Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Распространение и свойства холерных вибрионов, обусловивших вспышки холеры Эль Тор на Кавказе в период седьмой пандемии

На правах рукописи

Васильева Оксана Васильевна

Распространение и свойства холерных вибрионов, обусловивших вспышки холеры Эль Тор на Кавказе в период седьмой пандемии

14.02.02 - эпидемиология

03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 9 АПР 2015

Москва-2015

005567969

005567969

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Куличенко Александр Николаевич — доктор медицинских наук, профессор Савельев Вилорий Николаевич - доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Анисимов Андрей Павлович - доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора.

Быстрова Татьяна Николаевна — доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией эпидемиологии вирусных гепатитов ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора.

Ведущая организация: ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора

Защита состоится «5» июня 2015 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России) по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва ул. Гамалеи, д. 18 и на сайте Центра www.gamaleya.org

Автореферат разослан « » 2015 г.

Ученый секретарь к гл ,

диссертационногоСовета ' 1 /^^у'

доктор медицинских наук, профессор ^ V/1 Русакова Екатерина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Эпидемиологическая обстановка по холере представляет серьезную проблему для мирового здравоохранения. Это обусловлено серьезными эпидемическими осложнениями на эндемичных территориях, многочисленными заносами инфекции практически на все континенты, тенденцией роста заболеваемости в мире [Онищенко Г.Г., 2005; Москвитина Э.А. с соавт., 2011, 2012]. Холерой ежегодно заболевает 3-5 млн человек, из которых около 100-120 тыс. умирают. Болезнь ежегодно регистрируется в 20-25 странах мира. Наибольшее количество больных приходится на страны Африки, Америки и Азии.

Ситуация осложняется тем, что возбудитель текущей 7-й пандемии, начавшейся в 1961 году, Vibrio cholerae биовара Эль Тор [Бароян О.В., 1971] претерпел серьезные эволюционные изменения своего генома. В современный период в эндемичных очагах этой инфекции (Юго-Восточная Азия, Африка) возникли новые генетически измененные варианты V. cholerae биовара Эль Тор, которые отличаются повышенной вирулентностью [Nair G.B. et al., 2002; Monta M. et al., 2008; Смирнова Н.И., с соавт., 2010; Safa A. et al., 2010; Borkakoty В. et al., 2012; Okada К. et al., 2012]. Модификации генома возбудителя холеры определили способность его генетически измененных клонов к широкому распространению, проникновению на новые территории и вытеснению типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор [Nair G.B. et al., 2006; Monta M. et al., 2008; Safa A. et al., 2010; Grim C.J. et al., 2010; Москвитина Э.А. с соавт., 2012].

Такое положение определяет необходимость изучения изменчивости генома штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных на различных территориях и в разные годы, в том числе и на Кавказе, с целью обнаружения генетически измененных вариантов V. cholerae биовара Эль Тор. Все еще остаются мало изученными фенотипи-ческие свойства генетически измененных V. cholerae биовара Эль Тор, недостаточно сведений о структуре профага СТХф и мобильных генетических элементах. Эти данные необходимы для оценки их генетического разнообразия.

Развитие ситуации требует контроля над динамикой изменения биологических свойств возбудителя холеры (вирулентности, токсигенности, серо- и фаговарной характеристики, чувствительности к антибиотикам, генетической организации).

Помочь в решении этой задачи в части накопления, хранения, систематизации, предоставления данных в удобном для восприятия виде призваны информационные системы. Основу таких систем представляют собой компьютерные базы данных, которые могут быть использованы в качестве инструмента при эпидемиологическом анализе. Использование современных технологий позволяет быстро оценивать ретроспек-

тивные данные, сопоставлять их с современными данными, проводить ретроспективный и оперативный эпидемиологический анализ вспышек холеры на клеточном и молекулярном уровнях [Москвитина Э.А., 1996; Водопьянов A.C. с соавт., 2005, 2009].

Важную роль в предотвращении вспышек данной болезни на территории России играет прогнозирование рисков заноса и распространения холеры в каждом регионе, позволяющее грамотно спланировать профилактические мероприятия.

Подобная задача особенно актуальна для Ставропольского края, территория которого относится к первому типу по эпидемическим проявлениям холеры и нуждается в проведении усиленного комплекса противохолерных мероприятий. В целях рационального планирования санитарно-эпидемиологических мер в крае необходима оценка его административных территорий по степени риска заноса и распространения холеры.

Степень разработанности темы исследования. Впервые о генетически измененных вариантах биовара Эль Тор стало известно из работ G.B. Nair et al. [2002]. Исследования, проведенные впоследствии российскими учеными, показали, что эпидемические осложнения в Российской Федерации с начала 90-х годов были вызваны, в том числе, и генетически измененными штаммами холерного вибриона [Смирнова Н.И. с соавт., 2008; Монахова Е.В. с соавт., 2009; Миронова JI.B. с соавт., 2012]. А поскольку в период седьмой пандемии эпидемические проявления холеры неоднократно регистрировали на Кавказе (Ставропольский край, Дагестан, Грузия, Армения, Азербайджан), и при этом заносы инфекции происходили из различных регионов мира (Сирия, Иран и др.), есть все основания полагать, что они были обусловлены генетически различными штаммами V. cholerae. Генетически измененные штаммы вызывают особый интерес в силу малой изученности и высокой эпидемической опасности. Для дальнейшей оценки генетического многообразия V. cholerae и изучения свойств его измененных вариантов необходимо более глубокое исследование штаммов, выделенных на Кавказе в период седьмой пандемии. Разработки, касающиеся эпидемиологических рисков, опубликованы в работах В.Д. Белякова [1985] и Б.Л. Черкасского [2007], направлены на прогнозирование эпидемиологического процесса и проведение целенаправленного эпидемиологического надзора. Ю.М. Ломовым с соавт. [1997] разработана методика комплексной оценки степени потенциальной эпидемиологической опасности административных территорий города или района, основанная на количественных, качественных показателях и данных, характеризующих их эпидемический потенциал. A.B. Горобец [2005] на территории Ростовской области, выявлены города и районы с повышенным и низким эпидемическим потенциалом, что является базисом для оценки эпидемиологического

риска. Для административных территорий Ставропольского края оценка риска заноса и распространения холеры проведена впервые.

