Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изменения экспрессии мембранных и концентрации растворимых дифференцировочных антигенов клеток иммунной системы человека при различных формах хориоретинальной дистрофии

На правах рукописи

111

"¿'¿¿484740

Фотиади Ольга Геннадьевна

ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МЕМБРАННЫХ И КОНЦЕНТРАЦИИ РАСТВОРИМЫХ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫХ АНТИГЕНОВ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ХОРИОРЕТИНАЛЬНОЙ ДИСТРОФИИ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 НОЯ 2009

Москва-2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова» Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Караулов Александр Викторович доктор медицинских наук Евсегнеева Ирина Валентиновна

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Винницкий Леонид Ильич

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Станислав Степанович

Ведущее учреждение:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный университет им. Н.Н.Пирогова».

Защита диссертации состоится «15» декабря 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.08 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова»по адресу: 119991, Москва, ул. Б.Трубецкая, д.8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49.

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинский наук, профессор

Миронов Андрей Юрьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Инволюционная центральная хориоретинальная дистрофия (ИЦХРД) представляет собой хроническое дегенеративное заболевание сетчатки, связанное на начальном этапе развития с преимущественным поражением хо-риокапиллярного слоя хориоидеи, мембраны Бруха и слоя пигментного эпителия сетчатки [Хоу с соавт., 2009]. Появление хориоидальной неоваскуля-ризации означает резкий поворот в ходе заболевания в сторону необратимых повреждений и возникновении экссудативной формы ИЦХРД [Коэн, Квин-тель, 2005, Нероев В.В. с соавт.,2009]. Распространенность ИЦХРД в общей популяции увеличивается с возрастом: 40% в возрасте старше 40 лет и от 50 до 100 % в возрасте старше 60 лет [Williams et al., 1998, Klein et al., 2002, Friedman et al., 2004]. В экономически развитых странах мира ИЦХРД, как причина слабовидения, занимает 3-е место в структуре глазной патологии после глаукомы и диабетической ретинопатии [Кисилева Т.Н., 2009]. По данным последних лет ИЦХРД - заболевание, к которому имеется наследственная предрасположенность, отмечен аутосомно-доминантный тип наследования [Коэн, Квинтель, 2005, Hopkin, 2005]. Факторами риска заболевания являются повреждающее действие ультрафиолетовой радиации, атеросклероз, артериальная гипертензия, табакокурение и дефицит ключевых микроэлементов.

В основе периферической витреохориоретинальной дистрофии (ПВХРД) лежат дегенеративные изменения в сетчатке и стекловидном теле, в ряде случаев приводящих к формированию разрывов сетчатки и ее отслойки. Основное внимание до настоящего времени уделялось возникновению периферических хориоретинальных дистрофий сетчатки у лиц с близорукостью высокой степени. Патогенетическим обоснованием возникновения дистрофии служит растяжение склеральной капсулы и возникающие при этом трофические нарушения [Канцельсон JI.A. с соавт., 1990].

Патогенез хориоретинальных дистрофий до настоящего времени остается неизвестным. К возможным механизмам, лежащим в основе развития инволюционных форм хориоретинальных дистрофий относится активация свободнорадикального окисления, которому способствуют факторы риска, что приводит к накоплению токсических продуктов метаболизма з эпителии сетчатки и формированию коллоидных друз [Chandra et al., 1974, Thornton et al., 2009].

Роль иммунологических факторов в развитии хориоретинальных дистрофий стала активно изучаться лишь в последнее десятилетие. Экспериментальные и клинические исследования свидетельствуют об активной роли факторов врожденного иммунитета, ключевым звеном которых является активация комплемента, что также сопровождается усилением ангиогенных сигналов, [Bora et al., 1993, Евсегнеева И.В.. 2001, Haynes, 2005, Слепова О.С.,2002,2008]. Полученные данные заставляют исследователей перейти к изучению конкретных иммунологических факторов, включая изучение фенотипа клеток иммунной системы и основных растворимых иммунорегулятор-ных молекул.

Мембранные белки клеток иммунной системы играют важную роль в активации, регуляции и кооперации этих клеток и реализации иммунного ответа в целом [Ковальчук JI.B., 2003, Хаитов P.M. с соавт., 2009]. Определение их растворимых изоформ, играющих ведущую роль в иммунорегуляции [Новиков В.В. с соавт., 2008], в сочетании с традиционным иммунофеноти-пированием позволит выявить новые аспекты патогенеза различных форм хориоретинальной дистрофии и может быть полезным для мониторинговых и прогностических целей.

