Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Растворимые дифференцировочные антигены и молекулы гистосовместимости в сыворотке крови больных раком лёгкого

на правах рукописи

ПЕГОВ Роман Геннадьевич

Растворимые дифференцировочные антигены и молекулы гистосовместимости в сыворотке крови больных раком лёгкого

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 14.01.12 - онкология

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

АВТОРЕФЕРАТ

Москва 2010

003492530

Работа выполнена в ГОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия и в ГОУ ВПО Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Новиков Виктор Владимирович доктор медицинских наук, профессор Алясова Анна Валерьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Калюжин Олег Витальевич доктор медицинских наук, профессор Горшков Вячеслав Юрьевич

Ведущая организация:

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Росмедтехнологий.

Защита состоится «_»_2010 года в «_» часов на заседании диссертационного совета Д. 208.040.08 при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: 119991, Москва, ул.Трубецкая, д.8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49.

Автореферат разослан «_»_2010 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук,

профессор Миронов Андрей Юрьевич.

Актуальность темы

Злокачественные новообразования лёгкого занимают первое место (20-30%) в структуре онкологической заболеваемости мужского населения стран Западной и Центральной Европы, постсоветских государств, Северной и Южной Америки (Parkin D.M., 1992). По данным Международного агентства по изучению рака в мире ежегодно диагностируется около 1 млн. новых случаев рака лёгкого, что составляет более 12% от числа всех выявляемых злокачественных новообразований. В среднем каждые 8 минут регистрируется новый случай заболевания (Трахтенберг А.Х. и др., 2000, Чиссов В.И. и др., 2007). Неуклонно возрастающая заболеваемость раком и другими злокачественными новообразованиями лёгких, поздняя диагностика и, связанные с этим, низкие показатели операбельности и резектабельности, относительно низкая 5-летняя выживаемость, весьма ограниченные возможности основных методов лечения (хирургического, лучевого и лекарственного), определяют актуальность и социальную значимость данной патологии (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2006, Полоцкий Б.Е., и др., 2008). Остаются малоизученными общебиологические критерии прогноза рака лёгкого и значение иммунологических нарушений в патогенезе заболевания.

Важную роль в регуляции противоопухолевого иммунного ответа играют растворимые формы (s-формы) мембранных антигенов клеток иммунной системы, образующиеся за счет их шеддинга с поверхности клеток или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Получены данные о том, что они могут выполнять функции ограничителей иммунных реакций или же выступать в роли активаторов иммунологических процессов (Новиков В.В., Караулов A.B., Барышников А.Ю., 2008). Изучение реакций иммунной системы организма опухоленосителя открывает новые возможности для понимания механизмов канцерогенеза, выделения групп риска развития неопластических процессов, оценки эффективности лечебных воздействий, прогнозирования дальнейшего течения заболеваний, в частности, выявление раннего метастазирования на субклинической стадии. Однако в доступной литературе остаётся мало освещенным вопрос иммунологической диагностики и мониторинга рака лёгкого.

Среди маркеров, используемых для выявления и прогнозирования течения опухолевого процесса, выделяют группу белков, экспрессируе-мых опухолевыми клетками и названных раково-тестикулярными анти-

"U

\ J

генами. Но данные о наличии матричной РНК раково-тестикулярных антигенов у больных раком лёгкого в процессе противоопухолевой терапии в современной литературе практически отсутствуют.

Цель исследования: оценить содержание суммарных и олигомер-ных фракций растворимых форм ряда мембранных антигенов клеток иммунной системы в сыворотке крови, в том числе во взаимосвязи с наличием матричных РНК раково-тестикулярных антигенов N Y-ESO-1 и MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого.

Задачи:

1. Охарактеризовать сывороточные уровни растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 антигенов, олигомерных форм CD 18, CD50 и CD95 антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR в сыворотке крови больных раком лёгкого и их изменения в зависимости от особенностей гистологического строения опухоли и распространённости опухолевого процесса.

2. Проанализировать изменения содержания сывороточного уровня растворимых форм мембранных антигенов CD38, олигомерных форм CD 18, CD50 и CD95 антигенов, суммарных форм CD50 и CD95 антигенов растворимых молекул HLA I класса, HLA-DR после проведённого противоопухолевого лечения.

3. Изучить возможность существования мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1, MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого и выявить взаимосвязи между сывороточным уровнем растворимых антигенов и наличием мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1, MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого.

Научная новизна работы Впервые дана характеристика сывороточного содержания растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 мембранных антигенов, олигомерных форм CD 18, CD50 и CD95 мембранных антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR у больных раком лёгкого, в том числе с учётом гистологического строения опухоли и степени распространённости заболевания.

Выявлены взаимосвязи сывороточных уровней исследованных растворимых антигенов, указывающие на их совместную роль в развитии иммунного ответа при раке лёгкого.

Обнаружены мРН К раково-тестикулярных антигенов N Y-ESO-1 и MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого. Установлена взаимосвязь

между наличием мРНК раково-тестикулярных антигенов и сывороточным уровнем олигомерных форм CD18, CD38 растворимых антигенов и суммарной фракции CD50 антигена.

Научно-практическая значимость Сведения о содержании растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы могут быть использованы в изучении патогенеза рака лёгкого, в том числе механизмов ухода злокачественных опухолей лёгкого от иммунного надзора.

Полученные данные имеют мониторинговую значимость и могут быть использованы для разработки новых подходов к оценке эффективности проведённого лечения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Развитию рака лёгкого сопутствует статистически значимое повышение сывороточного содержания растворимой формы олигомерного CD18 антигена и достоверное понижение сывороточного уровня олигомерного CD50 антигена и растворимых молекул HLA I класса.

2. Рак лёгкого сопровождается появлением в крови больных мРНК ра-ково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и MAGE-A1-A6.

3. Проведение радикальной операции приводит к повышению сывороточного содержания растворимых форм олигомерных CD18 и CD50 антигенов.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2005.), X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2006.), V Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых учёных и студентов по медицине (Тула, 2006.), Всероссийской конференции "Нанотехнологии в диагностике опухолей" (Москва, 2009.), X Международном Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофарма-кологии» (Казань, 2009.), научно-технической конференции Нанотехно-логического общества России «Развитие нанотехнологического проекта в России: состояние и перспективы», секция: «Нанотехнологии в онкологии» (Москва, 2009.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК - 4.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, 24 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 2 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы содержит 44 отечественных и 110 иностранных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включены 94 больных раком лёгкого с различными морфологическими вариантами опухоли - немелкоклеточный рак, п=86 (91,5%), в том числе плоскоклеточный неороговевающий рак лёгкого, п=57 (60,6%), плоскоклеточный ороговевающий рак лёгкого, п=15 (16%), железистый рак лёгкого, п=10 (10,6%), смешанный рак, п=1(1,1%), злокачественный карциноид, п=3(3,2%) и мелкоклеточный рак лёгкого, п=8 (8,5%). На основании данных клинико-инструментального исследования и с учётом постхирургической классификации IA-IB стадии имели место у 25 больных (26,6%), IIA - у 7 больных (7,5%), IIB - у 22 больных (23,4%), IIIA - у 22 больных (23,4%), IIIB - у 10 больных (10,6%), IV - у 8 больных раком лёгкого (8,5%). Средний возраст больных составил 55,76±6,7г., из них 94,7%-мужчины, 5,3%-женщины.

