Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клинические аспекты изучения роли циклических нуклеотидов у больных раком молочной железы

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

на правах рукописи

УДК-618.19.-008. 6-07: 577. 113. 3

Воротников Игорь Константинович КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ РОЛИ ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Онкология -14.00.14

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

кэсква - 1991

Работа выполнена в ти-делении опухолей молочных желез (руководитель - доктор медицинских наук, профессор Е П. Летягин) Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР ( директор-академик АМН СССР H. Н. Трапезников].

Научный ру'зводитель: доктор медицинских наук, профессор Е П. Летягин

Официальные оппонента

1. Випшевскип А. А. доктор медицинских наук, профессор, зав. торакальным отделением НИИ хирургии им. А. Е Вишневского АМН СССР.

2. Буренин 11. С. доктор биологических наук, профессор, зав. лабороторкей экспериментальной эндокринной терапии опухолей. НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей БОНД АМН СССР.

Ьедущее учреждение: Московский научно-исследовательский институт онкологии им. П. А. Герцена МЗ РСФСР.

Защита состоится "„>о" l992L-r. в 14-00 на засе-

дании специализированного совета С К. 001.17. 01) при Всесоюзном онкологическом научном центре АМН СССР (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БОНД АЫН

СССР:

Автореферат разослан " " 1991 г.

Ученый секретарь специализированной" совета доктор медицинских наук, профессор

Е А. Турусо!

Актуальность теш.

Темпы роста заболеваемости раком молочной гюлезы, потеря рудоспособности женщин в активный возрастной период (45-54 го-а) приводят к значительным социально-экономическим потерям об-ества от злокачественных новообразований среди иэнского н^-селе-ия (Двойрин а Е , Аксель Е. И. ,1985).

При раке молочной железы частота выживаемости неуклонно меньшается с годами наблюдения за больными и нет такой времен-ой точки, когда больные могут считаться излеченными fMyers .N.,1976). Этот факт указывает на особенности патобиологии рака очной железы, которые до настоящего времени во многом остаются еизвестными.

Необходимость дальнейшего поиска биологических факторов, с дной стороны определяющих . азвитие процесса, а с другой, спсс-особных иметь практическое значение при решении тех или иных линнческих задач обратила внимание исследователей на систему нклических нуклеотидов в злокачественных опухолях и при раке элочной иелеаы в частности.

Интерес к системе циклических нуклеотидов при злокачествен- . ых 'гавообрааованиях предопределяется тем, что они являются од-ими из ключевых регуляторов процессов пролиферации и дифферен-кровки нарушение которых является одним из наиболее характерных рсявлений злокачественного роста.

В кастояпее время проведен целый ряд исследований (Нестерс-а M.R с соавт. , 1981; Feller N. et al, 1978; Minton J. P. et 1, 1974), свидетельствующих, что в злокачестЕек :ый опухолях че-эвека отмечается повыоение уровня цАМФ. В то ае время имеются анные о том, что цАШ> и его аналоги вызывают остановку или тор-элэние роста клеточных культур ( йедоров Н. А., 1979, Tiscale J., 1979). Разноречивые данные приводятся в отношении влияния итосгатиков на содержание цАМФ в опухоли ( Нестерова M. В. , 1982; rasad К. N., 1974). Столь ие противоречивые данные и о другом ислическш нуклеотиде - цГ1Й>, уровень которого по данным одних второв при раке повышен (Берпггейн JLÜ, 1987), а по данным друга- поклеен (Озгерельев А.С., 1986).

При таком тротиЕоречии данных .полученных, в основном на

экспериментальных кивотных и культурах ir» vitro трудно суить с истинной роди циклических нуклеотидов при развитии опухолевог процесса у человека,' что определяет необходимость выяснен* прикладного значения изучения циклических нуклеотидов для клину ческой онкологии, влияния на метаболизм нуклеотидов в терапевт* чесюк целях.

Цель исследования

Определить клиническое значение изучения циклических нукло отидов у Сольных раком молочной железы. Задачи исследования

1. Изучить содержание цАШ> и цГ№ в "нормальной" ткаш доброкачественных и злокачественных опухолях молочной железы.

2. Определить корреляционные взаимосвязи между основные клиническими (стадия заболевания) и биоимическими характерней каш злокачественных новообразований молочных келез и уровня» циклических нуклеотидов.

3. Провести параллельное изучение содержания ДНК в клеткг опухолей молочной иелезы методом проточной цитофлуорометрии уровней циклических нуклеотидов. Взаимосвязь цАМФ и цГМФ с прс лиферативными характеристиками и степенью анэуплокдии новообрг зованкй.

С. Выявить влияние химиотерапии на содержание цАМФ в опухс

лях.

5. Оценить возможность использования определения уровне циклических нуклеотидов для предсказания течения заболевания.

Научная новизна

В работе на большом клиническом материале дана оценка с< держания циклических нуклеотидов (цАМФ и цГЫФ) в доброкачестве: пых. злокачественных опухолях и в "нормальной" ткани молоч» железы.

Проведены исследования, не имеющие аналогов в мировой лип ратуре:

а) сопоставление уровней циклических нуклеотидов и особе ностей пролиферации и дифференшровки (наличие анеуплоидии), о

ределяемых проточной цитофлуориметрией при раке молочной ждеаы:

б) изучение ь.ляния химиотерапевтического лечения на изменения содержания иАМФ.

