Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Рациональная диагностика генитальной папилломавирусной инфекции

На правах рукописи

МИНКИНА ОКСАНА ВАСИЛЬЕВНА

РАЦИОНАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕНИТАЛЬНОЙ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.00.11 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации», ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет, ЦНИИ эпидемиологии Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор

Скрипкин Юрий Константинович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Баткаев Эдуард Алексеевич доктор медицинских наук, профессор Иванов Олег Леонидович

Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов

(Москва)

Защита диссертации состоится «_»_2005 года на заседании

диссертационного Совета К 208.072.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» по адресу: 117 997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ МЗ РФ.

Автореферат разослан «_»_2005 года

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор

Л.Ф. Марченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время у пациенток с ИППП серьёзное внимание уделяется состоянию шейки матки, поскольку современные данные свидетельствуют об инициирующем значении в возникновении и прогрессировании патологических процессов цервикального эпителия возбудителей бактериальной и, особенно, вирусной природы (Байрамова Г.Р., Прилепская В.Н., 2004; Бутова Е.А. с соавт., 2004; Ковалева Н.М. с соавт., 2004; Ку-банов А.А., Кисина В.И., 2003; Насырова СВ., 2004; Boyle D.C., Smith J.R., 1999; Franco EX., 2003; Walboomers J.M.M. et al., 1999).

Многочисленными эпидемиологическими исследованиями установлено, что основным экзогенным фактором рака шейки матки является вирус папилломы человека (ВПЧ) (Bosch F.X., de Sanjose S., 2002; Burd E.M., 2003; Munoz N., 1997; Franco E.L., Duarte-Franco E. et al., 2001). К настоящему времени идентифицировано более 100 различных типов ВПЧ, около 30 из которых передаются половым путем. На основании вероятности вызывать предраковые изменения и инвазивный рак типы ВПЧ делят на группы низкого и высокого онкогенного риска (Burd E.M., 2003; Munoz N., Bosch F.X. et al., 2003).

Из всех форм генитальной папилломавирусной инфекции (ПВИ) наибольшую опасность представляет субклиническая ПВИ, которая представлена плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями (ПИП). Эти поражения не определяются визуально, нередко вызываются онкогенными типами вируса и могут прогрес-

сировать до цервикального рака - второго по частоте злокачественного новообразования у женщин.

В течение многих лет методологической базой скрининга рака шейки матки остаются цитологические цервикальные мазки (Петрова А.С. с совт., 1994; Фролова И.И., 2003; Baldwin P. et al., 2003; Rinas A.C., 1999). Многолетний опыт показал недостаточную эффективность цитологического исследования, которое, с одной стороны, обладает низкой чувствительностью в диагностике ПИП, с другой стороны, низкой специфичностью в диагностике ПВИ. В связи с этим рассматривается возможность использования новых скрининговых технологий: жидкостной цитологии и ВПЧ ДНК-тестирования.

Жидкостный метод подготовки мазка призван улучшить качество цитологических препаратов, вместе с тем, его преимущества относительно традиционного Пап-теста окончательно не доказаны и требуют дальнейших рандомизированных клинических исследований (McConnell Н., 2003; Malle D. et al., 2003; Sawaya G.F., Grimes D.A., 1999). Также нерешенной для практических врачей остается проблема рационального использования ВПЧ-тестирования в рутинных клинических программах (Bosch F.X., de Sanjose S., 2002).

И, наконец, важнейшей задачей практического здравоохранения является внедрение современных методов скрининга церви-кальной неоплазии во все медицинские учреждения, специализирующиеся на диагностике и лечении заболеваний нижнего отдела генитального тракта (Кубанов А.А., Кисина В.И., 2003; Wallin K.L. et al., 2002).

Цель исследования. Повышение эффективности диагностики папилломавирусных поражений шейки матки с помощью новых скрининговых технологий: жидкостной тонкослойной цитологии и мультипраймерного ПЦР-тестирования.

Задачи исследования

1. Определить и сравнить эффективность традиционной и жидкостной цитологии в диагностике субклинической папиллома-вирусной инфекции - плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (ПИП) шейки матки.

2. Изучить результаты использования ПЦР тест-системы для одномоментной идентификации 14 высококанцерогенных типов ВПЧ (ВПЧ ВКР) и определить распространенность различных ВКР типов у пациенток с ПИП.

3. Провести сравнительный анализ эффективности жидкостной цитологии, ВПЧ ВКР-тестирования и их комбинированного использования в диагностике ПИП.

4. Проанализировать и сравнить результаты микроскопической диагностики генитальной инфекции в традиционных и тонкослойных цитологических мазках.

5. Изучить возможность использования жидкостного цитологического образца для ДНК-диагностики генитальных инфекций.

6. Оценить результаты использования жидкостного цитологического образца для диагностики плоскоклеточных интраэпители-альных поражений, ПВИ и другой генитальной инфекции у пациенток врача-венеролога.

Научная новизна

В данной работе впервые на основании цито-гистологических сопоставлений изучены основные стабильные операционные характеристики жидкостной тонкослойной цитологии у пациенток специализированного кабинета по цервикальной патологии и у пациенток врача-венеролога.

На значительном клиническом материале произведена сравнительная оценка эффективности, проанализированы преимущества и недостатки традиционной и жидкостной тонкослойной цитологии.

Получены данные о дополнительных диагностических возможностях жидкостных цитологических образцов для проведения бактериоскопического исследования и генетической детекции (ПЦР) различных инфекционных агентов нижнего отдела гениталь-ного тракта, в том числе 14 онкогенных типов ВПЧ.

На основании проведенного исследования определена наиболее эффективная методика скрининга цервикальной патологии с использованием комбинированного тестирования (жидкостной цитологии и ВПЧ ВКР-теста).