Цель исследования - анализ распространения холеры на Кавказе в период седьмой пандемии и изучение биологических и молекулярно-генетических свойств возбудителя данной инфекции.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать эпидемические проявления холеры на Кавказе с 1970 г. по настоящее время.

2. Создать информационную систему «Холера на Кавказе: штаммы холерных вибрионов», в которой будут представлены биохимические, серологические и генетические свойства холерных вибрионов, выделенных в период 1969-2010 гг., а также место и дата их выделения.

3. В сравнительном аспекте провести анализ фенотипических свойств типичных штаммов холерных вибрионов и измененных вариантов, обусловивших эпидемическое неблагополучие на Кавказе.

4. Изучить молекулярно-генетическую организацию выделенных на территории Кавказа измененных вариантов V. сЪо1егае биовара Эль Тор, провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена с1хВ.

5. На примере Ставропольского края провести анализ и ранжировать риски заноса и распространения холеры, определить с их учетом комплекс противохолерных мероприятий в целях совершенствования эпидемиологического надзора.

Научная новизна исследования. Впервые на Кавказе выявлены генетически измененные варианты V. с/ю1егае биовара Эль Тор и установлено, что эпидемические осложнения по холере 1970-1990 гт. были обусловлены типичными штаммами, а в 1993,1994 и 1998 гг. - генетически измененными вариантами.

Установлена изменчивость профага СТХ<р у генетически измененных вариантов V. сЪо1егае биовара Эль Тор, обусловленная присутствием разных аллелей гена гу/Л (м!?1™, Наибольшее количество штаммов, выделенных на Кавказе (72 %), со-

держали два аллеля гена

Показано, что генетически измененные варианты по своим морфологическим, биохимическим и гемолитическим свойствам не отличаются от типичных холерных вибрионов биовара Эль Тор. Однако часть штаммов оказалась резистентной к фагу Эль Тор (78,4 %) и не агглютинировала эритроциты морской свинки (3,9 %), не образовывала ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра (13,7 %).

Создана информационная система «Холера на Кавказе: штаммы холерных вибрионов», которая включает в себя 6181 паспорт штаммов холерного вибриона, выделенных от больных, вибриононосителей и из объектов окружающей среды в период 1969-2010 гг. на территории Кавказа. Представлены данные о биологических свойствах данных штаммов холерных вибрионов (биохимических, серологических, фаголиза-бельных и чувствительности к антибиотикам) и генетических особенностях возбудителя холеры.

Впервые с использованием квартального анализа проведена оценка факторов риска заноса и распространения холеры в Ставропольском крае. Выделены четыре группы административных территорий с низким, средним, высоким и очень высоким риском как заноса, так и распространения холеры.

Теоретическая и практическая значимость работы:

1. Разработана информационная система «Холера на Кавказе: штаммы холерных вибрионов», позволяющая следить за динамикой биологических свойств возбудителя (вирулентности, серо- и фаговаровой характеристики, чувствительности к антибиотикам), генетическими изменениями, одобрена Ученым Советом ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (протокол № 1 от 29.01.2015 г.) и утверждена директором института.

2. Методические рекомендации «ПЦР-генотипирование холерных вибрионов эльтор» одобрены Ученым Советом ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (протокол № 5 от 27.04.2010 г.) и утверждены директором института.

3. Методические рекомендации «ПЦР-генотипирование холерных вибрионов эльтор по тестированию генов гсгД®, с/хА, ге/С» одобрены Ученым Советом ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (протокол № 4 от 19.04.2010 г.) и утверждены директором института.

4. Разработки автора использованы в составлении комплексного плана противохолерных мероприятий в Ставропольском крае на период 2011-2015 гг. (утверждены первым заместителем председателем Правительства Ставропольского края 01.08.2011г.). Научные и практически значимые результаты исследования используются в лекционном материале для слушателей курсов специализации и повышения квалификации в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.

Методология и методы исследования. При подготовке и реализации программы исследования использована методология, основанная на традиционных, адаптированных к специфике поставленных задач, методах. В исследованиях использованы ме-

тоды: генетические и микробиологические, с последующей современной компьютерной статистической обработкой.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование информационной системы позволяет более эффективно проводить анализ вспышек, а также определять вновь выявленные изменения биологических (токсигенность, биохимические и серологические свойства, лизабельность фагами, антибиотикорезистентность) и генетических свойств возбудителя.

2. Штаммы холерного вибриона, изолированные от людей в регионе Кавказа с 1970 г. по 1990 г., в составе профага СТХф содержат ген ctxlf' (или ctxB3) и продуцируют токсин 2-го типа, характерный для вибрионов Эль Тор. Штаммы холерного вибриона, выделенные на территории Дагестана в 1993, 1994, 1998 гг., содержат ctxBclass (или ctxBl), продуцируют токсин 1-го типа, характерный для классического холерного вибриона.