На основании проведенных исследований впервые сформулированы следующие положения:

а) наибольшее значение цАМ$ отмечаются при I и III стадиях, тогда как уровень цГМФ при I стадии минимален, а при III стадии, также как и иАМФ достигает максимума. Это находит отражение в том, что при I-II стадиях соотношение цАМФ/цГйЬ более чем в два раза превосходит таковое при III;

б) в анеj .¡лоидных опухолях уровень циклических нуклоотидов достаточно стабилен и мало .эдвержен колебаниям ка$ е зависимости от стадии процесса, так и от уровней рецепторов стероидных гормонов. В диплоидных опухолях уровень цАЫФ достоверно выше при местнораспространенных стадиях по сравнению с начальными;

в) повышение цА№ при раке молочной железы в целом и по мере местпго распространения процесса является компенсаторным механизмом, направленным на ограничение злокачественно, о роста, что находит подтверждение в более агрессивном течении процесса при низком (<25 у. е.).содержании нуклеотида в опухоли;

г; высокая пролиферативная активность новообразования сопровождается достоверным уменьшением содержания цГШ> в опухоли;

д) существует выраженная зависимость между содержанием цЛШ> в диплоидных опухолях и уровнем рецепторов стероидных гормонов -наименьшие значения цАМЪ отмечаются в ЭР+ПР+ опухолях. При этом в 91,2Z случаях опухоли с низким содержанием цЛМФ (<25 у.е.) являются эстрогенрецепторположительними;

е) химиотерапьл приводит к достоверному снижению содержания цАН2> в процессе лечения.

фактическая значимость

Выделенные критические уровни циклических"нуклеотидов, определяемые в первичной опухоли, позволяют рекомендовать их для адекватного прогнозирования течения заболевания.

Выявленное снижение содержания цАМЗ в опухоли в процессе химиотерапии, сопровождающееся повышением пролиферативных характеристик опухолей, побуждает рекомендовать одновременное при*..-

некие препаратов, способствующих накоплению ЦА4® в опухолевых

¡слетках.

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, собств'з-ные данные, заключение, выводы к список литературы (154 источника). Текст диссертации изложен на 90 станинах машнописи. Диссертация иллюстрирована 16 таблицей и 10 рисунком.

КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение содержания циклических нуклеотидов в тканях

Е соответствии с задачами, поставленными в данной работе за период с 1987 по 1990 гг. выполнено определение уровней циклических аденозин ыонофосфата и гуановин монофосфата проведено у Е больных с доброкачественными опухолями к 142 ранее не леченнш больных раком молочной желегы. Иь страдающих раком молочной железы I к Па стадия заболевания отмечена у 42 Сольных, 116 - : 24 больных и Ш стадия - у ?б больных. У 53 больных параллелью производилось изучение содержания уровней циклических нуклеоти дов б "нормальной", непораженной ткани молочной железы и в ткан самой опухоли,a l 15 случаях - метастатически пораженных лимфа тических узлах.

У 8 больных проводилось изучение цА!Л> динамике, по и поел провбденного лечения.

Общее число проведенных исследований содержания цикличесм нуклеотидов составило 314.

Методика забора материала для исследований:

У больных, с III стадией заболевания в лень начал» лечен! производилась трепанобиопскя опухоли "трепан-иглой",, аз работа ной Е Е Летягиным с соавт. При этом полученный материал пред тавляет собой столбик опухолевой ткани песом до 500 мг.

У остальных больных, лечение которых начиналось с оператк ного вмешательства, ткань для исследования забиралась юлосред

твенно кз операт&ционного материала сразу после удаления сектора молочной железы или в момент мастоктсмии.

У В больных осуществлялось изучение содержания цАМФ в опухоли с одновременным исследование содержания ДНК в опухолевых клетках в динамике, до и после химиотерапии, проводимой по схеме СКГАУ в еле душем режиме:

1 день: Адриамишн - 40 мг/м , виикристин - 1 мг/м 8 день: Алриамлцин - 40 мг/м , метотрексат - 30 мг/м 15 день: Адриамиция - 40 мг/м . б-аторурааил - 60(3 мг/м 22 день: Адриамицин - 40 мг/м . циклофосфан - 400 мг/м

Ткань для исследования вшкзуказа''ньзс параметров забиралась двалды: - в день начала химиотерапии, с помощью трепанбиопсии и через 4-5 недель после окончания лечения во время операции. Уетодика определения циклических нуклеотидов

Экстракция циклических нуклеотидов проводили после предварительного взвешивания тканей и гомогенизации в жидком азоте в 4 мл. холодного 96 - градусного подкисленного этанола (парки ХЧ;. Экстракт центрифугировали при 3000 об. г- мин. при 4 градусах С в течении 30 мин. Предварительное добавление в гомогенат меченного тритием цАМФ покапало. что при таком спосо&е экстрагируется ско-ао 80Z нуклеотидоь.! т. е. коэффициент экстракции решен 0,8). Кон-дентрация циклических куклесгидов определяли с помощью соответствующих коммерческих наборов реагентов Cyclic AMP-К it. и Cyclic З.Р-Kit ("Amercnam", Великобритания) . Радиоактивность проб измеряли на спектрометре MARK - II IS (TREUKOR-EliKX"nE). эффектив-юсть счета по тритию которого составляет около ЛОХ, Полученные результаты выражали в пкмоль/г ткани. Учитывая колебания зкаче-1Ий нуклеотидов в разных коммерческих наборах для стандартизации юлученни.. результатов производили нормировку всех показателей ю максимальному значению исследуемого признака в калдом набора ю формуле: Vi-Pi х lOC/Vmax ,где Yi - значение куклеотнда ¡.осле гершровки, Pi - значение нуклеотида в данном наборе, Vmax -аксимальное значение изучаемого показателя в данном наборе. Поученные данные выражались б условных единицах (у. е.).

- б - -

Методика изучения содержания ДНК в клетк?х

Содержание ДНК "методом проточной цитофлуорометрии анализировалось параллельно с изучением содержания циклических нуклеотидов в тканях у 88 ранее не леченных больных раком молочной железы. У 9 больных с III стадией рака молочной железы содержи, дк ДНК в клетках изучалось дважды - до и после предоперационной химиотерапии.

Анализ содержания ДНК в клеточной популяции производили не проточном цитофлуориметре 1СР-22 (РЬуке, ФРГ).

Е полученной ДНК гистограмме процент клеточных ядер с различным содержанием ДНК автоматически вычисляется на ЭВМ по специально разработанной программе. Коэффициент вариации был в пределах 3-10, чаше в пределах 4-7. Содержание клеток по фазах! клеточного цикла вырааалосб в процентах.

