Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Рациональные подходы к сочетанию химиотерапии со стероидными гормонами и оксикобаламином при лечении злокачественных опухолей

п" 3 Л Г, РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НШ 41 ОНКОЛОГИЧЕСКИЛ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

- /Г

(НУ Iй,Чг'

' "' ч" 1 На правах рукописи

УДК- 618.146+618.19] -006. 04-085. 28-092. 9

КУБАСОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА

РАЦИОНАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К СОЧЕТАНИЮ ХИМИОТЕРАПИИ СО СТЕРОИДНЫМИ ГОРМОНАМИ И ОКСИКОБАЛАШНОМ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЯ

(14.00.14 - Онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1994

> / •

/ -': /

Работа выполнена в Онкологическом научном центре Российской Академии-медицинских наук

Научные руководители:

доктор биологических наук 3. П. Софьина

доктор медицинских наук Е Е. Кушшнский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л. Б. Горбачева доктор медицинских наук, профессор И. Е Шддубная

Ведущая организация - Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П. А. Герцена МЗ РФ.

Защита диссертации состоится " " Л^&Я- _1994 г> в

часов на заседании Специализированного совета (К. 001.17.01.) по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Онкологическом научном центре РАМН (Москва, 115478, Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан " 1994 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического научного центра РАМН.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук,

профессор В. С. Турус<

- 3 -АКТУАЛЬНОСТЬ ÎEMU

В последние годы комбинированная химиотерапия заняла ведущее место в лечении солидных опухолей, в том числе таких, как рак молоч-. ной железы, опухоли яичка, мелкоклеточный рак легкого, ряд опухолей у.детей. Однако во многих случаях результаты применения нескольких препаратов не оправдали ожиданий, приводя даже к снижению терапевтического эффекта (Krafft W., 1989; Averette H. Е. и соавт, 1991).

В связи с этим не теряют актуальности экспериментальные разработки каждой конкретной комбинации препаратов с учетом особенностей не только фармакодинамикн лекарственных средств, но и особенностей метаболизма, клеточной кинетики нормальных и опухолевых тканей.

Основной задачей при разработке оптимальных схем лечения опухолей является повышение избирательности химиотерапевтических препаратов, которая достигается при усилении противоопухолевого или уменьшении их токсического действия.

В настоящее время существует ряд способов повышения ингибирую-щего эффекта химиопрепаратов на опухолевые клетки. Выделяют несколько уровней избирательности действия химических соединений: различия в клеточной кинетике, отличия в фармакокинетике препаратов между нормальными и опухолевыми тканями, тканевоспецифические и опухолево-специфические факторы, определяющие более высокую чувствительность опухолевых клеток (Holland J. G. и соавт. , 1989; Tahara Е., 1991).

Известно, что эффективность действия большинства противоопухолевых препаратов возрастает с увеличением скорости пролиферации . (Е. Г. Киселева и соавт., 1985; Mattem J. и соавт., 1986; Bruyan B.K. и соавт., 1989). Поэтому опухоли, в которых интенсивность пролиферации выше, должны быть более чувствительными к цитостатическим агентам.

Однако, распределение клеток по циклу в опухолях животных и человека значительно варьирует. Так, средняя ростовая фракция серии опухолей молочной железы человека колеблется от 4% до 24%, она является намного меньшей, чем в культивируемых клетках, указывая на то, что большинство клеток этих новообразований находятся в G0(Conte P.P. и соавт., 1985). Пролкферативный пул большинства опухолей животных составляет ЮХ-100%, а при росте опухолей в солСгной форме обычно ниже, чем в асцитных опухолях (О. С. Франкфурт, 1975).

Это указывает на возможность усиления гибели опухолевьэс клеток

путем изменения состава клеточной популяции. В частности, избирательность действия противоопухолевых препаратов может быть увеличена в результате стимуляции размножения клеток в опухоли. Однако попытки усилить противоопухолевый эффект, .используя стратегию стимуляции пролиферации в терапии гормоночувствительных опухолей с помощью соответствующих гормонов в большинстве случаев не привели к успеху. Актуальным является выяснение причин этих неудач.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Hczi кастсягрго нссл^лпияиия - изучение подходов, позволяющих усилить противоопухолевое действие алкилирующих препаратов путем их комбинированного применения с модификаторами пролиферации: гормонами или оксикобаламином.

Для достижения вышеуказанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать адекватные модели для настоящего исследования. Оценить гормоночувствительность ряда экспериментальных опухолей молочной железы (Ca-755, БМР(п), KCMJI) и шейки матки (РШМ-5). Для этого изучить содержание в их цитозольной фракции рецепторов эстрогенов (РЭ), глюкокортикоидов (РГ), андрогенов (РА), прогестерона (РП), а также изменения функции яичников у мышей после перевивки этих опухолей методом определения эстральных циклов.

2. Исследовать влияние физиологических доз потенциальных стимуляторов пролиферации синэстрола и оксикобаламина на рост опухолей (Ca-755 и РШЫ-5) мышей на поздних стадиях их развития (7 сутки после перевивки).

3. Изучить противоопухолевое действие широко применяемых цикло-вависимых цитостатических препаратов циклофссфана и схемы CUF (цик-лофосфан, 5-фторурацил и метотрексат) при их комбинированном применении со стимуляторами пролиферации - синэстролом или оксикобалами-ном, для лечения экспериментальных злокачественных опухолей (Ca-755 и РОД*-5).

4. Оценить изменение уровня включения 3Н-тимидина в ДНК клеток Ca-755 и РИМ-5 как показателя пролиферации и уровня специфического связывания эстрадиола-17р с рецепторами в цитозольной фракции опухолей после проведения различных этапов комбинированной терапии.

