Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Распределение полиморфных генов апоптоза семейства каспаз у больных псориазом

| 003432453

На правах рукописи

ПОНОМАРЕВ Игорь Анатольевич

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕНОВ АПОПТОЗА СЕМЕЙСТВА КАСПАЗ У БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ

14.01.10- кожные и венерические болезни 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

2 5 ФЕБ 2010

Санкт-Петербург 2010

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им, С.М. Кирова» МО РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Самцов Алексей Викторович доктор медицинских наук профессор Имянитов Евгений Наумович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Данилов Сергей Иванович доктор биологических наук профессор Комов Вадим Петрович

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «_» марта 2010 года в 10 часов на заседании

совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 215.002.01 при ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор Пономаре ;аевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Псориаз - мультифакторное полигенное заболевание с преимущественным поражением кожи, основная роль в иммунолатогенезе которого отводится Т-лимфоцитам. Интенсивный поиск специфических для псориаза генов обусловлен наличием наследственной предрасположенности, присутствием аутоиммунного компонента и отсутствием целостного представления о патогенезе заболевания. Идентификация специфических для псориаза генетических детерминант позволит понять биологические механизмы этого дерматоза, даст возможность для разработки новой и индивидуальной специфической терапии [Владимиров В.В., Владимирова Е.В., 2006; Кубанова A.A. й соавт., 2006; Самцов A.B., Барбинов В.В., 2008].

Программируемая клеточная гибель является процессом противоположным пролиферации клеток 'и направлена на поддержание клеточного гомеостаза. Роль нарушений программируемой клеточной гибели в патогенезе псориаза признается многими исследователями [Клеменова И.А., 2007; Хайрутдинов В.Р. и соавт., 2007; Reefman Е. et al„ 2005; Kastelan М. et al., 2006; Raj D. et al., 2006; Raymond A.A. et al, 2007]. Увеличение количества клеток, демонстрируемое в области псориатических высыпаний, может являться результатом нарушения, как пролиферации, так и апоптоза. Чрезмерная активация Т-клеточного звена иммунитета, приводящая к избыточной продукции медиаторов воспаления и факторов роста, рассматривается при псориазе как дефицит активности апоптоза. Снижение интенсивности программируемой клеточной гибели Т-клеток может являться ключевым звеном в развитии псориаза. Разрешение псориатических высыпаний происходит вследствие элиминации активированных Т-лимфоцитов путем программируемой клеточной гибели [Кубанова A.A. и соавт., 2007; Victor F.C., Gottlieb A.B., 2002; Reefman Е. et al., 2005; Strober B.E., Menon K., 2007; Fluhr J.W. et al., 2008; Yazdi M.R., Mrowietz U„ 2008].

Популяционная вариабельность интенсивности апоптоза, изменяясь в широком диапазоне, может объяснять существенные различия в ответе больных псориазом на проводимую терапию. Индивидуальные различия индивидуумов обусловлены их генетической разнородностью. Наиболее распространенной причиной вариации генома являются замены единичных нуклеотцдов в последовательности ДНК - генные полиморфизмы. Полиморфизм нуклеотидов может приводить к замене аминокислоты в первичной структуре белка, что в ряде случаев сопровождается изменением функциональной активности этих молекул. Повышенная или сниженная активность этих молекул может коррелировать с клиническим признаком заболевания. Стабильность и распространенность генных полиморфизмов делают их перспективными для поиска ассоциаций с заболеванием. Ассоциативные исследования, направленные на установление связи генотипа с фенотипическими проявлениями, позволяют оценить роль генетических

факторов в патогенезе заболеваний [Ляхович В.В. и соавт., 2004; Глотов A.C. и соавт., 2005; Imyanitov Е. et al., 2005; Bromberg Y., Rost В., 2007; Lee P. H., Shatkay H„ 2008].

Число генов, продукты которых вовлечены в инициацию, реализацию и регуляцию апоптоза, достаточно велико. Представители семейства цистеиновых каспаз являются ключевыми и наиболее важными участниками программируемой клеточной гибели. Путем каскадного взаимодействия эти ферменты приводят к значительному усилению начального сигнала гибели клеток. Гены семейства каспаз также играют важную роль в реализации лечебного эффекта излучения ультрафиолетового спектра при терапии псориаза [Imyanitov Е. et al., 2005; Enjuanes А. et al., 2008; Lee PH., Shatkay H., 2008].

Цель исследования. Оценить роль полиморфных аллелей генов апоптоза семейства каспаз в формировании риска развития псориаза и псориатического артрита.

Задачи исследования:

1. Выявить все кодирующие несинонимичные полиморфизмы генов семейства каспаз, встречающиеся в популяции Северо-Западного региона РФ, частота которых верифицирована и составляет не менее 1%.

2. Проанализировать распределение частот генотипов и аллелей генов апоптоза семейства каспаз в группах больных псориазом и здоровых доноров. '

3. Выявить варианты генов каспаз с достоверно различающейся частотой в группах больных псориазом с псориатическим артритом.

4. Рассчитать прогностическую ценность метода генотипирования полиморфных генов апоптоза семейства каспаз с целью определения риска развития псориаза и псориатического артрита.

Научная новизна. Выполнено систематическое молекулярно-эпидемиологическое исследование, направленное на изучение распределения полиморфных генов семейства каспаз у больных псориазом.

Установлено, что частота гомозигот His/His гена Caspase-8 His302Asp среди больных псориазом (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров (1,2%), носители аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile среди пациентов с псориазом (80,4%) встречаются чаще, чем в контроле (55,2%).

Встречаемость носителей аллеля Leu полиморфного гена Casp2 Leul41Val у больных псориазом с псориатическим артритом (28,6%) выше, чем в группе больных без псориатического артрита (3,9%), частота носителей аллеля Asp полиморфного гена Casp7 Glu255Asp среди пациентов, имеющих псориатический артрит (61,9%), выше, чем у больных без псориатического артрита (32,9%).

Прогностическая ценность генотипирования полиморфных генов Casp8 His302Asp и CasplO Ile479Leu с целью оценки риска развития псориаза имеет умеренную чувствительность (51-67%) и высокую специфичность (73-81%) метода, генотипирование полиморфных генов Casp2 Leul41Val и Casp7 Glu255Asp, с целью определения риска формирования псориатического

артрита, имеет чувствительность от низкой до умеренной (34-70%) и высокую специфичность (81-82%).

Практическая значимость. Выявлены новые генетические маркеры псориаза - полиморфизмы Caspase-8 His302Asp, Caspase-10 Leu479Ile и псориатического артрита - полиморфизмы Caspase-2 Leul41VaI, Caspase-7 Glu255Asp, что позволяет включить их в генетическое тестирование, выполняемое лицам, предрасположенным к псориазу.

Установлено, что риск развития псориаза у лиц с генотипом His/His гена Caspase-8 His302Asp повышается в 5,5 раза. Наличие аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile в генотипе обследуемого повышает у.него риск развития псориаза в 4,3 раза, что необходимо учитывать при прогнозировании развития заболевания у родственников больного.

Присутствие в генотипе больных псориазом аллеля Leu гена Caspase-2 Leul41Val повышает риск развития псориатического артрита в 9,9 раз, наличие аллеля Asp гена Caspase-7 Glu255Asp повышает риск развития псориатического артрита в 2,4 раза, что позволяет прогнозировать у них развитие псориатического артрита.

Личное участие автора в получении результатов. Диссертант лично выполнил отбор пациентов для исследования, сбор жалоб и данных анамнеза заболевания, изучение медицинской документации, весь объем клинических и лабораторных исследований, сформировал базу данных, провел обработку полученных результатов, их статистический анализ и обобщение.

, Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфные гены апоптоза семейства каспаз Caspase-2 LeuMlVal, Caspase-7 Glu255Asp, Caspase-8 His302Asp, Caspase-10 Leu479Ile играют важную роль в формировании риска развития псориаза и псориатического артрита.

2. Частота гомозигот His/His гена Caspase-8 IIis302Asp у больных псориазом (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров (1,2%), носители аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile среди пациентов с псориазом (80,4%) встречаются чаще, чем в контроле (55,2%), встречаемость носителей аллеля Leu гена Casp2 Leu 141 Val у больных псориазом с псориатическим артритом (28,6%) выше, чем в группе больных без псориатического артрита (3,9%), частота носителей аллеля Asp гена Casp7 Glu255Asp среди пациентов, . имеющих псориатический артрит (61,9%), выше, чем у больных без псориатического артрита (32,9%).

3. Прогностическая ценность генотапирования полиморфных генов Casp8 His302Asp и Caspio Ile479Leu с целью оценки риска развития псориаза имеет умеренную чувствительность (51-67%) и высокую специфичность (73-81%) метода, генотипирование полиморфных генов Casp2 Leu 141 Val и Casp7 Glu255Asp, с целью определения риска формирования . псориатического артрита, имеет

чувствительность от низкой до умеренной (34-70%) и высокую специфичность (81-82%).

Реализация и внедрение полученных результатов работы. Результаты настоящего исследования внедрены в учебную, научно-исследовательскую и клинико-диагностическую работу кафедры кожных и венерических болезней ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ и ФГУ «442 Окружной военный клинический госпиталь Ленинградского военного округа» МО РФ.

Апробация и публикация материалов исследования. Основные положения диссертации были представлены на II Всероссийском Конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007 г.), II Российской научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2008 г.), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008 г.), Итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, (Санкт-Петербург, 2008 г.), Российской конференции по фундаментальной онкологии «Фундаментальная онкология - Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2008 г., 2009 г.).

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, получено 3 удостоверения на рационализаторские предложения.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций, списка используемой литературы. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками, содержит 13 таблиц. Библиографический указатель содержит 20Г источников, из которых 64 отечественных и 137 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Группа больных бляшечным псориазом была отобрана из числа пациентов клиники кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии. Критерием включения являлось наличие заболевания в течение 12 месяцев и более, подтвержденное медицинской документацией. Продолжительность болезни составила от 1 до 52 (в среднем 11,4±0,72) лет. В качестве источника ДНК использовались лейкоциты периферической крови 97 больных псориазом: мужчин — 73 (76%), женщин - 24 (24%). В качестве контроля изучали образцы крови 252 доноров, не имеющих псориаза в анамнезе. Возраст пациентов составлял от 18 до 82 (в среднем -41,6± 1,43) лет. У 79 (81%) больных заболевание началось до 40 лет (I тип псориаза), у. 18 (19%) - в 40 лет или позже (II тип псориаза). Тяжесть болезни оценивалась по индексу площади и тяжести псориатических поражений PASI (Psoriasis Area and Severity Index) [Fredriksson Т., Peterson K.,

1978; Feldman S.R. et al., 1996; Van de HerkhofP.C., 1997] (легкая степень - < 12 баллов, средняя - > 12 - 20 < баллов, тяжелая - > 20 баллов). Тяжелое течение заболевания отмечалось у 29 (30%) пациентов, средней степени тяжести - у 27 (28%) пациентов и легкое - у 41 (42%) пациентов. Диагноз псориатического артрита устанавливали на основании диагностических критериев по Moll J.M. и Wright V. [Moll J.M.H., Wright V., 1973]. Псориатический артрит наблюдался у 21 (22%) пациента. Дизайн исследования представлен на рисунке 1.

Рисунок 1 - Дизайн исследования

Для выделения ДНК из лейкоцитов периферической крови использовался модифицированный соль-хлороформный метод [МиНепЬасЬ Я. е1 а1., 1989]. Анализ однонуклеотидных замен проводился методом аллель-специфической ПЦР (АБ-РСЯ), а также аллель-специфической ПЦР в режиме «реального

времени» (real-time AS-PCR). ПЦР-амплификация происходила в объеме 20 мкл. В состав реакционной смеси входили: 1 ед. «hot-start» Taq-полимеразы «Thermostar» («Синтол», Москва), однократный ПНР буфер, 50 нг ДНК, 1.5 -3.0 mM MgCl2, по 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) и 100 нМ каждого праймера. Реакция начиналась с фазы активации Taq-полимеразы (95°С, 7 мин.). Последующие 33 - 35 циклов ПЦР состояли из фаз денатурации (90°С, 30 сек.), отжига (Татр = 55°С - 65°С, 60 сек.) и элонгации (72°С, 60 сек.). Результат ПЦР-реакции оценивался с помощью электрофореза в 10%-15% трис-боратном полиакриламидном геле, с последующим окрашиванием 0,02 % раствором бромида этидия. Визуализацию фрагментов осуществляли в ультрафиолетовом свете трансиллюминатора. Фотодокументирование выполнялось с использованием гель-документирующей системы «Vilber Lourmat» («АВТех», Москва).

Аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени проводилась на приборе «iQ iCycler» («Bio-Rad») и использовалась для оптимизации условий всех ПЦР-реакций, à также для генотипирования образцов по тем полиморфизмам, для детекции которых не удалось подобрать приемлемые условия аллель-специфической ПЦР. Кроме .того, в режиме «реального времени» проводили детекцию редко встречающихся однонуклеотидных замен. В случае аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени к описанной выше ПЦР-смеси добавляли интеркалирующий краситель SYBR-Green I (20х раствор, добавляется из расчета 1/100 объема реакции) и флюорофор FAM (fluorescein) (400 пМ раствор, добавляется из расчета 1/50 объема реакции).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием статистической программы «STATISTICA - 6.0» (StatSoft, Inc). Определение частот аллелей и генотипов были проведены во всех исследованных группах. Ассоциацию между заболеванием и генотипом определяли с помощью с помощью х-квадрат критерия Пирсона, сравнивая распределение генотипов и аллелей по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролей [Реброва О.Ю., 2002; Sasieni P.D., 1997]. Показатели «отношения шансов» - OR (odds ratio) - с 95% доверительным интервалом (95% CI), полученным при учете стандартной ошибки loge OR, рассчитывались относительно группы частых гомозигот для каждого полиморфизма [Дюк В., Эммануэль В., 2003; Савилов Е.Д. и соавт., 2004]. Анализ тенденций (trend test) проводили с использованием теста Cochran-Armitage trend test с одной степенью свободы. Достоверными считали различия при уровне ошибки р<0.05, то есть допускали 5%-ую вероятность того, что найденная в выборке связь между переменными является лишь случайной особенностью данной выборки [Савилов Е.Д. и соавт., 2004; Li Q. et al, 2009].

Для оценки прогностической значимости генотипирования в группах больных псориазом и здоровых доноров были составлены таблицы сопряженности, включающие генные полиморфизмы, по которым были получены статистически достоверные различия [Флетчер Р. и соавт., 1998; Власов В.В., 2001]. По данным таблиц были рассчитаны основные показатели

прогностичности и надежности диагностических критериев: чувствительность, специфичность, прогностичность положительного результата, прогностичность отрицательного результата, отношение правдоподобия для положительного результата, отношение правдоподобия для отрицательного результата (табл. 1).