Анализ полученного материала позволил оценить пациенток врача-венеролога, как группу повышенного риска по развитию цер-викальной онкологической патологии.

Практическая значимость

Проведенные исследования доказали более высокую эффективность жидкостной тонкослойной цитологии в диагностике плос-

коклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки в сравнении с традиционной методикой.

Разностороннее изучение жидкостного образца позволило также рекомендовать его использование в практике врача-венеролога, как наиболее экономичного, современного и информативного метода, для проведения микроскопического и молекуляр-но-биологического исследований.

Рекомендована схема комбинированного использования тонкослойной цитологии и ВПЧ ВКР-тестирования с помощью ПЦР тест-системы на 14 онкогенных вирусных типов, как наиболее эффективного подхода в поиске атипичных изменений шейки матки.

Результаты данного исследования будут способствовать внедрению новых скрининговых технологий в работу венерологической и гинекологической служб, консолидации врачей разных специальностей на этапе первичного выявления начальных форм цер-викальной патологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Жидкостная тонкослойная цитология является наиболее эффективным цитологическим способом скрининга папилломавирус-ных поражений шейки матки, удобна для бактериоскопии и ДНК-диагностики бактериальной и вирусной генитальной инфекции.

2. Наиболее рациональным способом скрининга, позволяющим

минимизировать ошибки в диагностике патологии шейки матки и практически исключающим вероятность «проскальзывания» тяжелых цервикальных поражений, является комбинированное исследо-

вание с применением цитологического метода и ДНК-тестирования на ВПЧВКР.

3. Детекцию ВПЧ ВКР наиболее рационально осуществлять с помощью ПЦР тест-системы для идентификации в ходе одной постановочной реакции вирусной ДНК сразу 14 онкогенных типов.

4. Внедрение в рутинную практику врачей-венерологов церви-кальных скрининговых методик является важным звеном в комплексе мероприятий на этапе первичной диагностики онкологической патологии шейки матки.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на совместных научно-практических конференциях и заседаниях сотрудников кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета ГОУ ВПО РГМУ МЗ РФ и КВКД № 1 ДЗ г. Москвы.

Основные положения работы доложены на научно-практической конференции Национального НИИ общественного здоровья «Роль здравоохранения в охране общественного здоровья» (Москва, 2004); научно-практической конференции «Концепции развития лабораторной службы» (Москва, 2004); IV научно-практической конференции «Терапия социально значимых заболеваний в дерматовенерологии. Новые лекарственные препараты и средства в дерматологии и косметологии» (Москва, 2004); 30-ом Европейском конгрессе по цитологии (Афины, Греция, 2004); 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004); юбилейной научно-практической конференции памяти профессора М.М. Желта-

кова «Хронические дерматозы: новые аспекты патогенеза и терапии. Инфекции, передаваемые половым путем» (Москва, 2004); X Междисциплинарном симпозиуме «Новое в дерматовенерологии, андрологии, акушерстве-гинекологии: наука и практика» (Москва, 2005).

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования используются в работе кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета ГОУ ВПО РГМУ МЗ РФ, КВКД № 1 ДЗ (г. Москва), ГКБ № 68 (г. Москва), а также в работе Центра Молекулярной Диагностики ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (г. Москва).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из списка сокращений, введения, 8 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.- Работа изложена на 163 страницах компьютерного текста, содержит 30 таблиц, 28 рисунков и 25 фотографий. Список литературы состоит из 209 источников (52 на русском языке, 157 на иностранных языках).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Объектом настоящего исследования явились 319 пациенток. В первую группу вошли 179 женщин, направленных в специализированный кабинет патологии шейки матки для уточнения диагноза в связи с наличием атипии в цитологических мазках или сомнитель-

ными/позитивными результатами предварительного кольпоскопи-ческого исследования или визуального осмотра, что позволило отнести данных пациенток к группе риска по цервикальной неопла-зии. Вторую группу- группу скрининга цервикальной неоплазии, составили 140 пациенток, посетивших венерологический кабинет.

Диагностические мероприятия у пациенток группы риска включали: клиническое обследование, рандомизированный забор материала для приготовления традиционного и тонкослойного цитологических мазков, кольпоскопическое обследование, прицельную биопсию, ПЦР-тестирование на присутствие ВПЧ ВКР и ВПЧ-пул, молекулярное генотипирование ВПЧ ВКР, ПЦР-анализ на присутствие других инфекционных агентов нижнего отдела гениталь-ного тракта; у пациенток группы скрининга - клиническое обследование, тонкослойный мазок и ПЦР диагностику ВПЧ и другой гени-тальной инфекции.

В качестве референтного метода использовали гистологическое исследование биоптата. Результаты морфологических исследований трактовались согласно современной классификации Бетесда, которая делит все плоскоклеточные интраэпителиальные поражения (ПИП) на две категории: низкой степени тяжести (Н-ПИП), объединяющей признаки папилломавирусной инфекции и цервикальную интраэпителиальную неоплазию первой степени (ЦИН 1), и высокой степени тяжести (В-ПИП), объединяющей ЦИН 2 и ЦИН 3.

Для приготовления традиционного цитологического препарата использовались одноразовые щетка Cervex Brush и пластиковый шпатель Эйра, последующая сухая фиксация мазка. Окрашивание

(комбинированным методом Май-Грюнвальда-Романовского-Гимзы по Паппенгейму) и интерпретация традиционных мазков осуществлялась в отделении патоморфологии МНИОИ им. П.А.Герцена.