Цель работы - изучить экспрессию мембранных антигенов клеток иммунной системы и содержание растворимых форм этих антигенов в сыворотке крови и оценить диагностическую и патогенетическую роль этих изменений у больных различными формами хориоретинальной дистрофией.

Задачи исследования:

1. Изучить экспрессию молекул гистосовместимости НЬА I класса (НЬА-1) и НЬЛ-БЯ, молекул адгезии (1САМ-1 и 1САМ-3) - СБ50 и С054, активационных антигенов (СБ38 и СВ25) и Баз-антигена (СБ95) на различных стадиях ИЦХРД и ПВХРД.

2. Выявить динамику изменений сывороточного уровня растворимых молекул гистосовместимости НЬА-1, НЬЛ-БЯ (бНЬА-!, эНЬЛ-БЯ , молекул адгезии СЭ50 (бСОЗО) и С054 (бСП54), растворимых антигенов СЭ38 (бСВ38) и СБ25 (бС025) и Раз-антигена (зС1395) при различных формах ИЦХРД и ПВХРД.

3. Оценить изменения растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы у больных экссудативной формой ИЦХРД в процессе комплексной терапии.

4. Определить корреляцию между мембранными и растворимыми формами мембранных антигенов при ИЦХРД.

Научная новизна

Впервые изучен фенотип клеток иммунной системы при различных формах хориоидальной дистрофии и установлены иммунофенотипические характеристики каждой из изученных форм ИЦХРД. Выявлено, что сывороточное содержание растворимого С025 антигена увеличивается при экссудативной форме ИЦХРД, а также при ПВХРД. В отличие от ИЦХРД при ПВХРД сывороточный уровень молекул Н1А-1 снижен.

Показано, что сывороточный уровень С095 антигена увеличивается при экссудативной форме ИЦХРД и центральном разрыве сетчатки и имеет выраженную тенденцию к увеличению при рубцовой форме ИЦХРД. Выявлено увеличение относительного содержания в сыворотке крови растворимого СБ38 антигена и молекул НЬЛ-БЯ при рубцовой форме ИЦХРД. Показано, что под влиянием комплексной терапии исходно повышенный

уровень растворимых молекул HLA-I и CD95 у больных экссудативной формой ИЦХРД нормализуются спустя 3 месяца после начала лечения.

Установлены коррелятивные взаимосвязи между уровнями ключевых сывороточных антигенов, а также между содержанием ряда субпопуляций иммунокомпетентных клеток и концентрацией сывороточных антигенов.

Практическая значимость

Доказано значение определения сывороточного уровня молекул HLA I класса и опосредующих апоптоз растворимых антигенов CD95 для оценки риска прогрессирования ИЦХРД.

Выявление особенностей изменения относительного содержания CD54, CD16, CD 1 lb-положительных лимфоцитов периферической крови и сывороточного уровня растворимых молекул CD25, CD38, CD95 и HLA-I в различные стадии ИЦХРД позволяет проводить целенаправленный иммуномониторинг этой категории больных для прогноза заболевания и оценки эффективности лечения. Предложен алгоритм определения иммунологических критериев прогрессирования хориоретинальной дистрофии.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на II национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2007), VIII и X конгрессах РААКИ (Москва, 2007, Казань, 2009), научно-практической конференции по офтальмоиммунологии (Москва, 2007), юбилейной научно-практической конференции 85 КБ ФМБА (Москва, 2008), Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» и IV Международной конференции по иммунотерапии, посвященной 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии (Москва, 2008), VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), совместном заседании кафедр клинической иммунологии и аллергологии ММА им.И.М.Сеченова, иммунологического центра 83 КБ ФМБА и лаборатории диагностики и биотерапии опухолей РОНЦ РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в рекомендуемых изданиях ВАК РФ, в которых содержится полный объем информации, касающейся темы диссертации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 14 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения собственных результатов и обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 80 отечественных и 88 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика больных

Исследование проведено на 87 больных ИЦХРД и 16 пациентах с ПЦХРД, наблюдающихся в центре офтальмологии и микрохирургии глаза КБ №85 ФМБА России. Характеристика обследованных пациентов представлена в таблице!. Таблица!