5. Изучить противоопухолевое действие антиэстрогена тамоксифена

- б -

при лечении Са-7Б5 и РИМ-5. Разработать оптимальный режим комбинированного применения тамоксифена с циклофосфаном.

6. Исследовать влияние ингибирующих пролиферацию доз гормонов (тамоксифена, преднизолона, прогестерона) на противоопухолевую ак-' тивность цитостатика циклофосфана при лечении мышей с аденокарцино-мой молочной железы (Са-755).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые изучено содержание рецепторов стероидных гормонов СРЭ, РП, РГ, РА) в экспериментальных перевиваемых опухолях молочной железы (Са-755. ВВДп), КСМЛ) и раке шейки матки (РШМ-5) мышей в равные сроки после перевивки опухолей, с учетом стадий астрального цикла, в разные часы суток. Выявлены околосуточные колебания уровня РЭ в Са-755 и РШМ-5, которые изменялись противоположно уровню включения 5Н-тимидина в ДНК клеток опухолей. Эти колебания сохранялись после проведения стимулирующей и цитотоксической терапии, однако ритм этих .колебаний изменялся.

Показано, что развитие опухолей молочной железы (Са-755, ВМР(л). КСМЛ) приводило к угнетению функции яичников у животных, прямо пропорционально скорости роста новообразований, тогда как перевивка РШМ-5 вызывала повышенную эстрогенизацию организма.

Показано, что опухоли Са-755 и РШМ-5 относятся к гормоночувст-вительным и могут быть использованы в качестве моделей рака молочной келезы и рака шейки матки при разработке комбинированной терапии .гормонами в сочетании с химиопрепаратами.

В работе экспериментально изучено комбинированное воздействие на опухоли стимуляторов клеточного деления (синэстрола или оксикоба-ламина) с последующим введением циклозависимых препаратов. Показано, что подобная схема комбинированного лечения должна быть строго индивидуализирована.

- Доказана возможность усиления противоопухолевого действия циклофосфана путем его комбинированного использования с тамоксифеном при лечении РШЫ-5, а также с тамоксифеном, преднизолоном и прогестероном при лечении Са-755. При этом, наиболее обоснованной представляется схема лечения терапевтических« дозами вышеуказанных гормонов, которая следует за цитотоксической терапией.

Представленные в диссертационной работе данные свидетельствуют

о целесообразности клинического испытания разработанных комбинаций циклофосфана с последующим введением тамоксифена, предниводона и прогестерона при лечении рака молочной железы.

Большая эффективность разработанной схемы возможна у больных в глубокой менопаузе или с предварительно подавленной'функцией яичников, а также при небольшой массе опухолевой ткани.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация апробирована на совместной научной конференции отдела экспериментальной х™нотеря.пии опухолей, лабораторий клинической биохимии и экспериментальной эндокринной терапии опухолей, отделений гинекологии и опухолей молочных желез, отделений клинической фармакологии и химиотерапии опухолей НИИ клинической онкологии ОВД РАМН 17 декабря 1993 года.

Материалы диссертации представлены: на 3 Всесоюзном совещании "Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей", Ногинский научный центр РАМН, Черноголовка (1987); на проблемной комиссии "Лекарственные методы лечения злокачественных опухолей", Москва (1991); на заседаниях Ученого совета НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМН в 1988 г. и в 1993 г.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на "^страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований (5 глав), обсуждения и выводов, иллюстрирована УЗ рисунками и таблицами. Список литературы включает 19?. работ. •

МАТЕРИМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. В работе использованы мыши инбредных линий, а также их гибриды, полученные из питомника "Столбовая" РАМН и ив разведения' ОНЦ РАМН.

Экспериментальные перевиваемые опухоли мышей получены из банка опухолевых штаммов ОНЦ РАМН. Раки молочной железы:' Са-755 - альвеолярная аденокарцинома молочной железы мышей С57В1/6 со слабо выраженным клеточным полиморфизмом; ВМР(п) - высокометастазирующий анап-лааированный солидный рак и КСМЛ - карцинйсаркома, иетастазирушая ь

лепоте (недифференцированный рак с массивными участками саркомоподо-бного роста) мышей A/snell. Плоскоклеточный рак шейки матки мышей СВА - РИМ-5.

Лекарственные средства В работе использованы противоопухолевые препараты в терапевтических для мышей дозах: циклофосфан Саранского фармэавода в дозе 100 мг/кг х 2/96 час или 200 мг/кг однократно, 5-фторурацил Дарницкого химфармзавода (100 мг/кг х 1), метотрексат' Уфимского витаминного завода (15 мг/кг х 1). Антиэстроген тамоксифен ("Зитазониум") фармэавода ЭГИС (Венгрия). Гормоны: синэстрол, прогестерон Швокуэнецкого химфармзавода, преднизолон ("Gedeon Richter", Венгрия). А такие оксикобаламин Ленинградского химфармобъединения "Октябрь". Режимы введения и дозы препаратов указаны при описании результатов.

Химиотералевтические методы. Опухолевые штаммы .прививали син-генныы животным подкожно в правую подмышечную область каждой мыши по 50 мг опухолевой взвеси в среде 199 в разведении 1:10, около 5 х 107 клеток. Действие исследуемых препаратов оценивали по критериям: тор-мопзние роста опухоли, увеличение продолжительности жизни животных. Токсичность комбинаций оценивали по ранней гибели мышей.

Методика исследования функции яичников у мышей.