Таблица 1 - Оценка прогностической значимости результатов генотипирования в группах больных псориазом и здоровых доноров

Генотип/аллель Аллель 1 Аллель 2 Всего

Больные псориазом а Ь а+Ь

Здоровые доноры с (3 С+(1

Всего а+с Ь+с1 а+Ь+с+(1

Чувствительность теста — это доля лиц с положительным результатом теста от общего числа лиц, имеющих заболевание: (а / (а+с)) * 100%.

Специфичность теста — это доля лиц с отрицательным результатом теста среди здоровых: (с! / (Ь+с1) )х 100%.

Прогностическая значимость положительного результата - это вероятность заболевания при положительном результате теста: а / (а+Ь).

Прогностическая значимость отрицательного результата - это вероятность отсутствия заболевания при отрицательном результате теста: (1 /

(С+С1).

Расчет отношений правдоподобия для положительного и отрицательного результатов теста помогает понять, насколько эффективен данный тест для выявления искомого заболевания. Отношение правдоподобия положительного результата - отношение вероятности получения положительного результата теста у пациента с наличием заболевания, к вероятности такого же результата у здорового донора: чувствительность / (1-специфичность), т.е. во сколько раз выше риск наличия заболевания при положительном результате теста.

Отношение правдоподобия отрицательного результата - отношение вероятности получения отрицательного результата геста у пациента с наличием заболевания, к вероятности такого же результата у здорового донора: (1-чувствительность) / специфичность, т.е. во сколько раз изменяется вероятность отсутствия заболевания при отрицательном результате теста.

Показателем, объединяющим отношения правдоподобия положительного и отрицательного результата, является отношение шансов диагностического теста: отношение правдоподобия положительного результата / отношение правдоподобия отрицательного результата. Этот показатель демонстрирует, во сколько раз больше вероятность наличия заболевания у лиц с положительным результатом теста по сравнению с лицами с отрицательным результатом теста.

Оценка прогностической значимости генотипирования в группах больных псориазом с псориатинеским артритом и без артрита оценивалась с помощью построения соответствующих четырехпольных таблиц (табл. 2).

Таблица 2 - Оценка прогностической значимости результатов генотипирования в группах больных псориазом с псориатическим артритом и без артрита

Генотап/аллель Аллель 1 Аллель 2 Всего

Больные псориазом с артритом а Ь a+b

Больные псориазом без артрита с d ■ c+d -

Всего а+с b+d a+b+c+d

По представленным данным аналогично вышеописанным формулам рассчитывались основные показатели прогностичности и надежности диагностических критериев: чувствительность, специфичность, прогностичность положительного результата, прогностичность отрицательного результата, отношение правдоподобия для положительного результата, отношение правдоподобия для отрицательного результата.

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

Выбор генетических вариантов, потенциально значимых для последующего популяционного молекулярно-генетического изучения, был произведен с учетом следующих критериев:

- изменение должно затрагивать экзон - кодирующую область гена;

- замена должна быть смысловой (nonsynonymous substitution), то есть вариабельность на уровне ДНК приводит к замене аминокислоты и изменению первичной структуры полипептида;

- представленные в базе данные о полиморфизме должны быть получены при изучении последовательности ДНК/кДНК, выделенной из здоровых человеческих клеток, а не из клеток опухолей или клеточных линий;

- заявленная лопуляционная частота полиморфизма определена и составляет более 1%. ■"'....

Включение каждого конкретного генетического варианта в исследование определялось совокупностью перечисленных критериев [Улыбина Ю.М., 2008; Imyanitov Е. et al., 2005].

Для выбора полиморфных вариантов генов мы воспользовались базой данных Entrez SNP Интернет-ресурса Национального Центра Биотехнологической Информации [http://wwv.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/]. Одиночные нуклеотидные замены, подходящие под наши условия были обнаружены у 8 генов семейства каспаз (по состоянию на 1 июня 2007 года): каспаза-1, -2, -5, -б, -7, -8, -9 и -10. У выбранных генов оказалось 15 полиморфизмов в кодирующей области, приводящих к замене аминокислот в полипептидной цепи (табл. 3).

Таблица 3 - Кодирующие несинонимичные полиморфизмы выбранных генов семейства каспаз с верифицированной популяционной частотой

№ п/п Название гена Локус ЬЫР Идентифик ационный номер БМР, ГО Нуклеотидная замена Частота редкого аллеля

1 СаБр1 11я23 ап37Ьуз «17103567 С/А 14.0%

2 Саяр2 7я34-435 Ьеи141Уа1 «4647297 СЮ 4.4%

3 СаБр5 11Я22.2 . -ц22.3 Ьеи13РЬе ге3181320 с/с 3.1%

4 А1а90ТЬг ге507879 в/А 42.8%

5 Н1в152Ащ гэЗ 181179 А/в 2.1%

6 Ьеи201Уа1 гэЗ 181326 сю 5.0%

7 Уа1318Ьеи ге523104 О/С 46.4%

8 СаБрб 4ц25 01и34А1а ге 11574696 А/С ' 5.0%

9 Ьуэ3501и гэ11574697 А Ю 20.0%

10 Сайр7 10я25 С1и255Азр гэ2227310 СЮ 21.1%

11 Савр8 2яЗЗ-Я34 НизЗОгАвр ге1045485 СЮ 8.2%

12 Саир9 1р36.3-р36.1 Уа128А1а ге 1052571 Т/С ■49.2%

13 Н1з173Агё Г52308950 АЮ 1.1%

14 А^2Ш1п гб 1052576 в/А 45.5%

15 СаэрЮ 2qЗЗ-ц34 Ие479Ьеи гв13006529 А/Т 35.2%

Пять полиморфизмов из первоначального списка - не были найдены ни в одной из исследованных групп: Савр5 Ьеи13РЬе (в/С), идентификационный номер БМР (Ю БКР) ге3181320, Саэрб Ш!52А^ (А/в) ГО БЯР ге3181179, СаБр5 Ьеи201Уа1 (СЮ), ГО БЫР 181326, Саэрб аи34А1а (А/С), ГО БЫР г.ч 11574696, Саярб Ьуэ35С1и (А/в), ГО ЭЫР ге1 157469. Это может быть связано с расовыми и этническими различиями популяций.

Один полиморфизм - Саэр1 С1п371уз (С/А), ГО 5КГР гз171035б7 - не был исследован, поскольку в рамках нашего метода нам не удалось найти оптимальных условий для детекции этой замены. Это объясняется трудностями, возникшими на этапе подбора аллель-специфических праймеров, поскольку нуклеотидная последовательность вокруг интересующих нас точек имела много СО повторов. .

Образцы ДНК 97 больных псориазом и 252 здоровых доноров были подвергнуты анализу по определению генотипов по 9-ти полиморфизмам. Результаты генотипирования были получены для 100% образцов в обеих группах. Все полученные данные, а также рассчитанные статистические параметры сведены в таблицу 4.

Таблица 4 - Распределение генотипов и аллелей изучаемых полиморфизмов в группах больных псориазом и здоровых доноров

Ген Генотипы и аллели Больные псориазом, (%) Здоровые доноры, (%) Trervd test, р valué

СС 2(2) 0(0)

Casp2 се 10(10) 21 (8) 0,11

141 ее 85 (88) 231 (92) .