Все больные проходили лечение в условиях ГУЗ Нижегородский областной онкологический диспансер г.Нижний Новгород. Комплекс клинико-инструментальных и лабораторных обследований соответствовал общепринятым стандартам оказания амбулаторно-стационарной помощи больным раком лёгкого. Всем больным по показаниям, в зависимости от распространённости опухолевого процесса и морфологического варианта опухоли проведено противоопухолевое лечение. Радикальное оперативное вмешательство, включающее расширенную лобэкто-мию, расширенную пневмонэктомию, а также расширенную комбинированную пневмонэктомию, выполнено 59 (62,8%) пациентам. 27(28,7%) пациентов получали нерадикальное противоопухолевое лечение: диагностическую торакотомию с последующим проведением хи-мио-лучевой терапии, полихимиотерапию, лучевую терапию. Симптоматическую терапию получили 8 человек (8,5%).

Контрольная группа здоровых доноров составила 30 человек сопоставимых по полу и возрасту.

Сывороточное содержание растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 антигенов, олигомерных форм CDI8, CD50 и CD95 антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса (HLA-I) и HLA-DR оценивалось в образцах сыворотки крови обследованных больных до проведения противоопухолевого лечения (100%) и после выполнения радикальной операции (21,3% больных). Содержание мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1, MAGE-A1-A6 в крови изучено у 22 (24,5%) больных.

Для определения растворимой формы молекул HLA I класса, HLA-DR, а также олигомерного CD 18 антигена, суммарного CD38 антигена, суммарного и олигомерного CD50 антигена, суммарного и олигомерного CD95 антигена использовали иммуноферментные методы на основе мо-ноклональных антител серии ИКО, любезно предоставленных проф. А.Ю. Барышниковым, и поликлональных антител, направленных против поверхностных антигенов клеток иммунной системы. Иммуноферментные методы ранее были разработаны в Нижегородском госуниверситете им. Н.И.Лобачевского (Новиков В.В. и др., 2008). Всего выполнено 914 исследований.

Содержание мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и MAGE-A1-A6 в опухолевых клетках, циркулирующих в крови больных, определяли совместно с к.б.н. Д.В.Новиковым (НИИ молекулярной биологии и регионарной экологии Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского) методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции с использованием специфических прай-меров. Наряду с определением мРНК NY-ESO-1, проводили как совместное определение мРНК шести представителей семейства MAGE-A (MAGE-A1-A6), так и раздельное тестирование мРНК каждого из шести членов этого семейства раково-тестикулярных антигенов. Всего выполнено 144 исследования.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, коэффициента Стьюдента с использованием непараметрических методов анализа: критерия Крускала-Уоллиса, Манна-Уитни, критерия Уилкоксона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Использовалась компьютерная программа "Statgrafics plus 5.1 for Windows".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сывороточный уровень растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы у больных раком лёгкого

Проведённые исследования выявили, что у больных раком лёгкого сывороточный уровень растворимого олигомерного антигена CD 18 был повышен в 1,3 раза (р=0,02) по сравнению с контролем. Повышение растворимого CD 18 антигена отмечено и при других неопластических процессах, например лимфоме Ходжкина (Алясова A.B. и др. 2000). Содержание олигомерного CD50 антигена у обследованных больных оказалось в 1,2 раза ниже нормы (р=0,003). Снижение sCD50 антигена в сыворотке крови ранее описывалось при множественной миеломе, хроническом лимфолейкозе и B-клеточной лимфоме (Голенков А.К. и др., 2002). Кроме того, рак лёгкого сопровождался понижением сывороточного уровня молекул sHLA-I в 1,3 раза (р=0,03) в сравнении с контролем (Табл. 1).

Таблица 1

Содержание растворимых антигенов в сыворотке крови больных раком лёгкого и здоровых доноров (U/ml)

Антиген Норма Рак лёгкого Достоверность отличий

Олигомерный CD 18 104,6±11,3 ]40,7±11,8* р=0,02

Суммарный CD38 190,3±44,5 232,04±19,8 р=0,39

Олигомерный CD50 65,8±2,8 52,8±2,9* р=0,003

Суммарный CD50 348,6±73,6 358,2±29,5 р=0,9

Олигомерный CD95 371,9±51,7 283,6±59,7 р=0,271

Суммарный CD95 375,4±32,9 363,5±15,2 р=0,74

HLA-I 1012,2±101,8 760,55±50,4* р=0,03

HLA-DR 99,1 ±22,0 103,7±10,1 р=0,84

* - статистически достоверные отличия в сравнении с нормой (р<0,05)

По данным литературы пониженное содержание растворимых молекул НЬА 1 класса отмечено у больных опухолями мозга (Тигомгек1 С. е!.а1., 1996). При раке желудка оно снижается по мере прогрессирования заболевания (БЫтига Т. е!.а1., 1994). Достоверных отличий в содержании растворимого антигена С038, суммарных фракций С050 и С095 мембранных

антигенов, олигомерной фракции CD95, а также растворимых молекул HLA-DR у больных раком лёгкого н здоровых лиц не было (р>0,05).

Выявленные отличия в концентрациях олигомерных фракций растворимых мембранных антигенов CD 18 и CD50 и растворимых молекул HLA I класса у больных раком лёгкого и здоровых лиц указывают на возможность участия этих белков в формировании иммунного ответа при раке лёгкого и механизмах ухода опухоли от иммунологического надзора. Известно, что малигнизированные клетки могут непосредственно вмешиваться в продукцию растворимых форм антигенов и активно участвовать в иммунных реакциях, следствием чего является нейтрализация цитотокси-ческих клеток, прежде всего Т-лимфоцитов (Головизин М.В., 2001; Новиков В.В., Караулов A.B., Барышников А.Ю., 2008). Возможно, пониженное содержание олигомерного sCD50 антигена и растворимых молекул HLA I класса связано с пониженной экспрессией мембранных форм данных антигенов на иммунокомпетентных клетках в условиях иммуносупрессии, вследствие чего отсутствует полноценная первичная активация иммунного ответа. Гсшенков А.К. с соавт. (2002г.) отметили снижение содержания SCD50 антигена при нормальной экспрессии мембранной формы данного антигена у больных лимфопролиферативными заболеваниями и предположили его взаимосвязь с нарушением синтеза sCD50 антигена.

Изучены особенности сывороточного уровня растворимых форм ряда мембранных антигенов при разных гистологических вариантах строения опухоли (Табл. 2).

Выявлено, что плоскоклеточный неороговеваюший рак лёгкого характеризуется уровнем олигомерного CD18 антигена в 1,4 раза превышающим (р<0,05) уровень здоровых доноров крови. У больных другими вариантами опухолей не выявлено достоверных отличий в сывороточном содержании олигомерного CD18 антигена по сравнению с контролем (р>0,05).

Мелкоклеточный вариант опухоли (MPJ1) характеризовался содержанием растворимой олигомерной фракции CD50 антигена в 1,7 раза (р=0,001) выше нормы, а также в 2,2 раза выше (р<0,05) уровня антигена у больных плоскоклеточным неороговевающим раком лёгкого. Кроме того относительная концентрация олигомерной фракции sCD50 у больных МРЛ в 2,3 раза превышала (р<0,05) уровень антигена больных плоскоклеточным ороговевающим раком лёгкого. Концентрация антигена при плоскоклеточных формах рака лёгкого достоверно была ниже уровня здоровых доноров крови (р<0,05).

Таблица 2

Содержание растворимых антигенов в сыворотке крови больных раком лёгкого при разных морфологических вариантах опухоли (U/ml)

Антиген Норма Морфологический вариант опухоли

Плоскоклеточный неороговевающий рак (п=57) Плоскоклеточный ороговевающий рак (п=15) Мелкоклеточный рак (п=8) Железистый рак(п=10)

Олигомерный CD 18 104,б±11,3 147,9±14,4* 101,1±38,2 68,5±54,1 153,4±27,0

Суммарный CD38 190,3±44,5 244,4±25,2 138,9±49,9 309,9±66,1 205,9±59,2

Олигомерный CD50 65,8±2,8 52,2±2,6* 48,9±6,9 * 112,3±9,9 н.т.