Индекс плоидности высчитывали из соотношения истинного канала. соответствующего исследуемой популяции клеток к стандартному каналу диплоидной популяции (162 канал). В качестве стандарта использовали лимфоциты человека. Опухоли откосили к анеуп-лоидным, если индекс плоидности превышал 1.1.

•Метод определения рецепторог стероидных горюнов

Параллельно с изучением уровней циклических нуклеотидов в злокачественных опухолях молочной железы у большинства (126) Сольных изучалось содержание в новообразованиях уровней рецепторов эстрадиола (ЭР) и уровней рецепторов прогестерона (ПР) у 1QC пациенток.

Определение рецепторов эстрадиола и прогестероьа в иитово-лях исследуемых опухолей производилось методом, предложенным Е. 0. R. Т. С. Breast Cancer Cooperative Group, 1973 с небольшими модификациями. Границей рецептороположительности считали 10 Фмоль/мг цитозольного. белка.

Статистическая обработка материала

Статистическая обработка материала проводилась при помощи критерия X и по йсаеру-Стьденту. Различия расценивались как достоверные при Р < 0,05.

РЕЗУЛЪТь/Ы ЮСЛЕДОВАНШ И ИХ ОБСЩЕНКЕ

Содержание циклических нуклеотидов в тканях у больных е доброкачественными и злокачественными опухолями молочной железы.

Определение содержания цАМФ в опухолевой ткани Oes предварительного лечения проведено у 139 больных раком молочной железы и у 5 больных с доброкачественными новообразованиями молочной железы. У 65 больных с опухолевой патологией параллельно произведено изучение содержания цАМФ в непораженной ткани железы, а в 15 случаях цАШ? определялся в метастазах рака молочной железы в регионарные лимфатические узлы.

Уровень цАШ' в исследуемых образцах колебался в широких пределах : в нормальной ткаии от 1,8 до 57,6 у. е., в доброкачественных опухолях от 4,1 до 35,1 у. е. , в злокачественных новообразований: от 1,1 до 100 у. е. ив метастазах рака молочной железы от 14,9 до 100 у. е. (таблица 1).

Таблица 1

Средние уровни цМ№ (у.е.) в нормальной ткани молочной железы, доброкачественных и злокачественных опухолях, метастазах рака молочной железы в регионарные лимфатически^ узла

i 1 1 I , | Нормальная| ■■ ■ -......... Доброкач. ................ Рак молочной Метастазы в ¡

| ) ткань | 1 1 ! опухоли железы л/узлы |

1 1 1 I ЦАМФ | 11,0+1,31 i 15,9±б,05 29.9+2,06 37.9+6.5С |

I I (n»65) * | t. i . . i (п-5) * (п-139) ** ( n-15i ** ¡ !

** Статистически достоверно (р < 0,05) по сравнении с *.

Представленные данные свидетельствует о значительном повышении содержания цАМФ в злокачественных опухолях и метастазах рака молочной железы по сравнению с доброкачественными новосбра-Е званиями г непораженной тканью железы. Вместе с тем, большая вариабельность уровней цАШ внутри обследованных гругш побудила детализировать распределение злокачественных опухолей и неизмененной гкани железы в зависимости от содержания цАМФ (тай. 2).

ТеЛлица 2

Распределение новообразований и "нормальной" ткани молочной железы в зависимости от уровней ЦАЖ

1 , , , ) Уровни цА1й , , 1 1

1 | < 25 у. е. ; I 25 - 80 у. е. > 80 у. е. | 1

I Рак молочной | железы 1 46,8 х | (65 из 139) 48,2 % (67 из 139) 1 Б.о х | (7 из 139) |

| "Нормальная" I ткань > 1 I 35,4 г | (23 из 65) I 64,6 г ! (42 И5 65) ! о г | ! __________________________I

Представленные данные позволяют утверждать, что наряду с общим повышением содержания цАМФ в злокачественных опухолях су-щзствуот три разновидности рака молочной железы- с высоким, средним и низким уровнем содержания цАМФ.

Таблица 3

Доля опухолей с низким (< 25 у.е.) содержанием цАШ> и его средние значения в зависимости от стадии заболевания.

I ......... 1 1 1 1 и Стадия заболевания *

■ 1 1 I \ \ 1 И 1 III |

1 1 I X опухолей с 1 I низким содер-( I жанием ЦА1Й ( 1 1 • 21,42 * | (3 ИЗ 14) | 64,ОХ *** | (32 ИЗ 50) I 40, ОХ * | (30 из 75) |

| Средние уров-| I ни цА1№ ) ( 1 1 32,6+3,48 | I > 24,4+2,31 ** | ( 33,1+2,79 * | 1

** Статистически достоверно (р < 0,05) по сравнению с *

*** Статистически достоверно (р < 0.01) по сравнению с *.

В связи с этим, представляется выжнь^ выявление клинически и биологических различий, характерных для агих опухолей.

Сравнение содержания цАМ5 в злокачественных опухолях в за-, висииости от стадш заболевания позволило установить достоверные различия в содержании нуклеотида при I и III стадиях по сравнению со II стадией заболевания. (Таб. 3).

Бэ менее важными выглядят различия в содержании oAMi в непораженной ткани железы в зависимости от стадии заболевания. (таб. 4).

Обнаруженные закономерности указывают на то, что окружающая опухоль ткань молочной железы не является индифферентной и непосредственно реагирует на изменения биохимических процессов в новообразования".

Таблица 4

Содержание цАШ> в "нормальной" ткани молочной железы при различных стадиях заболевания.

1 1 1 1 Стадия заболевания

1 г 1 1 1 1 1 I | i II Г1 |

1 1 ]% "норшльных" | |тканей с низ- I |k»im содержани-1 ( ем цАМФ | i | 1 25, ОХ * | (2 из 8) | 1 1 1 64.7Х ** (22 из 34) 66,71 ** 1 (10 из 15) 1

1 1 | Средние уров-1 | ни цШ> 1 1 • 1 20,316,17 | 1 . . 1 10, "¿1,58 10,2+2,55 !