3. Штаммы холерных вибрионов Эль Тор, выделенные в 1970-1990 гг., в области RS2 профага СТХф содержат ген rstREI. Штаммы, выделенные в 1993, 1994, 1998 гг., содержат разные аллели фагового гена rstR - rstREI, rstRclass.

4. Проведенное ранжирование административных территорий Ставропольского края по степени риска позволило выделить районы, подверженные наибольшей опасности заноса или распространения холеры, и определить комплекс первоочередных профилактических мероприятий. Подобный подход к оценке риска и дальнейшего распространения холеры может быть использован и для других административных территорий Российской Федерации.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы выполнены совместно с кандидатом медицинских наук, старшим научным сотрудником И.В. Савельевой (ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора).

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты исследований получены с использованием современного поверенного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.

Материалы диссертации представлены на заседаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013); на итоговых конференциях «ФКУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (Ставрополь, 2010, 2011); Всероссийской научной конференции с международным участием

«Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); Региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Причерноморском регионе» (Ставрополь, 2013). Апробация диссертационной работы состоялась на расширенном заседании лаборатории диагностики холеры и других кишечных инфекций ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (протокол № 1 от 6 февраля 2015 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 19 научных работах, 6 из которых опубликованы в периодических изданиях, рекомендованных «Перечнем ВАК».

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 242 источника, в том числе 111 работ отечественных и 131 работу зарубежных авторов. Материалы исследований иллюстрированы 35 таблицами и 13 рисунками.

Собственные исследования

Материалы и методы исследования. Диссертационная работа выполнена в рамках плановых НИР: «Распространение и свойства холерных вибрионов на территории Кавказа» (ГР № 01200112536), «Фенотипические и молекулярно-генетические исследования штаммов холерных вибрионов, выделенных на Кавказе в период седьмой пандемии» (ГР № 01200700919), «Изучение биологии и молекулярно-генетической организации «гибридных» вариантов холерного вибриона Эль Тор и клинико-эпидемиологических особенностей обусловленной ими холеры на Кавказе» (ГР № 1201169584).

В работе использовали 120 штаммов V. cholerae Ol серогруппы (119 штаммов Эль Тор и 1 штамм классического биовара). Штаммы выделены от людей и из объектов окружающей среды в Азербайджане, Армении, Грузии, Дагестане, Кабардино-Балкарии, Краснодарском и Ставропольском краях. Изучение фенотипических свойств холерных вибрионов проводили согласно МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры». Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием специфических праймеров проводили на термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Секвени-рование генов проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США). При сопоставлении последовательностей использовали программы FinchTV 1.4.0. и BLAST (NCBI).

Информационная система «Холера на Кавказе: штаммы холерных вибрионов» включает 6181 паспорт штаммов холерного вибриона, выделенных на Кавказе за период 1969-2010 гг. от больных и вибриононосителей, а также из объектов окружающей среды. Для разработки информационной системы использованы современные программные продукты с открытым кодом. В качестве системы управления базой данных выбрали MySQL. Пользовательский интерфейс написан на языке PHP с применением технологии AJAX. Кроме того, для наглядной визуализации географических объектов использованы Яндекс.Карты. На картах представлены места выделения холерных вибрионов как из окружающей среды, так и от людей.

Для определения риска заноса и распространения холеры объектами исследования послужили 10 городов краевого значения и 26 районов согласно административно-территориальному делению Ставропольского края. При изучении миграции населения в Ставропольском крае проанализировали материалы, полученные из Территориального органа Федеральной службы государственной статистики и Управления Федеральной миграционной службы по Ставропольскому краю с 2007 г. по 2011 г. Для анализа санитарно-гигиенических факторов использовали сведения государственных докладов «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Ставропольском крае» за период 20072011 гг., подготовленных Управлением Роспотребнадзора по Ставропольскому краю. Для оценки природно-климатических условий административных территорий проанализировали данные Ставропольского краевого центра по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды, а также Ставропольского центра государственного мониторинга природных ресурсов.

Для ранжирования территорий по группам риска заноса и распространения холеры использовали встроенные квартальные функции пакета прикладных программ Microsoft Excel 2010. Для оценки достоверности различий между группами штаммов при описании их биологических свойств использовали относительные показатели в процентах [Савилов Е.Д. с соавт., 1993], критерий у} [Рокицкий П.В., 1973]. Статистический анализ данных осуществляли с помощью программного продукта Microsoft Excel 2010.

Генетическая характеристика V. cholerae Эль Тор, изолированных на Кавказе

Дифференциация типичных штаммов и измененных вариантов основывалась на выявлении различий в нуклеотцдной последовательности гена ctxB, кодирующего В -субъединицу холерного токсина. Однонуклеотидную несинонимичную замену в положении 203 в 3'- концевой области гена ctxB у измененных вариантов определяли с помощью МАМА (Mismatch Amplification Mutation Assay) ПЦР анализа [Monta M. et

al., 2008]. У типичных Эль Тор вибрионов в нуклеотидной последовательности гена ctxB в позициях 115 и 203 присутствует тимин (Т), тогда как у классических вибрионов цитозин (С) [Kumar P. et al., 2009]. Полученные результаты показали, что у 56 изученных штаммов в геноме профага СТХср присутствует ген ctxB3 (или ctxB Эль Тор типа), и следовательно, эти штаммы продуцируют СТ, характерный для вибрионов Эль Тор. Такие штаммы были выделены в Дагестане (1970, 1973 гг.), Грузии (1970 г.), в Азербайджане (1977, 1980, 1985, 1989, 1990, 1991 гг.), в Ставропольском крае (1980 г.) и г. Ставрополе (1990 г.), а также в Краснодарском крае (1987 г.). Однако, все исследованные штаммы (62 изолята), выделенные во время эпидемических вспышек в Дагестане (1993, 1994 гг.) и Ставропольском и Краснодарском краях (1994 г.), содержали в профаге СТХф ген ctxBl (или ctxB классического типа) и продуцировали СТ классического типа (рисунок 1).