C/G с 14(7) 21 (4)

б 180(93) 483 (96)

АА 30 (31) 96(38)

Casp5 90A/G Ав 48 (49) 95 (38) 0,78

йй 19(20) 61(24)

А 108 (56) 287(57)

0 86 (44) 217(43)

СС 10(10) 30 (12)

Casp5 Сй 46 (47) 113(45) ' 0,94

3-18 (Ю 41 (42) 109 (43)

C/G С 66 (34) 173 (34)

в 128 (66) 331(66)

СС 60 (62) 138(55)

Casp7 се 31 (32) 89 (35) 0,17

255 во 6(6) 25(10)

C/G с 151(78) 365(72)

в 43 (22) ■ 139(28)

СС 6(6) 3(1)

Casp8 Сй 13(13) 43(17) 0,26

302 оо 78 (80) 206 (82)

C/G С 25 (13) 49(10)

О 169 (87) 455 (90)

СС 11(11) 45(18)

Casp9 28T/C СТ 51(53) 109(43) 0,66

тт 35 (36) 98 (39)

с 73 (38) 199(39)

т 121 (62) 305 (61)

АА 0(0) 0(0)

Casp9 173 A/G Ав 9(9) 11(4) 0,08

Ш 88(91) 241 (96)

А 9(5) 11 (2)

в 185(951 493(98)

АА 11(11) 46(18)

Casp9 АО 48 (50) 115(46) 0,23

221 вй 38 (39) 91(36)

A/G А 70 (36) 207(41)

б 124 (64) 297 (59)

Продолжение Таблицы 4 - Распределение генотипов и аллелей изучаемых полиморфизмов в группах больных псориазом и здоровых доноров

Ген Генотипы и аллели Больные псориазом, (%) Здоровые доноры, (%) ■ Trend test, р value

CasplO 479 А/Т АА 16(16) 51 (20) 0,01

AT 62 (64) 88 (35)

ТТ 19(20) ■ 113(45)

А+ (АА+АТ) 78 (80) 139(55)

А 94 (48) 190 (38)

'Г 100(52) 314(62)

Примечание: А+ (АА+АТ) - носители аллеля А, включающие всех гомозигот АА и гетерозигот AT.

Выявлены статистически достоверные различия при сравнении отдельных полиморфизмов между группой больных псориазом и здоровыми донорами. Анализ распределения генотипов и аллелей полиморфизма Casp8 His302Asp (C/G) показал, что встречаемость гомозигот His/His (С/С) среди больных псориазом - 6/97 (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров - 3/252 (1,2%) (OR= 5,47, 95% CI: 1,19-28,23; р<0,05) (табл. 4).

Чувствительность этого генетического теста, направленного на выявление гомозигот His/His - 66,7% (95% CI: 31,3-90,9%), специфичность - 73,3% (95% CI: 72,3-73,9%), прогностическая значимость положительного результата -6,2% (95% CI: 3,0-8,5%)), прогностическая значимость отрицательного результата - 98,9% (95% CI: 97,6-99,7%). Прогностическая значимость теста зависит как от чувствительности и специфичности метода диагностики, так и от встречаемости болезни в популяции. Так как заболеваемость псориазом среди населения Северо-Западного региона РФ около 3%, прогностическая значимость положительного результата теста в этой популяции низкая, даже при условии средних значений чувствительности и специфичности теста. Прогностическая значимость отрицательного результата отвергает вероятность развития псориаза в будущем при отрицательном результате теста.

Расчет отношения правдоподобия позволяет определить реальную ценность информации, полученной при выполнении генотипирования. Так отношение правдоподобия для положительного результата для генетического теста на выявление - 2,5. Это значение показывает, что вероятность развития псориаза у лиц, гомозиготных по аллелю His гена Casp8 His302Asp выше в 2,5 раза, чем у носителей других генотипов.

Отношение правдоподобия-отрицательного результата - 0,45. Это значение показывает, что вероятность развития псориаза у лиц, имеющих генотипы His/Asp и Asp/Asp, повышается на коэффициент 0,45 (снижается в 2,2 раза).

Отношение шансов диагностического теста - 5,5 (OR= 5,47, 95% CI: 1,1928,23), т.е. риск развития псориаза у лиц с положительным результатом теста

(наличие генотипа His/His) по сравнению с пациентами с отрицательным результатом теста выше в 5,5 раза (табл. 5).

Анализ распределения генотипов и аллелей гена Caspio Ile479Leu (А/Т) показал, что частота носителей аллеля lie (А+), которые представлены в популяции генотипами Ile/Ile + Ue/Leu (АА+АТ), составила 78/97 (80,4%), что статистически достоверно выше, чем в группе здоровых доноров - 139/252 (55,2%) (OR=3,34, 95% CI: 1,85-6,08; р<0,05). Встречаемость гетерозигот lie/Leu (А/Т) среди больных псориазом - 62/97 (63,9%) была выше, чем в группе контроля - 88/252 (34,9%) (OR=3,30, 95% CI: 1,97-5,55; р<0,05).

Частота «редкого» аллеля Не (А) среди больных псориазом - 94/194 (48,5%) была выше, чем среди здоровых доноров - 190/504 (37,7%) (OR= 4,32, 95% CI: 2,96-6,31; р<0,05) (табл. 4). Оценочный тест на степень ассоциации в зависимости от числа полиморфных аллелей (trend test) показал, достоверные различия — р=0,01, что свидетельствует о наличии тенденции повышения степени ассоциации аллеля Не с риском развития псориаза при увеличении в генотипе количества аллелей Не.

Чувствительность генетического теста по выявлению аллеля Не составила - 51,1% (95% CI: 45,0-57,0%), специфичность - 80,6% (95% CI: 78,4-82,7%), прогностическая значимость положительного результата низкая - 48,5% (95% CI: 42,7-54,1%), прогностическая значимость отрицательного результата -82,2% (95% CI: 80,0-84,3%) - с высокой вероятностью отвергает возможность развития псориаза при отрицательном результате теста.

Отношение правдоподобия для положительного результата - 2,6, что показывает - вероятность генотипирования аллеля Не среди больных псориазом в 2,6 раза выше, чем вероятность выявления этого варианта у здорового донора.

Отношение правдоподобия отрицательного результата - 0,60. Полученное значение показывает, что вероятность развития псориаза у лиц, не имеющих этого аллеля, повышается на коэффициент 0,6 (снижается в 1,65 раза).

. Отношение шансов диагностического теста - 4,3 (OR= 4,32, 95% CI: 2,966,31), т.е. риск развития псориаза у лиц с положительным результатом теста (наличие аллеля Не) по сравнению с пациентами с отрицательным результатом теста выше в 4,3 раза (табл. 5).

На следующем этапе мы провели исследование встречаемости генотипов и аллелей изучаемых генов в контрольной группе. С целью выявления возможного модифицирующего влияния полиморфных генов "семейства каспаз на течение псориаза мы провели оценку характера распределения вариантов полиморфных генов среди больных псориазом, имеющих псориатический артрит, и пациентов без псориатического артрита.

Анализ распределения аллелей и генотипов. полиморфного гена Casp2 Leul4lVal (C/G) показал более высокую частоту носителей аллеля Leu (С+), которые представлены в популяции генотипами Leu/Leu + Leu/Val (CC+CG), составила 6/21 (28,6%), что статистически достоверно выше, чем в группе больных без псориатического артрита - 3/76 (3,9%) (OR= 9,73; 95% CI: 1,8656,62; р<0,05). Встречаемость гетерозигот Leu/Val (C/G) среди больных

псориазом с псориатическим артритом - 5/21 (23,8%) была выше, чем у пациентов без псориатического артрита - 3/76 (4,0%) (OR= 7,60; 95% CI: 1,3845,81; р<0,05).