** Статистичесга. достоверно (р <0,0Ь) по сравнению с *. С другой стороны, вполне вероятно допустить, что биохимические процессы в нормальной ткани оказывают свое воздействие на опухоль Исходя из этих предположений, кажется логичным изучение соотнопений уровней цАЮ в опухолевой и нормальной ткани, (таб. 5) Таким образом, очевидно, что в процессе прогрессирования происходи" неуклонное увеличение содержания цЛМФ в опухоли по сравнению с окружающей опухоль нормальной тканью, причем этот фено^н обусловлен как увеличением содержания цАШ> в опухоли, так и -нижением уровня нуклеотида в окружающей "нормальней" ткя-

- io - -

ни.

Таблица 5.

Соотношение цАМф'в' опухолевой и "нормальной" ткани в зависимости от стадии заболевания.

1 t ...... .............. 1 Стадия заболевания ----------- ' 1 1 1

i i i 1 I 1 IIa 1 Пб i i i 1 1 1 III 1

1 Соотношение 1 цАМФ i 1 1 1 1 1 ! |1,8±0.48***| 2,6+0.42* | 3,3±0,72 1 I f 1 n-7 1 п-22 1 п-10 1__________..L .......... ....i---- .... 1 1 t i 14,6+0,79**! f 1 1 П-14 1 i '

** Статистически достоверно (р<0,01) по сравнению с *** * Статистически достоверно (р<0,05) по сравнению с **

Определение содержания другого важного регулятора - цГШ производилось у 54 больных раком молочной железы в опухолях, с параллельным анализом содержания цЗ'МФ в "нормальной" ткани у 17 пациентов. Уровень цГМФ колебался при раке молочной железы от 1,8 до 100 у. е. ив "нормальной" ткани от 1,9 до 23,7 у. е.

Установлено, что содержание цГМФ в злокачественных опухолях молочной железы достоверно (р<0,01) выше по сравнению с окружающей опухоль непораженной ткани железы, составляя соответственно 22,2±3,1 и 9,1+1,б1 у. е.

Кроме того, выявлено, что существуют закономерности изменения содержания цРЬй не только при сравнении его уровней в новообразованиях и непораженной ткани, но и в опухолях при различной степени распространенности процесса (табл. 6).

Как видно из приведенных данных отмечается значительное возрастание содеразкеник цГМФ при раке молочной келезы 111 стадии по сравнению с более ранними стадиями заболевания. Это находит подтверждение и в том, что если при I - Пб стад их i доля опухолей с низким содержанием цПй> (менее 10 у.е.) составлята 60,7% (17 из 28 больных), то при III стадии - всего 26,9% (7 из 26 больных) - (р<0,05).

Таблица б.

Содержание цГМФ в злокачественных опухолях молочной железы в зависимости от степени распространенности процесса-

Стадия заболевания -1--

Па

Пб

III

■4-

19,4+7.3 112,8±5,1 * |28,0±4,9 ** (п-13) 1 (п-7) | (п»26)

* Статистически достоверно (р<0,05) по сравнению-с **.

Аналогичные закономерности выявлены и при рассмотрении содержания цГМФ в "нормальной" ткани (таблица 7). Таблица 7.

Содержание цГМФ в "нормальной" ткани молочной железы в зависимости от стадии заболевания.

Стадия заболевания

1 I I Па | 1К ! II!

-1-,----,-1-

Уровень ЦГШ> I 4,510,89 | 9.5+1,6 I 6,8+4.46 114.55+4,79 (у. е.) 1 (п-4) I (п-б) I (п«3) I (г 1*4)

1_1_1_и

Выявленные различия не носят статистически достоверного характера. что по-ви"имому определяется малым чистом обследованных больных. То же самое можно сказать и о результатах, полученных при изучении соотношения содержания цГМФ в опухоли и "иогмаль-ной" ткани, средние значения которого при I стадии более чем в 2 раза превышает аналогичные показатели'при Ш стадии (таб. 6).

При рассмотрении роли циклических нуклеотидоь в различных биологических явлениях наряду с их обоим содержанием важным является и их соотношение. Ранее приведенные данные однозначно свидетельствуют о том, что как в опухолевой так и в "нормальной" ткани молочной железы при злокачественном росте отмечаются выраженные измен ния, которые подчас носят разнонаправленный харак-

Телица 6.

Соотношение содержания цГМФ в опухолевой и "нормальной" ткани в зависимости от стадии заболевания.

Стадия заболевания » 1

1 I | Па 1 I Пб 1 П1 | 1 |

| Соотношение ! цГМЬ 4,3+1,33 (п-4) 1 1 2,7+0,97 1 (п-5) .1 . ........ 1 1 2,2+0,86 ! (п-3) 1...... ......... 1 1 1 2,1+0,95 1 1 (п-4) ! > |

тер. Суммирующим показателем мозга условно считать соотношение содержания двух нуклеотидов (отношение уровня цАШ> к цГМ$). Оказалось, что несмотря на то, что при раке отмечается повышение содержания оооих нуклеотидов. повышение цАМФ Солее значимо. Так, если в злокачественных опухолях молочной железы соотношение цАМ$/цГМ1? составило 3,82+0,49 (п-51), то в "нормальной" ткану этот показатель составил 1,05+0,25 (п«13) (р<0,01), т.е. этот показатель превышал в злокачественных опухолях аналогичный е "нормальной" ткани более чем в 3,5 раза.

Однако, при этом важным представляются следующие данные: при 1II стадии заболевания по сравнению с Солее ранними стадиям* этот показатель в опухоли достоверно ниже (таблица 9).

Таблица 9.