Клиническая характеристика обследованных пациентов

Заболевания Формы Число больных Пол, жен/муж Возраст, лет

ИЦХРД 87 64/23 61,4± 2,3

Атрофическая 36 30/6 65,7± 2,5

Экссудативная 19 14/5 59,9± 3,1

Центральный разрыв сетчатки (ЦРС) 10 7/3 62,8± 1,8

Субретинальная неоваскулярная мембрана (СНМ) 8 6/2 57,6 ±6,0

Рубцовая 14 7/7 72,4± 2,8

ПЦХРД 16 9/6 55,7± 4,5

Всем пациентам офтальмологами Центра КБ № 85 для постановки

диагноза и динамического наблюдения проводилось комплексное 7

офтальмологическое обследование, включающее определение остроты зрения, биомикроофтальмоскопию, осмотр с 3-х зеркальной линзой Гольдмана, статическую компьютерную периметрию, а также оптическую когерентную томографию сетчатки и флюоресцентную ангиографию глазного дна. В качестве контрольной группы использовалась кровь 120 здоровых доноров.

Иммунофенотнпированне клеток. Поверхностные рецепторы лимфоцитов исследовали с помощью широкой панели моноклональных антител (МКА) фирмы «AbD Serotec» (Великобритания) против соответствующих антигенов методом непрямой поверхностной иммунофлюоресценции (табл.2).

10 мкл моноклональных антител (МКА) раскапывали по пробиркам. В пробирки содержащие МКА добавляли по 100 мкл цельной крови и инкубировать 30 минут при t +4° С, после чего добавляли I мл лизиругощего буфера и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Пробирки центрифугировали в течение 7 минут при 1000 об/мин, супернатант сливали и добавляли в каждую пробу 2 мл ФСБ (фосфатно - солевого буфера) при рН =7,4. После чего повторно центрифугировали в течение 7 минут при 1000 об/мин и снова супернатант сливали и ресуспендировали в 300 мкл ФСБ, содержащем 1% формалин. Реакцию анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur фирмы Becton Dickinson (США).

Определение уровня растворимых антигенов в сыворотке крови. Содержание растворимого CD25 (IL-2R) антигена, CD38 антигена, CD95 (Fas) антигена и молекул HLA-DR в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с помощью поликлональных антител против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и меченых пероксидазой хрена моноклональных антител ИКО-Ю5, ИКО-20, ИКО-160 и ИКО-1, соответственно (Новиков В.В. и др., 2008). Очищенные с помощью сульфата аммония и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе козьи поликлональные антитела против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток в рабочем разведении сорбировали в лунки планшетов для иммунофер-ментного анализа в течение 16-18 час при +4-8 °С.

8

Таблица 2

Моноклональные антитела, использованные в работе

Кластер днфферен-цировкн антител Клеточная специфичность

CD3 FITC Зрелые Т-лимфоциты

CD4 FITC Т-хелперы/индукторы

CD 8 FITC Т-киллеры

CD 16 FITC NK-клетки

CD 20 FITC В-лимоциты, фолликулярные дентритные клетки

HLA-DR FITC B-лимфоциты, активированные Т-лимфоциты

CD71 FITC Рецептор к трансферрину

CD25 FITC а-цепь рецептора интерлейкина-2

CD 54 FITC Молекулы адгезии ICAM-1, лиганд для LFA-1 и МАС-1

CD38 PE Активированные лимфоциты

CDllbPE C3bi рецептор СЗ компонента комплемента

CD95 FITC FAS- антиген, опосредующий апоптоз

После 3-5 кратного отмывания не связавшихся антител с помощью забуференного фосфатами физиологического раствора в лунки наносили образцы исследуемых сывороток с последующей инкубацией планшетов в течение 1 часа при комнатной температуре и 3-5 кратным отмыванием не связавшихся белков с помощью забуференного фосфатами физиологического раствора, содержащего 0,1 % Твин-20.

Затем в лунки планшетов наносили рабочий раствор очищенных и конъюгированных с пероксидазой корня хрена моноклональных антител с

последующей инкубацией и отмыванием планшетов как описано выше. Для каждой тестируемой сыворотки ставили отрицательный контроль, где вместо моноклональных антител лунки планшетов обрабатывали раствором конъюгированных с пероксидазой поликлональных мышиных иммуноглобулинов в той же концентрации, что и моноклональные антитела. В качестве положительного контроля использовали образцы предварительно тестированной сыворотки крови больных системной красной волчанкой, содержащей высокий уровень растворимых антигенов.