Частота «редкого» аллеля Leu (С) у больных псориазом с псориатическим артритом была значительно выше - 7/42 (16,7%), чем у пациентов без артрита -3/152 (2,0%) (OR= 9,93; 95% CI: 2,16-51,50; р<0,05). Оценочный тест на степень ассоциации в зависимости от числа полиморфных аллелей (trend test) показал достоверные различия - р=0,0004, что свидетельствует о наличии тенденции повышения степени ассоциации аллеля Leu с риском развития псориатического артрита при увеличении в генотипе больного количества аллелей Leu. .

Чувствительность генетического теста по выявлению аллеля Leu составляет - 70,0% (95% CI: 36,3-91,8%), специфичность - 81,0% (95% CI: 79,282,2%).

Прогностическая значимость положительного результата генотипирования варианта Leu гена Casp2 Leul41Val относительно невысокая -16,7% (95% CI: 8,7-9,2%), в то же время прогностическая значимость отрицательного результата - 98,1% (95% CT: ■ 95,9-99,5%) с высокой вероятностью отвергает возможность развития псориатического артрита при отрицательном результате теста.

Отношение правдоподобия для положительного результата - 3,7, что показывает — вероятность развития псориатического артрита среди больных псориазом при выявлении аллеля Leu повышается в 3,7 раза.

Отношение правдоподобия отрицательного результата - 0,37. Полученное значение показывает, что вероятность развития псориатического артрита повышается на коэффициент 0,37 (снижается в 2,7 раза) у больных псориазом, не имеющих варианта Leu гена Casp2 Leu 141 Val.

Отношение шансов диагностического теста - 9,9 (OR- 9,93; 95% CI: 2,1651,50), т.е. риск развития псориатического артрита у лиц с положительным результатом теста (наличие аллеля Leu) по сравнению с пациентами с отрицательным результатом теста выше в 9,9. раза (табл. 5).

Анализ характера распределения аллелей и генотипов полиморфного гена Casp7 Glu255Asp (C/G) показал среди больных псориазом е псориатическим артритом более высокую встречаемость носителей аллеля Asp (G+), которые представлены в популяции генотипами Glu/Asp + Asp/Asp (CG+GG) - 13/21 (61,9%), чем в группе больных без псориатического артрита - 25/76 (32,9%) (OR= 3,32; 95% CI: 1,10-10,19; р<0,05).

Частота «редкого» аллеля Asp (G) среди больных псориазом с псориатическим артритом - 15/42 (35,7%) - выше, чем у пациентов без псориатического артрита - 29/152 (19,1%) (OR= 2,36; 95% CI: 1,04-5,32; р<0,05). Оценочный тест на степень ассоциации в зависимости от числа полиморфных аллелей (trend test) показал достоверные различия - р=0,027, что свидетельствует о наличии тенденции повышения степени ассоциации аллеля Asp с риском развития псориатического артрита при увеличении в генотипе больного количества аллелей Asp.

Чувствительность генетического теста, направленного на выявление аллеля Asp - 34,1% (95% CI: 22,2-46,9%), специфичность - 82,0% (95% CI: 78,685,8%), прогностическая значимость положительного результата - 35,8% (95% •CI: 23,3 -49,2%), прогностическая значимость отрицательного результата -81,0% (95% CI: 77,5-84,7%).

Отношение правдоподобия для положительного результата - 1,9, что показывает - вероятность развития псориатического артрита среди больных псориазом при выявлении аллеля Asp повышается в 1,9 раза.

Отношение правдоподобия отрицательного результата - 0,8. Полученное значение показывает, что вероятность развития псориатического артрита повышается на коэффициент 0,8 (снижается в 1,3 раза) у больных псориазом, не имеющих варианта Asp гена Casp7 Glu255Asp.

Отношение шансов диагностического теста - 2,4 (OR= 2,36; 95% CI: 1,045,32), т.е. риск развития псориатического артрита у лиц с положительным результатом теста (наличие - аллеля Asp) по сравнению с пациентами с отрицательным результатом теста выше в 2,4 раза (табл. 5).'

Таблица 5 - Результаты прогностической ценности метода генотипирования полиморфных генов каспаз с целью оценки риска развития псориаза и псориатического артрита

Полиморфный ген Аллели, генотипы Ожидаемое событие Риск развития события Se, % sp, % +PV, % -PV, %

Caspase-8 His302Asp His/His Развитие псориаза Повышается в 5,5 раза 66,7 73,3 6,2 98,9

Caspase-10 Leu479Ile He Развитие псориаза Повышается в 4,Зраза 51,1 80,6 48,5 82,2

Caspase-2 Leul41Val Leu Развитие псориатического артрита Повышается в 9,9 раза 70,0 81,0 16,7 98,1

Caspase-7 Glu255Asp Asp Развитие псориатического артрита Повышается в 2,4 раза 34,1 82,0 35,8 81,0

Примечание: Эе -. чувствительность, Бр - специфичность, +РУ -прогностическая значимость положительного результата, - -РУ прогностическая значимость отрицательного результата.

Таким образом, в результате проведенного исследования нами выявлена ассоциация гомозиготного генотипа His/His гена Casp8 His302Asp, аллеля Не гена CasplO Ile479Leu с риском развития псориаза.

Полученные данные указывают на ассоциацию аллеля Leu гена Casp2 Leul41Val, аллеля Asp гена Casp7 Glu255Asp с риском развития псориатического артрита у больных псориазом. Эти результаты свидетельствуют о модифицирующем влиянии генов Casp2 Leu 141 Val и Casp7 Glu255Asp на течение псориаза.

Определение прогностической ценности генотипирования полиморфных генов апоптоза семейства каспаз Casp8 His.302Asp и Caspio Ile479Leu, с целью оценки риска развития псориаза, выявило умеренную чувствительность (5167%), высокую специфичность (73-81%), низкую прогностическую значимость положительного результата. (6-49%) и высокую прогностическую значимость отрицательного результата (82-99%) метода (табл. 6).

Оценка прогностической ценности генотипирования полиморфных генов Casp2 Leul41 Val и Casp7 Glu255Asp, с целью определения риска формирования псориатического артрита у больных псориазом, выявила чувствительность от низкой до умеренной (34-70%), высокую специфичность (81-82%), низкую прогностическую значимость положительного результата (17-36%) и высокую прогностическую значимость отрицательного результата (81%) метода (табл.5).

Анализ полученных результатов позволяет утверждать, что одним из ключевых звеньев механизма развития псориаза может являться изменение активности процесса программируемой клеточной гибели, обусловленное генетической вариабельностью индивидуумов. Полиморфизм/генов апоптоза семейства каспаз, характеризующийся заменой нуклеотидной последовательности в кодирующих областях ДНК этих молекул, возможно, обладает функциональной значимостью и ассоциирован с развитием псориаза. Каспаза-2 и каспаза-7 активируются при Fas-индуцируемой апопготической гибели активированных Т-лимфоцитов. Возможно, что указанные генные полиморфизмы модулируют функциональную активность соответствующих ферментов и оказывают влияние на клеточный гомеостаз иммунной системы, продукцию цитокинов, пролиферацию эпидермиса.

ВЫВОДЫ

1. В популяции Северо-Западного региона РФ встречаются 9 кодирующих несинонимичных полиморфизмов генов семейства каспаз с частотой не менее 1% - Caspase-2 Leul41Val, Caspase-5 Ala90Thr, Caspase-5 Val318Leu, Caspase-7 Glu255Asp, Caspase-8 His302Asp, Caspase-9 Val28Ala, Caspase-9 Hisl73Arg, Caspase-9 Arg221Gln и Caspase-10 Leu479Ile.

2. Встречаемость гомозигот His/His гена Caspase-8 His302Asp у больных псориазом (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров (1,2%), частота носителей аллеля Не' гена Caspase-10 Leu479Ile среди пациентов с псориазом (80,4%) выше, чем среди здоровых лиц (55,2%).