функцию яичников оценивали с помощью изучения астральных•циклов (ЯП Кабак, 1968), которые отражают регулярно повторяющиеся изменения половой системы самки и обусловлены согласованным взаимодействием гормонов яичников (эстрогенов, прогестерона) и гонадотропных .гормонов гипофиза (ЮГ и ЛГ). Методика основана на том, что каждой фазе полового цикла соответствует определенный клеточный состав влагалищного содержимого (факт открыт Звансом и Лангом у крыс в 1920 году, Аллеиом у мышей - в 1922 году).

Определение рецепторов стероидных гормонов в цитозольной фракции опухолей проводили в лаборатории клинической биохимии ОЩ РАИН радиолигандным методом (Л. С. Бассалык и соавт., 1987).

Содержание рецепторов стероидных гормонов вычисляли по разности между общим и неспецифическим связыванием лигандов с рецепторами в цитозольной фракции опухолей и выражали в фемтомолях гормона, специфически связанного в 1,0 от общего белка. Границе^ рецепторополо- ч-тельности считали 10 фмоль/мг цитозольного белка. Белок определяли по методу Лоури.

Исследование пролиферативной активности клеток опухолей методом краткосрочных переживающих культур.

Для оценки влияния препаратов на пролиферативную активность клеток опухолей в работе использовали модифицированный метод краткосрочных переживающих культур, предложенный Li С. Р. и соавт. (1930) и Malt land M. С. и соавт. (1931). Эффект препаратов оценивали методом радиометрической индикации на основании разного уровня включения опухолевыми клетками3Н-тимидина в ДНК (Я.В. Добрынин и соавт., 1974).

Фрагменты опухолевой ткани инкубироьали в питательной среде с меченым тритием тимидином (3 jnCu/мл). Экстрагирование из клеток ну-клеотидов проводили на ЬОДИНиЙ иаие > -.i/ipaxepMuOïâïâ УТ-IG. Гадкоак тивность образцов измеряли на сцинтилляционном _р-счетчике Mark-111 ("Traoor Analytic", Голландия).

Содержание нуклеиновых кислот в материале определяли спектрофо-тометрически на СФ-16. Рассчет производили в соответствии с методом А. С. Спирина (1958) по разности величин абсорбции при длине волн 270 и 290 мкм. Показатель интенсивности включения в ДНК клеток меченого предшественника определяли в распадах за 1 мин на 1 мкг нуклеиновых кислот.

Статистическую обработку результатов проводили по методу Оише-ра-Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рецепторы стероидных гормонов в экспериментальных опухолях молочной железы и шейки матки мышей

На основании анализа полученных результатов для дальнейших исследований были отобраны рак молочной железы Са-755 и рак шейки мат-» ки РШМ-5. Эти опухоли в большем проценте случаев были рецепторополо-жительными и чаще содержали несколько видов рецепторов стеооидных гормонов, чем КСШ1 и ВМР(п).

•Установлено, что РЭ были обнаружены в 447. опухолей Са-755, РГ определялись - в 45%. Значительно более редко выявлялись РА в опухолях и отсутствовали РП (табл. 1). В РШМ-5 РЭ определялись в 45* опухолей, РГ найдены в 34% , 19% опухолей оценивали как РА+ и во всех опухолях отсутствовали РЕ Экспериментируя со спонтанными и индуцированными опухолями молочной железы мышей, Н. С. Картавова и соавт.

Таблица 1

Содержание рецепторов стероидных гормонов $ опухолях Са-755 и РШМ-5 у мышей

1 1 | Уровень рецепторов стероидных гормонов, (фмоль/мг белка. Mim) |

Г 1 1 | Штамм |Число наЧ Iопухоли)блвдений | f 1 1 P3 РГ PA ' |

1 I I ICa-755 | 102 | I I 1 ■ ■ i 20±1.4 ( 44Z ) 39i7,6 ( 45X ) 18±1,5 | ( 22Z ) |

t , j | | РШМ-5 | 60 | 1 1 1 i . ,. ..•„.,. J______ ...,.._■. ,„i _ 2412,4 ( 45Z ) 32*6,2 ( 34Z ) 24±3,4 1 ( 19X ) |

Примечание: в скобках указан X рецептороположительных опухолей.

.(1983) также не обнаружили высокого содержания эстрогенсвязываюше. о белка: количество РЭ+ опухолей составило 7,7%, а после введения ДМБА - 28.55:.

Принимая во внимание возможность эндокринных влияний на связывание эстрадиола-17р с рецепторами в ткани опухоли (ЕЕ Сергеев и соавт., 1990; У711тко & и соавт, 1980; Баег Б. и соавт., 1984). было

РЭ, 25] (фмоль/мг 30-) белка)

Са-755 РШМ-5

d рг рг + +

рг ое

стадии

астрального

цикла

Рис. 1. Содержание РЭ в опухолях Са-755 и РИЛН5 у мышей, находящихся в разных стадиях астрального цикла

проведено определение уровня РЭ в Са-755 и РИМ-5 в разные фазы астрального цикла. В РШМ-5 в проэструсе <рг) РЭ отсутствовали, тогда как в Са-755 уровень РЭ снижался лишь к концу фазы астрального цикла. В диэструсе (с1) оба вида опухолей содержали РЭ (рис. 1). Полученные результаты согласуются с высоким уровнем митотической активности эпителия матки в рг и нивким в с1 (С.С. Лагучев, 1970). Известно также, что у животных эстрогены в '-рови резко возрастают в рг и остаются высокими в эструсе (ое) (ЕМ. Туркевич, 1982), в с1 они быстро снижаются до минимума.

Обнаружены околосуточные колебания уровня РЭ в Са-755 и РШМ-5. Повышение РЗ в опухолях ной ладились в ¿4.00 чаи, тигда как и утреннее время (9.00 час) РЭ снижались (рис. 2).