1 2 3 4 5 6 7

9 10 1112 1314 15

Рисунок 1 - Электрофореграмма ампликонов, полученных с праймерами на ген ctxBc'ass-. штаммы V. cholerae биовара Эль Тор, выделенные в 1994-1998 гг., 1 - 4075, 2 - 2354, 3 - 53, 4 - 4075, 5 - 3914, 6 - 15, 7 - 51, 8 - 5435, 9 - 5476,10 - 6,11 - 5476,12 - 8066,13 - 286; контроли 14 - И cholerae классического биовара 569В; 15 - Ladder 100

Для подтверждения полученных результатов было проведено секвенирование гена ctxB у генетически измененных V. cholerae биовара Эль Тор.

В качестве контрольных нуклеотидных последовательностей гена ctxB использовали штаммы 0395 классического биовара и № 16961 биовара Эль Тор, представленные в GenBank, а также нуклеотидную последовательность референс штамма V. cholerae классического биовара - 569В. Установлено, что генетически измененные штаммы в позициях 115 и 205 содержат цитозин, что характерно для классических холерных вибрионов.

G.B. Nair et al. [2002] показали, что помимо разной нуклеотидной последовательности гена ctxB измененные варианты могут содержать различные аллели фагового гена rstR: rstRclass и rstREI. Поэтому у исследуемых штаммов был определен аллель гена rstR. ПЦР анализ показал, что 56 штаммов, выделенные с 1970 г. по 1990 г., в 100 % случаев содержали в геноме профага СТХф ген rstREI (таблица 1). Большинство штаммов V. cholerae, выделенных в 1993-1998 гг. (85,4 %), имели два аллеля гена rstR - rstREI и rsíRc,ass.

Присутствие двух генов rstR разных типов (rstRclass и rstREI) может означать, что в хромосоме этих штаммов, имеющей измененный ген ctxB, присутствуют две копии профага СТХф, - одна из которых классического типа (ctxBl, rstRclass), а другая -гибридная (ctxBl, rstREI), локализованные либо в тандемном порядке на одной хромосоме, либо на разных хромосомах [Safa A. et al., 2010; Смирнова Н.И. с соавт., 2011].

У 6 генетически измененных штаммов (9,6 %), выделенных от больных в Дербентском, Гергебильском и Каякентском районах Республики Дагестан, был обнаружен только аллель rstREI.

Это означает, что в их хромосоме присутствует гибридный профаг СТХф, в геноме которого содержатся гены холерных вибрионов обоих биоваров - Эль Тор (rstRE!) и классического (ctxBl). Всего 2 штамма (3,5 %), выделенные от людей в Дагестане в 1994 г., содержали ген rstRdass, что свидетельствует о присутствии профага классического типа CTXclass в хромосоме этих штаммов (таблица 1).

Таблица 1 - Распространенность аллелей генов сОсВ и rstR в геноме профага СТХф V. сИо1егае биовара Эль Тор, выделенных в 1970-1990 гг. и 1993-1998 гг.

Количество Год Аллель гена ctxB Аллель гена rstR

штаммов выделения ctxBl ctxB3 rstRc,ass rstRы rstR"/ rstRclass

56 1970-1990 0 56 0 56 (100 %) 0

62 1993-1998 62 0 2 (3,5 %) 6 (9,6%) 53 (85,4 %)

Полученные данные позволили выявить среди измененных вариантов V. сЬо1егае, выделенных в 1993-1998 гг. на территории Дагестана, изменчивость профага СТХф, которая выражалась в содержании помимо гена сиШ разных аллелей гена rstR -rstRcla" и/или rstREI. На основании этих данных все изоляты были разделены нами на

три группы. Чаще всего (85,4 %) встречали изоляты с генами ctxBl и rstRE,lrstRcIa's, содержащие две копии профага СТХф. Такие изоляты отнесены нами к генотипу II. Наименее встречаемые (3,5 %) изоляты с генотипом III содержали ctxBl и rstRCIass . Штаммы, встречающиеся в 9,6 %, содержали в своем геноме ctxBl и rstREI и отнесены нами к генотипу I. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей по анализу последовательностей генов rstR и ctxB [Миронова Л.И. с соавт., 2012, 2014; Шашкова А.В., 2012].

Изучение распространенности SXT-элемента в штаммах V. cholerae Эль Тор

SXT-элемент отсутствовал в штаммах V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных до 1993 года, а в настоящее время он присутствует почти во всех клинических штаммах холерного вибриона, выделенных, в Индии, Юго-Восточной Азии, Северной и Восточной Африке, Центральной и Южной Америке [Dziejman М. et al., 2002; Kumar P. et al., 2010]. Однако данных о распространенности этого элемента среди генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор в доступной литературе представлено недостаточно. С целью выявления STX-элемента нами исследованы 44 клинических штамма, из которых 10 были выделены во время эпидемических вспышек в Азербайджане в 1977 г., 1985 г. и г. Ставрополе в 1990 г. и являются типичными Эль Тор вибрионами. Другие 34 штамма были выделены на территории Дагестана в 1993, 1994 и 1998 гг. и, согласно проведенным нами исследованиям, являются генетически измененными вариантами.

