована с использованием методов неинвазивной пренатальной диагностики. Это касалось диагностики пола плода при гемофилии, миодистрофии Дюшенна, Х-сцепленном тяжелом иммунодефиците. В одном наблюдении удалось избежать инвазивной пренатальной диагностики, так как был установлен женский пол плода, в двух остальных ситуациях раннее определение пола плода позволило наметить план обследования и диагностики. Кроме того, неинвазивное определение пола плода позволило определить мужской пол при атипично сформированных гениталиях плода в одном клиническом наблюдении. При кариотипировании после рождения был установлен кариотип 46ХУ, у новорожденного имела место мошоночная форма гипоспадии полового члена.

Установлено, что в основной группе отмечается рост значений DYS-14 и SRY с 6-й по 20-ю неделю гестании достоверно превышающий аналогичные показатели в контрольной группе (р<0,05) (Рис.3).

Среднее; Отрезки Среднее±0.95 Дее интервал

Рис.3. Уровни ОУБ-М и БИТ в динамике у женщин основной и контрольной групп.

Проведено проспективное наблюдение за течением и исходами беременностей женщин всех исследуемых групп. Самым частым осложнением в I триместре у женщин основной группы был угрожающий и начавшийся выкидыш: при эхографическом исследовании выявлено образование ретрохориальных гематом в 37,7% (46) наблюдений, ретроамниотических гематом в 9,8% (12), образование отслоек хориона без визуализации гематом отмечено в 12,3% (15) случаев.

Если обобщить потери беременности в основной группе до 22-х недель то суммарно прервалось 22 беременности, из них только в 27,3% (6) случаях плоды были женского пола, при этом с аномальным кариотипом в 3 наблюдениях. Из 16 плодов

мужского пола (72,7% от числа ранних потерь) хромосомная патология отмечена лишь в 3 наблюдениях, в остальных 13 выявлен нормальный мужской кариотип.

Согласно полученным нами данным, потери беременности в большей степени происходят при беременностях плодами мужского пола. В этой связи, определение половой принадлежности плода на ранних сроках беременности может иметь прогностическое значение в связи с доказанным более высоким риском прерывания беременности при наличии плода мужского пола. Были проанализированы уровни генов У-хромосомы у женщин с последующими потерями беременностей до 22 недель. Установлено, что отмечается рост значений ЭУБ-М и БЯУ с 6-й по 20-ю неделю гестации достоверно превышающий, как средние показатели в группе, так и контрольные значения (р<0,01).

Проанализированы осложнения П и Ш триместров, а также исходы беременностей у наблюдаемых женщин. Всего у женщин основной группы было 13 преждевременных родов в связи с декомпенсированной плацентарной недостаточностью, все путем операции кесарева сечения и 87 своевременных родов, из них 33% оперативным путем и 54% через естественные родовые пути. На рисунке представлены результаты анализа показателей БКУ и ОУБ-Н женщин с преждевременными родами по сравнению с результатами женщин, беременность которых закончилась своевременными родами (рис. 4). Из полученных данных следует, что высокие уровни сэ-ДНК в периферической крови матери в первом триместре свидетельствуют о повышенном риске гестационных осложнений, ассоциированных с нарушениями плацентации - самопроизвольного прерывания беременности и плацентарной недостаточности.

У женщин основной группы проведено исследование, направленное на выявление клеток трофобласта в отделяемом цервикального канала в I триместре беременности.

Наилучшие результаты были получены при заборе отделяемого цервикального канала свабом (апробировались также методы аспирации слизи и аспирации с предшествующим лаважем). Метод идентификации клеток трофобласта с использованием моноклональных антител к цитокератину-7 и НЬА-О на стеклах не привел к желаемому результату в виду множественных ложно-положительных реакций. Для приготоютения мазков наиболее информативен был метод жидкостной цитологии, позволивший освободить образцы от детрита и слизи, равномерно распределить на предметном стекле монослоем взвесь отмытых клеток, включая клетки трофобласта. Подобным образом были исследованы образцы цервикальной слизи 28 беременных женщин основной группы в сроках от 6 до 12 недель. Клетки трофобласта были идентифицированы морфологически с последующим подтверждением путем идентификации генов У-хромосомы методом ПЦР в 12 из 28 наблюдений, что составило 42,9%. Во всех 12 наблюдениях после рождения был подтвержден мужской пол новорожденного. Достигнутые результаты позволяют

предположить, что получение клеток трофобласта из цервикальных образцов беременных женщин в первом триместре может быть в будущем использовано для выявления количественной и структурной хромосомной патологии плода. Преимущества данного метода - неинвазивность, возможность выявления аномалий на ранних сроках и быстрота анализа.

