Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Роль полиморфных вариантов генов, участвующих в рецепторном пути индукции апоптоза (FADD, Fas и каспазы-8) в патогенезе ишемического инсульта

На правах рукописи

КОЛЬЦОВА Кира Владимировна

РОЛЬ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В РЕЦЕПТОРНОМ ПУТИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА (FADD, FAS И КАСПАЗЫ-8) В ПАТОГЕНЕЗЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА

14.00.13 - «Нервные болезни»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□Ü3QB54TY

Москва - 2007

003065477

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и

социальному развитию >>

Научный руководитель.

Член-корреспондент РАМН,

профессор Вероника Игоревна Скворцова

Научный консультант-

Доктор биологических наук, профессор Светлана Андреевна Лимборская, Институт молекулярной генетики РАН

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор Максимова Марина Юрьевна Научный центр неврологии РАМН

Доктор медицинских наук, профессор Авакян Гагик Норайрович Российский государственный медицинский университет

Ведущая организация. Московский Областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Защита состоится___2007 года в_часов на

заседании диссертационного совета К 208.072 01 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, Москва, ул Островитянова, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета Автореферат разослан ____2007 год.

Ученый секретарь диссертационного совета, £ М-и

Доцент Губский Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Сосудистые поражения нервной системы являются одной из

важнейших проблем клинической неврологии. Внимание к сосудистой

патологии мозга объясняется ее широкой распространенностью, высоким

процентом смертности и инвалидизации

На протяжении последних 25 - 30 лет во всем мире ведется активное

изучение механизмов развития цереброваскулярных заболеваний и поиск

эффективных методов их профилактики и лечения Ишемический инсульт

может представлять собой один из синдромов моногенной наследственной

патологии, но в большинстве случаев этиология инсульта полигенна

Проводится изучение роли кандидатных генов, участвующих в

формировании основных факторов риска цереброваскулярной патологии

[Скворцова В И., Гусев ЕИ, Лимборская С А, Сломинский П. А, 2001].

Многочисленные исследования позволили выделить ряд кандидатных генов,

вовлеченных в патогенез ишемии мозга. Однако выявить определенные

полиморфные варианты генов либо генные мутации, определяющие развитие

ишемического инсульта, до сих пор не удалось

Наряду с изучением молекулярно-генетических аспектов

формирования основных факторов риска цереброваскулярной патологии

проводится изучение генетических механизмов апоптоза и антиалоптозной

защиты, а также исследования генов, определяющих индивидуальную

чувствительность ткани мозга к ишемии [Скворцова В И, Лимборская С А,

Сломинский П А, 2004] Установлены основные механизмы,

обусловливающие переход обратимых гемодинамических, клеточных и

молекулярных изменений в области ишемической полутени в стойкие,

формирование зоны некроза

Наряду с некрозом, в момент повреждения запускается механизм

отсроченного (вторичного) повреждения клеток, в основе которого лежит

апоптоз [Emery Е., 2000] Возможность перехода апоптоза в некроз

3 ч\

(апоптозно-некротический континуум, апонекроз) недостаточно изучена, и это является предметом более широкого рассмотрения проблемы [Yuan J, 2004].

Одним из важнейших регуляторов апоптоза является транскрипционный фактор, белок р53 [Chopp М., 1992], а концевую роль в реализации некротической и апоптотической гибели клеток играет ядерный регулятор - ДНК-разрушающий фермент PARP-1 [Arends M.J., 1991].

На кафедре фундаментальной и клинической неврологии ГОУ ВПО РГМУ совместно с отделом молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН проведена работа, в которой выявлена достоверная связь Ват HI полиморфных вариантов гена р53 и Rsa-I полиморфизма гена PARP-1 с объемом инфаркта мозга у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом [Шетова И.М, 2004]

В индукции апоптоза в клетках нервной ткани важную роль играют рецепторы Fas. Они принимают участие в реализации передачи первичного апоптотического сигнала благодаря взаимодействию с адаптерным белком FADD (Fas associated death domain), который индуцирует олигомеризацию каспазы-8, что активирует саморасщепление фермента с образованием активной протеиназы и реализует процесс апоптоза клетки [Miyashita Т, 1994] Однако в ходе исследований последних лет идентифицирована дополнительная Fas-зависимая неапоптотическая программа клеточной смерти Установлено, что даже в условиях ингибирования каскада каспаз активация рецепторов семейства Fas приводит клетки к гибели, причем в этих условиях морфологически она больше напоминает некроз, чем апоптоз [Yuan J, 2004]

Таким образом, учитывая полигенную природу развития инсульта, представлялось интересным исследовать, существует ли ассоциация полиморфизмов генов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD, Fas) и митохондриального пути индукции апоптоза (PARP-1, р53) с объемом

инфаркта мозга, что может предоставить дополнительные прогностические критерии для определения варианта течения заболевания и формирования очага инфаркта при остром ишемическом инсульте.