Для приготовления тонкослойных препаратов методом жидкостной цитологии использовалась система CYTOSCREEN. После забора клеточного материала съемная головка пластиковой щетки Су-toprep помещалась во флакон со стабилизирующим раствором Cyto-screen. Стабилизирующий раствор позволяет сохранить структуру и иммуноцитохимические свойства клеток, избежать бактериального «засорения» образца, устойчив к высокой и низкой температурам и хранится вместе с исследуемым материалом в течение 2 лет. -

Флаконы с жидкостными клеточными образцами отправляли для дальнейшей обработки на кафедру клинической лабораторной диагностики РМАПО. В условиях лаборатории с помощью специального оборудования (шейкер, нефелометр, центрифуга) из присланной суспензии клеток готовили препараты, в которых клетки располагались в виде тонкого слоя (монослоя) на стандартном участке, предназначенном для микроскопирования. Тонкослойные микропрепараты окрашивались аналогично традиционным. Оценка традиционных и тонкослойных мазков производилась цитологами «слепо» по отношению к кольпоскопическому и гистологическому диагнозам.

Остаточную клеточную суспензию в дальнейшем использовали для ПЦР-диагностики ПВИ и другой генитальной инфекции в Центре Молекулярной Диагностики ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ.

Для одновременной амплификации участков ДНК Е1-Е2 генов трех групп ВПЧ ВКР (мультиплекс-ПЦР) использовалась тест-система «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин». ПЦР-анализ на наличие ДНК 14 типов ВПЧ ВКР (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 70) проводился в одной пробирке. Для последующего генотипирования ВПЧ использовались типоспецефические ПЦР тест-системы, также разработанные в ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ.

ДНК-диагностика различных инфекционных агентов гени-тального тракта проводилась с использованием следующих тест-систем: «АмплиСенс Chlamydia trachomatis-330/BKO-630», «АмплиСенс Mycoplasma hominis 330», «АмплиСенс Ureaplasma urea-lyticum 450», «АмплиСенс Neisseria gonorrhoeae», «АмплиСенс Ци-томегаловирус-500/ВКО-800», «АмплиСенс HSV I, II», «АмплиСенс Trichomonas vaginalis», «АмплиСенс Gardnerella vaginalis-355».

Для адекватной оценки эффективности диагностических методов определялись следующие операционные характеристики: чувствительность, специфичность, точность теста, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов, отношения правдоподобия. Взаимоотношения между данными тестирования и реальным наличием или отсутствием патологии сводились в специальные четырехпольные таблицы («латинский квадрат»). Достоверность различий показателей изучаемых тестов определялась с помощью критерия Стьюдента. Различие между сравниваемыми величинами считалось достоверным при уровне значимости р<0.05. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с помощью программы «Microsoft Excel».

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ клинико-анамнестических данных свидетельствовал, что для пациенток обеих изучаемых групп характерно нерегулярное использование барьерных методов контрацепции, наличие двух и более половых партнеров, высокая частота перенесенных урогени-тальных инфекций и распространенность курения.

Как известно, ПВИ шейки матки клинически бессимптомна и жалобы, которые предъявляли 47,4% пациенток группы риска и 53,9% пациенток группы скрининга, были следствием сопутствующих вагинальных инфекций. Основными жалобами были следующие: обильные или умеренные выделения из половых путей, в части случаев сопровождаемые зудом или неприятным запахом, ощущение раздражения или чувство дискомфорта в области наружных половых органов, болезненность при половом акте. По результатам ретроспективного анализа при наличии ПИП жалобы имели 58,6% пациенток группы риска и 63,7% - группы скрининга.

В результате анализа традиционных цервикальных мазков пациенток группы риска клеточная атипия была обнаружена в 20,5% случаев: в 10,2% микропрепаратов диагностированы Н-ПИП, в 10,3% - В-ПИП. В итоге жидкостного цитологического исследования клеточная атипия обнаружена у 57,1% пациенток: у 45,5% - Н-ПИП, у 11,5%-В-ПИП.

Показатель чувствительности жидкостной цитологии в диагностике ПИП в целом (74,7%) более чем в два раза превысил соответствующий показатель традиционной (30,5%). Чувствительность жидкостной цитологии в диагностике В-ПИП (93,3%) также досто-

верно превысила аналогичный показатель традиционной (60,0%). Это особо важно, так как свидетельствует, что при использовании жидкостного метода только 6,7% пациенток с В-ПИП, мазки которых ложно расценены как нормальные, будут упущены клиницистом, тогда как при использовании традиционной методики доля этих пациенток во много раз больше - 40,0%.

По результатам ПЦР-тестирования присутствие ВПЧ ВКР констатировано у половины пациенток группы риска (53,2%), вне зависимости от наличия или отсутствия атипичных изменений на шейке матки: у 43,9% - с гистологической нормой, у 40,0% - с реактивными изменениями эпителия и у 41,5% - с Н-ПИП. Единственным гистологическим заключением, при котором ВПЧ ВКР определялись в 100% случаев, было В-ПИП. Сопоставление результатов гистологического исследования и ВПЧ ВКР-диагностики показало наличие канцерогенных типов ВПЧ у 60,0% пациенток с ПИП.

Чувствительность ВПЧ ВКР-теста для ПИП в целом составила 60,0%, специфичность - 57,4%, для В-ПИП - 100% и 57,9% соответственно.

С учетом преимуществ каждого из двух скрининговых методов (жидкостной цитологии и ВПЧ ВКР-тестирования) мы оценили, насколько их совместное применение улучшает эффективность диагностики поражений шейки матки. При оценке результатов комбинированного тестирования учитывали любые позитивные заключения, т.е. когда результат хотя бы одного из двух методов был позитивным.

Показатель чувствительности комбинированного скрининга для ПИП в целом составил 83,2%, для В-ПИП - 100%, т.е. комбинированное тестирование, которое осуществлялось из единого жидкостного образца, показало себя наиболее эффективным способом скрининга цервикальных папилломавирусных поражений.