Суммарный CD50 348,6±73,6 377,2±38,8 308,0±75,2 408,7±103,0 309,1±92

Олигомерный CD95 371,9±51,7 288,2±84,3 270,6±97,3 324,7±238,3 н.т.

Суммарный CD95 375,4±32,9 376,3±78,9 315,1±52,7 357,9±52,5 360,2±46,9

HLA-I 1012,2±101,8 792,0±63,8 552,7±63,8 * 635,5±170,5 795,6±152,5

HLA-DR 99,1±22,0 108,7±12,7 57,0±25,0 124,1±33,1 89,3±29,6

Примечание: н.т. - не тестировали

*-достоверные отличия от нормы (р<0,05); **- достоверные отличия от плоскоклеточного неороговевающего рака (р<0,05); ***- достоверные отличия от плоскоклеточного ороговевающего рака (р<0,05);

Содержание растворимых молекул НЬА I класса в крови больных плоскоклеточным ороговевающпм раком оказалась в 1,8 раза ниже нормы (р<0,05). При других вариантах злокачественных опухолей лёгкого не обнаружены статистически значимые отличия в содержании растворимых молекул НЬА I класса, в том числе с нормой.

Был проведён корреляционный анализ между сывороточными уровнями растворимых антигенов у больных разными морфологическими вариантами рака лёгкого (рис. 1).

плоскоклеточныи ороговевающпм рак

плоскоклеточный неороговевающии рак

железистый рак мелкоклеточный рак

О 2 4 б 8 10

количество корреляционных свжей с высокой степенью достоверности

Рис. 1. Количество корреляционных связей с высокой степенью достоверности между сывороточными уровнями тестированных растворимых антигенов у больных разными морфологическими вариантами

рака лёгкого.

В результате проведённого анализа выявили, что наибольшее количество корреляционных связей имелось у больных плоскоклеточными формами рака лёгкого, наименьшее при мелкоклеточном раке и железистом раке лёгкого.

Возможно, это обусловлено более высокой сопряженностью механизмов иммунного ответа на неопластический процесс у больных плоскоклеточным раком в сравнении с опухолями низкой дифференцировки (мелкоклеточный рак), что клинически проявляется в более длительном анамнезе и медленном прогрессировании заболевания, отсутствии раннего массивного метастазирования в регионарные лимфатические узлы и отдалённые органы при небольшом размере первичной опухоли лёгкого. Но, в то же время, плоскоклеточные формы рака лёгкого менее чувствительны к лекарственному и лучевому воздействию в отличие от мелкоклеточного рака.

Оценка уровней растворимых антигенов у больных немелкокле-точным раком лёгкого (HMPJI) и мелкоклеточным раком лёгкого подтвердила приведённые выше изменения тестированных белков. Полученные данные представлены в таблице 3.

У больных НМРЛ содержание олигомерного sCD 18 антигена оказалось в 1,4 раза выше (р<0,05) нормы, а у больных МРЛ имела место тенденция к снижению уровня данного антигена (р>0,05).

Сывороточное содержание растворимого олигомерного CD50 антигена у больных НМРЛ в 1,3 раза было ниже (р<0,05) уровня антигена здоровых доноров крови и в 2,3 раза ниже (р>0,05) относительной концентрации антигена больных МРЛ, а относительная концентрация олигомерного CD50 антигена больных МРЛ в 1,7 раза превышала норму (р<0,05).

Таблица 3

Содержание растворимых антигенов в сыворотке крови больных немелкоклеточным и мелкоклеточным раком лёгкого (U/ml)

Антиген Норма п=30 Морфологический вариант

Немел коклеточны i рак лёгкого п=86 Мелкоклеточный рак лёгкого п=8

Олигомерный CD 18 104,6±11,3 144,3±31,3 * 68,5±48,8

Суммарный CD38 190,3±44,5 224,5±20,7 323,5±57,9

Олигомерный CD50 65,8±2,8 49,8±2,2 *,** 112,4±10,1 *

Суммарный CD50 348,6±73,6 353,5±30,9 408,7± 101,5

Олигомерный CD95 371,9±51,7 280,6±62,7 324,7±234,6

Суммарный CD95 375,4±32,9 364,0±15,9 357,9±52,4

HLA-I 1012,2±101,8 772,2±52,7 * 635,5±173,0

HLA-DR 99,1±22,0 101,7±10,6 124,1±34,0

* - статистически достоверные отличия от нормы (р<0,05); ** - статистически достоверные различия с больными мелкоклеточным раком лёгкого (р<0,05).

У больных НМРЛ в отличие от группы контроля наблюдалось статистически достоверное в 1,3 раза (р<0,05) понижение содержания растворимых молекул НЬА I класса.

Сывороточное содержание растворимого СБ38 антигена, суммарной фракции С050 и СБ95 антигенов, олигомерной фракции С095 ан-

тигена и HLA-DR не имело достоверных различий у больных HMPJI и МРЛ, а также не отличалось от нормы (р>0,05).

По-видимому, выявленные отличия в содержании растворимых антигенов у больных разными гистологическими вариантами рака лёгкого связаны с особенностями формирования иммунного ответа при различном морфологическом строении опухоли, что в свою очередь может определять особенности клинического течения отдельных вариантов заболевания. У больных мелкоклеточным раком лёгкого, протекающим наиболее агрессивно и имеющим худший прогноз, не выявлено статистически достоверных отличий в содержании растворимых антигенов, за исключением повышения уровня олигомерного CD50 антигена. По-видимому, это связано с наличием более выраженной иммуносупрессии у больных данным морфологическим вариантом опухоли.

В ходе работы изучили сывороточное содержание растворимых форм мембранных антигенов у больных различными стадиями рака лёгкого. Выявлено, что содержание олигомерного CD50 в сыворотке крови больных раком лёгкого при IB, IIB и II1A стадиях достоверно (р=0,0035) ниже уровня антигена здоровых доноров. Уровень олигомерного CD50 антигена в сыворотке крови больных раком лёгкого при 1В, IIB, IIIA стадиях прогрессивно снижался, но при ШВ стадии отмечалось увеличение в 1,5 раза уровня исследуемого белка в отличие от его содержания у больных ША стадией (р<0,05) (рис.2).

норма ig ив ша ШВ

иядия

Рис. 2. Сывороточное содержание олигомерного С050 на разных стадиях рака лёгкого *- статистически достоверные различия по сравнению с нормой (р<0,05); ** - статистически достоверные различия по сравнению с ША стадией

(р<0,05)

Возможно, рост сывороточного содержания данного антигена связан с распространённостью опухолевого процесса и появлением сопутствующих раку лёгкого осложнений, таких как параканкрозная пневмония, сегментарные и долевые ателектазы, абсцедирование, плеврит.

Сывороточное содержание растворимых молекул HLA I класса при НА стадии рака лёгкого, равное 496,4±184,1 U/ml оказалось в 2 раза ниже нормы (р<0,05). Уровни других исследованных растворимых антигенов в сыворотке крови больных раком лёгкого на разных стадиях заболевания статистически значимо не отличались от нормы (р>0,05) и между собой (р>0,05).

Сывороточная концентрация олигомерного CD18, олигомерного CD50, sHLA-1 антигенов имела статистически значимые отличия и на разных уровнях диссеминации опухолевого процесса. Сывороточное содержание олигомерного CD 18 антигена при диссеминации N1, равное 182,0±20,8 U/ml, было в 1,7 раза выше (р<0,05) уровня нормы и в 2 раза выше (р<0,05) уровня сывороточного содержания антигена больных с диссеминацией N2 (92,9±25,5U/ml). При других уровнях диссеминации опухолевого процесса не выявлены достоверно значимые отличия в содержании sCD18 антигена, в том числе с нормой (р>0,05).