Соотношение одержания циклических нуклеотидов (цАМФ / цГЫФ) в зависимости от стадии процесса

Стадия заболевания

I

;1а

116

ш

4-

Соотношение нуклеотидов

4.8±1.80 I 5,8+2.06 | 5,8+1.77**! 2,1+0,30*

(г,-7) | (п-13) | (п-б) ) (п-25) _1_<_

* Статистически достоверно (р<0,05) по сравнению с **.

Ззеииосвяаъ сод^яа^'я циклических нуклеотидов со степенью анеу-ипидии опухолевых клеток, распределением их по фазам клеточного цикла и содержанием рецепторов стероидных гормонов.

Центральное место циклических нуклеотидов в регуляции самого пирокого спектра биохимических процессов предполагает, что выявленные различия в содержании обоих циклических нуклеотидов в эпухолевой и "нормальной" ткани молочной железы может быть вызвано или сопровождаться коренными изменениями других важных внутриклеточных биологических систем.

При раке молочной железы часто отмечается явление ансуплои-ции. Сравнительный, анализ содерк .am цАМФ в опухоли'в диплоидных и анеуплоидных опухолях позволил выявить тенденцию к понижению удержания нуклеотида в анеуплоидных опухолях. При диплоидных ьовообразаваниях уровень ц.»МФ составил 34,9+3,73 in-39), тогла как в анеуплоидных £8,8+3,13 (г,«45). Интересно отметить, что уровень цАМФ в анеуплоидных опухолях в среднем при начальных и иестнораспространенных формах рака молочной железы достаточно стабилен, составляя при 1-116 стадиях 27,7+4,02 (п-21), а при III стадии - 29.7+4,76 (п--24). Таким образом, описанные ранее данн..э с повышенном содержании цАМФ в новообразованиях при III стадии полностью определяются различиями среди диплоидных опухолей. Так, уровень цАМ1> в диплоидных новообразованиях I-Пб стадиях достоверно ни»? по сравнению с диплоидными новообразования-tfit при III стадии, составляя 27,5+4.68 (п-20) и 42,8+5,39 (п-3 9) соответственно (р<0,05).

Содержание ц1Ж в анеуплоидных опухолях т кже меньше по сравнению с диплоидными 10,4+2,68 (п-18) и 26,1+14,99 (п-5) соответственно. Естественно, что соотношение цАМЬ/цГМФ в диплоидных и анеуплоидных новообразованиях остается неизменным -6,1+1,24 (п-15) для анеуплоидных и 7,9+4,87 (п-5) - для диплоидных.

Одним из патогмонкчных свойств злокачественных нсвообраго-ваний является усиление пролиферации клеток. Нами не выявлено достоверных различий г содержании цАМФ з зависимости от пролиФе-ративно' активности опухолей и распределением опухолевых клетсч по фазам клеточ.ого цикла (таб. 10).

Таблица 10

Уровень цАШ е опухолях в зависимости от фаз клеточного цикла

1 | Сазы клеточного ) цикла 1 ■ Процент клеток — Уровень цАМФ Число больных 1 1 1 P 1 1 1

1 ! I 00/61 1 1 <30 30 - 50 >50 32,9+9,26 33,0+3,65 33,9+5,03 8 32 24 1 1 1 i 1 1 |р>0,С51 1 |

I 1 S 1 1 <40 >40 32,9+4,26 34,9±5,00 49 15 1 1 I 1 |р>0,05| 1 I

I ! G2/M t 1 <10 >10 32,2+4.52 34,2+3,94 17 45 1 1 ! i |р>0,05| 1 )

1 Пролиферативный 1 пул <40 >40 26,4+4,62 36,2+4,12 21 43 1 ( 1 1 ! р> 0,051 i 1

Таблица 11. Уровень цГШ1 б зависимости от фаз клеточного цикла

1 | Фаза клеточного | цикла ' 1 Процент клеток Уровень цГМФ Число больных 1 1 1 р ! 1 1

! | G0/G1 <50 >50 5,3+0,75 £7,2+11,53 10 7 1 1 |р<0,05! 1 |

1 | s 1 1 <30 >30 30,9+11,68 5,210.69 6 11 1 1 I- i |р<0,05!

1 1 | G2/M 1 <10 >10 27.2+10.55 5,3+0,76 f 10 ! 1 i I |р<0,051

1 i Пролиферативный 1 пул 1, . ... .._. . — . <40 >40 30,9+11.68 5,2+0,53 6 11 ________ ! I 1 1 |р<0,05| > t

При гшалнее взаимосвязи пролиферативных особенностей злокачественных новообразований и уровня цГМФ выявлены большие различия в содержании нуклеотида (таб.11).

Проведенные исследования позволили установить, что по мере увеличения пролиферативной активности опухоли яроисходиг1 параллельное сни.жение цГМФ в новообразованиях, соответсвеннс повышая значения в соотновении цАШ>/цГМ1> при повышении продиферативных характеристик, составляя £,"¿1,49 (п«0) при низкой и 3,6+1,32 (п-10) с высокой пролиферативной активностью (р<0,05)\

ОдноЯ из систем, оказывающих существенное влияние на функционирование килечных келеа в физиологических условиях и на течение рака молочной иелезы - является система рецепторов стероидных гормонов.

Изолированнее изучение свяаи содержания циклических нуклео-твдов и рецепторов эстрогепв в новообразованиях не выявило различий в уровнях нухлеотидов (таблица 12).

Таблица 12.

Зависимость уровней циклических нуклеотидов от рецепторов стероидных гормонов

1 ......1 1 рецеиторы 1 цАМФ ! ! цг® 1 ! »

1 ЭР+ | 30,312,52 п-64 | 19,8±4,СУ 1 п-2'3 |

1 ЭР- | 1 1 33,513,11 п-52 1 18,9+3,71 п-23 1

1 1 1 ПР+ 1 27.6+2,44 п-61 1 16.5i3.74 1 п»2-1 !

1 ПР- 1 32.2+2,98 п-61 | 22,б+с,84 п-19 !