Результаты генотипирования продемонстрировали, что у 50,6% пациенток группы риска присутствовал один тип, у 49,4% -от двух до четырех типов ВПЧ ВКР. Доминирующее положение занимает ВПЧ 16 (54,4%), к числу распространенных относятся 31, 33 и 18 типы (26,3%, 15,8% и 14,0% соответственно). Другие типы ВПЧ ВКР обнаруживались с меньшей частотой (от 12,3% до 1,8%). Из всех возможных для детекции 14 ВКР типов у обследованных пациенток группы риска не были обнаружены только два: 53 и 70.

Сравнительный анализ результатов бактериоскопического исследования традиционных и тонкослойных мазков показал большую информативность тонкослойных микропрепаратов в оценке степени выраженности воспалительной реакции, в идентификации морфотипов бактерий и диагностике влагалищных дисбиозов.

В результате ДНК-диагностики присутствие инфекционного агента обнаружено у 54,5% пациенток группы риска. Наиболее часто встречались: Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis (в 72,9% и 45,9% образцов соответственно). Реже были идентифицированы: Mycoplasma hominis - у 5,9% пациенток, Cytomegalovirus -у 3,5%, Chlamydia trachomatis - у 2,4%, Herpes simplex virus - в 1,2% случаев. Ни в одном из исследуемых образцов не были обнаружены Neisseria gonorrhoeae и Trichomonas vaginalis.

При тщательном сопоставлении гистологических диагнозов, полученных у пациенток группы риска, и результатов диагностики генитальной инфекции оказалось, что частота обнаружения инфекционных агентов хоть и была высокой, но не зависела от наличия или отсутствия ВПЧ-поражения: инфекционные агенты были обнаружены у 55,4% пациенток с Н-ПИП, у 63,3% с В-ПИП, у 50,0% пациенток с реактивными изменениями эпителия и у 78,0% - с гистологической нормой.

Таким образом, жидкостный цитологический образец является высокоинформативным материалом как для микроскопического поиска клеточных атипий и бактериоскопии, так и для проведения генетической диагностики бактериальной и вирусной генитальной инфекции.

На основании преимуществ жидкостной цитологии, доказанных в группе риска, мы применили этот метод для обследования пациенток, посетивших кабинет врача-венеролога.

В результате тонкослойного цитологического исследования цервикальная атипия была диагностирована у 41,7% пациенток: у 34,8% - Н-ПИП, у 6,9% - В-ПИП. Это значительно выше аналогичного показателя в общей популяции женщин и, значит, относит пациенток венерологической клиники к группе риска по цервикальной неоплазии.

По результатам ВПЧ ДНК-тестирования остаточного жидкостного образца с помощью мультипраймерной ПЦР тест-системы «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин» присутствие ВПЧ ВКР констатировано у 31,7% пациенток группы скрининга.

Ранее мы доказали, что наиболее чувствительным способом поиска ПИП в целом, и практически исключающим потерю В-ПИП, является совместное использование цитологического метода и ВПЧ ВКР-тестирования. С учетом результатов комбинированного тестирования пациенток группы скрининга на дальнейшее кольпоскопи-ческое исследование необходимо направить 56,1% из них, что только на 15,0% меньше, чем в группе риска и еще раз подтверждает актуальность поиска атипий шейки матки у пациенток врача-венеролога.

Анализ результатов генотипирования жидкостного цитологического материала 44 ВПЧ ВКР-позитивных паценток врача-венеролога позволил выявить превалирующие ВКР типы: 16 тип - у 31,8% пациенток, 52 тип - у 25,0% и 31 тип, найденный в 20,4% случаев. В меньшем числе случаев определялись 33 и 56 типы ВПЧ (18,2% и 15,9% соответственно). Другие онкогенные типы были идентифицированы еще реже - от 9,1% до 4,5% случаев. Ни в одной из исследуемых проб не были обнаружены только 39, 53 и 70 типы ВПЧ.

В результате бактериоскопии тонкослойных микропрепаратов пациенток группы скрининга нормальное состояние биоценоза нижнего отдела генитального тракта констатировано в 58,9% случаев; признаки воспаления обнаружены в 20,1%; грибы рода Candida -в 6,5% мазках; бактерии рода Mobiluncus - в 4,3%; Leptotrix - в 3,6%; «ключевые» клетки, являющиеся одним из диагностических критериев бактериального вагиноза - в 10,1% случаях.

Бактериоскопия и ПЦР-диагностика урогенитальных инфекций позволила определить, что количество жидкостных образцов с единственным инфекционным агентом в группе скрининга, также как и в группе риска, преобладало над числом образцов с микст-инфекцией - 64,1% и 35,9% соответственно. Доминировали в группе скрининга также Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis (70,3% и 43,7% соответственно). Доли проб с этими инфекционными агентами в группе риска (93,6%) и в группе скрининга (95,1%) практически идентичны. Остальные микроорганизмы были идентифицированы значительно реже: Mycoplasma hominis - у 23,5%, Chlamydia trachomatis - у 7,8% и Neisseria gonorrhoeae - у 4,7% пациенток группы скрининга. Ни в одном из исследуемых образцов пациенток группы скрининга не были обнаружены Trichomonas vaginalis, Herpes simplex virus и Cytomegalovirus.

Сопутствующие инфекционные агенты обнаружены у половины пациенток с В-ПИП, у 54,3% с Н-ПИП, у 63,2% пациенток с реактивными изменениями эпителия и у 48,8% - с цитологической нормой, что, как и в группе риска, демонстрирует отсутствие зависимости от наличия цервикального папилломавирусного поражения.

Таким образом, обобщая результаты обследования пациенток группы скрининга, следует отметить, что для них характерна высокая частота субклинической папилломавирусной инфекции (41,7%), в том числе высококанцерогенными типами ВПЧ (41,4%). Это диктует целесообразность внедрения цервикального скрининга в пере-

чень рутинных диагностических мероприятий в венерологической практике.