Рис. 2. Околосуточные изменения уровня РЭ и включения 3Н-тиыидина • в ДНК клеток Са-755 и Р1Ш-5 на 8-9 дни после перевивки.

Показано, что пролиферативная активность опухолевых клеток изменялась в течение суток в обратном направлении, относительно содержания РЭ. Так, уровень включения 3Н-тимидина в ДНК клеток опухолей повышался в утренние часы и снижался в ночное время.

Изменение функции яичников у мышей с- различными опухолями

Для более полной характеристики отобранных моделей было обсле-

довано влияние перевиваемых опухолей на гормональные взаимоотношения в организме мышей-носителей. В экспериментах показано, что Са-755 и РШМ-5 по-разному влияли на функцию яичников. По мере роста Са-755 возрастало число, животных, находящихся в <1, а также продолжительность этой фавы по сравнению с интактными мышами (рис. 3). У части животных прекращался астральный цикл. Полученные данные свидетельствуют о подавлении функции яичников и снижении зстрогенизации организма при развитии Са-755.

67Х|

Z 100-J 10 день после перевивки 9СН

ОД d 70-1 60-1 '5СН 40Н 30-1 20-J ICH

I_L-

20 день после перевивки d

I 09

|ЗЗХ|

d

|-1

|56Х| ое

'б 77.\

ое

|26Z|

I

Са-755

интактные Са-755 интактные С57В1/6 057В1/6

Рис. 3. Число животных в ое и (1 (!) в разные сроки после перевивки Са-755.

Клинические исследования последних лет также показывают, что у больных раком молочной железы в 75,6% наблюдений имеются изменения, в яичниках в виде фолликулярных кист, гиперплазии стромы, при этом клиническое тепение рака молочной железы у больных репродуктивного возраста находится в достоверно'й корреляционной зависимости с состоянием фолликулярного аппарата яичников (С. К Наварина, 1979).

В отличие от Са-755, РШМ-5 на протяжении большей части периода своего роста вызывал повышенную эстрогенкзацию организма, на что указывает увеличивание числа мышей с длительным ое (табл. 2).

Известно, что развитие опухолей тела маткиОЯ.В. Бохман и со авт., 1988) и шейки матки (Л Ораэбаева, 1970) в большинстве случаев обусловлено относительной гиперэстрогенизацией, возникающей на Фон*

Таблица 2

Изменение показателей астрального цикла мышей СБА после перевивки опухоли Р11М-5

1 |Фаза 1 День | Длительность фаз астрального цикла, 1 ■ дни, Шда |

после | ( % наблюдений )

|цикла пере- | Мыши с ■ РИМ-5 I Интактные самки СБА I

вивки | 1-5 | 1 6т 10 | 1 1-5 6-10 |

ю ! 1 2.5Ю.1 1 1 6.8*0.5 | 2,0±0,1 6,810,5 |

1 с! (90+2,92:) | (1012,9^) | (5813,1%) (4211,8%) |

20 | 2,5+0,2 | 7,2+0.3 | 1,510 8,2±0,4 |

(80+3, П) | (20+5,3%) | 1 (58+3,1%) (4211,8%) |

. 10 | 1 3,410,4 | 1 6,8±0,4 1 3,1±0,2 1

| ое (7814,5%)* | (22+4,5%)* | (100%)

20 | 3,2±0,7 | 8,210,9 | 3,2±0,1 7,510,3 |

1 1 (31+6, ЭХ)" | 1 (6916,9%)* | (6713,5%) (3313,5%) . | 1

Примечание: представлены данные 4 опытов (127 мышей), х -различия между показателями на 10 и 20 дни достоверны, р<0,05.

дефицита,прогестерона. У больных предраком и раком шейки матки во всех возрастных группах повышена экскреция эстрадиола-17р с мочой (3. Тогайбаева, 1970).

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что исследованные перевиваемые опухоли мышей Са-755 и Р1Ш-5 относятся к гормоно-чувствительным и могут быть использованы в качестве моделей для разработки возможных путей повышения эффективности действия цикдозави-симых цитостатиков при лечении аналогичных опухолей.

Изучение стимулирующего действия синэстрола и оксикобаламина на Са-755 и РШМ-5 Для обоснования схемы комбинированного использования химиопре-паратов со стимуляторами пролиферации нами предварительно было изучено влияние малых доз синэстрола и оксикобаламина на рост опухолей. Предполагалось, что синэстрол будет стимулировать размножение

астрогенчувствительных клеток, а оксикобаламин - гормононечувстви-тельных.

lis работ О. IL Епифановой (1965), Dickson R. В. и соавт. (1986), Friedly А. и соавт. (1989), Dauvois S. и соавт. (1990), известно, что эстрогены стимулируют деление клеток, увеличивая ростковую фракции опухолей в 2-3 раза, ускоряя прохождение фаз S и Gy в 1,5 раза, увеличивая пролиферативный пул в 3-5 раз.

Для метил- и оксикобаламинов ЕЕ Мясищевой и соавт. (1986), показано, что они способны вызывать стимуляцию роста некоторых эксперт,«ентальных опухолей, выводя покоящиеся клетки в митотический цикл, увеличивая пролиферативный пул Са-755 на 30%.