1 ( I ЭР+ПР+ ! 26,5+3,08 п-38 | 17,1+5,32 1 г*-" 1

I ЭР+ПР- | 35,9+5,10 п-20 ! 26,7+12.88 п-7 I

I ! 29.3+4,09 п-23 ! 14,9+4,33 г.-10 1

! ЗР-ПР- | 3и,3±3,68 п-20 ! 20.2+5.34 п-12 !

i . , . ., . i — ... .. .,. :

Однако, оказалось, что содержание цАМ5> в новообразованиях я зависимости от реиепторного статуса зависит от плоидноста опухоли. Так. если з алеуплоидных опухолях уровень цАШ не отличался в зависимос-ч от содергания рецепторов стероидных гормонов,

- 16 - -

тс в дгляоидных новообразованиях выявлены значительно боле ниа-кие уровни содержания нуклеотида в ЭР+ПР+ опухолях по сравнению с другими вариантами рецепторного статуса (таб. 13). Таблиш 13.

Содержание цАМФ в зависимости от пдоидности и рецепторного статуса новообразований.

I-1 ------------------- ( Рецепторкый 1 статус Уровень 1 цАШ> |

1 диплоидные | анеуплоццвые |

| ЭР+ ПР+ 26,2+5,95 п-12 * | 31,1+4,94 п-15 |

1 ЭР+ ПР- 39,7+9,91 п- 9 | 27,6±9,35 п- 3 |

! ЭР- ПР+ 48,1+7,94 п- 6 ** | 24,7+5,75 п-10 * |

I ЗР- ПР- 1.................. 39.819,36 п- 7 | | 25,7±б,19 П-14 | 1

* Статистически достоверно (р<0,05) по сравнению с **

Еще более наглядно выглядит связь уровней цАШ>, рецепторов эстрогенов и плоидности. (таб. 14)

При анализе данных таблицы отмечено, что при низких значе-нкх цАШ> диплоидные опухоли в 91,2% случаев (ь 11 из 12 ) является эстрогенрецептороположитедъными. Таблица 14.

Распределение новообразований в зависимости от уровней цАШ>, пдоидности V рецепторов эстрогенов.

г -------------г | Уровни | Диплоидные АнеуплоиДные |

1 ЭР+ | ЭР- 1 1 . ЭР+ 1 ЭР- |

1 1 1 <25 | I 25-80 | 1 >80 | 1 | " - - -----....... 11 (52,47.) | 1 ( 7,7%) 8 (38,Ш|10 (76,9%) 2 ( 9,5%)! 2 (15,4%) ■ 1 ■)- 9 (50,0%) | 9 (50,0%) } ! - 1 1 | 14 (58,32) | 9 (37,5%) 1 1 ( 4,2%) |

1 1 I Итого | 1 1 1 21 } 13 . ........1. ., . , I 1 1 18 | 1 . .... . 1 24 | >

Изменения содержался цАМ£ в процессе химиотерапии. Циклические нуклеотиды и прогнозирование течения заболевания.

Одним из основных терапевтических методов, применяемых: в настоягаэе время при лечении рака молочной железы является химиотерапия, обладающая цитотоксическим и цитостатичесгаш действием. В связи с этим значительный интерес вызывает изучеш^ влияния лекарственного лечения на содержание в опухолях одного из ключевых регуляторов лролиферативных процессов - цАМФ.

Проведенные ксследованк. позволили установить,, что ь процессе хишотерапии далеко не всегда удается наблюдать снияение яролиферативней активности.

Динамическое исследование уровней цАШ> в новообразованиях до и после предоперационной химиотерапии позволило установить Еероятнуг причину этого явления. Оказалось, что уровень цАМФ в процессе лечения достоверно снижается .

Так, если среднее содержание цАА№ в новообразованиях до начала лечения составляло 56,9+9,27 у.е., то после химиотерапии среднее значение нуклеотида в этих № ■ опухолях было 25,1+3,17 у.е.ч>8), (р<0.01).

Таким образом, нами проведено динамическое исследование пролифератиьной активности опухоли (9 больных) и содержания цАМФ в новообразованиях '.8 больных), при котором отмечено, с одной стороны бесспорное снижение уровней нуклеотида в процессе предоперационной химиотерапии, а с другой - отсутствие значительного снижения пролиферзтк^ной активности новообразования в результате химиотерзпевтического лечения, а в ряде случаев, даже ее .увеличение. На основании доказанного тормозящего влияния цАМI- к а пролиферации ¡слеток можно предположить, что падение содержания -лто-го клеточного регулятора приводит к адаптивному'увеличению про-лиферативной активности опухоли.

Бероя^о, резкое снижение уровня цАМФ адекватно объясняет наблюдаемое в разе случаев увеличение пролиферативной активности опухоли под воздействием химиотерапии.

Существующие аксперименталькыэ данные указывают на то, чт^

все хикиотералевтические препараты вызывают повывение уровня цАШ>. Исключение составляют антрацикдиновые антибиотики, воздействие которых вызывает снижение содерльлия цАМФ в трансформированных клетках. В данном исследовании, как уже указывалось ранее нами анализировалось изменение содержания цШ и пролифератигной актиъности опухоли в процессе химиотерапии по схеме СКРАУ, включающей в себя адриамицин. Поэтому отмеченные нами закономерности не следует априорно распространять и на влияние других химиоте-рапевтических схем на содержание цАШ- в опухоли и данные предположения нуждаются в дальнейшей проверке. Заманчивой представляется перспектива сочетанного применения химиотерапии с ' включением адркамицина с препаратами, накапливающими цАМФ в клетках, которое теоретически позволило бы сохранить высока эффективность схем химиотерапии, содерлздих адриамицин с одновременным устранением его побочного влияния.

Наиболее важным показателем, определяющим роль того или иного биологического фактора, является его сопряженность с течением заболевания. В настоящее время при раке молочной железы общепринятыми фактосами, влияющими на прогноз являются степень распространенности процесса, уровень рецепторов стероидных гормонов и степень плоидности опухоли.