ВЫВОДЫ

1. Генитальная папилломавирусная инфекция высококанцерогенными типами ВПЧ обнаружена у 31,7% пациенток врача-венеролога: у 45,5% из них в латентной форме, у 54,5% - в субклинической, представленной плоскоклеточными интраэпителиальны-ми поражениями (ПИП) шейки матки. Эти поражения не определяются визуально и не имеют клинической симптоматики, но ввиду высокого онкогенного потенциала требуют своевременной диагностики. Жалобы, которые имелись у 63,7% пациенток с ПИП, были обусловлены наличием сопутствующей генитальной инфекции и/или влагалищного дисбиоза.

2. Чувствительность жидкостной цитологии в диагностике субклинической папилломавирусной инфекции (74,7%) значительно превышает аналогичный показатель традиционного цитологического исследования (30,5%). Наибольшую чувствительность (93,3%) жидкостная цитология демонстрирует в диагностике плоскоклеточных интраэпителиальных поражений высокой степени тяжести (В-ПИП).

3. Высококанцерогенные типы ВПЧ (ВКР ВПЧ) обнаружены у 60,0% пациенток с ПИП шейки матки (у 41,5% - с Н-ПИП и 100% -с В-ПИП). У 50,6% выявлен один онкогенный тип, у остальных 49,4% - от двух до четырех. Доминирующее положение занимает 16 тип (54,4%), к числу также распространенных относятся 31, 33 и 18 типы (26,3%, 15,8% и 14,0% соответственно), с меньшей частотой

(от 12,3% до 1,8%) обнаруживались 52,39, 56, 58, 51, 45, 35, 59 и 66 типы. Разнообразие онкогенных вирусных типов у пациенток с ПИП шейки матки подтверждает рациональность использования ПЦР тест-системы для одномоментной детекции ДНК 14 онкоген-ных типов.

4. Чувствительность ВПЧ ВКР-тестирования уступает аналогичному показателю жидкостного цитологического метода в детекции интраэпителиальных поражений в целом (60,0% и 74,7% соответственно) и превосходит его в диагностике В-ПИП (100% и 93,3% соответственно). Комбинированное применение указанных методов повышает чувствительность диагностики ПИП в целом (83,2%) и практически исключает «проскальзывание» через сеть скрининга поражений высокой степени тяжести.

5. Жидкостный цитологический образец может быть использован для ДНК-диагностики полного спектра урогенитальных инфекций и для бактериоскопии. Тонкослойный цитологический мазок более информативен, по сравнению с традиционным, в оценке степени выраженности воспалительной реакции, в идентификации морфо-типов бактерий и дифференциальной диагностике влагалищных дисбиозов.

6. Жидкостный цитологический образец является информативным и удобным материалом для использования в венерологической практике с целью диагностики субклинической папилломавирусной и других генитальных инфекций. В результате исследования жидкостного цитологического образца ПИП диагностированы у 41,7% пациенток врача-венеролога. ВКР типы ВПЧ обнаружены у 31,7%

обследованных, доминирующим являлся ВПЧ 16 (31,8%). Частота идентификации ДНК других инфекционных агентов (46,0%) не зависела от наличия или отсутствия папилломавирусного поражения.

7. Высокая частота субклинической папилломавирусной инфекции, в том числе ВКР типами ВПЧ, относит пациенток врача-венеролога к группе риска по цервикальной неоплазии. Комбинированная диагностика (тонкослойный цитологический мазок и ВКР ВПЧ-тестирование) с использованием единого жидкостного образца является эффективным и рациональным способом скрининга церви-кальной неоплазии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для эффективного функционирования программы цервикаль-ного скрининга целесообразно его внедрение в работу венерологической службы. Такой подход позволит наиболее полно охватить и контролировать группы повышенного риска по развитию церви-кальной патологии.

2. В качестве классификации папилломавирусных поражений шейки матки в клинической практике рекомендуется использовать современную терминологию Бетесда системы.

3. Новая диагностическая технология - жидкостная тонкослойная цитология - повышает эффективность цервикального скрининга и может быть рекомендована для замещения традиционного цитологического мазка.

4. У пациенток группы риска по цервикальной неоплазии наиболее эффективным способом скрининга, исключающим проскальзы-

вание тяжелых цервикальных поражений, является комбинированное тестирование - тонкослойное цитологическое исследование и ДНК-диагностика онкогенных типов вируса, которое может осуществляться из единого жидкостного образца. При позитивном результате хотя бы одного из двух тестов пациентка должна быть направлена на кольпоскопическое исследование.

5. Для диагностики ПВИ шейки матки целесообразно использование мультипраймерной тест-системы для одномоментной идентификации ДНК 14 типов ВПЧ ВКР.

6. Остаточная клеточная суспензия может быть использована врачом-венерологом для дополнительных исследований: молеку-лярно-биологических на полный спектр урогенитальных инфекций и бактериоскопии.

7. Использование жидкостной системы в клинической работе врачей-венерологов позволяет архивировать набранный клеточный материал и организовать «живые» «банки» данных, с помощью которых можно многократно проводить необходимые и уточняющие исследования, так как стабилизирующий раствор системы сохраняет набранный материал в течение нескольких лет.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Минкина Г.Н., Калинина B.C., Минкина О.В. Вагинальный микробиоценоз при папилломавирусной инфекции шейки матки // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы урогениталь-ных инфекций, передаваемых половым путем». - М, 2003. - С. 78.