Таблица 3

Включение 3Н-тимидина в ДНК клеток Са-755 и РШМ-5 после введения синэстрола на 7-8 сутки роста опухоли

Время |Доза:мкг| Включение 3Н-тимидина, (DPM/мин на мкг нуклеин, к-т/мл,

1/щщьхчи-(__ Mim)__

года |сло введ.| 24 часа после стимуляции | 48 часов после стимуляции |/ час | Контроль |Синэстрол j X | Контроль |Синэстрол| X

_I_I_I_I_i-

Са-755

824*18,0 |1007±37,8 | +221 313*77,9 | 771±81,3|+146' 586*103,D |1494*170,7|+15^ 775*65,9 |1032±76,7| +33* 816186,7 |1365*113,4| +б/| 234*37,3 |941±194,2|+302х 3606*141,611743*148,6 Г-5211041*213,611280±98,71 +23 26311221,4|3144t499,2I +2012867+225,113087*133,8 +8

зима (XII) лето (VIVID весна (IV)

227*40,5 94113,2 691*49,0 404*10,5 154*23,0 477* 5.5 598*96,2

РШМ-5 I 223*15,5 I 596*72,8 I 368*31,3 I 441*19,6 I 172*21,5 I 628*50,6 I 249*35,4

I -2| 629*49,4 1+5371 319*32,9 I -4?1 207±51,6 I +9| 335*16,7 Г +121 86+23,8 I +32| 460+34,8 I -5£f| 144Ü7&

I 286*40,91 -55*

I 379*55,61 +19

I 911 8,7| -56

I 502l53,2| +5tf

I 20*3,3 I -77 |1029*65,2|+124"

I 140*43,21 -3

х - достоверно к контролю (р<0,05).

С помощью метода определения интенсивности включения лН-тимиди-на в ДНК опухолевых клеток обнаружено, что после двухкратного введения синэстрола в дозе 5 мкг/мышь в опухоли Ca-755 возрастало число ДНК-синтезирукяцих клеток. Статистически значимое повышение уровня включения 3Н-тимидина на 33X-302X по сравнению с контролем (р<0,05) наблюдалось в опытах через 24-48 часов после введения препарата (табл. 3).

При увеличении доэы гормона до 10 мкг/мышь двухкратное применение препарата практически не изменяло число клеток в S-фазе.

Кпелвние синэстрола мышам с Р1Ш-5 в дозе 5 и 10 мкг/мышь х 2/24 часа достоверно увеличивало интенсивность включения *н-тиыидина по сравнению с контролем в единичных опытах череа 24 - 48 часов после стимуляции. Шлучеиные нами результаты подтверждаются данными

Таблица 4

Включение 5Н-тимидина в ДНК клеток Ca-755 и PUM-5 после введения оксикобаламина в дозе 0,01 мг/мышь х 3/24 часа

Включение3Н-тимидина.(0Р1А/мин на икг нуклеиновых к-т/мл, Mim)

Время Непосредств. после стимуляции | 24 часа после стимуляции

года Контроль |Оксикобаламин|Х к К| Контроль § 1 1 |Оксикобаламин|Х к К > 1

Ca-755

весна 36Q6il09,7| 21251228,7 | -41 |1041±191,3| 1220*142,6 | +17

(IV) 5861103,9| 12281 65,3 |+110*| 775165,9 | 6001 39,2 | -23

лето 1409±126,3| 26571220,6 | +89*|1547l96,2 | 12291102,1 1 "21

982191,9 | 25611 47,5 1+161*11608150,5 I 12071 99,1 | +25

662186,2 | • 4311201,5 1+117"\ ■ 1 1 | 1 |

РШМ-5

осень 315l96,2 | 152132,1 | -61* Г 612130,8 | 439113,1 | -28

( X ) 129113.< | 152132,1 | +77*1 1 1

237*21,1 | 322120,5 | +36*| 1 I

зима 365150,0 | 219121,8 | -40 | 888175,7 | 642146,4 | -28

( 1 ) 231+18,2 | 210136,3 |-9| 1 1

________ 277140,2 | 314117,4 | +13 | 327148,5 > | | 502156,2 L | +54

х - достоверно по отношению к контролю,' р<0,05

200СН

8

3

I

1000-1

зорен __

Контроль

Оксикобаламин

~1-1-1-1-1-1-т-1-1-г-

9 12 15 18 21 24 3 . 6 9 12 часы суток

Контроль

ОксикоОаламин

т-1—ч-1-1-1-1-1-1-г

9 12 15 18'.' 21 24 3 6 9 12 часы суток

ЗОСХИ

200СН

100СЧ

Контроль о Оксикобаламин

1-г~.—I-1-1-1-1-1-1—=г~

9 12 15 18 21 24 3 6 9 12 часы суток

Рис. 4. Изменение уровня включения ^гямидйна в ДНК клеток Са-755 после введения оксикобаламина (0,01 мг/мышь х 3/24 часа). | - время введения препарата

3. П. Софьиной и соавт. (1972), показавших, что с увеличением генерации РШМ-5 чувствительность опухоли к эстрогенам снижается.

Оксикобаламин применялся в дозе 0,01 мг/мышь х 3/24 часа. Стимулирующий эффект отмечался непосредственно после введения препарата: интенсивность включения %-тимидина на 89%-161% (для Са-755) или на 36%-77% (для РЩМ-5) превышала соответствующие величины в контроле, р<0,05 (табл. 4).

Показано, что после применения синэстрола или оксикобаламина в Са-755 и РШМ-5 сохранялись околосуточные ритмы синтеза ДНК Стимулирующее действие препаратов проявлялось в течение последующих суток как приростом синтеза ДНК, так и пЬявлением внеочередных пиков включения 3Н-тимидина по сравнению с контролем. Однако, кривая синтеза ДНК зависела от того, на какую исходную фазу этих колебаний приходилось воздействие стимулятора

Так, единственный пик включения3Н-тимидина в ДНК клеток Са-755, как и в контроле, но наступивший раньше контрольного (через 21 час), получен после введения оксикобаламина в 9.00 час утра (рис. 4). Два дополнительных пика (через 6 и 15 часов) получены после введения стимулятора в 12.00 час дня. И один дополнительный пик наблюдался при введении оксикобаламина в 15.00 час (через 12 часов после введения).