Концентрацию растворимых молекул HLA I класса, состоящих из ßr микроглобулина и а-цепи молекулы гистосовместимости I класса, определяли в сыворотке крови иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител ИКО-53 (против а-цепи молекулы HLA I класса) и ИКО-216 (против ргмикроглобулина) (Новиков В.В. и др., 2008). В лунки планшетов для иммуноферментного анализа в течение 16-18 часов при температуре + 4-8 °С сорбировали моноклональные антитела ИКО-53. После отмывания не связавшихся моноклональных антител в лунки наносили образцы исследуемых сывороток с последующей инкубацией планшетов в течение 1 часа при комнатной температуре и отмывкой не связавшихся белков. Затем лунки планшетов в тех же условиях обрабатывали рабочим раствором очищенных моноклональных антител ИКО-216, конъюгированных с пероксидазой хрена. Для каждого образца ставился отрицательный контроль. С этой целью использовали образцы поликлональных мышиных антител, меченных пероксидазой хрена и разведенных в той же концентрации, что и моноклональные антитела ИКО-216.

После заключительного отмывания не связавшегося конъюгата, реакцию проявляли раствором 0,1 %-ного ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буферном растворе pH 5,0, содержащем 0,01 % перекиси водорода. Реакцию останавливали 1М раствором H2SO4. Учет результатов проводили с помощью фотометра Multiskan MS фирмы Labsystems при длине волны 492 нм. Результаты выражали в условных единицах (U/ml).

10

Методы статистического анализа.

Для статистической обработки данных использовался программный пакет прикладной статистики SPSS 17.0. Абсолютные и процентные показатели мембранных и растворимых антигенов анализировались методами описательной вариационной статистики.

Дпя изучения достоверности различий с нормой брали разницу доверительных интервалов для средних, долей и значений. Различия между группами оценивали с помощью сравнения средних по t-критерию Стьюдента, непараметрическим критериям Манна-Уитни и Вилкоксона (Гланц С., 1999). Одно-факторный дисперсионный анализ среди подгрупп проводили методами Бон-ферронн, Тьюки и Даннета для множественных сравнений.

Исследование связей параметров (корреляционный анализ) проводили линейным параметрическим методом (рассчитывали коэффициент Пирсона) и непараметрическим методом (рассчитывали критерий Спирмана).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При большинстве клинических форм, за исключением атрофической формой ИЦХРД, отмечена выраженная тенденция к увеличению общего и относительного числа лимфоцитов в периферической крови. У пациентов при рубцовой форме ИЦХРД обнаружено статистически достоверное повышение относительного содержания лимфоцитов на 14% относительно нормы. Подобные изменения были выявлены при ПВХРД, однако вследствие большого разброса данных увеличение было статистически недостоверным, представляя собой лишь тенденцию к повышению.

Изучение экспрессии дифференцировочных антигенов и молекул главного комплекса гистосовместимости на поверхности этих клеток вывило ряд иммунофенотипических отличий у больных ПВХРД и ИЦХРД, имеющих разные клинические формы заболеваний (табл. 3).

В частности, атрофическая и экссудативная формь1 ИЦХРД характеризовались статистически достоверным повышением относительного содержания

С054-положительных лимфоцитов (ICAM-1+) более чем в два раза относительно нормальных значений. На этих стадиях ИЦХРД обнаруживалась выраженная, но статистически недостоверная тенденция к повышению содержания CDllb, CD71, CD95 HLA-DR-положительных. клеток и натуральных киллеров (CD16+). При СНМ статистически достоверных изменений в популяционном составе лимфоцитов не обнаружено, но выявлены тенденции к повышению CD16+, HLA-DR+, CDllb и CD54 клеток. У пациентов с центральным разрывом сетчатки на фоне увеличения относительного содержания CD4+ лимфоцитов в три раза снижалось количество CD25+ клеток, что вероятно связано с изменениями в содержании различных субпопуляций СБ4+клеток.

Заметим, что для больных ИЦХРД с центральным разрывом сетчатки была характерна также выраженная тенденция к повышению относительного содержания CDllb+ клеток при нормальном содержании СОЗ-положительных клеток (общая фракция Т-лимфоцитов), СБ8-положительных клеток (цитоток-сические Т-клетки), натуральных киллеров (CD 16+) и В-клеток (CD20+). При рубцовой форме ИЦХРД на фоне повышенного содержания общей популяции лимфоцитов, но нормального содержания CD3+ и CD4 + Т-клеток, в 1,4 раза повышалось содержание CD8+ клеток, вследствие чего снижалось значение иммунорегуляторного индекса. Кроме того, в 2,5 раза повышался уровень CD16+ клеток. Возможно, повышение относительного содержания CD8-положительных клеток обусловлено не только изменениями в уровне цитоток-сических Т-лимфоцитов, но и натуральных киллеров, часть которых может экс-прессировать CD8 антиген. При рубцовой форме ИЦХРД было повышено также содержание CDllb+ и CD71+ лимфоцитов. Обнаруживалась, кроме того, тенденция к повышению количества клеток, несущих другие активационные антигены - CD25, HLA-DR, CD95, CD54. При ПВХРД изменения в популяционном составе лимфоцитов были сходны с изменениями при атрофической форме ИЦХРД и экссудативной форме ИЦХРД. На фоне нормального содержания CD3, CD4, CD8, С020-положительных клеток в 1,9 раза повышалось относительное количество С054-положительных клеток (р<0,05).