Сывороточное содержание олигомерного CD50 антигена у больных без диссеминации (N0), равнялось 51,l±4,2U/ml, что в 1,3 раза было ниже нормы (р<0,05). Сывороточное содержание олигомерного CD50 антигена больных с уровнем диссеминации N1 составило 5l,8±5,6U/ml, что в 1,3 раза ниже уровня здоровых доноров крови (р<0,05). При других уровнях диссеминации опухолевого процесса достоверно значимых отличий в содержании олигомерного CD50 антигена не выявлено (р>0,05).

Концентрация растворимых молекул HLA I класса в сыворотке крови больных раком лёгкого с уровнем диссеминации N2, равнялась 544,5±113,lU/ml, что достоверно в 1,8 раза ниже уровня нормы (р<0,05). Содержание растворимых молекул HLA I класса у больных с другими уровнями диссеминации опухолевого процесса не имело достоверно значимых отличий, в том числе и с нормой (р>0,05).

Следовательно, каждый уровень диссеминации рака лёгкого сопровождается изменением сывороточной концентрации рассматриваемых белков адгезии и растворимых молекул HLA I класса, что указывает на их роль в процессе диссеминации и прогрессировании заболевания. Самый высокий сывороточный уровень олигомерного CD 18 отмечен у

больных на начальной стадии заболевания, с последующим снижением по мере лрогрессирования. Сывороточный уровень олигомерного CD50 антигена по мере прогрессирования заболевания снижался, но не был связан с уровнем диссеминации, в то же время самая низкая концентрация sHLA-I наблюдалась у больных с уровнем диссеминации N2. Полученные данные свидетельствуют об углублении иммуносупрессии по мере прогрессировании заболевания.

Было выявлено, что у больных, имевших показания к радикальной операции, уровень олигомерной фракции CD 18 антигена оказался в 1,5 раза выше нормы (р<0,05), а уровень антигена больных, нуждающихся в проведении консервативного лечения, имеет лишь тенденцию к снижению (р>0,05) (Табл. 4). Относительная концентрация олигомерной фракции sCD50 антигена в сыворотке крови больных, имевших показания как к радикальную операцию, так и консервативное лечение было в 1,3 раза ниже нормы (р<0,05).

Исходное сывороточное содержание растворимых молекул HLA I класса у радикально оперированных больных раком лёгкого оказалось достоверно ниже нормы (р<0,05) в 1,3 раза, а у больных, нуждающихся в консервативном лечении оно было ниже нормы в 1,4 раза.

Сывороточные уровни других изучаемых растворимых антигенов не менялись.

У всех радикально прооперированных больных (лобэктомия, пневмон- эктомия, расширенная комбинированная пневмонэктомия) сывороточный уровень изучаемых растворимых антигенов был определён до проведения радикальной операции, и после неё. Обнаружено статистически достоверное повышение сывороточного уровня олигомерного CD 18 антигена в послеоперационном периоде (р<0,05), равное 404,1±64,7 U/ml, в сравнении с нормой и уровнем антигена в доопера-ционном периоде. Если в сравнении с дооперационным периодом уровень олигомерного CD 18 антигена после операции был повышен в 2,6 раза и составил 156,8±68,6 U/ml, то в сравнении с нормой он был увеличен в 3,9 раза (рис.3).

Выявлено, что сывороточный уровень олигомерного CD50 антигена у больных после выполнения радикальной операции составил 82,9±6,7 U/ml, что в 1,3 раза выше нормы (р<0,05) и в 1,6 раза выше сывороточного уровня антигена первичных больных (р<0,05) (рис.3).

Таблица 4

Исходное сывороточное содержание растворимых антигенов у больных, нуждающихся

в разных методах лечения (U/ml)

Антиген Норма Вид проведённого лечения

Радикальная операция (п=59) Неоперативное противоопухолевое лечение (п=27) Симптоматическая терапия (п=8)

Олигомерный CD 18 104,6±11,3 151,8±13,2 * 92,9±26,5 153,9±53,0

Суммарный CD38 190,3±44,5 227,7±24,9 252,2±38,0 200,5±67,2

Олигомерный CD50 65,8±2,8 51,7±3,5 * 58,7±6,9 * 45,6±13,8

Суммарный CD50 348,6±73,6 347,3±37,5 392,5±55,4 323,3±101,9

Олигомерный CD9S 371,9±51,7 313,6±73,7 223,5±104,2 н.т.

Суммарный CD95 375,4±32,9 362,0±19,4 360,4±28,6 384,8±52,6

HLA-I 1012,2±101,8 747,4±63,2 * 700,2±93,4 * 1060,9±171,5

HLA-DR 99,1 ±22,0 95,6±12,9 117,1±18,9 117,0±34,1

Примечание: н.т. — не тестировали; *- статистически значимые различия с нормой (р<0,05);

А

и ю1

450 400

300 250 200 150 100 50 О

В

Ш.1

100 30 60 40 20 О

104,6

я<1>ш

ба.а

т-рш

¿56 8

долечения

послелсчшм

ЦШ

долечвии

после течения

Рис.3. Сывороточное содержание растворимых олигомерных С018 (А) и С05О (В) антигенов у больных раком лёгкого до и после проведения радикальной операции. *- статистически достоверные различия с нормой (р<0,05); **-статистически значимые различия с уровнем антигена до операции (р<0,05)

По-видимому, оперативное удаление опухоли способствует изменению условий формирования иммунного ответа пациентов и оказывает активирующее влияние на течение иммунных реакций организма. Возможно, выявленное изменение относительной концентрации растворимых мембранных антигенов связано с особенностями течения послеоперационного периода (формирование фиброторакса при пневмонэктомии,

заживление послеоперационной раны, в том числе лёгочной ткани при органосохранных операциях).

Определение мРНК раково-тестикулярныхантигенов NY-ESO-i и MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого

В настоящее время показано, что в опухолевых клетках инициируется экспрессия генов, кодирующих так называемые раково-тестикулярные антигены. Экспрессию данных генов определяют по наличию матричной РНК, кодирующей раково-тестикулярные антигены (Segal et al., 2005). Одной из задач данной работы послужило исследование наличия мРНК раково-тестикулярного антигена N Y-ESO-1 и мРНК шести представителей семейства M AGE-A (MAGE А1-А6) в образцах крови больных раком легкого в сопоставлении с сывороточным содержанием растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы.

С помощью обратной транскрипции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией, матричная РНК N Y-ESO-1 была обнаружена в 59% образцах периферической крови обследованных первичных больных раком лёгкого. Кроме того, у больных, содержащих мРНК NY-ESO-1, в 76,9% случаев обнаружена мРНК MAGE-A1-A6.

Матричная РНК MAGE-A1-A6 антигенов выявлена в 54,5% образцах крови обследованных больных. У больных, содержащих мРНК MAGE А1-А6, в 83,3% случаев обнаружена мРНК NY-ESO-1. Отмечено, что мРНК MAGE-A1-A6 не определялась у больных плоскоклеточным ороговевающим раком лёгкого.

У 45,5% больных раком лёгкого в крови присутствуют одновременно мРНК NY-ESO-1 и мРНК MAGE-A1-A6 раково-тестикулярных антигенов, а у 68,2% больных раком лёгкого в крови присутствует хотя бы одна из исследованных мРНК.

Сывороточное содержание растворимого CD38 антигена у мРНК NY-ESO-1-негативных больных, равное 384,5±77,9U/ml, статистически достоверно превышало норму в 2,0 раза (р<0,05). Сывороточный уровень растворимого CD38 антигена у мРНК N Y-ESO-1 -позитивных больных, равный 320,2±70,4U/ml, имел тенденцию к повышению (р>0,05) (рис. 4).