2. Минкина О.В., Минкина Г.Н., Шипулина О.Ю. и др. Применение жидкостной цитологической системы CYTO SCREEN в клинике ИППП для комбинированной диагностики генитальных инфекций и интраэпителиаль-ных поражений шейки матки // Тез. научно-практической конференции памяти А.Л. Машкиллейсона. -М., 2004. - С. 55.

3. Шипулина О.Ю., Минкина ОБ., Слугина Т.В. и др. Сравнительная оценка чувствительности жидкой цитологии (ЖЦ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) как скрининговых методов выявления предраковых изменений эпителия шейки матки // Материалы научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней»/ Раздел 1 «Генодиагностика инфекций, передаваемых половым путем». Том 1.- М., 2004. -С. 147-151.

4. Шипулина О.Ю., Куевда ДА., Минкина О.В. и др. Определение относительной концентрации ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) в эпителии шейки матки при дисплазиях различной степени тяжести // Материалы научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней»/ Раздел 4 «Новые технологии в генодиагностике инфекционных болезней». - Том 1. - М., 2004. - С. 390- 394.

5. Минкина Г.Н., Шипулина О.Ю., Минкина О.В. и др. Результаты ВПЧ-диагностики при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях шейки матки // Тез. Российского конгресса «Генитальные инфекции и патология шейки матки». — М., 2004. - С. 62.

6. Минкина Г.Н., Минкина О.В., Чепурная Ю.Г. и др. Сравнительная эффективность традиционной цитологии и кольпоскопии в скрининге заболеваний шейки матки // Материалы YI Российского форума «Мать и дитя» - М., 2004 - С. 420.

7. Минкина О.В., Скрипкин Ю.К., Шипулина О.Ю. Состояние цервикального эпителия при папилломавирусной инфекции типами высокого канцерогенного риска // Тез. Всероссийской Конференции

канцерогенного риска // Тез. Всероссийской Конференции Дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов». - Н. Новгород, 2004. - С. 74.

8. Минкина О.В., Скрипкин Ю.К., Шабалова И.П. и др. Жидкостная цитология в диагностике папилломавирусной инфекции шейки матки // Тез. Всероссийской Конференции Дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов». - Н. Новгород, 2004. - С. 74- 75.

9. Минкина Г.Н., Минкина О.В., Шипулина О.Ю. Распределение онко-генных типов вируса папилломы человека при плоскоклеточных интраэпи-телиальных поражениях шейки матки высокой степени тяжести // Тез. Всероссийской Конференции Дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов». - Н. Новгород, 2004.-С. 75.

10. Shipulina О., Minkina О., Kuevda D. et al. Thin Prep cytology and high risk HPV real-time PCR in cervical cancer screening // EUROGIN 2004. HPV Infection and Cervical Cancer Prevention. Priorities and New directions / International expert meeting. - France, Nice, 2004. - P. 48.

11. Минкина Г.Н., Чепурная Ю.Ю., Минкина О.В. Эпидемиология, стандартизация и скрининг-диагностика некоторых гинекологических заболеваний // Материалы научно-практической конференции Национального НИИ общественного здоровья РАМН «Роль здравоохранения в охране общественного здоровья». — М., 2004. — С. 105-106.

12. Shabalova I.P., Kasojan К.Т., Minkina O.V. et al. Liquid-based and traditional gynecological cytology: a comparative study // J. Cytopathology. - 2004. -Vol. 15.-№2.-P. 37.

Заказ № 345 Подписано в печать 11.03.05 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1 ООО "Цифровичок", тел. 741-18-71,505-28-72

www.cfr.ru

/% ti \ «Orne

V f s i )

\ -S * 5 У

22 MAP mVC-'

Актуальность проблемы

Инфекционные заболевания нижнего отдела генитального тракта являются одной из наиболее частых причин обращения женщин репродуктивного возраста в специализированные лечебные учреждения. В настоящее время при объективной оценке этой категории больных серьёзное внимание уделяется состоянию шейки матки, поскольку современные данные свидетельствуют об инициирующем значении в возникновении и прогрессировании патологических процессов цервикального эпителия возбудителей бактериальной и, особенно, вирусной природы (2, 5, 15,19, 26, 73, 197).

Рак шейки матки является первой злокачественной опухолью с доказанной вирусной этиологией (101). Многочисленными эпидемиологическими исследованиями установлено и официально заявлено ВОЗ, EUROGIN и Национальным Институтом Здоровья США, что вирус папилломы человека (ВПЧ) — это основной экзогенный фактор цервикального канцерогенеза (11, 70, 71, 75, 142). Современные данные свидетельствуют, что ДНК ВПЧ присутствует в 99% зарегистрированных в мире случаев цервикальных опухолей (191, 197). К настоящему времени идентифицировано более 100 различных типов ВПЧ, около 30 из которых передаются половым путём и инфицируют генитальный тракт (33, 145). На основании вероятности вызывать предраковые изменения и инвазивный рак типы ВПЧ делятся на группы низкого и высокого онкогенного риска (25).

Папилломавирусная инфекция (ПВИ) может протекать в клинической форме - классические остроконечные кондиломы, которые являются проявлением инфицированности доброкачественными типами ВПЧ и легко диагностируются. Значительно большую опасность представляет субклиническая ПВИ, которая нередко вызывается онкогенными типами ВПЧ и представлена плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями (ПИП). Эти поражения не определяются визуально и могут прогрессировать до цервикалыюго рака.

Рак шейки матки является второй по частоте злокачественной опухолью у женщин репродуктивного возраста. Ежегодно в мире от цервикалыюго рака умирает около 231 ООО женщин (157). Большинство этих случаев регистрируется в тех странах, где не организованы системные профилактические программы скрининга цервикальной неоплазии (62).