12

Таблица 3

Популпциониын состав лимфоцитов периферической крови больных ИЦХРД и ПВХРД

Популяция клеток Клинические формы ИЦХРД ПВХРД Норма

Атрофическая Экссудативиая снм ЦРС Рубцовая

Лимфоциты,% 30,0±5,0 34,0±12,0 34,0±11,0 31,0±7,0 34,0±2,0* 35,0±11,0 29,8±0,8

Лимфоциты, 1864±552 2416±1150 2289±858 2446±705 2263±313 2340±935 1920±70

клеток/мкл

СБЗ\ % 63,9±8,8 70,8±5,8 72,8±9,6 72,8±11Д 66,7±3,1 65,8±11,3 66,7±5,2

СБ4+, % 38,6±7,9 39,3±15,3 33,0±7,6 41,8±1,2* 43,6±8,7 37,2±7,5 35,2±4,6

СБ8\ % 27,7±7,8 36,1±20,1 40,7±10,8 28,7±5,8 40,3±2,2* 32,5±б,9 28,7±5,6

СБ20+, % 11,7±3,9 15,1±6,0 8Д±3,7 9,0±4,0 9,9±1,9 8,5±2,5 8,2±1,9

С016", % 21,8±9,6 18,0±б,3 19,6±9,б 13,3±11,2 25,2±3,1* 23,6±9,4 10,3±4,2

% 15,6±3,8 12,4±53 15,4±6,5 12,8±3,4 12,4±2,1 12,1±2,4 9,0±1,8

СБ71+, % 6,4±4Г? 7,1±5,3 4,7±3,4 3,б±2,1 8,2±3,4* 4,8±3,5 3,2±1,9

СВ25\ % 2,5±1,3 3,2±1,4 2,4±1,1 0,9±0,5* 4,9±2,1 2,5±1,6 2,6±0,9

СЭ38\ % ■34,0±10,1 30,2±6,3 26,0±11,4 27,4±5,3 2б,1±4,3 34,0±8,1 32,4±8,6

СШ1Ь\ % 45,7±14,2 373±15^ 50,4±16,2 36,4±133 52,4±11,9* 46,0±12,6 20,4±7,6

С095\ % 35,9±13,9 44,9±8,3 28,1±10,4 29,3±7,6 31,2±7,4 36,9±12,8 26,7±6,3

СП54\ % 20,8±14,5* 19,9±11,7* 153±12,6 11,5±8,8 26,5±19,7 17,1±9,4* 9,2±4,1

* - р<0.05 в сравнении с контролем (здоровыми донорами)

Присутствовала также тенденция к увеличению популяции натуральных киллеров, НЬА-ОК+, СР11Ь+ и СБ95+ клеток. В целом, обнаруженные изменения свидетельствуют о наличии на системном уровне активационных процессов при различных формах хориоретинальной дистрофии.

Рисунок 1

Концентрация яСВ25 в сыворотке крови больных ИЦХРД и ПВХРД

а ^

З3.

° £ СП ш

1 а

I *

и-

1000

400

Контроль ИЦХРД-АП ИЦХРД-ЭГ ИЦХРД-ЦР ПВХРД

* - р<0.05 в сравнении с контролем (здоровыми донорами)

Активация иммунной системы сопровождается изменениями в содержании целого ряда эффекторных белковых молекул, включая как цитокины, так и растворимые дифференцировочные молекулы (антигены) и растворимые молекулы главного комплекса гистосовместимости. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы участвуют в регуляции активационных процессов, часто выступая в качестве ограничителей процессов активации. Для изучения роли данной группы молекул в патогенетических механизмах развития хориоретинальной дистрофии мы провели определение сывороточного уровня представителей этой группы эндогенных иммунорегуляторов.

Установлено, что сывороточное содержание растворимого CD25 антигена увеличивается при атрофической форме, экссудативной форме ИЦХРД, при разрывах сетчатки, а также при ПВХРД. Наиболее выраженные изменения были выявлены при экссудативной форме ИЦХРД и при ПВХРД. Концентрация растворимого CD25 антигена повышалась в этих случаях в несколько раз (рис. 1).