3. Частота носителей аллеля Leu полиморфного гена Caspase-2 Leu 141 Val среди больных псориазом с псориатическим артритом (28,6%) выше, чем в группе больных без псориатического артрита (3,9%), встречаемость носителей аллеля Asp полиморфного гена Caspase-7 Glu255Asp среди пациентов, имеющих псориатический артрит (61,9%), выше, чем у больных без псориатического артрита (32,9%).

4. Прогностическая ценность генотипирования гена Caspase-8 His302Asp имеет чувствительность, специфичность, прогностическую значимость положительного и отрицательного результата - 66,7%, 73,3%, 6,2%, 98,9%, соответственно; гена Caspase-10 Ile479Leu - 51,1%, 80,6%, 48,5%, 82,2%, соответственно; гена Caspase-2 Leul4IVal - 70,0%, 81,0%, 16,7%, 98,1%, соответственно; гена Caspase-7 Glu255Asp - 34,1%, 82,0%, 35,8%, 81,0%, соответственно.

5. Риск развития псориаза у лиц,-имеющих генотип His/His гена Caspase-8 His302Asp, повышается в 5,5 раза, наличие аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile в генотипе обследуемого повышает у него риск развития псориаза в 4,3 раза. Присутствие в генотипе больного псориазом аллеля Leu гена Caspase-2 Leul41Val повышает риск развития псориатического артрита в 9,9 раза, аллеля Asp гена Caspase-7 Glu255Asp повышает риск развития псориатического артрита в 2,4 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Лицам с отягощенным семейным анамнезом по псориазу ■ -родственникам первой и второй степени родства - рекомендуется проводить генотипирование полиморфных генов программируемой клеточной гибели семейства каспаз Casp8 His302Asp и CasplO Ile479Leu с целью оценки риска развития данного дерматоза. Выявление генотипа His/His гена Caspase-8 His302Asp, повышает вероятность развития псориаза в 5,5 раза. При проведении генотипирования необходимо учитывать, что этот метод имеет умеренную чувствительность - 66,7% и специфичность - 73,3% и высокую прогностическая значимость отрицательного результата - 98,9%. Наличие аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile в генотипе обследуемого повышает у него риск развития заболевания в 4,3 раза. Генитипирование этого гена имеет умеренную чувствительность - 51,1%, высокую специфичность - 80,6% и прогностическую значимость отрицательного результата - 82,2%.

2. Всем больным псориазом, не имеющим псориатического артрита, целесообразно выполнять тестирование генетических полиморфизмов Casp2 Leul41VaI и Casp7 Glu255Asp с целью оценки риска развития псориатического артрита. Присутствие в генотипе пациента с псориазом аллеля Leu гена Caspase-2 Leul41Val повышает у него риск развития псориатического артрита в 9,9 раза. Данный генетический тест имеет умеренную чувствительность — 70,0%, высокую специфичность - 81,0% и прогностическую значимость отрицательного результата - 98,1%. Выявление аллеля Asp гена Caspase-7 Glu255Asp повышает риск развития псориатического артрита у больного псориазом . в 2,4 раза. Генитипирование этого гена имеет низкую чувствительность - 34,1%, но обладает высокой специфичностью - 82,0% и прогностической значимостью отрицательного результата - 81,0%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пономарев И.А.' Изучение распределения полиморфных генов семейства каспаз и рецепторов апоптоза TNFR1 Glnl21Arg и DR4 Argl41His у больных псориазом / H.A. Пономарев, A.C. Жуков, В.Р. Хайрутдинов, А.Г. Иевлева, Ю.М. Улыбина, A.B. Мошкалов, E.H. Суспицын, Н.В. Митюшкина, A.B. Того, A.B. Чаплыгин, Ю.Р. Полозов, A.B. Самцов, E.H. Имянитов // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. -Прил.2(22).-С. 730-731.

2. Жуков A.C. Распределение аллелей гена полиморфизм Ile479Leu гена каспаза-10 / A.C. Жуков, И.А. Пономарев, В.Р: Хайрутдинов, A.B. Чаплыгин, A.B. Мошкалов, А.Г. Иевлева, Е.Ш. Кулигина, Ю.М. Улыбина, Н.В. Митюшкина, Н.В. Маслаков, A.B. Самцов, E.H. Имянитов // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - Прил. 2 (22). - С. 731.

3. Жуков A.C. Изучение распределения полиморфных генов семейства каспаз и рецепторов апоптоза TNFR1 Glnl21Arg и DR4 Argl41His у больных псориазом / A.C. Жуков, И.А. Пономарев // Материалы итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии (факультетов подготовки врачей). - СПб, ВМедА, 2008. - С. 149.

4. Жуков A.C. Распределение аллелей гена полиморфизм Ile479Leu гена каспаза-10 / A.C. Жуков, И.А. Пономарев // Материалы итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей академии (факультетов подготовки врачей). - СПб, ВМедА, 2008. - С. 150.

5. Хайрутдинов В.Р. Особенности распределения полиморфных генов апоптоза у больных псориазом / В.Р. Хайрутдинов, И.А. Пономарев, A.C. Жуков, A.B. Самцов, E.H. Имянитов // Сборник тезисов научных работ «Санкт-Петербургские дерматологические чтения». - Санкт-Петербург, 2008 г.-С 76-79.

6. Пономарев И. A. Ile479Leu полиморфизм гена каспаза-10 - новая генетическая детерминанта псориаза? / И.А. Пономарев, A.C. Жуков, В.Р. Хайрутдинов, A.B. Мошкалов, E.H. Суспицын, Е.Ш. Кулигина, Ю.М. Улыбина, Н.В. Митюшкина, A.B. Того, Е.В. Белогубова, A.B. Самцов, E.H. Имянитов // Вопросы онкологии. - 2008. - Прил. Т. 54, № 2. - С. 21-22.

7. Жуков A.C. Полиморфизм генов рецепторов апоптоза TNFR1 Glnl21Arg и DR4 Argl41His у больных псориазом // A.C. Жуков, И.А. Пономарев, В.Р. Хайрутдинов, A.B. Мошкалов, К.Г. Буслов, А.Г. Иевлева, Ю.М. Улыбина, Н.В. Митюшкина, A.B. Того, A.B. Самцов, E.H. Имянитов // Вопросы онкологии. - 2008. - Прил. Т 54, № 2. - С. 11.

8. Хайрутдинов В.Р. Встречаемость полиморфных генов семейства каспаз у больных псориазом / В.Р. Хайрутдинов, И.А. Пономарев, A.C. Жуков, A.B. Мошкалов, А.Г. Иевлева, А.Г. Соколенко, Ю.М. Улыбина, Н.В. Митюшкина, A.B. Того, Е.В. Белогубова, A.B. Самцов, E.H. Имянитов // Вопросы онкологии. - 2008. - Прил.Т. 54, № 2. - С. 30-31.

9. Хайрутдинов В.Р. Новая генетическая детерминанта псориаза -Ile479Leu полиморфизм гена каспаза-10 / В.Р. Хайрутдинов, И.А.

Пономарев, A.C. Жуков, A.B. Самцов, E.H. Имянитов // Вестник дерматологии и венерологии. - 2008. - № 1. - С. 12-14.

10. Хайрутдинов В.Р. Полиморфизм Ala228Glu гена Dr4 и его связь с риском развития псориаза / В.Р. Хайрутдинов, A.C. Жуков, И.А. Пономарев, A.B. Мошкалов, A.B. Самцов, E.H. Имянитов // Вопросы онкологии. - 2009. -Прил. Т. 55, № 2. - С. 36-37.