ПЦР анализ показал присутствие последовательности SXT-элемента в геномах всех исследованных измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенных в Дагестане в 1993, 1994 и 1998 гг. У подавляющего большинства этих штаммов в геноме присутствовали гены, кодирующие резистентность к стрептомицину В (strB), триметоприму (dfrAl) и сульфаметоксазолу (sulll). У штаммов V. cholerae типичных вариантов биовара Эль Тор все анализируемые гены отсутствовали. Следует отметить, что из всех изученных штаммов, имеющих в геноме SXT-элемент, у двух отсутствовали гены, кодирующие резистентность к стрептомицину В, сульфаметоксазолу и триметоприму, что составило 5,5 %. Полученные нами данные, совпадают с генетической характеристикой, обусловленной SXT-элементом антибиотикорезистентности, представленной А.К. Goel с соавт. [2008] и Т.А. Кулыпань [2013]. Наличие в генетически измененных штаммах V. cholerae биовара Эль Тор SXT-элемента, отсутствовавшего в типичных штаммах, выделенных на Кавказе до 1993 г., свидетельствует о появлении генетических детерминант резистентности, которые могут

существенно затруднить общепринятые подходы к экстренной профилактике и этиотропному лечению холеры.

Культурально-морфологические, биохимические, серологические, фаголизабель-ные и другие свойства типичных и измененных V. cholerae Эль Тор

С целью выявления различия фенотипических свойств у типичных и измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор нами в сравнительном аспекте изучены свойства штаммов, выделенных в Дагестане в 1993-1994 гг., и у штаммов, изолированных в Азербайджане, Грузии, Дагестане, Ставропольском крае в 1970-1990 гг.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что независимо от времени и места выделения, изучаемые штаммы типичных и генетически измененных вариантов V. cholerae биовара Эль Тор таксономически относятся к роду Vibrio семейства Vibrionaceae, виду Vibrio cholerae 01.

Особый интерес представляло отношение изучаемых штаммов к тестам, определяющим биовар у холерных вибрионов OI серогруппы, так как из данных литературы известно, что генетически измененные штаммы, изолированные в Матлабе (Бангладеш) в 1991-1994 гг., по фенотипическим свойствам не могли быть отнесены ни к классическому, ни к Эль Тор биовару [Safa А., 2010]. Были изучены 46 штаммов холерного вибриона, выделенных на Кавказе с 1970 по 1990 гг., и 51 штамм возбудителя холеры, изолированных с 1994 по 1998 гг.

В соответствии с результатами исследований 38 типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор (82,6 %), изолированные с 1970 по 1990 гг., обладали устойчивостью к 50 ЕД полимиксина В, агглютинировали эритроциты морской свинки, образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра, лизировались диагностическим бактериофагом Эль Тор, 8 штаммов холерного вибриона (17,3 %) проявили вариабельность по изучаемым признакам, 6 из них не лизировались диагностическим фагом Эль Тор, 2 штамма не образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра. Все штаммы не лизировались бактериофагом С, были устойчивы к 50 ЕД полимиксина В, агглютинировали эритроциты морской свинки.

При изучении 51 штамма генетически измененных холерных вибрионов, выделенных на территории Кавказа с 1994 по 1998 гг., было установлено, что только 11 штаммов (21,6 %) были устойчивы к 50 ЕД полимиксина В, агглютинировали эритроциты морской свинки, образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра. Большая часть данных штаммов отличалась вариабельностью по изучаемым признакам. Так, 2 штамма (3,9 %) были чувствительны к 50 ЕД полимиксина В, 40 штаммов (74,8 %) не лизировались фагом Эль Тор; 7 штаммов

(13,7 %) не образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра, не агглютинировали эритроциты морской свинки.

Отмечено увеличение доли штаммов с атипичными свойствами у генетически измененных вариантов по сравнению с типичными штаммами V. сИокгае биовара Эль Тор. Наиболее выражено нарастание доли устойчивых штаммов к лизирующему действию фага Эль Тор. Так, доля типичных штаммов холерного вибриона Эль Тор, выделенных с 1970 по 1990 гг., устойчивых к лизирующему действию диагностического фага Эль Тор, составила 13,3 %, а у генетически измененных штаммов, выделенных с 1993 по 1994 гг., - 78,4 %.

Изучение антибиотикорезистентности клинических штаммов холерного вибриона Эль Тор, выделенных на Кавказе

В результате проведенных исследований было показано, что все штаммы, выделенные в период эпидемических осложнений по холере на Кавказе с 1970 по 1998 гг., обладали чувствительностью к ципрофлоксацину, гентамицину, доксициклину и поли-миксину. Показано статистически достоверное нарастание в 1993-1998 гг. по сравнению с 1970-1990 гг. устойчивости холерных вибрионов к тетрациклину (параметры х2=99,4, с!£=5, р<0,001) от 6,3 % до 64,1 % и левомицетину (параметры %2=51,2, с№=5, р<0,001) от 0 % до 45,1 %.

Оценка риска заноса и распространения холеры на примере Ставропольского края

Территория Ставропольского края относится к I типу по эпидемическим проявлениям холеры, что требует усиленного эпидемиологического надзора за этой инфекцией [Москвитина Э.А., 1996].

Однако при проведении противохолерных мероприятий в Ставропольском крае следует учитывать, что край состоит из административных районов, находящихся в различных климато-географических зонах, обеспеченных разными санитарно-бытовыми условиями, с неоднородной интенсивностью миграционных связей. Такое многообразие диктует необходимость дифференцированной оценки факторов риска заноса и распространения холеры в городах и районах Ставропольского края.