Рисунок 2

Концентрация sHLA-I в сыворотке крови больных ИЦХРД и ПВХРД

При ИЦХРД с формированием субретинальной неоваскулярной мембраны и при центральном разрыве отмечена выраженная тенденция к увеличению уровня бНЬА-! в сыворотке крови (рис. 2). В отличие от ИЦХРД, при ПВХРД концентрация зНЬА-1 была достоверно снижена.

Показано, что сывороточный уровень бСВ95 антигена статистически достоверно увеличивался при экссудативной форме и разрывах сетчатки ИЦХРД и имел тенденцию к повышению при атрофической форме, особенно, при формировании субретинальной неоваскулярной мембраны (рис. 3).

Рисунок 3

Концентрация sCD95 в сыворотке крови больных ИЦХРД и

ПВХРД

1400

1200

1600

С

Контроль ИЦХРД- ИЦХРД- ИЦХРД- ИЦХРД- ИЦХРД- ПВХРД АП ЭГ СНМ ЦР РС

* - р<0.05 в сравнении с контролем (здоровыми донорами)

Выявлено увеличение относительного содержания в сыворотке крови растворимых CD38 (рис. 4) и HLA-DR (рис. 5) антигенов при рубцовой стадии ИЦХРД. Следует отметить, что концентрация первого антигена имела выраженную тенденцию к повышению при формировании субретинальной неоваскулярной мембраны и при экссудативной форме ИЦХРД. Средний уровень растворимых молекул HLA-DR в сыворотке крови больных при экссудативной форме заболевания у ряда больных был снижен, в процессе лечения значительно повышался, но в среднем не отличался от показателя в контроле.

Показано также, что под влиянием комплексной терапии исходно повышенные уровни HLA-I и CD95 у ряда ранее не леченных больных с экссудативной формой ИЦХРД нормализуются уже через 3 месяца после проведенного лечения (рис. 6 и 7).

Рисунок 4

Содержание «СВ38 в сыворотке крови больных ИЦХРД и ПВХРД

АП ЭГ СНМ ЦР РС

* - р<0.05 в сравнении с контролем (здоровыми донорами)

Заметим, что содержание СБ95-положительных лимфоцитов при всех исследованных формах хориоретинальной дистрофии не претерпевало статистически достоверных изменений. Однако при всех формах наблюдалась тенденция к повышению их содержания, что сопровождалось увеличением концентрации растворимой формы СБ95 антигена. Мембранная форма последнего участвует в инициации апоптоза, а растворимая форма блокирует апоптотические процессы при их чрезмерном развитии.

Обнаружены статистически значимые корреляции между содержанием растворимых молекул, чей уровень изменяется при различных формах ИЦХРД. Так, отмечены статистически достоверные корреляции между сывороточным уровнем растворимых .чСБ25 и эСВ54 (11=0.64) антигенов, между сывороточным уровнем молекул зНЬА-БК и зСБ38 (11=0.76) и сывороточным содержанием вША-БЯ и бНЬА- I (11=0.47).

Рисунок 5

Концентрация молекул вНЬА-Би в сыворотке крови больных ИЦХРД и

ПВХРД

Заметим, что все они в мембранной форме участвуют в активационных процессах клеток, а в растворимой форме способны ограничивать активацион-ные процессы. Корреляционная связь при ИЦХРД между зСБ25 и эС054 антигенами может быть связана со скоординированным сходом молекул адгезии СБ54 и одной из субъединиц рецептора интерлейкина-2 - молекулы СБ25 - с активированных Т-лимфоцитов в процессе их миграции в очаг воспаления и осуществления эффекторных функций. Положительная корреляция между сывороточным уровнем молекул зНЬЛ-БЯ и зНЬА-1 свидетельствует о наличии процессов презентации антигена, идущих с участием как молекул гистосовме-стимости первого класса, так и молекул гистосовместимости второго класса. Одним из итогов презентации антигена лимфоцитам, является последующий шеддинг антиген-презентирующих молекул с поверхности клеток.

Рисунок б

Концентрация растворимых форм НЬА-1 в сыворотке крови доноров и больных с ЦХРД до и спустя 3 месяца лечения

_ Е 2500

2000

(Л И

1500

1000

После лечения ЦХРД

Доноры

Хотя повышенный уровень молекул НЬЛ-БК может быть связан и с их сходом с поверхности эндотелиальных клеток в участках воспаления. Более выраженная корреляция в содержании растворимых молекул НЬА-ОК с содержанием растворимых молекул СВ38 отражает активное вовлечение в иммунные процессы в большей степени клеток, несущих на своей поверхностной мембране эти молекулы.