400

1 300

i U ml 200 f 100 \ 0

Рис. 4. Сывороточное содержание растворимого CD38 антигена у N Y-ESO-1 -негативных и NY-ESO-1 -позитивных больных раком лёгкого *- статистически значимые отличия от нормы (р<0,05)

Возможно, увеличенное сывороточное содержание sCD38 антигена у NY-ESO-1 -негативных больных, являясь отражением идущих в организме физиологических процессов, связанных с активацией иммунной системы, может выступать в роли фактора, ограничивающего активаци-онные процессы и тормозящего реакцию иммунной системы на чужеродные агенты. Изменение в крови содержания этого антигена может модулировать механизмы взаимодействия клеток, идущие при его участии.

У больных мРНК NY-ESO-1 -позитивным раком лёгкого обнаружен достоверно высокий (р<0,05) в сравнении с нормой (в 2 раза) сывороточный уровень растворимого суммарного антигена CD50, равный 713,0±112,6U/ml.

Сывороточные уровни других исследованных растворимых форм мембранных антигенов не имели достоверных отличий у негативных и позитивных по мРНК NY-ESO-1 больных и не отличались от нормы (р>0,05).

У мРНК MÄGE-Al-Аб-негативных больных раком лёгкого содержание растворимого олигомерного CD 18 антигена составило 172,1 ±20,6U/ml, что в 1,6 раза было выше (р<0,05) нормы. Аналогичные данные получены и у негативных по данным мРНК больных раком лёгкого.

норма кепшгсиме теишше

Содержание растворимого CD38 антигена в сыворотке крови мРНК MAGE-Al-Аб-негативных больных составило 388,9±66,8U/ml, что как и у мРНК NY-ESO-1-негативных больных раком лёгкого и всей группы негативных по содержанию исследованных мРНК, превысило норму в 2 раза (р<0,05), (рис. 5).

400 3S0 300 250 Г ml 200 ISO 100 50 О

150,Л

норм»

немпшнме поятшны«

Рис. 5. Сывороточное содержание растворимого CD38 антигена у MAGE-Al-Аб-негативных и MAGE-Al-Аб-позитивных больных раком лёгкого *- статистически значимые отличия от нормы (р<0,05)

Сывороточный уровень олигомерной фракции CD50 антигена у мРНК MAGE-Al-Аб-позитивных больных равен 51,7±4,4U/ml, что в 1,3 раза был ниже нормы (р<0,05). У мРНК MAGE-A1-A6 - позитивных больных раком лёгкого содержание суммарного sCD50 антигена, равное 744,9=665,2 U/ml, достоверно в 2,1 раза оказалось выше нормы (р<0,05).

Сывороточное содержание других исследуемых растворимых форм мембранных антигенов не имело достоверных отличий у негативных и позитивных по мРНК MAGE-A1-A6 больных и не отличалось от нормы (р>0,05).

Таким образом, экспрессия генов MAGE-A1-A6 и NY-ESO-1 была взаимосвязана с проявлениями иммунного ответа у больных раком лёгкого.

ВЫВОДЫ

1. Развитие рака лёгкого, независимо от стадии заболевания, сопровождается повышением содержания олигомерной формы растворимого CD18 антигена и понижением олигомерной фракции растворимого CD50 антигена и растворимых молекул HLA I класса.

2. Изменение содержания растворимого антигена CD38, олигомерной и суммарной фракций sCD50 и sCD95 антигенов, олигомерной фракции sCD18, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR взаимосвязано с гистологическим вариантом строения опухоли: при мелкоклеточном варианте рака лёгкого отмечается статистически достоверное повышение уровня олигомерного sCD50 антигена, при немелкоклеточном раке лёгкого - рост относительной концентрации олигомерного sCD18 антигена и снижение содержания олигомерного sCD50 антигена и растворимых молекул HLA I класса.

3. При диссеминации N1 значительно повышается уровень олигомерного sCDIS антигена и понижается уровень олигомерной фракции sCD50 антигена; при диссеминации N2 характерно значительное понижение уровня растворимых молекул HLA I класса. Отсутствие поражения регионарных лимфатических узлов сопровождается понижением относительной концентрации олигомерной фракции sCD50 антигена.

4. У больных раком лёгкого в 59% случаев присутствует мРНК NY-ESO-1 и в 54,5% случаев мРНК MAGE-A1-A6. Для мРНК NY-ESO-1-позитивных больных характерно присутствие в крови мРНК МAGE-A 1-А6 в 76,9% случаев. У мРНК MAGE-Al-Аб-позитивных больных в 83,3% случаев присутствует мРНК NY-ESO-1.

5. У мРНК NY-ESO-1-негативных больных значительно повышен сывороточный уровень олигомерной фракции sCD18 антигена, в то время как у мРНК NY-ESO-1-позитивных больных достоверно возрастает сывороточный уровень суммарного sCD50 антигена. У мРНК MAGE-A1-Аб-негативных больных раком лёгкого повышена относительная концентрация олигомерной фракции sCD18 и суммарного sCD38 антигенов.

6. Проведение радикальной операции сопровождается повышением сывороточного уровня олигомерных фракций растворимых CD 18 и CD50 антигенов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Определение уровней растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 антигенов, олигомерных форм CD 18, CD50 и CD95 антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR может быть использовано как дополнительный метод дифференциальной диагностики морфологических вариантов рака лёгкого.

На основании исходного уровня растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 антигенов, олигомерных форм CD 18, CD50 и CD95 антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR можно планировать проведение противоопухолевого лечения у первичных больных раком лёгкого.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пегов Р.Г., Алясова A.B., Новиков В.В. Растворимые антигены CD38 и CD50 при раке лёгкого // Российский биотерапевтический журнал.-2006.-Т.5. - № 1.-С. 9-10.

2. Алясова A.B., Пегов Р.Г., Михайлова Е.М., Новиков В.В., Барышников А.Ю. Содержание растворимой формы молекул HLA 1 класса в сыворотке крови больных раком молочной железы и лёгкого // Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - Т.7. - № 1. - С.3-3.

3. Пегов Р.Г., Алясова A.B., Новиков В.В., Барышников А.Ю. Содержание растворимой формы молекул HLA 1 класса в сыворотке крови больных раком лёгкого // Клиническая лабораторная диагностика. -2009. - №2. - С.38-40.

4. Новиков Д.В., Белова Т.В., Пегов Р.Г., Алясова A.B., Морозова П.Н., Князев Д.И., Калугин A.B., Конторщикова К.Н., Барышников А.Ю., Новиков В.В. Частота обнаружения мРНК MAGE-A1-A6 в крови онкологических больных // Клиническая лабораторная диагностика. - 2009. -№4.-С.25-27.

5. Белова Т.В., Новиков Д.В., Пегов Р.Г., Алясова A.B., Новиков В.В. Обнаружение мРНК GAGE 1-8, MAGE-A1-6 и NY-ESO-I в периферической крови и клетках опухолевого очага больных раком лёгкого // Материалы научной конференции с международным участием «Наноонколо-гия», Москва, 18-19 февраля 2009г.: Российский биотерапевтический журнал. - 2009.-Т.8.-№ 1.-С. 13-13.

6. Алясова A.B., Пегов Р.Г., Михайлова Е.М., Новиков В.В., Барышников А.Ю. Растворимые молекулы HLA 1 класса в сыворотке крови больных раком молочной железы и лёгкого // Нижегородский медицинский журнал. -2008. - №4. - С. 98-103.

7. Лютина Е.В., Новиков В.В., Алясова A.B., Пегов Р.Г., Барышников

A.Ю. Содержание растворимого CD95 антигена в сыворотке крови больных опухолями различных локализаций // Тез.докл.1Х Российского онкологического конгресса, Москва. -2005. -С. 217-217.