В ходе определения риска заноса холеры учитывали количество прибывших в среднем за 5 лет на каждую территорию края из других регионов Российской Федерации, из стран СНГ и Балтии, а также из государств дальнего зарубежья. Для определения принадлежности каждой территории к той или иной группе риска был выбран квартильный анализ, позволяющий распределить количество прибывших на 4 группы в автоматическом режиме. Территории с показателями до первого квартиля составляют

группу с низкой степенью риска, от первого до второго - средней; от второго до третьего - с высокой; выше третьего - очень высокой степенью риска заноса холеры.

В результате проведенного районирования территория края была разделена на четыре группы по степени риска заноса холеры (рисунок 2).

Апана<

,е Ипатовский

Донское

> ТруНОВСКИЙН обильный

Арзгмр

Новоалексак

Петровский

Новоселицкии

Советский

Кировский

Курский

Красногвардейский

Кочубеевское

Условные обозначения ^^^^ Ч

I - низкии - средний I - высокий | - очень высокий

Кисловодск

Предгорный

Рисунок 2 - Эпидемиологическое районирование территории Ставропольского края по степени риска заноса холеры

К первой группе территорий (с низкой степенью риска) отнесены: Апанасенков-ский, Арзгирский, Новоселицкий, Степновский, Туркменский, Левокумский, Александровский, Андроповский, Благодарненский, Красногвардейский и Нефтекумский районы.

Вторую группу составили территории со средней степенью риска: города - Же-лезноводск, Лермонтов, Буденновск; Ипатовский, Петровский, Труновский, Буденнов-ский, Кочубеевский районы.

Третья группа - территории с высокой степенью риска: Грачевский, Кировский, Минераловодский, Советский, Изобильненский, Курский, Новоалександровский районы, а также г. Георгиевск.

Четвертая группа - территории с очень высокой степенью риска: города - Минеральные Воды, Невинномысск, Ставрополь, Ессентуки, Кисловодск, Пятигорск, а также Предгорный, Шпаковский и Георгиевский районы. Эти территории отличаются наибольшей миграционной активностью.

Для оценки риска распространения холеры на административных территориях Ставропольского края проанализированы санитарно-гигиенические и природно-климатические факторы, оказывающие наибольшее влияние на развитие эпидемического процесса. К наиболее значимым санитарно-гигиеническим и природно-климатическим факторам риска, позволяющим оценить опасность для каждой из территорий, отнесены: удельный вес нестандартных по микробиологическим показателям проб питьевой воды в разводящей сети выше среднего уровня по краю, удельный вес нестандартных по микробиологическим показателям проб воды в источниках централизованного питьевого водоснабжения выше среднего уровня по краю, проблемы с коммунальным благоустройством населенных пунктов (высокая степень износа водопроводных сетей, приводящая к частым авариям, подача воды по графику, наличие смешанного водоснабжения), выделение из окружающей среды вибрионов 01 и поп 01/0139 серогрупп, благоприятные для возможного распространения инфекции природно-климатические условия (минимальная среднемесячная температура июля выше +23,0...+24,0 °С, максимальная среднемесячная температура июля выше +42...+44 °С, продолжительность безморозного периода в среднем 270-275 дней. Для выяснения степени риска распространения холеры для каждой административной территории рассмотрены вышеназванные факторы риска.

Для оценки степени риска распространения холеры в районах и городах для каждого из них определены факторы риска. При наличии фактора риска территория получала «1», при отсутствии такового - «0». Суммирование результатов, полученных административными территориями, дало их итоговые оценки в баллах, которые в свою очередь были ранжированы по квартилям. В результате все административные образования Ставропольского края были разделены на четыре группы по степени риска распространения холеры (рисунок 3).

Группа 1 (низкая степень риска): г. Ессентуки; Александровский, Благодарнен-ский, Георгиевский, Кировский, Предгорный, Труновский, Шпаковский, Туркменский, Ипатовский, Апанасенковский, Красногвардейский районы.

Группа 2 (средняя степень риска): города - Ставрополь, Невинномысск; Буденновск™, Новоселицкий, Советский, Курский, Минераловодский, Петровский районы.

Группа 3 (высокая степень риска): города - Железноводск, Пятигорск; Андро-повский, Арзгирский, Грачевский, Нефтекумский, Степновский, Новоалександровский районы.

Группа 4 (очень высокая степень риска): г. Кисловодск; Изобильненский, Кочу-беевский, Левокумский районы.

Красногвардейский

Донское

Арэгнр

Арзгирский

Грачевский

Шпсковский

Новоселицкий

Андроповский: Курсавка

Условные обозначения

Советский

[МинераловодС

средний

высокий

очень высокий

Курская

Кировский

Курский

Предгорный

Рисунок 3 - Эпидемиологическое районирование территории Ставропольского края по степени риска распространения холеры

Итак, с целью дифференцированного построения системы эпидемиологического надзора, все административные территории Ставропольского края были распределены на две группы - по риску заноса холеры и риску распространения холеры в случае ее заноса. К наиболее опасным территориям относятся города Пятигорск, Кисловодск, а также Новоалександровский, Грачевский, Изобильненский районы в которых повышен риск как заноса, так и распространения холеры (рисунок 4).

Апанасенковску

. Дивное

Ипатовский

Донское

. Труновский]

г—и

Туркменский

Арзгир

Арзгмрский

Петровский

Левокумское

Буденновский

Условные обозначения

нефтекумский(

высокий риск

Кисловодск\ •

Курский

Рисунок 4 - Территории Ставропольского края с высоким риском заноса и распространения холеры

Таким образом, с целью совершенствования эпидемиологического надзора за холерой при разработке плана санитарно-эпидемиологических мероприятий следует учитывать степень риска каждой административной территории края. Для территорий с высокой степенью риска заноса холеры должны быть в первую очередь усилены профилактические меры по выявлению, локализации и ликвидации единичных случаев заноса. В районах с повышенным риском распространения заболевания целесообразно активизировать работу по мониторингу объектов окружающей среды на предмет выявления холерных вибрионов, а также усилить надзор за санитарно-гигиеническим состоянием населенных пунктов, объектов водоснабжения, мест массового отдыха населения, развивать информационно-разъяснительную деятельность.