На рисунке 5 представлена кривая синтеза ДНК после введения синэстрола мышам с РШМ-5. Достоверный прирост уровня включения^-тими-дина по сравнению с контролем на 1562-495% или 141%-532% наблюдался

после введения синэстрола (10 мкг/мышь х 2/24 часа).

в вечерние и ночные часы (18-6 час) последующих двух суток после стимуляции.

Основываясь на полученных данных по увеличению пролифератиьиий активности клеток опухолей после введения стимуляторов пролиферации, предполагалось повысить ингибируйщий эффект цитостатиков.

Влияние синэстрола и оксикобаламина на противоопухолевую активность цитостатиков при лечении перевиваемых опухолей Са-755 и Р1ИМ-5

Исследования по комбинированноvy применению стимуляторов пролиферации с цитостатиками проводились на поздних, сроках роста опухолей (7 сутки после перевивки). Очевидно, что введение противоопухолевого препарата должно приходиться на ту фазу клеточного цикла,.в которой опухолевые клетки будут наиболее чувствительными к цитотоксическому действию. Известно, например, что циклофосфан первично блокирует клетки в фазе S, увеличивая ее среднюю продолжительность по сравнению с контролем (Pul S. и Coven D.M., 1973; 0.С. Франкфурт, 1976), и ускоряет прохождение клетками фаз Gf и (Е. Г. Киселева и соавт., 1987). Поэтому, при определении времени введения цитостатика мы ориентировались на суточные изменения синтеза ДНК после стимуляции роста опухолей.

Однако, следует отметить, что эффективность стимуляции зависит от многих факторов: доз и режимов введения препаратов, стадии роста опухолей, их индивидуальной чувствительности, времени года, исходного уровня синтеза ДНК, а для синэстрола - и уровня РЭ. Это затрудняет четкое определение момента последующего применения цитостатика, чтобы его воздействие приходилось на ту фазу клеточного цикла, в которой опухолевые клетки будут наиболее чувствительными.

Поэтому в подавляющем большинстве опытов не удалось усилить противоопухолевое действие цитостатиков (циклофосфана и комбинации CI.F) предварительным введением синэстрола или оксикобаламина.

Лишь в одном из большого числа проведенных опытов наблюдалось увеличение противоопухолевого эффекта циклофосфана.на РИМ-5 после предварительного введения синэстрола. Продолжительностъ жизни животных при этом статистически достоверно возрастала с 30% до 62% (табл. 5).

Таблица б

Комбинированное действие синестрола и циклофосфана на рост РШМ-5 мышей СБА

-1-1-1-:-1-

| Доза: мг/кг х IТорможен, роста опухоли. (2 к К) УПЖ| "Р"

Препарат | число, введен. |сутки после окончания леченияк |к цик

I /интервал.час 1 ■ 7 I i 11 1 i 14 |конт|лофос i i

1 Синэстрол 15мкг/мышь * 2/24 1 +41 | 1 +22 | +5 1 1 | -4 |>0,05

»л(1>ллЛои 1 9ПП Y 1 ^»HiW^wiyM.. I --— -- — fifí 1 86* 1 90* 1 30*1

Oyj Син^Циююф! 5 + 200 65* | 88х | 88* | 62х |<0,05

J_I_I_:_I_I_L

х-достоверно к контр., р<0,05. УПЖ-удлинение продолжительности жизни

Таким образом, схема комбинирования стимуляторов пролифератив-ной активности с цитостатиками должна быть строго индивидуализирована, однако практически ее провести нереально. Это,, .по-видимому, и объясняет неудачи применения данного метода лечения в клинике и в опытах in vivo на развившихся опухолях, состоящих из гетерогенной клеточной популяции. Четкие результаты получены лишь при изучении этих вопросов in vitro на синхронно делящихся культурах (Hug V. и соавт., 1986; Clarke R. и соавт., 1987; Emerman J. Т. и соавт., 1990).

Изучение гормональных препаратов в качестве ингибиторов роста опухолей в комбинации с цитостатиками

На основании представленных нами экспериментальных данных и анализа литературы более обоснованной представляется схема, при которой гормональное лечение не физиологическими, а терапевтическими дозами гормонов следует проводит^ после цитостатической терапии.

В этом случае цитостатики "выбивают" из общей популяции опухолевых клеток те, которые наиболее активно пролиферируют. Эти же клетки оказываются наименее чувствительными к гормонотерапии, так как в них содержится наименьшее количество рецепторов стероиднЬа гормонов. Кроме того, цитостатики снижают пролиферативный потенциал и тех клеток, которые они не убивают. В этих клетках в связи.' со снижением синтеза ДНК должны появляться рецепторы гормонов, и эти клетки будут становиться гормокочувствительными. Подтверждение этого предположе-

Таблица 6

Изменение уровня РЭ в Са-755 и РШМ-5 после '• проведения пРотивоопухолгиЯ терапии

1 I Штамм ........... ....... 1 РЭ, (фмоль/мг белка). (М ± гп) |

Цитостатик| опухоли 1 1 До начала введения цитостатиков |24 часа после окончания! | лечения |

1 Циклофосфан| Са-755 О | 14,9 1 7,38 . 1

Схема С№ | РШМ-5 19,7 ± 3,46 | 36,9 ¿18,98 |

Циклофосфан| РШМ-5 г. - ....... 1.. ........ О | 13,1 ± 3.55 | 1 1

ния получено нами в эксперименте. Из представленных в таблице 6 данных следует подчеркнуть, что после введения цитостатиков в опухолях Са-755 и РИМ-5 обнаруживаются РЭ.