Рис. 4. Динамика роста показателей SRY и DYS-14 у пациенток основной группы с последующим развитием преждевременных и своевременных родов.

Другим аспектом работы явилось неинвазивное определение резус-принадлежности плодов у резус-отрицательных беременных женщин.

В этой связи нами было проведено неинвазивное определение резус-D гена плодов по крови 120 резус-отрицательных беременных женщин в сроках от 8 до 20 недель беременности методом ПЦР в режиме реального времени. В 48 наблюдениях кровь плода была определена, как резус-отрицательная. Этот результат был подтвержден после рождения детей иммунологическим методом во всех случаях, ложно-негативных результатов не было. При анализе результатов у 60 новорожденных, которым внутриутробно был выявлен положительный резус-D ген, было отмечено 2 несовпадения -кровь детей после рождения была определена, как резус-отрицательная, в одном случае подобный результат получен при кордоцентезе и после рождения ребенка.

При повторном исследовании крови этих детей методом ПЦР вновь был получен повторный положительный результат на наличие ДНК резус-D гена. По-видимому, в данном случае мы имеем дело с так называемым «слабым» резус-D геном, который встречается среди резус-отрицательных женщин в европейской и российской популяциях с частотой 4-5 % [Радзинский В.Е., 2004, ACOG practice bulletin, 2006].

В III триместре беременности отмечалось нарастание титра резус-антител у 11 пациенток. В связи с ухудшением состояния плодов и тяжелой формой гемолитической болезни плодов проводилось внутриутробное переливание ЭМОЛТ, в 6 случаях с положительным эффектом. Во всех вышеперечисленных наблюдениях резус-фактор плода был безошибочно определен как положительный, что было подтверждено иммунологическим методом при кордоцентезе. Определение резус-фактора плода при гемолитической болезни имеет важное практическое значение, так как необходимо проведение дифференциальной диагностики с другими состояниями плода, сопровождающимися отечным синдромом, в частности, неиммунной водянкой плода.

В нашем исследовании у 11 пациенток с рождением ребенка с отечной формой гемолитической болезни плода в анамнезе, при высоких анамнестических титрах резус-антител в течение данной беременности плоды были резус-отрицательными, что позволило избежать ненужных инвазивных процедур и досрочного родоразрешения. Необходимо отметить, что титр резус-антител не может быть критерием тяжести гемолитической болезни плода при предшествующей сенсибилизации, более того, он может нарастать даже при отрицательной резус-принадлежности плода в течение данной беременности. Определение резус-D гена в таком случае является исключительно важным, так как помогает избежать инвазивных процедур (амниоцентеза, кордоцентеза)

для оценки степени тяжести гемолитической болезни плода при высоких титрах антител и отрицательном резус-факторе плода.

Анализ качества определения резус-Э гена плода у резус-отрицательных беременных женщин показач, что чувствительность метода составила 96,6%, специфичность 100%.

Резус-фактор плода был определен как отрицательный в 52,8% случаях (19) у повторнобеременных несенсибилизированных женщин, в 46,5% наблюдениях (20) у первобеременных несенсибилизированных женщин, что позволило оптимизировать тактику ведения беременности этих пациенток, избегая профилактики резус-иммунизации во время беременности. Диагностических ошибок у данной категории беременных не было.

На основании проведенного исследования показана возможность неинвазивного определения резус-Э гена плода по периферической крови женщины с 8 недель беременности. Данная методика позволяет выработать правильную тактику ведения беременности, как у несенсибилизированных, так и у сенсибилизированных резус-отрицательных женщин. Определение у пациенток резус-отрицательной принадлежности крови плодов позволяет снизить затраты на ведение беременности, избежать многократного определения резус-антител, назначать профилактическое введение антирезус иммуноглобулина только при положительной резус-принадлежности плода.

У резус-сенсибилизированных женщин определение резус-Э гена плода помогает избежать ненужных инвазивных диагностических и лечебных процедур при отрицательной резус-принадлежности крови плода. В случаях положительной резус-принадлежности плода дает возможность на ранних сроках оценить риск развития гемолитической болезни плода, своевременно начать проведение лечебно -профилактических мероприятий.

В целом, предложенные методики позволяют неинвазивным способом с высокой чувствительностью и специфичностью определять резус-принадлежность, пол плода, прогнозировать развитие гестационных осложнений, начиная с первого триместра беременности.