Выявлены также высокие корреляционные положительные связи (р<0.05) между относительным и абсолютным содержанием СБ8-положительных клеток, чье количество значительно повышается в рубцовую стадию ИЦХРД, и содержанием в крови растворимых молекулам СБ25 (11=0.49 и 0.48 соответственно; р<0.05), СБ38 (Я=0.81 и 0.74; р<0.01), НЬЛ-БЯ (Я=0.54 и 0.58; р<0.01). Вероятно, повышение содержания СВ8-положительных клеток связано с увеличением количества активированных цитотоксических Т-клеток,

чью чрезмерную активацию сдерживают растворимые молекулы СБ25, СВ38, НЬЛ-БК, сошедшие в мембраны этих же клеток.

Содержание популяции Т-клеток (СБЗ-положительных) и общей популяции лимфоцитов находится в положительной корреляционной связи (р<0.05) с сывороточным уровнем растворимых молекул СБ25, С038, НЬД-БЯ, хотя для СВ4-положительных Т-лимфоцитов подобных взаимосвязей не обнаружено. Содержание СВ54-положительных лимфоцитов также положительно коррелирует с уровнем зНЬА-ОК молекул (11=0.68; р<0.01).

Рисунок 7

Концентрация растворимых форм СБ95 в сыворотке крови доноров и больных с ИЦХРД до лечения и через 3 месяца

Доноры

ЦХРД

* - р<0.05 в сравнении с контролем (здоровыми донорами)

Таким образом, растворимые антигены участвуют в регуляции иммунного ответа, информация об их наличии и функциональной роли важна для понимания патогенеза различных форм дистрофии сетчатки. Доказана прогностическая и мониторинговая значимость определения растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток при данном заболевании.

200

выводы

1. При периферической витреохориоретинальной дистрофии (ПВХРД) на фоне нормального содержания CD3+, CD4+, CD8+- и CD20+ клеток в периферической крови повышено относительное количество CD54+ лимфоцитов, также отмечена тенденция к увеличению числа CD 16+, HLA-DR+, CD11Ь+ и CD95+ клеток.

2. В крови больных атрофической и экссудативной формах инволюционной центральной хориоретинальной дистрофией (ИЦХРД) увеличено относительное число CD54+ лимфоцитов. У пациентов с центральным разрывом сетчатки повышено процентное содержание CD4+ клеток, но снижено число CD25+ лимфоцитов. В рубцовую стадию ИЦХРД увеличено число клеток, экспрессирующих антигены CD8, CD lib, CD 16 и CD7I, и снижен индекс CD4/CD8.

3. Концентрация растворимого антигена CD25 в сыворотке крови увеличена при экссудативной форме ИЦХРД, а также при периферической витреохориоретинальной дистрофии (ПВХРД). В отличие от ИЦХРД при ПВХРД сывороточный уровень растворимых молекул HLA-I снижен.

4. Уровень растворимого антигена CD95 в сыворотке крови повышен при экссудативной форме ИЦХРД, при центральных разрывах сетчатки и имеет выраженную тенденцию к увеличению при атрофической форме ИЦХРД и, особенно, при формировании субретинальной неоваскулярной мембраны. Концентрация растворимых антигенов CD38 и HLA-DR в сыворотке крови увеличена у больных при рубцовой форме ИЦХРД.

5. Комплексная терапия больных экссудативной форме ИЦХРД нормализует исходно повышенные уровни растворимого CD95 антигена и молекул HLA-I через 3 месяца после проведенного лечения.

6. При ИЦХРД с использованием непараметрического критерия Спирмана выявлена положительная корреляционная связь сывороточных

концентраций следующих пар растворимых антигенов: sCD25 и sCD54, sHLA-DR и sCD38, sHLA-I и sHLA-DR.

7. При ИЦХРД обнаружена положительная корреляционная связь между числом CD8+ клеток в крови и сывороточными концентрациями sCD25, sCD38 и sHLA-DR, а также между количеством CDllb+ клеток и уровнем sHLA-I и sCD95. Отрицательная связь выявлена между относительным числом CD95+ клеток в крови и сывороточной концентрацией sHLA-I.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется использовать определение относительного содержания CD54, CD 16, CD 1 lb-положительных лимфоцитов периферической крови и сывороточного уровня растворимых молекул CD25, CD38, CD95 и HLA-I в иммуномониторинге больных хориоретинальной дистрофией с целью прогноза заболевания и оценки эффективности лечения.