Учитывая, что одним из основных гормональных стимуляторов пролиферации в эндометрии являются эстрогены, была предпринята попытка

Таблица 7

Комбинированное действие циклофосфана и тамоксифена на рост РШМ-5 (начало введения препаратов - 7 сутки после перевивки опухоли)

1 1 Доза: _ |Торможение роста опухоли, Средняя г i УТ1Ж. |,

| Препарат мг/кг х чжН (% к контролю) продолжит. % к |

ло введ. /инНсутки после окончан. лечен. жизни, (дни) конН

тервал(час) | 1 2 I 1 7 1 1 11 (М±т) ролю|

Щнклофосфан 1 200 x 1 | 1 86* | 1 75" | 59" 37,313,42 x. 52 1

Цамоксифен 10 x 6/24 | +24 | +49" | +98* 24.6t3.76 0,4|

- » - 50 X 6/24 | +29 | +61' | +49* 30,710,8 25 |

— я — 100 x 6/24 | +19 | +47" | +57" 29,611,16 21 |

<а« Циклоф.-»Там 200+10 | • 87" | 75" | 61" 37,114,63 51'I

— а - 200+50 | 90" | 83" | 68" . 4812,06 0б"|

200 + 100 | 1 85' | 1 75х | 1 .68" 46,112,54 88 | 1 1

- достоверно к контролю; хх - достоверно к циклофосфану, р<0,05 УПЖ - удлинение продолжительности жизни

использовать антизстроген для повышения эффективности лечения рака шейки матки (РШМ-5).

При введении тамоксифена в терапевтической для мышей довв (50-100 мг/кг в течение 6-10 дней ежедневно) череа 6-7 дней после циклофосфана (200 мг/кг однократно) наблюдалось статистически достоверное (р<0.05) увеличение продолжительности жизни животных с Р1Ш-5 (табл." 7). Происходило усиление противоопухолего эффекта циклофосфана, хотя один тамоксифен не вызывал статистически значимого удлинения продолжительности жизни мышей, а даже несколько усиливал рост опухолей по сравнению с контролем, что указано рпдии авторов с ско-периментальных и клинических наблюдениях ((ЗоИагсИз М.М. и соавт.,

Таблица 8

Комбинированное действие циклофосфана и гормональных препаратов на рост опухоли мышей Са-755

—I

Г Препарат

I-

I Контроль ЦШклофосфан IТамоксифен |Прогестерон IПреднизолон |Циг-лод>-+Там

см

|Цикл—"Про г 1Иикл-»Предн ¡Циклоф-*-Там I Ш Прог |Циклоф-*Там I — Предн I Цикл-»Там-* 11!редн-Ч1рог |Цикл. -*Там+ IПредн+Прог

Доза: мг/кг х число введен./ интервал (час)

1-,-;-г

Средняя продолжи-| Удлинение про

тельность жизни, (дни, Мш)

должительности жизни. Т. к контр

..р.. |

к конт-| ролю

200 X 1' 100 X 6/24 5 X 10/24 5 X 10/24 200 + 100 200 + 5 . 200 +5 200+100+5

200+100+5

200+100+5+5

20.3 * 1,52 36,2 ± 1,87

18 ± 1.05 18,6 * 0,82 23 ± 1,46 36,8 * 1,91 32,1 1 1,84 38 * 2,62

34.4 + 2,41

36,8 ± 0,97 42,4 ± 2,74 "40,4 ± 1,39

77 -И - 8 13 81 58 87 70

81

108*

99

<0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <.0,05 <0,05

<0,05

<0,05

<0,05

х - достоверно'по сравнению с действием одного циклофосфана, р<0,С

1989; Love R.R. , 1990):

Введении тамоксифена черев 1 сутки после циклофосфана ни приьи-дило к увеличению противоопухолевого эффекта. По-видимому,- иромулу-ток времени был недостаточен для того, чтобы в опухоли произошли процессы, которые ведут к увеличению ее гормоночувствительностк.

Предположительно, применение в указанной выше схеме кортикосте-роида, угнетающего продукцию эстрогенов надпочечниками, должно бело способствовать увеличению эффективности лечения. Введение коргико-стероида в эту комбинацию можно считать более обоснованным, так .как в опухоли было обнаружено увеличение в 3-4 раза содержания РГ после действия цитостатика.

Эта схема комбинированной химио-гормонотерапии была изучена при лечении рака молочной железы (Са-755). В соответствии с данными Н.И. Лазарева и сотр. (1974) предполагалось с помощью тамоксифена подавить продукцию эстрогенов и ЯСГ, от которых зависят пролифера-

Таблица 9

Противоопухолевая активность комбинации препаратов циклофосфан+гормоны при лечении Са-755

1 | Схема 1 Торможение роста опухоли, (X к циклофосфану) 1 1

1 | лечения На фоне окоИ Сутки после окончания 1 лечения |

1 1 чания лечен. | I '2 1 1 4 6 1 8-10 | 1 1 12-14| 1 18 |

1 1 Jf Ж К I 1 И 1

| Циклоф—>- Там 17 -13 | 79 | 64 68 1 58 | 31 | 22 |

¿А* | Циклоф—^Прог +12 +38 | +17 | - +52* 1 +11 1 +50 | 26 |

| Циклоф-^Иред 60 - 61' I 72* | - 68* 1 30 | 24 | 8 I

| Циклоф-^*Там 18 - 17 | 14 - 1 +13 | 11 | |

1 гт | —► Прог I Циклоф—«- Там . гг | —f Предн - 63* | 1 1 1 1

67 - | 36 +6 1 +14 | - |

1 1 1 1

, „ . £ л" iVi | Циклоф—Там-* 52 - 44* • | 31 | - - - |

| Предн-^Прог 1 1 х I

|Циклоф—-Там+ 81 - 92" | 95* | - 90* 1 75* | 73Х | 69* |

|Предн + Прог 1 1 < 1 1 » 1 1 1 1 1 |

Примечание: х - достоверно по отношению к циКлофосфану, р<0,05

тивные процессы в молочной железе. Кортикостероид должен был подавить продукцию эстрогенов надпочечниками, а прогестерон стимулировать функциональные процессы в железе.