ВЫВОДЫ

1.При анализе клинико-анамнестических данных устаноатено, что пациентки с привычным выкидышем и неосложненным течением беременности были сопоставимы по возрасту, характеру менструальной функции, частоте соматических заболеваний. Отмечено статистически значимое различие в частоте воспалительных заболеваний органов малого таза у женщин с привычным выкидышем (31,1%) по

19

сравнению с пациентками контрольной группы (13,6%) - р<0,05. Отмечена высокая частота осложнений первого триместра в виде угрожающего и начавшегося выкидыша у женщин основной группы (59,8%). Установлено, что у беременных с привычным выкидышем уровни клеток с киллерной цитотоксической активностью СЭ16+ в 1,9 раз и СЭ56+ в 1,7 раза превышали аналогичные показатели в группе контроля (р<0,01).

2. Выявлена циркуляция свободной эмбриональной ДНК в периферической крови беременных женщин, начиная с 6-й недели беременности. Установлен прирост уровней сэ-ДНК с увеличением срока беременности при физиологическом и осложненном течении гестационного процесса. Установлена сильная прямая корреляция между высокими уровнями Ж клеток с цитотоксической активностью и сэ-ДНК в периферической крови женщин на ранних сроках осложненной беременности, что указывает на взаимосвязь клеточной киллерной активности материнского организма с апоптозом клеток трофобласта.

3. Определение сэ-ДНК в периферической крови беременных с 6 до 12 недель позволяет правильно установить пол плода в 99% случаев, что является диагностически значимым методом при сцепленных с полом заболеваниях, адреногенитальном синдроме, расхождении полового генотипа и фенотипа (чувствительность теста составляет 99,2%, специфичность 98,9%, точность метода 99,1%). Проведенный проспективный анализ показал, что беременности плодами мужского пола сопровождаются достоверно большим числом осложнений и относятся к беременностям высокого риска.

4. Высокие уровни сэ-ДНК в периферической крови матери свидетельствуют о повышенном риске ранних и поздних гестационных осложнений, ассоциированных с нарушениями плацентации - самопроизвольного прерывания беременности, плацентарной недостаточности, задержки роста плода, досрочного родоразрешения.

5. Выявление клеток трофобласта и эмбриональной ДНК в отделяемом цервикального канала в I триместре беременности методом жидкостной цитологии позволяет использовать полученный материал для неинвазивной пренатальной диагностики.

6. Доказана диагностическая значимость неинвазивного определения резус-0 гена плода по периферической крови женщины с 8-й недели беременности, что позволяет выработать правильную акушерскую тактику как при наличии, так и при отсутствии резус-сенсибилизации (чувствительность метода 96,6%, специфичность 100%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У женщин с высоким риском сцепленных с полом заболеваний рекомендуется неинвазивное определение пола плода в I триместре для уточнения целесообразности проведения инвазивной пренатальной диагностики и оптимизации дальнейшей тактики ведения беременности. Неинвазивное определение пола плода показано при подозрении на АГС, при неясном поле плода по данным УЗИ для выработки оптимальной терапевтической программы антенатального наблюдения и терапии после родоразрешения. Определение пола плода методами неинвазивной пренатальной диагностики влияет на акушерскую тактику в следующих клинических ситуациях: при сцепленных с полом заболеваниях, при риске врожденной гиперплазии коры надпочечников, при неясной половой принадлежности плода по данным УЗИ, при аномалиях, развития мочеполовой системы и генетических синдромах.

2. Определение резус-Б гена плода по периферической крови рекомендуется всем несенсибилизированным резус-отрицательным женщинам при наличии беременности от резус-положительного партнера с целью выработки показаний для антенатальной профилактики резус-иммунизации. Установление резус-отрицательной принадлежности крови плода снижает затраты на ведение беременности, позволяет избежать многократного определения резус-антител, не проводить антенатальную профилактику резус-иммунизации.

3. При ведении беременности у резус-сенсибилизированных женщин неинвазивная диагностика резус-отрицательной принадлежности крови плода позволяет избежать ненужных инвазивных диагностических и лечебных процедур и определить правильную тактику ведения беременности и сроки родоразрешения.