8. Пегов Р.Г. Содержание растворимого CD38 антигена у больных раком лёгкого // Сборник материалов V Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых учёных и студентов по медицине, Тула. - 2006. - С. 182-183.

9. Сахарнов H.A., Новиков Д.В., Пегов Р.Г., Алясова A.B., Новиков

B.В. Особенности экспрессии мРНК Fas антигена в клетках опухолевого очага рака молочной железы и легкого // Тез.докл. X Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и имму-нофармакологии», Казань. - 2009. - С. 208-208.

10. Новиков В.В., Караулов A.B., Барышников А.Ю., Алясова A.B., Новиков Д.В., Гостюжова Е.А., Пегов Р.Г. Особенности структурного пула растворимых дифференцировочных антигенов и молекул гистосов-местимости при онкозаболеваниях // Тез.докл. X Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммуно-фармакологии», Казань. - 2009. - С. 206-207.

11. Пегов Р.Г. Рак лёгкого на страницах русскоязычных ресурсов интернета // Нижегородский медицинский журнал. - 2006. - №3. -С. 135-137.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СБ - кластеры дифференцировки

НЬА - человеческий лейкоцитарный антиген (главный комплекс гисто-совместимости)

N0 - отсутствие метастазирования в регионарные лимфатические узлы N1 - метастазирование в бронхопульмональные и корневые лимфатические узлы со стороны поражённого лёгкого

N2 - метастазирование в лимфатические узлы средостения со стороны поражённого лёгкого

N3 - метастазирование в отдалённые лимфатические узлы

бНЬА - растворимая форма молекулы главного комплекса гистосовме-

стимости

бСО - растворимая форма дифференцировочных молекул

МРЛ - мелкоклеточный рак лёгкого

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

НМРЛ - немелкоклеточный рак лёгкого

ПХТ - полихимиотерапия

РНК - рибонуклеиновая кислота

Подписано в печать 28.01,2010г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Усл.печ.л.1,0. Заказ № 332. Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нижний Новгород, ул.Трудовая,6 Тел.:436-86-40

Злокачественные новообразования лёгкого занимают первое место (20-30%) в структуре онкологической заболеваемости мужского населения стран Западной и Центральной Европы, постсоветских государств, Северной и Южной Америки [37]. По данным Международного агентства по изучению рака в мире ежегодно диагностируют около 1 млн. новых случаев рака лёгкого, что составляет более 12% от числа всех выявляемых злокачественных новообразований. В среднем каждые 8 минут регистрируют новый случай заболевания [37, 11]. Неуклонно возрастающая заболеваемость раком и другими злокачественными новообразованиями лёгких, поздняя диагностика и, связанные с этим, низкие показатели операбельности и резектабельности, относительную низкую 5-летнюю выживаемость, весьма ограниченные возможности основных методов лечения (хирургического, лучевого и лекарственного), несомненно ассоциированная иммунодепрессия и возможность её усугубления под влиянием противоопухолевой терапии, малая изученность общебиологических критериев прогноза и вопросов восстановительной терапии определяют актуальность и социальную значимость заболевания [11]. Остаётся до конца не изученным вопрос канцерогенеза и ухода опухоли от иммунного надзора.

Важную роль в регуляции противоопухолевого иммунного ответа играют растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы, образующиеся за счет их шеддинга с поверхности клеток или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Получены данные о том, что они могут выполнять функции ограничителей иммунных реакций или же выступать в роли активаторов иммунологических процессов [23]. Контроль реакции иммунитета на развитие опухоли и изучение его состояния даёт большие возможности для понимания механизмов канцерогенеза, выделения групп риска развития неопластических процессов, оценки эффективности лечебных воздействий, прогнозирования дальнейшего течения заболеваний, в частности, выявление раннего метастазирования на су б клинической стадии. Однако, в доступной литературе нам практически не встречалось работ по изучению роли растворимых антигенов в оценке эффективности терапии и прогнозировании течения рака лёгкого.

Малоизученным остаётся вопрос диагностики и мониторинга рака лёгкого. Среди маркеров, используемых для выявления и прогнозирования течения опухолевого процесса, выделяют группу белков, экспрессируемых опухолевыми клетками и названных раково-тестикулярными антигенами. Но исследования роли этих белков в прогнозировании течения заболевания у больных раком лёгкого единичны.

Цель исследования: оценить содержание суммарных и олигомерных фракций растворимых форм ряда мембранных антигенов клеток иммунной системы в сыворотке крови, в том числе во взаимосвязи с наличием матричных РНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать сывороточные уровни растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 антигенов, олигомерных форм CD18, CD50 и CD95 антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR в сыворотке крови больных раком лёгкого и их изменения в зависимости от особенностей гистологического строения опухоли и распространённости опухолевого процесса.

2. Проанализировать изменения содержания сывороточного уровня растворимых форм мембранных антигенов CD38, олигомерных форм CD 18, CD50 и CD95 антигенов, суммарных форм CD50 и CD95 антигенов растворимых молекул HLA I класса, HLA-DR после проведённого противоопухолевого лечения.

3. Изучить возможность существования мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1, MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого и выявить взаимосвязи между сывороточным уровнем растворимых антигенов и наличием мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1, MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого.

Научная новизна работы

Впервые дана характеристика сывороточного содержания растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 мембранных антигенов, олигомерных форм CD18, CD50 и CD95 мембранных антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR у больных раком лёгкого, в том числе с учётом гистологического строения опухоли и степени распространённости заболевания.

Выявлены взаимосвязи сывороточных уровней исследованных растворимых антигенов, указывающие на их совместную роль в развитии иммунного ответа при раке лёгкого.

Обнаружены мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого. Установлена взаимосвязь между наличием мРНК раково-тестикулярных антигенов и сывороточным уровнем олигомерных форм CD 18, CD38 растворимых антигенов и суммарной фракции CD50 антигена.

Практическая ценность

Сведения о содержании растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы могут быть использованы в изучении патогенеза рака лёгкого, в том числе механизмов ухода злокачественных опухолей лёгкого от иммунного надзора.

Полученные данные имеют мониторинговую значимость и могут быть использованы для разработки новых подходов к оценке эффективности проведённого лечения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Развитию рака лёгкого сопутствует статистически значимое повышение сывороточного содержания растворимой формы олигомерного CD 18 антигена и достоверное понижение сывороточного уровня олигомерного CD50 антигена и растворимых молекул HLAI класса.

2. Рак лёгкого сопровождается появлением в крови больных мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и MAGE-A1-A6.

3. Проведение радикальной операции приводит к повышению сывороточного содержания растворимых форм олигомерных CD 18 и CD50 антигенов.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2005.), X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2006.), V Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых учёных и студентов по медицине (Тула, 2006.), Всероссийской конференции "Нанотехнологии в диагностике опухолей" (Москва, 2009.), X Международном Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009.), научно-технической конференции Нанотехнологического общества России «Развитие нанотехнологического проекта в России: состояние и перспективы», секция: «Нанотехнологии в онкологии» (Москва, 2009.).

ВЫВОДЫ

1. Развитие рака лёгкого, независимо от стадии заболевания, сопровождается повышением содержания олигомерной формы растворимого CD18 антигена и понижением олигомерной фракции растворимого CD50 антигена и растворимых молекул HLA I класса.

2. Изменение содержания растворимого антигена CD38, олигомерной и суммарной фракций sCD50 и sCD95 антигенов, олигомерной фракции sCD18, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR взаимосвязано с гистологическим вариантом строения опухоли: при мелкоклеточном варианте рака лёгкого отмечается статистически достоверное повышение уровня олигомерного sCD50 антигена, при немелкоклеточном раке лёгкого — рост относительной концентрации олигомерного sCD18 антигена и снижение содержания олигомерного sCD50 антигена и растворимых молекул HLA I класса.