Введение препаратов мышам начинали через 48 часов после перевивки опухоли. Гормоны применяли через 6 дней после циклофосфана в дозах: тамоксифен 100 мг/кг х 6/24 часа, преднизолон и прогестерон по 5 мг/кг х 10/24 часа в разных режимах (табл. 8).

В экспериментах было показано существенное, увеличение противоопухолевого эффекта цитостатика с помощью последующей гормонотерапии.. При одновременном применении гормонов чсрсс 5 после циклпфпофа-на средняя продолжительность жизнй мышей возрасла с 77% до 99%. Введение курсов тамоксифена, преднизолона и прогестерона с интервалами в 24 часа через 6 суток после цитостатика также привело к увеличению средней продолжительности жизни мышей до 108% по сравнению.с контролем (р<0,05).

При первом режиме лечения уже на фоне 4 инъекции гормонов размеры опухолей были на 83%-92% меньше объемов Са-755* леченных одним цитостатиком (табл. 9). Различия в торможении роста опухолей в обеих группах сохранялись статистически достоверными 18 дней после окончания терапии (р<0,05). При последовательном режиме введения гормонов усиление ингкбирующего действия циклофосфана было более кратковременным. Различия в торможении роста опухолей в группах с изолированным введением циклофосфана и.с комбинированным лечением были достоверными на фоне окончания лечения и составили 44%-52% (р<0,05).

Таким образом, настоящее исследование на перевиваемой солидной опухоли молочной железы мышей Са-755 показало целесообразность использования гормонов в терапевтических дозах для усиления противоопухолевой активности циклофосфана при лечении гормоночувствительных опухолей с низким пролиферативннм пулом.

Эффективность лечения зависела от режима введения препаратов. Более высокий терапевтический эффект был получен при одновременном введении гормонов через 6 суток после цитостатика.

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения частоты выявления и уровней рецепторов стероидных гормонов в цигозольной фракции экспериментальных опухолей (аденокарцкноме -молочной железы Са-755 и раке шейки матки РИМ-5), а

галле влияния атих опухолей на фуикцшо яичникоь * органиома шли-.и оиухопоносителей, вышеуказанные опухоли могут Сыть отнесены к юрыи нечувствительным и служить моделью для исследования вовмолвюсч-ы1 ш* вывеши терапевтической активности различных видов комбинированной химио- и гормонотерапии.

2. Установлено, что в Са-7Б5^и РШ-5 имеются околосуточние ритмы синтеза ДНК, которые сохраняются как после стимуляции роста опухолей сннэстролом или оксикобаламином, так и после химиотерапии. .

• 3. Показано, что содержание рецепторов эстрогенов в опухолях (Са-755 и РШ-5) изменяется в противоположном направлении по отношении к включению ^Н-тимидина в ДНК тех же опухолевых клеток..

4. Обнаруиэно, что синзстрол и оксикобалашга в дозах, близких к физиологическим, могут оказывать стимулирующее влияние на синтез ДНК в опухолях Са-755 и Р1Ш-5, которое зависит от фазы цикла опухолевых клеток и выракается в виде прироста синтеза ДНК, либо в. появлении внеочередных пиков синтеза ДНК.

5. Неоднородность реакции опухолевых клеток несинхронизирован-ной популяции на стимулирующее воздействие делает непредсказуемым оптимальный срок последующего введения цитостатиков. Поэтому представляется нецелесообразным применение для лечения опухолей с относительно низким пролиферативным пулом комбинации синзстрола или ок-сикобаламина в качестве стимуляторов пролиферации с цитостатиками.

6. Показано, что после эффективной терапии цитостатиками в ци-тобольиой фракции опухолей Са-755 и РИМ-5 увеличивается уровень специфического связывания эстрогенов и глюкокортикоидов. Рецептор-отрицательные опухоли становятся рецепторполояительными, что позволяет рекомендовать использование гормонотерапии (тамоксифен, пред-низолон, прогестерон) .вслед 8а интенсивной химиотерапией циклофос-фаном.

7. Разработан оптимальный ре*™ терапии зкспериькнтальной аде-нокарциноиы молочной иелевы Са-755, при котором усиление противоопу-

холевого действия циклофосфана достигается путем последующего приме нения тамоксифена, прогестерона и преднизолона в терапевтических до пах.

8. Результаты исследования позволяют предложить комбинацию циклофосфана с последующим применением гормональных препаратов (тамоксифена, прогестерона, преднизолона) в терапевтических дозах для изучения в клинике при лечении рака молочной желевы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зависимость гормонального статуса мышей от вида и скорости роста опухолей.- Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей, Черноголовка, 1087, 1, 78-81, (соавт. : 3. П. Софьина, Л. С. Бассалык).

2. Гормональные вещества как стимуляторы или ингибиторы роста опухолей в комбинации с цитостатиками. - Вестник 0НЦ. РАЫН, Приложение к выпуску 1, 1993, 26-30 (соавт.: 3.П.Софьина).