В данном исследовании нами проанализирована роль цАЬЫ» и цГМФ в предсказании частоты возврата заболевания у 75 больных местнораспространенным раком молочной железы (. Ш стадия). Сроки наблюдения за пациентами 12-60 месяцев. Итоги подведены на 30 марта 1991 года.

К моменту проведения анализа возврат заболевания отмечен у 37 из 75 больных (49,3%).

Выявлена связь прогрессировали; процесса с содержанием цАМФ в первичных опухолях (до лечения). Она проявлялась б более частом мет ас т аз кровак ии новообразований с низким {<25 у. е.) или высоким (>80 у. е. ) содержанием цАМФ. Возврат заболевания отмечен у 63.37. (19 из 30 больных) с уровнем цАЫФ < 25 у. е., у 66,7% (4 из 6) с уровнем куклеотида >80 у. е. и лишь у 35,9% (14 из 39) - с уровнем цАМ5 25-80 у.е. (табл.15).

Таблица 15 наглядно демонстрирует оправданность выделения критических уровней содержания цАШ> в первичной опухоли, позво-

ДЯХГ51Х оценить вероятное течение заболевания. В целом прогресс«' рование в-группе с плохим прогнозом по выделенным критериям .ровня цАМ$ в первичной опухоли (<25 или > 30 у. е. )' оарегистри-ровано.у 23 из 36 сольных (63,9%), а в группе больных с хорошим прогнозом по изучаемому показателю (уровень цАШ> - 25-80 у.е.) -лишь у 14 из 39 пациентов р<0,05), т.е. эти группа боль-

ных различаются по частоте прогрессировали заболевания почта в 2 раза

Та5.ггица 25

Частота возврата заболевания у больных местнорасярос, раненным раком молочной железы в зависимости от уровня цАМ4> в первичной опухоли.

Уровень ОАЫФ У- е.

Число больных

В том числе с прогресс-ированием

<25 £5-80 >80

30 3?

19 14 4

-----1

53,3 * | 35,9 ** | 56.7 !

) Всего (---

37

4^.3

* Статистически достоверно (р<0.05) ..о сравнений с **.

Таю™ образом, проведенные исследования позволили не только впервые установить то? факт, что в пользу плохого прогноза течения рака молочной железы говорит очень низкий и очень высокий уровень 'дШ> в первичной опухоли, но и установить критические уровни, которые могут быть использованы в прогнозировании вероятности возврата заболевания. Требует дополнительного • подтверждения Еыягтенный факт плохого прогноза заболевания у пациентов с очень высокими показателями цАЫФ ь первичкой опухоли (>80 у.е.) в связи с малым числом Сольных з этой группе.

&.м-сте с тем, полученные данные предопределили не обход., •

п

шсть качения взаимосвязи прогностического значения с другими известными факторами, применяемыми для предсказания течения заболевания.

Еще одним прогностическим признаком при раке молочной железы является степень анеуплоидии новообразования. Параллельное исследование содержания ДНК в опухолевых клетках к уровня ЦАШ> -ткани опухоли у больных раком молочной желееы 1П -стадии проведено у 42 больных. Установлено, что среди больных с анеуплоиднь?-ии новообразованиями возврат заболевания встречается чашр (в 55,5%. у 13 из 23 пациентов), чем у больных с диплоидными опухолями (35,82, у 7 из 19).

Одновременное исследование прогностического значения уровней цАШ> и плоидности опухоли позволило установить, что сочетание анеуплоидии и низких ',<25 у. е.) и очень высоких (>80 у. е.) значений цАМФ б 66,7% (8 из 12 случаев) сопровождается прогрес-сировыгием заболевания, тогда как возврат .заболевания в группе больных с диплоидными опухолями со средними значенный нуклеотида (25-80 у.е..) отмечен лишь в 30,6% случаев (4 из 13)Лр'-0,05).

Параллельное изучение содержания цМФ И'.реиепгоров зсторо-генов (ЭР) в опухолях молочной железы проведено у 64 больных. Прогрессирование заболевания отмечено у 31 пациента. Распределение больных в зависимости от -содержания в опухоли ЗР было следующим: ЗР-положительные опухоли составили 45,9% (30 из 64). Возврат заболевания отмечался часе у больных у больных с ЭР-негативными новообразован!, :ми, по сравнению с пациентами, опухоли которых содержали ЭР (20 из 34 - 58.8/. и 11 из 30 - 36,7%, соответственно).

Как было показано ранее, уровни цАМ> и рецепторов ьстьоге-ное в опухолях не взаимосвязаны, и, следовательно, эти два показателя могут взаимно дополнять друг друга (ряс. Ю).

Сочетание двух прогностически неблагоприятных Факторов -отсутствия рецепторов эстрогенов в опухолях к низких (<25 у.'е.) или очень высоких значений (>80 у.е.) цШ> до-товерно чада (р<0,01) сопровождается прогрессировать* заболевания п сравнению с группами больных с другими комбинациями анализируемых параметров.

Рисунок 10.

Связь уровней цАМФ и рецепторов эстрогенов на прогноз заболевания

иАШ <25.>80 <25, -•80 25 - 80 25 - 80

ЭР- ЭР+ ЭР- ЗР+

ПР БРЫ ПР БРИ ПР 1 БРЫ ПР 1 БРИ

* , * А * 1 * 1 * 1 > 1 *

* * * * А I * * 1 А

* * А * * 1 А * 1 *

* * * * 1 * • * | *

* * * А 1 * * 1 *

* * * * 1 А 1 *

* * 1 А *

* * А 1 * \ *

А * * 1

* * I * 1

* * ! * 1

* 1 1

Возврат 807. 35, 3 X 42.1 У 38,5?.