3. При диссеминации N1 значительно повышается уровень олигомерного sCD18 антигена и понижается уровень олигомерной фракции sCD50 антигена; при диссеминации N2 характерно значительное понижение уровня растворимых молекул HLA I класса. Отсутствие поражения регионарных лимфатических узлов сопровождается понижением относительной концентрации олигомерной фракции sCD50 антигена.

4. У больных раком лёгкого в 59% случаев присутствует мРНК NY-ESO-1 и в 54,5% случаев мРНК MAGE-A1-A6. Для мРНК NY-ESO-1-позитивных больных характерно присутствие в крови мРНК MAGE-A1-A6 в 76,9% случаев. У мРНК MAGE-Al-Аб-позитивных больных в 83,3% случаев присутствует мРНК NY-ESO-1.

5. У мРНК NY-ESO-1-негативных больных значительно повышен сывороточный уровень олигомерной фракции sCD18 антигена, в то время как у мРНК NY-ESO-1-позитивных больных достоверно возрастает сывороточный уровень суммарного sCD50 антигена. У мРНК MAGE-A1-A6негативных больных раком лёгкого повышена относительная концентрация олигомерной фракции sCD18 и суммарного sCD38 антигенов.

6. Проведение радикальной операции сопровождается повышением сывороточного уровня олигомерных фракций растворимых CD18 и CD50 антигенов.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Определение уровней растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 антигенов, олигомерных форм CD 18, CD50 и CD95 антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR может быть использовано как дополнительный метод дифференциальной диагностики морфологических вариантов рака лёгкого.

На основании исходного уровня растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 антигенов, олигомерных форм CD 18, CD50 и CD95 антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR можно планировать проведение противоопухолевого лечения у первичных больных раком лёгкого.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рак лёгкого - злокачественный опухолевый процесс, первично поражающий жизненно-важную дыхательную систему человека. Средний возраст впервые выявленных больных составляет 55-60 лет, но всё чаще заболевают лица более молодого возраста. Кроме того, доля заболевших женщин, составляющая около 10% от общего числа больных раком лёгкого, прогрессивно растёт. Отсутствие клинической картины на начальных стадиях заболевания - причина позднего обращения пациентов за медицинской помощью. Наличие сопутствующих II и III стадиям рака лёгкого воспалительных процессов способствует поздней верификации заболевания в лечебно-профилактических учреждениях общего профиля и неоказанию своевременного специфического противоопухолевого лечения в специализированных учреждениях и отделениях. Отсутствуют высоко эффективные методы лечения, что определяет низкие показатели 5-летней выживаемости и сохранения общих показателей смертности на уровне незначительно меньшим показателей заболеваемости (на 100 тысяч населения 70 заболевших и 60-65 умерших в год). Всё это определяет социально-экономическую и медико-биологическую значимость данной патологии.

Рак лёгкого, как и другие злокачественные новообразования, является классическим примером иммунопатологии и сопровождается изменениями множества мембранных белков-рецепторов, осуществляющих и регулирующих межклеточные взаимодействия, а также их растворимых форм.

Целью настоящей работы была оценка содержания суммарных и олигомерных фракций растворимых форм ряда мембранных антигенов клеток иммунной системы в сыворотке крови, в том числе во взаимосвязи с наличием матричных РНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и

MAGE-A 1-А6 в крови больных раком лёгкого. В настоящей работе мы исследовали уровни растворимых форм суммарных фракций CD38, CD50, CD95 антигенов, олигомерных форм CD18, CD50 и CD95 антигенов, а также растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR.

В настоящее время растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы рассматриваются в качестве участников глобальной иммунологической сети, тесным образом связанной со всеми физиологическими системами организма. В состав глобальной иммунологической сети включают антитела и антиидиотипические антитела, цитокины, рецепторы Т-клеток, В-клеток, множество других мембранных белков, осуществляющих лиганд-рецепторное взаимодействие, а также их растворимые формы, образующиеся за счет шеддинга и альтернативного сплайсинга матричной РНК. Растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы осуществляют чаще всего многонаправленное воздействие, приводящее при нарушении их равновесного содержания к блокаде межклеточных мембранных взаимодействий и ограничению иммунного ответа. Например, повышение уровня растворимых белков адгезии является компенсаторным механизмом, не позволяющим процессам активации иммунной системе выходить за физиологические пределы.

Межклеточные взаимодействия могут быть блокированы растворимыми молекулами гистосовместимости, взаимодействующими с Т-клеточным рецепторным комплексом, растворимыми формами белков, входящими в состав. Т-клеточного рецепторного комплекса (например, антигеном CD8), также другими белками, участвующими в межклеточных взаимодействиях. К ним в первую очередь, относятся белки адгезии, чьи растворимые формы могут взаимодействовать с лигандами мембранных форм адгезионных антигенов. Присутствуя в крови и других тканях в нормальной концентрации, растворимые формы мембранных белков не оказывают существенного влияния на интенсивность иммунологических процессов, протекающих в организме. Повышение или снижение их концентрации приводит к смещению равновесия в системе рецептор-лиганд. Значительное увеличение концентрации растворимых форм антигенов адгезии, происходящее, в частности, при чрезмерной активации того или иного звена иммунной системы, приведет к торможению адгезионных процессов.

Важным регулятором почти всех видов иммунного и воспалительного ответа являются адгезивные гликопротеины поверхности клеток, в связи с чем, для исследования были выбраны представители молекул адгезии — ICAM-3 (CD50), а также CD38 антиген. CD50 антиген является лигандом LFA-1 антигена, экспрессирующегося на всех типах лейкоцитов.

В результате проведённого исследования было обнаружено, что рак лёгкого сопровождается достоверным снижением относительного содержания олигомерной фракции sCD50 антигена и растворимых молекул HLA I класса и повышением сывороточного уровня олигомерной фракции CD18 антигена, в то время как содержание суммарных фракций CD38, CD50 и CD95 антигенов, олигомерной фракции CD95 антигена и HLA-DR антигена не имело достоверных отличий.

В литературе мало освещён вопрос, касающийся содержания растворимого CD 18 антигена при неопластических процессах в виду его недавнего открытия. Имеются данные о повышенном содержании данного антигена у больных лимфомой Ходжкина и пониженном содержании у больных раком молочной железы [3, 4]. В нашей работе выявлено повышение количества олигомерной фракции растворимого CD 18 антигена, что может быть одним из факторов, тормозящих первичный иммунный ответ у больных раком лёгкого. Оценивая содержание антигена у больных на разных стадиях рака лёгкого, не было отмечено достоверных отличий, хотя сывороточный уровень олигомерного CD18 антигена в крови больных раком лёгкого с метастатическим поражением лимфатических узлов корня лёгкого, в том числе бронхопульмональной группы, в 1,7 раза превысил норму и в 2 раза превысил уровень антигена больных с метастазами в лимфатические узлы средостения. Сравнив все морфологические варианты опухоли, было выявилено, что олигомерная фракция CD18 антигена достоверно повышается у больных немелкоклеточным раком лёгкого, в основном у больных плоскоклеточным неороговевающим раком лёгкого. Следовательно, морфологический вариант опухоли взаимосвязан с содержанием данного антигена и качеством иммунного ответа. Отсутствие повышения олигомерной фракции sCD18 антигена у больных мелкоклеточным раком лёгкого на фоне отсутствия динамики суммарных фракций CD38, CD50 и CD95 антигенов, олигомерной фракции CD95 антигена и HLA-DR антигена свидетельствует о выраженной иммуносупрессии и, как следствие, о более злокачественном и прогностически худшем течении заболевания с данным вариантом опухоли.