В течение многих лет методологической базой скрининга рака шейки матки остаются цитологические цервикальные мазки (32, 45, 162). К сожалению, современный анализ демонстрирует ограниченную чувствительность и специфичность этого метода. По данным разных авторов уровень ложно-негативных мазков, в том числе и у женщин с инвазивным цервикальным раком, достигает 70% (97, 203). В связи с этим рассматривается возможность использования новых скрининговых технологий, анализируются их достоинства и недостатки.

Объектом активного изучения в настоящее время является жидкостный метод подготовки мазка, с помощью которого преодолевается большинство проблем, имеющих отношение к его качеству и влияющих на конечное цитологическое заключение (18, 60, 131, 134). Вместе с тем, преимущества жидкостной цитологии относительно традиционного Пап-теста окончательно не доказаны и требуют дальнейших полноценных рандомизированных клинических исследований (109, 134, 171).

Поскольку степень цитологической атипии оценивается с определенной долей субъективизма, в то время как ВПЧ-генетическая информация всегда присутствует в цервикальных интраэпителиальных поражениях, независимо от степени тяжести, для первичной диагностики инфекционной патологии шейки матки предлагается использовать молекулярно-биологические технологии (70). В последние годы широко обсуждается необходимость включения генетических тестов (Hybrid Capture, ПЦР) на все идентифицированные в настоящее время высококанцерогенные типы ВПЧ в программу цервикального скрининга. Считается, что присутствие ДНК ВПЧ в шейке матки поможет идентифицировать от 20 до 30% женщин с цервикальными заболеваниями, которые имели ложно-отрицательные цитологические результаты (161). Вместе с тем, целесообразность скрининга на ВПЧ подвергается сомнению, поскольку большинство молодых женщин с ВПЧ в генитальном тракте имеют нормальную цитологию, низкий риск цервикального рака и самостоятельно элиминируют вирус в течение 12-24 месяцев (201).

И, наконец, с целью максимально раннего выявления патологии шейки матки и вовлечения наибольшего числа женщин в программу цервикального скрининга, важнейшей задачей практического здравоохранения является внедрение современных скрининговых методик цервикальной неоплазии во все медицинские учреждения, специализирующиеся на диагностике и лечении заболеваний нижнего отдела генитального тракта, а следовательно, в перечень рутинных мероприятий в клиниках ИППП (19, 198).

Цель исследования

Повышение эффективности диагностики папилломавирусных поражений шейки матки с помощью новых скрининговых технологий: жидкостной тонкослойной цитологии и мультипраймерного ПЦР-тестирования

Задачи исследования:

1. Определить и сравнить эффективность традиционной и жидкостной цитологии в диагностике субклинической папилломавирусной инфекции -плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (ПИП) шейки матки.

2. Изучить результаты использования ПЦР тест-системы для одномоментной идентификации 14 высококанцерогенных типов ВПЧ и определить распространенность различных ВКР типов у пациенток с ПИП.

3. Провести сравнительный анализ эффективности жидкостной цитологии, ВПЧ ВКР-тестирования и их комбинированного использования в диагностике ПИП.

4. Проанализировать и сравнить результаты микроскопической диагностики генитальной инфекции в традиционных и тонкослойных цитологических мазках.

5. Изучить возможность использования жидкостного цитологического образца для ДНК-диагностики генитальных инфекций.

6. Оценить результаты использования жидкостного цитологического образца для диагностики плоскоклеточных интраэпителиальных поражений, ПВИ и другой генитальной инфекции у пациенток врача-венеролога.

Научная новизна

В данной работе впервые на основании цито-гистологических сопоставлений изучены основные стабильные операционные характеристики жидкостной тонкослойной цитологии у пациенток специализированного кабинета по цервикальной патологии и у пациенток врача-венеролога.

На значительном клиническом материале произведена сравнительная оценка эффективности, проанализированы преимущества и недостатки традиционной и жидкостной тонкослойной цитологии.

Получены данные о дополнительных диагностических возможностях жидкостных цитологических образцов для проведения бактериоскопического исследования и генетической детекции (ПЦР) различных инфекционных агентов нижнего отдела генитального тракта, в том числе 14 онкогенных типов ВПЧ.

На основании проведенного исследования определена наиболее эффективная методика скрининга цервикальной патологии с использованием комбинированного тестирования (жидкостной цитологии и ВПЧ ВКР-теста).

Анализ полученного материала позволил оценить пациенток врача-венеролога, как группу повышенного риска по развитию цервикальной онкологической патологии.

Практическая значимость

Проведенные исследования доказали более высокую эффективность жидкостной тонкослойной цитологии в диагностике плоскоклеточных интра-эпителиальных поражений шейки матки в сравнении с традиционной методикой.

Разностороннее изучение жидкостного образца позволило также рекомендовать его использование в практике врача-венеролога, как наиболее экономичного, современного и информативного метода, для проведения микроскопического и молекулярно-биологического исследований.

Рекомендована схема комбинированного использования тонкослойной цитологии и ВПЧ ВКР-тестирования с помощью ПЦР тест-системы на 14 он-когенных вирусных типов, как наиболее эффективного подхода в поиске атипичных изменений шейки матки.

Результаты данного исследования будут способствовать внедрению новых скрининговых технологий в работу венерологической и гинекологической служб, консолидации врачей разных специальностей на этапе первичного выявления начальных форм цервикальной патологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Жидкостная тонкослойная цитология является наиболее эффективным цитологическим способом скрининга папилломавирусных поражений шейки матки, удобна для бактериоскопии и ДНК-диагностики бактериальной и вирусной гениталыюй инфекции.

2. Наиболее рациональным способом скрининга, позволяющим минимизировать ошибки в диагностике патологии шейки матки и практически исключающим вероятность проскальзывания тяжелых цервикальных поражений, является комбинированное исследование с применением цитологического метода и ДНК-тестирования на ВПЧ ВКР.