Выводы

1. Создана информационная система «Холера на Кавказе: штаммы холерных вибрионов», которая включает в себя данные о биологических свойствах холерных вибрионов (биохимических, серологических, фаголизабельности, чувствительности к антибиотикам), генетических особенностях (с/хЛ, ШВЫ, ЫС, с£с5с/ак, 6181 штаммов, выделенных от больных, вибриононосителей и из объектов окружающей

среды в период с 1969 г. по 2010 г. на территории республик Северного Кавказа, Ставропольского и Краснодарского краев, а также Республик Азербайджан, Армения и Грузия. Информационная система может быть использована для ретроспективного анализа вспышек холеры в регионе и изучения эволюции возбудителя холеры.

2. Впервые на примере Ставропольского края — территории, относящейся к I типу по эпидемическим проявлениям холеры, с использованием метода ранжирования проведена оценка факторов риска заноса и распространения инфекции. Выделены четыре группы административных территорий, характеризующихся низкой, средней, высокой и очень высокой степенью риска заноса и распространения холеры. К наиболее неблагополучным территориям, на которых по сумме показателей повышен как риск заноса, так и риск распространения холеры, отнесены курортные города Кавказских Минеральных Вод (Ессентуки, Кисловодск, Пятигорск), а также Грачевский, Изобильнен-ский и Новоалександровский административные районы.

3. Определен комплекс первоочередных противохолерных мероприятий, проводимых в зависимости от степени риска заноса и риска распространения инфекции. Для территорий Ставропольского края с очень высокой и высокой степенью риска заноса холеры рекомендовано усиление мероприятий по выявлению и готовности к локализации и ликвидации единичных очагов, связанных с заносом инфекции, на территориях с очень высоким и высоким риском распространения - усиление мониторинга объектов окружающей среды для выявления контаминации холерным вибрионом, надзора за санитарно-гигиеническим состоянием населенных пунктов, объектов водоснабжения, мест массового отдыха населения в соответствии с действующими нормативными документами.

4. С применением секвенирования ДНК и ПЦР установлено, что этиологическим агентом холеры на территории Кавказа с 1970 г. по 1990 г. были типичные холерные вибрионы биовара Эль Тор, содержащие ШВЗ, а в 1993, 1994 и 1998 гг. генетически измененные варианты этого же биовара, несущие аллель <ЯхВ1.

5. Впервые на территории Кавказа была установлена изменчивость профага СТХср у генетически измененных вариантов V. сИо1егае биовара Эль Тор, обусловленная присутствием разных аллелей гена гяШ п№а). Наибольшее количество штаммов (72 %) содержало два аллеля гена Г5/Я, что указывает на наличие в геноме этих штаммов двух профагов СТХф - классического и гибридного.

6. Показано, что генетически измененные варианты штаммов холерного вибриона, выделенные на Кавказе, по морфологическим, биохимическим и гемолитическим свойствам не отличаются от типичных штаммов. Однако большинство изученных

штаммов (78,4 %) резистентны к фагу Эль Тор, 3,9 % штаммов не агглютинировали эритроциты морской свинки и 13,7 % не образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра. Установлено статистически достоверное нарастание антибиотико-резистентности к тетрациклину и левомицетину у штаммов, изолированных в 19931994 гг., по сравнению со штаммами, выделенными в 1970-1990 гг.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Савельев В. Н., Грижебовский Г. М., Бабенышев Б. В., Таран А. В., Савельева И. В., Васильева О. В., Гусева JL В. Генетическая гетерогенность клинических штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных на Кавказе в период седьмой пандемии // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов-на-Дону, 2009. - В. 22. - С. 108113.

2. Васильева О. В., Савельева И. В., Дорошенко И. Г., Москвитина С. И., Гусева Л. В., Бабенышев Б. В. Савельев В. Н., Грижебовский Г. М. Мобильные генетические элементы антибиотикорезистентности «гибридного» биовара Vibrio cholerae Ol // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: матер. III науч,-практ. конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. организаций Роспотребнадзора (31 мая - 2 июня 2011, Оболенск). - Протвино: A-ПРИНТ ЗАО, 2011. -С. 14-17.

3. Васильева О. В., Солодовников Б. В., Савельев В. Н., Бабенышев Б. В., Савельева И. В. Обнаружение гибридных штаммов холерных вибрионов эльтор среди клинических изолятов на Северном Кавказе // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: материалы научно-практической школы-конференции молодых учёных и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора (25-27 мая 2010, Оболенск, Моск. обл.). - Протвино: A-ПРИНТ ЗАО, 2010. - С. 353-355.

4. Савельев В. Н., Савельева И. В., Васильева О. В, Бабенышев Б. В., Ковалев Д. А., Грижебовский Г. М., Антоненко А. Д., Курбанов Ш. X., Батаев Т. М., Куличенко А. Н. Эволюция Vibrio cholerae eltor и обнаружение их генотипических вариантов на Кавказе // Проблемы особо опасных инфекций. - 2012. - Вып. 4(114). - С. 58-60.

5. Савельев В. Н., Савельева И. В., Бабенышев Б. В., Васильева О. В., Грижебовский Г. М., Куличенко А. Н. Эволюция Vibrio cholerae eltor и обнаружение их гибридных вариантов на Кавказе // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов-на-Дону, 2011. - Вып. 24. - С. 86-92.