заболе- (12 из 15) (6 ИЗ 17) (3 ИЗ 19) (5 из 13)

вания

ПР - прогрессирование заболевания

БРЫ- без реципива и метастазов

При анализе влияния содержания цГМФ на течение заболевания такте отмечена тенденция к более частому прогроссированию у больных с низкими значениями нуклеотида в опухоли (<10 у.е.) -57,1% (4 из 7 больных) по сравнению с пациентами с более высоким содержанием цГМ>! в новообразованиях (>10 у.е.) - .36,87- (7 из 19). Данные недостоверны в связи с малым числом обследованных больных.

При изучении взаимосвязи прогноза заболевания с соотношением дв,гх нуклеотидор в опухоли (цАЫХ>/Ш'Ш>) выявлены закономерности аналогичны наблюдаемым при изучении влияния содержания цамф на течечие заболевания. Наихудший прогноз отмечался в группе

бодьньч с очень низкими значениями коэффициента про1 ресси-рования), а наилучший - у больных со. средними цифрами (14,ЗХ,Р<0;05) (таб.16). ' Таблица 16.

Частота возврата заболевания в зависимости от соотношении ц/Ш/цГМФ в новообразованиях

1

ЦАМФ/ЦГЫФ

Число больных

В том числе с прогрессировать

I <0.3 I 0,3-1.3 i . >1.3

Б 7 13

80 л 14,3 ** 46,2

* Статистически достоверно (р<0,05) по сравнению с **.

В целом, подводя итоги можно констатировать, что в данном исследовании, нам представилась возможность коснуться лишь отдельных, лежащих на поверхности, фактах, связанных с этой многогранной проблемой. И те перспективные направления, которые обозначились даже при столь общем подходе указывают на то, сколь значительные результаты могут быть получены при дальнейших исследованиях.

ВЫВОДЫ

1. Злокачественные опухоли молочной железы характеризуются более высоким уровнем цАМФ и цГМ1> по сравнению с доброкачественными опухолями и непораженной тканью молочной железа Повышение цАМФ более выражено, что приводит к повышению показателей соотношения цАШ>/цГШ> в опухоли по сравнению с "нормальной" тканью.

2. Наибольшие значения цАМ- отмечаются при 1 и III стадиях, (32,6+3,48 и 33,1+2,79 у. е. , соотьетстве"но, при II ладош -24,4+2,31 у.е.), тогда как уровень цГМФ при I стадии минимальный (15,9+5,03 у.е.), а при III стадии (28 0+4.9 у.е.) также как и цА1№ достигает максимума. Это находит отражение в том, что при

I-! I стадиях соотношение цАЫФ/цГМФ более чем в два раза превосходит таковое при »Л.

3. Окружающая опухоль непораженная ткань молочной железы не является индифферентной. Выявлено, что максимальное содержание цА1® в "нормальной" ткани отмечается при 1 стадии, а цГМФ - при III. Результатом отмеченных изменений является то, что соотношение цАДО в опухоли/ц/Ой в "нормальной" ткани прогрессивно возрастает от ! до III стадии (1,8+0,43 и 4,6+0,79, соответственно) , а аналогичное соотношение цГМФ наибольшее при I стадии (при I стадии - 4,3+1,33 и 2,1+0,95 - при III).'

4. В анеуплоидкых опухолях уровень циклических нуклеотидов достаточно стабилен и мало подвержен колебаниям кац в зависимости от стадии процесса так и от уровней рецепторов стероидных гормонов. В диплоидных опухолях уровень цАШ достоверно вьшк при местнораепрстараненных ствпиях по сравнению с начальными (42,815.39 и 27,5+4,68 у.е. . соответственно). Содержание цГМФ в диплоидн-х опухолях более чем в два риза превосходит таковое з анеуплоидных.

5. При раке молочной железы отмечено отсутствие взаимосвязи содержания уровня цАМФ в зависимости от продиферативных характеристик новообразований, в то время как высокая пролифоративная активность новообразований достоверно сопровождается уменьшением содержания цГШ> в опухоли.

6. Взаимосвязь между содержанием цАМФ и уровнем рецепторов стероидных гормонов однозначно сопря^зна с плоидностыо опухоли: в анеуплоидных опухолях подобная связь отсутсвует. в диплоидных достоверно наименьшие значения цАМФ отмечаются в ЗР+ПР+ опухолях. При этом оказалось, что в 91,22 случаях опухоли с низким содержанием цАУФ (<25 у.е.) являются ЭР положительными.

7. Выявленные критические уровни содержания цАШ> в первичной опу.-оли позволяют рекомендовать их для адекватного прогнозирована течения рака молочной яелезы. Больные местнораспростра-ненным раком полочной железы с неблагоприятными значениями цАМФ ;<25,>80 у.е.) и при отсутствии в опухоли рецепторов зстогенов при существующих методах лечения в 80% случаях обречены на возврат заболевания

8. Химиотерапия (с включением адриамицина), один из ваиби-

лее распространенных методов лечения, достоверно приводит к снижению содержания гШЙ- Ё -опухоли.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Взаимосвязь содержания циклического аденозин-3 5 -монофосфата, простагландинов группы Е (ПГЕ) и содержанием ДНК в опухолевых клетках при раке молочной железы. - В кн. Диагностика и лечение злокачественных опухолей в условиях онкологических диспансеров. Тезисы докладов. Ижевск, 1989 г. , с. 168. (соавт. ЕШЛетягин, Б. Ш. Чиквалвили, Н. Е. Нушлинский, Т. Е Пискунова, Т. Г. Николаева).

2. Биологические и клинические аспекты изучения циклического гуанозин -3 ,5 - монофосфата при раке молочной железы. - Антибиотики и химиотерапия, 1990, 35. N 12, с. 29-30. (соавт. В. Е Ле-тягин, Б. Ell Чиквашвили, Е Е. Нушлинский, Т.Г.Николаева, Т. Е Пискунова. А. С. Вайрядян, Е. Б. Золотухина, Воронцова А. Е).

участок множительной техники вокц амн ссср

ПОДП. К ПЕЧАТИ }с

ЗАКА1 3 2 S тир а* | 0 С3*'«