3. Детекцию ВПЧ ВКР наиболее рационально осуществлять с помощью ПЦР тест-системы для идентификации в ходе одной постановочной реакции вирусной ДНК сразу 14 онкогенных типов.

4. Внедрение в рутинную практику врачей-венерологов цервикальных скрининговых методик является важным звеном в комплексе мероприятий на этапе первичной диагностики онкологической патологии шейки матки.

Структура работы

Диссертация состоит из списка сокращений, введения, 8 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 163 страницах компьютерного текста, содержит 30 таблиц, 28 рисунков и 25 фотографий. Список литературы состоит из 209 источников (52 на русском языке, 157 на иностранных языках).

ВЫВОДЫ

1. Генитальная папилломавирусная инфекция высококанцерогенными типами ВПЧ обнаружена у 31,7% пациенток врача-венеролога: у 45,5% из них в латентной форме, у 54,5% - в субклинической, представленной плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями (ПИП) шейки матки. Эти поражения не определяются визуально и не имеют клинической симптоматики, но ввиду высокого онкогенного потенциала требуют своевременной диагностики. Жалобы, которые имелись у 63,7% пациенток с ПИП, были обусловлены наличием сопутствующей генитальной инфекции и/или влагалищного дисбиоза.

2. Чувствительность жидкостной цитологии в диагностике субклинической папилломавирусной инфекции (74,7%) значительно превышает аналогичные показатели традиционного цитологического исследования (30,5%). Наибольшую чувствительность (93,3%) жидкостная цитология демонстрирует в диагностике плоскоклеточных интраэпителиальных поражений высокой степени тяжести (В-ПИП).

3. Высококанцерогенные типы ВПЧ (ВКР ВПЧ) обнаружены у 60,0% пациенток с ПИП шейки матки (у 41,5% - с Н-ПИП и 100% - с В-ПИП). У 50,6% выявлен один онкогенный тип, у остальных 49,4% - от двух до четырех. Доминирующее положение занимает 16 тип (54,4%), к числу также распространенных относятся 31, 33 и 18 типы (26,3%, 15,8% и 14,0% соответственно), с меньшей частотой (от 12,3% до 1,8%) обнаруживались 52, 39, 56, 58, 51, 45, 35, 59 и 66 типы. Разнообразие онкогенных вирусных типов у пациенток с ПИП шейки матки подтверждает рациональность использования ПЦР тест-системы для одномоментной детекции ДНК 14 онкогенных типов.

4. Чувствительность ВПЧ ВКР-тестирования уступает аналогичному показателю жидкостного цитологического метода в детекции интраэпителиальных поражений в целом (60,0% и 74,7% соответственно) и превосходит его в диагностике В-ПИП (100% и 93,3% соответственно). Комбинированное применение указанных методов повышает чувствительность диагностики ПИП в целом (83,2%) и практически исключает «проскальзывание» через сеть скрининга поражений высокой степени тяжести.

5. Жидкостный цитологический образец может быть использован для ДНК-диагностики полного спектра урогенитальных инфекций и для бактериоскопии. Тонкослойный цитологический мазок более информативен, по сравнению с традиционным, в оценке степени выраженности воспалительной реакции, в идентификации морфотипов бактерий и дифференциальной диагностике влагалищных дисбиозов.

6. Жидкостный цитологический образец является информативным и удобным материалом для использования в венерологической практике с целью диагностики субклинической папилломавирусной и других генитальных инфекций. В результате исследования жидкостного цитологического образца ПИП диагностированы у 41,7% пациенток врача-венеролога. ВКР типы ВПЧ обнаружены у 31,7% обследованных, доминирующим являлся ВПЧ 16 (31,8%). Частота идентификации ДНК других инфекционных агентов (46,0%) не зависела от наличия или отсутствия папилломавирусного поражения.

7. Высокая частота субклинической папилломавирусной инфекции, в том числе ВКР типами ВПЧ, относит пациенток врача-венеролога к группе риска по цервикальной неоплазии. Комбинированная диагностика (тонкослойный цитологический мазок и ВКР ВПЧ-тестирование) с использованием единого жидкостного образца является эффективным и рациональным способом скрининга цервикальной неоплазии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для эффективного функционирования программы цервикалыюго скрининга целесообразно его внедрение в работу венерологической службы. Такой подход позволит наиболее полно охватить и контролировать группы повышенного риска по развитию цервикальной патологии.

2. В качестве классификации папилломавирусных поражений шейки матки в клинической практике рекомендуется использовать современную терминологию Бетесда системы.

3. Новая диагностическая технология - жидкостная тонкослойная цитология - повышает эффективность цервикалыюго скрининга и может быть рекомендована для замещения традиционного цитологического мазка.

4. У пациенток группы риска по цервикальной неоплазии наиболее эффективным способом скрининга, исключающим проскальзывание тяжелых церви-кальных поражений, является комбинированное тестирование - тонкослойное цитологическое исследование и ДНК-диагностика онкогенных типов вируса, которое может осуществляться из единого жидкостного образца. При позитивном результате хотя бы одного из двух тестов пациентка должна быть направлена на кольпоскопическое исследование.

5. Для диагностики ПВИ шейки матки целесообразно использование муль-типраймерной тест-системы для одномоментной идентификации ДНК 14 типов ВПЧ ВКР.

6. Остаточная клеточная суспензия может быть использована врачом-венерологом для дополнительных исследований: молекулярно-биологических на полный спектр урогенитальных инфекций и бактериоскопии.

7. Использование жидкостной системы в клинической работе врачей-венерологов позволяет архивировать набранный клеточный материал и организовать «живые» «банки» данных, с помощью которых можно многократно проводить необходимые и уточняющие исследования, так как стабилизирующий раствор системы сохраняет набранный материал в течение нескольких лет.