6. Васильева О. В., Куличенко А. Н., Савельев В. Н., Бабенышев Б. В., Москвитина С. И. Информационно-поисковая база данных «Холера на Кавказе» // Актуальные

проблемы болезней, общих для человека и животных: матер. Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием. - Ставрополь, 2012. - С. 152.

7. Дорошенко И. Г., Савельев В. Н., Бабенышев Б. В., Савельева И. В., Васильева О. В. Чувствительность к антибактериальным препаратам холерных вибрионов эльтор, обусловивших эпидемическую форму холеры на Кавказе // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: материалы научно-практической школы-конференции молодых учёных и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора (25-27 мая 2010, Оболенск, Моск. обл.). - Протвино: А-ПРИНТ ЗАО, 2010.-С. 117-119.

8. Савельев В. Н., Васильева О. В., Савельева И. В., Бабенышев Б. В., Куличенко

A. Н. К генодиагностике возбудителя современной холеры // Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т. 2, № 1-2. - С. 318-319.

9. Васильева О. В., Москвитина С. И. Савельев В. Н., Бабенышев Б. В. Создание информационной системы «Холера на Кавказе» // Инфекция и иммунитет. - 2012. -Т. 2, № 1-2. - С. 126.

10. Савельев В. Н., Васильева О. В., Савельева И. В, Солодовников Б. В., Бабенышев Б.

B., Грижебовский Г. М., Дорошенко И. Г. Ретроспективный анализ генотипов холерного вибриона эльтор, выделенных на Кавказе в период седьмой пандемии холеры // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов-на-Дону, 2010. - Вып. 23.-С. 81-86.

11. Савельев В. Н., Бабенышев Б. В., Савельева И. В., Васильева О. В., Гусева Л. В., Грижебовский Г. М., Курбанов Ш. X., Асваров Б. М., Батырова Б. А., Дорошенко И. Г., Антоненко А. Д. Чувствительность/устойчивость к антибактериальным препаратам клинических штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных на Кавказе в период седьмой пандемии холеры // Антибиотики и химиотерапия. - 2010. - Том 55, № 5-6. - С. 8-13.

12. Бабенышев Б. В., Савельева И. В., Дорошенко И. Г., Васильева О. В., Савельев В. Н., Гусева Л. В. Чувствительность к антибиотикам холерных вибрионов эльтор различных генотипов, выделенных на Кавказе в период седьмой пандемии // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: материалы X Межгос. научно-практ. конф. - Ставрополь, 2010. - С.164-165.

13. Савельева И. В., Бабенышев Б. В., Савельев В.Н, Грижебовский Г. М., Васильева О. В., Солодовников Б. В., Дорошенко И. Г Генотипы токсигенных холерных вибрионов

эльтор, выделенных от людей на Кавказе // Молекулярная диагностика - 2010: сборник научных трудов VII Всерос. научно-практической конференции с международным участием. - М, 2010. Т. 1. - С. 417-419.

14. Васильева О. В., Савельев В. Н., Дубянский В. М., Москвитина С. И., Бабенышев Б. В., Куличенко А. Н. Эпидемиологические риски заноса и распространения холеры в Ставропольском крае // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов-на-Дону, 2013. - Вып. 26. - С. 42-44.

15. Савельева И. В., Савельева Е. И., Бабенышев Б. В., Москвитина С. И., Васильева О. В., Гусева Л. В., Савельев В. Н., Куличенко А. Н. // Анализ фенотипических свойств генетически измененных (гибридных) вариантов биовара эльтор, выделенных на Кавказе // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов-на-Дону, 2013. - В. 26.-С. 123-129.

16. Васильева О. В., Савельев В. Н., Дубянский В. М., Куличенко А. Н. Совершенствование эпидемиологического надзора на территории I типа по эпидемиологическим проявлением холеры на примере Ставропольского края // Здоровье населения и среда обитания. - 2013. - № 10. - С. 29-31.

17. Васильева О. В., Савельев В. Н., Дубянский В. М., Москвитина С. И., Куличенко А. Н. Оценка эпидемиологического риска заноса и распространения холеры на примере Ставропольского края // Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Причерноморском регионе: матер, региональной науч.-практ. конф. с международным участием, 24-25 сентября 2013 г., г. Ставрополь : электрон, изд. - Ставрополь, 2013. - С. 131-132. - Режим доступа: http://snipchi.ni/updoc/Materiali%20konferenzii Sbornik.pdf

18. Савельева И. В., Куличенко А. Н., Савельев В. Н., Хацуков К. X., Савельева Е. И., Бабенышев Б. В., Антоненко А. Д., Васильева О. В. Микробиологические и молекулярно-биологические аспекты характеристики холерных вибрионов-возбудителей современной холеры Эль Тор // Проблемы медицинской микологии. - 2014. - Т. 16, № 2. - С. 121.

19. Васильева О. В., Савельев В. Н., Дубянский В. М., Куличенко А. Н. Совершенствование эпидемиологического надзора за холерой на примере Ставропольского края // Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины: материалы. VI Всероссийской науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора, 22-24 октября 2014 г., г. Ставрополь. - Ставрополь: Экспо-Медиа, 2014. - С. 7-8.

Сдано в печать 25.03.2015 г. Подписано к печати 25.03.2015 г. Формат 84x108 1/16. Гарнитура Times New Roman. Объем 1 ус.п.л. Тираж 100 экз. Заказ №731 Отпечатано в ИП Бочков В.Б. г. Ставрополь, ул. Маршала Жукова, 46