11. Хайрутдинов В.Р. Изучение связи между риском развития псориаза и полиморфными вариантами генов Bid SerlOGly, Serv Lisl29Gly, Faim Leul27Ser, Faim Thrll7A!a / В.Р. Хайрутдинов, A.C. Жуков, И.А. Пономарев, A.B. Мошкалов, A.B. Самцов, E.H. Имянитов // Вопросы онкологии. -2009. - Прил. Т. 55, № 2. - С. 37.

12. Хайрутдинов В.Р. Роль полиморфных генов программируемой клеточной гибели в формировании риска развития псориаза / В.Р. Хайрутдинов, A.C. Жуков, И.А. Пономарев, P.A. Грашин, A.B. Самцов, E.H. Имянитов. II Вестник дерматологии и венерологии. - 2009. - JV» 4. -С. 4-9.

Подписано в печать 15.02.10 Формат 60x84/16

Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 185

Типография BMA им. С.М. Кирова 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

Формирование, развитие и проявление заболеваний человека является результатом сложной цепи взаимодействий всего двух факторов: генотипа и окружающей среды. Завершение проекта по расшифровке генома человека открыло совершенно новый спектр знаний. Геномные исследования дали потрясающие возможности для идентификации генетической предрасположенности к развитию многих болезней. В изучении наследственных заболеваний наибольший интерес сосредоточен на исследовании мультифакториальных болезней. Среди предполагаемых практических результатов этих работ необходимо отметить изучение оценки вклада генетических факторов в формирование риска развития заболеваний, профилактические меры на основе генетического тестирования, прогнозирование развития и течения болезней, генетически детерминированный индивидуальный подбор фармакотерапии и дозы лекарственных препаратов [Баранов B.C., Айламазян Э.К., 2001; Хуснутдинова Э.К., 2001; Янковский Н.К., Боринская С.А., 2004; Venter J.C. et al., 2001].

Псориаз - мультифакториальное полигенное заболевание с преимущественным поражением кожи, основная роль в иммунопатогенезе которого отводится Т-лимфоцитам. В настоящее время необходимость изучения молекулярных основ псориаза стала очевидной. Интенсивный поиск специфических для псориаза генов обусловлен наличием наследственной предрасположенности, присутствием аутоиммунного компонента и отсутствием целостного представления о патогенезе заболевания. Идентификация специфических для псориаза генетических детерминант позволит понять биологические механизмы этого дерматоза, даст возможность для разработки новой и индивидуальной специфической терапии [Владимиров В.В., Владимирова Е.В., 2006; Кубанова A.A. и соавт., 2006; Самцов A.B., Барбинов В.В., 2008].

Программируемая клеточная гибель является процессом противоположным пролиферации клеток и направлена на поддержание клеточного гомеостаза. Роль нарушений программируемой клеточной гибели в патогенезе псориаза признается многими исследователями [Клеменова И.А., 2007; Хайрутдинов В.Р. и соавт., 2007; Reefman Е. et al., 2005; Kastelan М. et al., 2006; Raj D. et al., 2006; Raymond A.A. et al., 2007]. Увеличение количества клеток, демонстрируемое в области псориатических высыпаний, может являться результатом нарушения, как пролиферации, так и апоптоза. Чрезмерная активация Т-клеточного звена иммунитета, приводящая к избыточной продукции медиаторов воспаления и факторов роста, рассматривается при псориазе как дефицит активности апоптоза. Снижение интенсивности программируемой клеточной гибели Т-клеток может являться ключевым звеном в развитии псориаза. Разрешение псориатических высыпаний происходит вследствие элиминации активированных Т-лимфоцитов путем программируемой клеточной гибели [Кубанова А.А. и соавт., 2007; Victor F.C., Gottlieb А.В., 2002; Reefman Е. et al., 2005; Strober B.E., Menon K., 2007; Fluhr J.W. et al., 2008; Yazdi M.R., Mrowietz U., 2008]. Популяционная вариабельность интенсивности апоптоза, изменяясь в широком диапазоне, может объяснять существенные различия в ответе больных псориазом на проводимую терапию. Индивидуальные различия индивидуумов обусловлены их генетической разнородностью. Наиболее распространенной причиной вариации генома являются замены единичных нуклеотидов в последовательности ДНК - генные полиморфизмы. В отличие от мутаций, приводящих к патологическим изменениям и снижающих жизнеспособность, генный полиморфизм имеет менее отчетливые фенотипические проявления. Вместе с тем, генный полиморфизм далеко не всегда является нейтральным для организма. Полиморфизм нуклеотидов может приводить к замене аминокислот в первичной структуре белка и появлению белковых продуктов с несколько измененными физико-химическими свойствами и, соответственно, параметрами функциональной активности этих молекул. Стабильность и распространенность генных полиморфизмов делают их перспективными для поиска ассоциаций с заболеванием. Ассоциативные исследования, направленные на установление связи генотипа с фенотипическими проявлениями, позволяют оценить роль генетических факторов в патогенезе заболеваний [Ляхович В.В. и соавт., 2004; Глотов A.C. и соавт., 2005; Imyanitov Е. et al., 2005; Bromberg Y., Rost В., 2007; Lee Р. Н., Shatkay Н., 2008].

Число генов, продукты которых вовлечены в инициацию, реализацию и регуляцию апоптоза, достаточно велико. Представители семейства цистеиновых каспаз являются ключевыми и наиболее важными участниками программируемой клеточной гибели. Путем каскадного взаимодействия эти ферменты приводят к значительному усилению начального сигнала гибели клеток. Гены семейства каспаз играют важную роль в реализации лечебного эффекта излучения ультрафиолетового спектра при терапии псориаза [Imyanitov Е. et al., 2005; Enjuanes A. et al., 2008; Lee Р. H., Shatkay H., 2008].

Цель исследования.

Оценить роль полиморфных аллелей генов апоптоза семейства каспаз в формировании риска развития псориаза и псориатического артрита.

Задачи исследования:

1. Выявить все кодирующие несинонимичные полиморфизмы генов семейства каспаз, встречающиеся в популяции Северо-Западного региона РФ, частота которых верифицирована и составляет не менее 1%.

2. Проанализировать распределение частот генотипов и аллелей генов апоптоза семейства каспаз в группах больных псориазом и здоровых доноров.

3. Выявить варианты генов каспаз с достоверно различающейся частотой в группах больных псориазом с псориатическим артритом.

4. Рассчитать прогностическую ценность метода генотипирования полиморфных генов апоптоза семейства каспаз с целью определения риска развития псориаза и псориатического артрита.

Научная новизна полученных результатов.

Выполнено систематическое молекулярно-эпидемиологическое исследование, направленное на изучение распределения полиморфных генов семейства каспаз у больных псориазом.

Установлено, что частота гомозигот His/His гена Caspase-8 His302Asp среди больных псориазом (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров (1,2%), носители аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile среди пациентов с псориазом (80,4%) встречаются чаще, чем в контроле (55,2%).

Встречаемость носителей аллеля Leu полиморфного гена Casp2 Leu 141 Val у больных псориазом с псориатическим артритом (28,6%) выше, чем в группе больных без псориатического артрита (3,9%), частота носителей аллеля Asp полиморфного гена Casp7 Glu255Asp среди пациентов, имеющих псориатический артрит (61,9%), выше, чем у больных без псориатического артрита (32,9%>).