Рак лёгкого, как и другие злокачественные опухоли, сопровождается появлением в крови специфических белков, являющихся продуктом синтеза мРНК опухолевых клеток. В настоящей работе были выявлены мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1, MAGE-A1-A6 в крови больных и оценён уровень растворимых мембранных антигенов у негативных и позитивных по содержанию mPHKNY-ESO-1 и MAGE-A1-A6 больных раком лёгкого. Выявлено, что олигомерная фракция sCD18 антигена достоверно повышена у мРНК МАСЕ-А1-А6-негативных больных раком лёгкого. Этот вывод подтверждает индивидуальность формирования иммунного ответа при каждом варианте опухоли.

Было выявлено, что у больных, перенесших в последствии радикальную операцию, в отличие от больных, перенесших впоследствии консервативные методы (химио-лучевую терапию) и симптоматическое лечение, содержание олигомерного sCD18 антигена достоверно выше. Согласно полученным данным у радикально прооперированных больных в послеоперационном периоде уровень антигена вырос относительно нормы и уровня дооперационного периода.

Таким образом, повышенное содержание олигомерной фракции sCD18 антигена характерно в основном для более высокодифференцированных форм рака лёгкого, при которых более вероятно выполнение радикального оперативного вмешательства.

Снижение сывороточного уровня олигомерной фракции sCD50 антигена у больных раком лёгкого, выявленное в результате проведённого исследования, возможно, является косвенным признаком пониженной экспрессии мембранной формы данного антигена на иммунокомпетентных клетках в условиях имеющейся иммуносупрессии, вследствие чего отсутствует полноценная первичная активация иммунного ответа. Голенков А.К. с соавторами (2002г.) [10] отметили снижение содержания . sCD50 антигена при нормальной экспрессии мембранной формы данного антигена у больных лимфопролиферативными заболеваниями и связали его с нарушением синтеза sCD50 антигена. У больных раком лёгкого снижение относительной концентрации олигомерной фракции sCD50 антигена происходит при нормальном уровне суммарного sCD50. Возможно, для олигомерной фракции sCD50 антигена у больных раком лёгкого характерен быстрый распад антигена при нормальном его шеддинге, что и обусловливает пониженное содержание данного белка.

В результате проведённого исследования выявлено, что для больных раком лёгкого по мере прогрессирования заболевания характерно снижение уровня олигомерного sCD50 антигена, но при IIIB стадии отмечен значительный его рост, по-видимому, обусловленный наличием в запущенных стадиях рака лёгкого постобтурационных воспалительных процессов в лёгочной ткани.

Кроме того, достоверно низкие сывороточные уровни олигомерного sCD50 антигена имели больные без метастазирования и с диссеминацией в лимфатические узлы бронхопульмональной группы и корня лёгкого поражённой стороны.

У больных разными морфологическими вариантами рака лёгкого, сывороточное содержание олигомерной фракции sCD50 антигена оказалось различно. Так, если для немелкоклеточного рака лёгкого характерно достоверное снижение уровня данного антигена, то у больных мелкоклеточным раком лёгкого происходит его достоверный и значительный рост. Следовательно, у больных мелкоклеточным раком лёгкого повышенный уровень олигомерной фракции sCD50 антигена приводит к торможению адгезионных процессов, участвующих в формировании механизмов цитотоксических реакций.

Характерно, что достоверно низкие концентрации олигомерной фракции sCD50 антигена имели операбельные больные. В послеоперационном периоде выявлен значительный рост данного антигена, связанный, возможно, с особенностями послеоперационного периода (формирование фиброторакса при пневмонэктомии, заживление послеоперационной раны, в том числе лёгочной ткани при органосохранных операциях).

На сывороточное содержание олигомерной фракции CD50 антигена влияет экспрессия опухолевыми клетками мРНК MAGE-A1-A6. Было выявлено, что у позитивных по данной мРНК больных раком лёгкого уровень антигена был значительно снижен. В то же время при пониженной концентрации олигомерного sCD50 антигена у этих больных определён повышенный сывороточный уровень суммарной фракции sCD50 антигена. Полученные данные подтверждают возможную причину пониженного содержания олигомерной фракции sCD50 антигена — быстрый распад данной фракции sCD50 антигена.

Установлено, что уровень суммарной фракции sCD50 антигена значительно повышен у больных раком лёгкого, в крови которых выявлялась мРНК NY-ESO-1, а также мРНК MAGE-A1-A6.

Ведущая роль в презентации чужеродного антигена и формировании иммунного синапса принадлежит молекулам гистосовместимости I класса.

Исследование у пациентов с раком лёгкого сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса позволило отметить наличие статистически значимых отличий от нормы, а именно его снижение. Ранее описывалось снижение концентрации sHLA-I молекул у больных опухолями головного мозга, а также больных раком желудка. Возможно, снижение уровня растворимых молекул HLA Т класса связано с наличием иммуносупрессии и, сниженной экспрессии мембранных форм данного антигена.

Выявлено, что сывороточное содержание растворимых молекул HLA I класса у больных раком лёгкого достоверно снижено при IIA стадии, а также у больных с метастатическим поражением лимфатических узлов средостения с поражённой стороны (уровень диссеминации N2). В результате проведённого исследования отмечено, что достоверное снижение растворимых молекул HLA I класса зависит от морфологического варианта опухоли и характерно для больных немелкоклеточным раком лёгкого, главным образом больных плоскоклеточным ороговевающим раком лёгкого.

Характерно, что достоверно сниженные значения растворимых молекул HLA I класса имели пациенты, перенесшие впоследствии радикальное оперативное лечение, и пациенты, которым впоследствии было проведено консервативное лечение (химио-лучевая терапия) в отличие от больных, находящихся на симптоматическом лечении.

У пациентов, перенесших радикальное оперативное вмешательство, в послеоперационном периоде не выявлено достоверных изменений в содержании растворимых молекул HLA I класса.

Исследование мРНК NY-ESO-1 и мРНК MAGE-A1-A6 в крови больных раком лёгкого не обнаружило достоверных отличий уровней растворимых молекул HLA I класса у больных, отличающихся по наличию экспрессии данных генов.

Повышенная сывороточная концентрация sCD38 антигена выявлена у больных, не содержащих в крови данные мРНК. Известно, что повышенное содержание sCD38 антигена приводит к блокаде экстравазации лимфоцитов при миграции из кровяного русла в органы и ткани, возможно с этим связано прогрессирование рака лёгкого. Увеличение сывороточного содержания растворимых антигенов CD38 является отражением идущих в организме физиологических процессов, связанных с активацией иммунной системы. Растворимая форма данного антигена может выступать в роли ограничителя активационных процессов, тормозя реакцию иммунной системы на чужеродные агенты. С одной стороны, повышенный сход с мембраны СВ38 антигена снижает плотность его экспрессии на клетке. В итоге меняется адгезионная способность клеток, реализующаяся при участии CD38 антигена. С другой стороны, изменение в крови и тканях содержания этого антигена может модулировать механизмы адгезионного взаимодействия клеток, основанные на участии исследуемого антигена. Растворимый CD38 антиген участвует в ограничении процессов миграции мононуклеарных клеток из сосудистого русла в тканевое пространство, и соответственно к месту локализации опухоли. Это один из путей, с помощью которого формируется механизм ускользания опухолевых клеток от надзора со стороны иммунной системы. Таким образом, повышенный уровень растворимого CD38 антигена у мРНК NY-ESO-1 и мРНК MAGE-A1-A6 - негативных больных можно рассматривать в качестве одного из факторов ухода опухоли от противоопухолевого ответа со стороны иммунной системы.

Таким образом, представленные изменения уровней исследованных растворимых антигенов и растворимых молекул HLA I класса, а также экспрессия мРНК раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и MAGE-A1-А6 помогают понять их роль в формировании иммунного ответа у больных раком лёгкого.