2. Для оценки риска прогрессирования ИЦХРД целесообразно проведение комплексного клинико-офтальмологического и иммунологического обследования с определением сывороточного уровня опосредующих апоптоз растворимых молекул CD95 и растворимых молекул HLA I класса.

3. С целью достижения максимального терапевтического эффекта у больных ИЦХРД рекомендуется использование комплексной терапии с включением антиоксидантов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Евсегнеева И.В, Фотиади О.Г, Марньпс С.А. Исследование динамики сывороточных форм мембранных антигенов при различных клинических формах ЦХРД // Сборник материалов 10-й научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии», М., 2007. - С.38 -43.

2. Караулов A.B., Евсегнеева И.В., Фотиади О.Г., Новиков В.В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы в развитии инволюционной центральной хориоретинальной дистрофии сетчатки // Российский аллергологический журнал. - 2007. - № 3. -С.209

3. Evsegneeva I.V., Fotiadi O.G., Karaulov A.V. The serum level of membrane antigens soluble forms of immune system cells in healthy persons and patients with diabetic retinopathy and senile maculodystrophy // "Immune-mediated diseases" Abstracts of the 2nd congress, 2007. - P. 18.

4. Караулов A.B., Евсегнеева И.В., Фотиади О.Г., Кокушков Д.В., Новиков B.B. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы: прогностическая и мониторинговая значимость при различных заболеваниях // Сборник материалов II Национального конгресса терапевтов. «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации» М., 2007. - С.95.

5. Евсеегнеева И.В., Марных С.А., Фотиади О.Г., Караулов A.B. Клинико-патогенетическая роль мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в развитии ЦХРД и диабетической ретинопатии. Офтальмоиммунология: итоги и перспективы // Материалы научно-практической конференции. М., 2007. - С. 110-113.

6. Евсегнеева И.В., Марных С.А., Фотиади О.Г., Новиков В.В., Караулов A.B. Исследование динамики сывороточных форм мембранных антигенов при различных клинических формах ЦХРД // Сборник материалов юбилейной конференции КБ № 85 ФМБА России «60 лет в науке н практике», М., 2008. - С. 316 -321.

7. Евсегнеева И.В., Марных С.А., Фотиади О.Г., Новиков В.В., Караулов A.B. Мембранные и растворимые формы дифференцировочных антигенов у больных сахарным диабетом 2 типа при развитии диабетической ретинопатии // Сборник материалов юбилейной

конференции КБ № 85 ФМБА России «60 лет в науке и практике», М., 2008.-С. 307-315.

8. Караулов A.B., Евсегнеева И.В., Марных С.А., Фотиади О.Г., Новиков В.В. Сравнительное исследование содержания растворимых форм дифференцировочных антигенов у больных диабетической ретинопатией и центральной хориоретинальной дистрофией // Аллергология и иммунология, 2008. - т. 9, №4. - С. 456 - 457.

9. Караулов A.B., Фотиади О.Г., Марных С.А., Евсегнеева И.В. Изучение содержания мембранных и растворимых форм дифференцировочных антигенов и молекул главного комплекса гистосовместимости у больных центральной хориоретинальной дистрофии // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - т. 54, № 3-4.- С.130 - 131.

10. Караулов A.B.. Марных С.А., Фотиади О.Г., Евсегнеева И.В. Растворимые формы дифференцировочных антигенов у больных центральной хориоретинальной дистрофией. // Аллергология и иммунология, 2009. - т. 10, №3. - С. 397 - 398.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИЦХРД - Инволюционная центральная хориоретинальная дистрофия ИКО - Серия моноклональных антител

ПВХРД - Периферическая витреохориоретинальная дистрофия

СНМ - Субретинальная неоваскулярная мембрана

ЦРС - Центральный разрыв сетчатки

CD - Clusters Differentiation (кластеры дифференцировки)

HLA- Human Leucocyte Antigen (антигены лейкоцитов человека)

FAS- антиген - антиген CD 95, опосредующий апоптоз

ICAM-1,3 - Intercellular Adhesion Molecule (молекулы межклеточной

адгезии типа 1 и 3)

LFA — Lymphocyte Function-Associated Antigen ( NK - Natural killer (натуральные киллеры)

ММА нм.И.М.Сеченова I Ьлписппо п печать

Тираж 100 экземпляров