4. Высокие значения уровней сэ-ДНК в I триместре беременности являются неблагоприятным прогностическим фактором ранних и поздних гестационных осложнений и должны служить основанием для расширенного клинико-лабораторного обследования, углубленного мониторинга и подбора терапии.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сухих Г.Т., Трофимов Д.Ю., Баранов И.И., Тетруашвили Н.К., Файзуллин Л.З., Донников А.Е., Карнаухов В.Н., Федорова Н И. Научное обоснование применения малоинвазивных технологий пренатального генетического определения резус-фактора плода с целью предотвращения развития патологии плода и новорожденного. Методические рекомендации МЗ РФ. М. - 2011. - 24с.

2. Федорова H.H.. Карнаухов В.Н., Файзуллин Л.З., Тетруашвили Н.К. Эмбриональные ДНК в плазме крови, как факторы риска потери беременности. //Материалы V Международного Конгресса по репродуктивной медицине. - 2011. - М., - С. 78-79.

3. Коган Е.А., Файзуллина Н.М., Демура Т.А., Федорова Н.И., Карнаухов В.Н. Выявление фетальных клеток в эндоцервикальных образцах беременных женщин, как метод неинвазивной пренатальной генетической диагностики. //Материалы V Международного Конгресса по репродуктивной медицине. - 2011. - М., - С. 30.

4. Федорова Н И.. Тетруашвили Н.К., Файзуллин Л.З., Карнаухов В.Н., Сидельникова

B.М. Использование неинвазивного метода определения резус-принадлежности плода в ведении резус-отрицательных беременных женщин. //Материалы IV Международного Конгресса по репродуктивной медицине. - 2010. - М„ - С. 131-132.

5. Федорова Н И.. Тетруашвили Н.К., Демура Т.А., Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Значение эмбриональных клеток, выделенных из цервикального канала в ранней неивазивной пренатальной диагностике //Акушерство и гинекология. - 2010. - №1. -

C. 28-31.

6. Файзуллин Л.З., Карнаухов В Н., Федорова Н И.. Тетруашвили Н.К., Умбрумянц Д.В., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Метод ПЦР для пренатальной диагностики резус-фактора плода по периферической крови матери //Клиническая лабораторная

диагностика. -2010. -№11.-С. 4143.

7. Федорова Н И.. Тетруашвили Н.К., Файзуллин Л.З., Карнаухов В.Н. Неинвазивная пренатальная диагностика на ранних сроках беременности: определение резус-принадлежностн плода. Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний. //Материалы XXIII Международного конгресса с курсом эндоскопии. - 2010. - М., - С. 120.

8. Федорова Н И.. Тетруашвили Н.К., Файзуллин Л.З., Карнаухов В.Н., Умбрумянц Д.В., Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Определение резус-принадпежности плодов по крови резус-отрицательных беременных женщин //Антибиотики и химиотерапия. -2009. Спецвыпуск. - Т.54, № 34. - С. 158-159.

9. Федорова H.H.. Тетруашвили Н.К., Файзуллин Л.З., Карнаухов В.Н., Умбрумянц Д.В., Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Неинвазивная диагностика резус-принадлежности плода по крови матери на ранних сроках беременности //Вестник РУДН.-2009.-№6.-С. 137-141.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АГС - адреногенитальный синдром

АФС - антифосфолипидный синдром

ВА - волчаночный антикоагулянт

ВЗОМТ - воспалительные заболевания органов малого таза

ГБН - гемолитическая болезнь новорожденных

ДВС - синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания

ДНК - дезоксирибонуклеїновая кислота

ЗРП - задержка развития плода

ПНБ - привычное невынашивание беременности

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СПКЯ - синдром поликистозных яичников

сэ-ДНК - свободная эмбриональная ДНК

УЗИ - ультразвуковое исследование

ЭМОЛТ - эритроцитарная масса, обедненная лейкоцитами и тромбоцитами

ОУЭ-М - ген У-хромосомы

НЬА - лейкоцитарные антигены человека

НЬА-С - лейкоцитарные антигены человека-в

МК - натуральные киллеры

511У-пол-детерминирующий район У-хромосомы

АЛГОРИТМ ОБСЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОК С ПРИВЫЧНЫМ ВЫКИДЫШЕМ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ СЭ-ДНК В ПЕРВОМ ТРИМЕСТРЕ БЕРЕМЕННОСТИ

АЛГОРИТМ ВЕДЕНИЯ РЕЗУС-ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ЖЕНЩИН, БЕРЕМЕННЫХ ОТ РЕЗУС-ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО ПАРТНЕРА, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ПЛОДА

Отпечатано в ООО «Форза» Заказ №297/6п, 1,0 пл. Формат 60x90 1/16тираж 100 Подписано в печать 15.05.2012