Прогностическая ценность генотипирования полиморфных генов Casp8 His302Asp и CasplO Ile479Leu с целью оценки риска развития псориаза имеет умеренную чувствительность (51-67%) и высокую специфичность (73-81%) метода, генотипирование полиморфных генов Casp2 Leul41Val и Casp7 Glu255Asp, с целью определения риска формирования псориатического артрита, имеет чувствительность от низкой до умеренной (34-70%) и высокую специфичность (81-82%).

Научно-практическая значимость.

Выявлены новые генетические маркеры псориаза - полиморфизмы Caspase-8 His302Asp, Caspase-10 Leu479Ile и псориатического артрита -полиморфизмы Caspase-2 Leu 141 Val, Caspase-7 Glu255Asp, что позволяет включить их в генетическое тестирование, выполняемое лицам, предрасположенным к псориазу.

Установлено, что риск развития псориаза у лиц с генотипом His/His гена Caspase-8 His302Asp повышается в 5,5 раза. Наличие аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile в генотипе обследуемого повышает у него риск развития псориаза в 4,3 раза, что необходимо учитывать при прогнозировании развития заболевания у родственников больного.

Присутствие в генотипе больных псориазом аллеля Leu гена Caspase-2 Leul41Val повышает риск развития псориатического артрита в 9,9 раз, наличие аллеля Asp гена Caspase-7 Glu255Asp повышает риск развития псориатического артрита в 2,4 раза, что позволяет прогнозировать у них развитие псориатического артрита.

Основные положения, выносимые на защиту,

1. Полиморфные гены апоптоза семейства каспаз Caspase-2 Leul41Val, Caspase-7 Glu255Asp, Caspase-8 His302Asp, Caspase-10 Leu479Ile играют важную роль в формировании риска развития псориаза и псориатического артрита.

2. Частота гомозигот His/His гена Caspase-8 His302Asp у больных псориазом (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров (1,2%), носители аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile среди пациентов с псориазом (80,4%) встречаются чаще, чем в контроле (55,2%), встречаемость носителей аллеля Leu гена Casp2 Leul41Val у больных псориазом с псориатическим артритом (28,6%) выше, чем в группе больных без псориатического артрита (3,9%), частота носителей аллеля Asp гена Casp7 Glu255Asp среди пациентов, имеющих псориатический артрит (61,9%), выше, чем у больных без псориатического артрита (32,9%).

3. Прогностическая ценность генотипирования полиморфных генов Саэр8 Н1з302А8р и СаэрЮ 11е479Ьеи с целью оценки риска развития псориаза имеет умеренную чувствительность (51-67%) и высокую специфичность (73-81%) метода, генотипирование полиморфных генов Саэр2 Ьеи141Уа1 и Саэр7 01и255АБр, с целью определения риска формирования псориатического артрита, имеет чувствительность от низкой до умеренной (3470%) и высокую специфичность (81-82%).

Реализация и внедрение полученных результатов работы.

Полученные результаты и рекомендации успешно используются в лечебно-диагностической и учебно-методической работе кафедры кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, ФГУ «442 Окружной военный клинический госпиталь Ленинградского военного округа» МО РФ.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены на II Всероссийском Конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007 г.), II Российской научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2008 г.), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008 г.), Итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, (Санкт-Петербург, 2008 г.), Российской конференции по фундаментальной онкологии «Фундаментальная онкология - Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2008 г., 2009 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, получено 2 удостоверения на рационализаторские предложения.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 100 страницах и включает введение, обзор литературы, 3 главы собственных наблюдений, включающих материалы и методы исследования, полученные результаты и заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы, содержащий 201 источников (в том числе 64 отечественных и 137 иностранных). Диссертация иллюстрирована 13 рисунками, содержит 13 таблиц.

ВЫВОДЫ

1. В популяции Северо-Западного региона РФ встречаются 9 кодирующих несинонимичных полиморфизмов генов семейства каспаз с частотой не менее 1% - Caspase-2 Leul41Val, Caspase-5 Ala90Thr, Caspase-5Val318Leu, Caspase-7 Glu255Asp, Caspase-8 His302Asp, Caspase-9 Val28Ala, Caspase-9 Hisl73Arg, Caspase-9 Arg221 Gin и Caspase-10 Leu479Ile.

2. Встречаемость гомозигот His/His гена Caspase-8 His302Asp у больных псориазом (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров (1,2%), частота носителей аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile среди пациентов с псориазом (80,4%) выше, чем среди здоровых лиц (55,2%).

3. Частота носителей аллеля Leu полиморфного гена Caspase-2 Leul41Val среди больных псориазом с псориатическим артритом (28,6%) выше, чем в группе больных без псориатического артрита (3,9%), встречаемость носителей аллеля Asp полиморфного гена Caspase-7 Glu255Asp среди пациентов, имеющих псориатический артрит (61,9%), выше, чем у больных без псориатического артрита (32,9%).

4. Прогностическая ценность генотипирования гена Caspase-8 His302Asp имеет чувствительность,, специфичность, прогностическую значимость положительного и отрицательного результата - 66,7%, 73,3%, 6,2%, 98,9%, соответственно; гена Caspase-10 Ile479Leu - 51,1%, 80,6%, 48,5%, 82,2%, соответственно; гена Caspase-2 Leul41Val - 70,0%, 81,0%, 16,7%, 98,1%, соответственно; гена Caspase-7 Glu255Asp - 34,1%, 82,0%, 35,8%, 81,0%, соответственно.

5. Риск развития псориаза у лиц, имеющих генотип His/His гена Caspase-8 His302Asp, повышается в 5,5 раза, наличие аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile в генотипе обследуемого повышает у него риск развития псориаза в 4,3 раза. Присутствие в генотипе больного псориазом аллеля Leu гена Caspase-2 Leul41Val повышает риск развития псориатического артрита в 9,9 раза, аллеля Asp гена Caspase-7 Glu255Asp повышает риск развития псориатического артрита в 2,4 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ '

1. Лицам с отягощенным семейным анамнезом по псориазу -родственникам первой и второй степени родства - рекомендуется проводить генотипирование полиморфных генов программируемой клеточной гибели семейства каспаз Casp8 His302Asp и CasplO Ile479Leu с целью оценки риска развития данного дерматоза. Выявление генотипа His/His гена Caspase-8 His302Asp, повышает вероятность развития псориаза в 5,5 раза. При проведении генотипирования необходимо учитывать, что этот метод имеет умеренную чувствительность - 66,7% и специфичность - 73,3% и высокую прогностическая значимость отрицательного результата - 98,9%. Наличие аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile в генотипе обследуемого повышает у него риск развития заболевания в 4,3 раза. Генитипирование этого гена имеет умеренную чувствительность — 51,1%, высокую специфичность - 80,6% и прогностическую значимость отрицательного результата — 82,2%.

2. Всем больным псориазом, не имеющим псориатического артрита, целесообразно выполнять тестирование генетических полиморфизмов Casp2 Leul41Val и Casp7 Glu255Asp с целью оценки риска развития псориатического артрита. Присутствие в генотипе пациента с псориазом аллеля Leu гена Caspase-2 Leul41Val повышает у него риск развития псориатического артрита в 9,9 раза. Данный генетический тест имеет умеренную чувствительность - 70,0%, высокую специфичность - 81,0% и прогностическую значимость отрицательного результата - 98,1%. Выявление аллеля Asp гена Caspase-7 Glu255Asp повышает риск развития псориатического артрита у больного псориазом в 2,4 раза. Генитипирование этого гена имеет низкую чувствительность - 34,1%, но обладает высокой специфичностью - 82,0% и прогностической значимостью отрицательного результата - 81,0%.