Активное изучение генов, вовлеченных в комплекс генетических реакций, определяющих тканевой ответ на ишемическое повреждение и участвующих в формировании морфологического дефекта, а также их полиморфных вариантов определяет актуальность настоящей работы, ее цель и задачи.

Цель работы

Изучение полиморфных вариантов генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD, Fas и каспазы 8) и их влияния на формирование инфаркта мозга, течение и исход острого ишемического атеротромботического инсульта

Задачи исследования'

1. Изучение клинически« особенностей развития ишемического атеротромботического инсульта и МРТ закономерностей формирования инфаркта мозга на протяжении острого периода заболевания.

2. Анализ структурных особенностей однонуклеотидного полиморфизма rs3740720 гена FADD, однонуклеотидного полиморфизма в 5'фланкирующей области -1677 G/A гена Fas и однонуклеотидного полиморфизма rs 3769823 каспазы 8 и их влияния на формирование инфаркта мозга, течение и исход ишемического инсульта

3. Исследование связи комбинаций полиморфных вариантов генов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD, Fas и каспазы-8) и митохондриального пути (PARP-1 и р53) с объемом церебрального инфаркта, течением и исходом заболевания ишемического инсульта

4 Разработка молекулярно-генетических критериев прогнозирования объема инфаркта мозга и исхода ишемического инсульта

Научная новизна

1. Впервые проведено комплексное динамическое клиническое, МР-морфометрическое, молекулярно-генетическое исследование пациентов в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта с целью изучения роли полиморфизмов генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза в патогенезе ишемического инсульта

2. Обнаружена ассоциация комбинаций полиморфизмов генов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD и Fas) и митохондриального пути (PARP-1 и р53) с тяжестью состояния больных в остром периоде ишемического инсульта и объемом инфаркта головного мозга.

3. Комбинации полиморфных вариантов генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза FADD и Fas могут быть применены в качестве критериев для прогнозирования объема инфаркта головного мозга при ишемическом инсульте

Практическая значимость работы 1. Обнаруженная взаимосвязь между полиморфными вариантами генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD и Fas), митохондриального пути (PARP-1 и р53), тяжестью состояния больных в остром периоде ишемического инсульта и объемом инфаркта мозга позволяет применять исследование комбинаций генотипов FADD и Fas для раннего прогнозирования течения ишемического инсульта и объема очага инфаркта головного мозга.

2 Выявление генетических маркеров индивидуальной чувствительности головного мозга к ишемии расширяет возможности первичной профилактики ишемического инсульта, позволяет разработать новые подходы к диспансеризации практически здоровых лиц из групп риска с целенаправленным и комплексным их обследованием и превентивным лечением

3 Изучение генетических основ повреждающего действия ишемии позволяет выявить новые мишени для лечения инсульта. Выявленная ассоциация между полиморфными вариантами генов FADD, Fas и размерами инфаркта головного мозга доказывает перспективность использования нейропротекторов, реализующих свое действие через торможение процессов апоптоза.

Внедрение в практику Результаты настоящего исследования применяются в работе неврологических отделений ГКБ №20 и ПСБ №31 г. Москвы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Объем ишемического повреждения головного мозга при ишемическом атеротромботическом инсульте и тяжесть течения заболевания высокодостоверно ассоциированы с полиморфными вариантами генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза FADD и Fas

2. Носительство комбинации генотипов (G/G) Fas и (А/А; A/G) FADD достоверно увеличивает риск развития крупноочагового церебрального инфаркта (>90 см3) и тяжелого течения ишемического инсульта.

3. Носительство 3 и более «неблагоприятных» полиморфных вариантов генов FADD, Fas, PARP-1 и р53 ассоциировано с наличием очагов инфаркта головного мозга большого объема по сравнению с комбинациями, объединяющими не более 2 «неблагоприятных» полиморфных вариантов этих генов (р=0,01).

4. Обнаруженная достоверная связь полиморфных вариантов генов-регуляторов апоптоза FADD, Fas, PARP-1 и р53 с объемом церебрального инфаркта и тяжестью ишемического инсульта указывает на возможность создания расширенных подходов к диспансеризации практически здоровых лиц из групп риска с использованием превентивной нейропротективной терапии, направленной на торможение процессов гибели клеток и активацию

защитных механизмов в условиях церебральной ишемии; позволяет проводить раннее прогнозирование течения церебрального инсульта.

Апробация работы Апробация диссертации состоялась на совместной конференции кафедры фундаментальной и клинической неврологии с курсами нейрохирургии, лабораторной, функциональной и нейролучевой диагностики ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета и отдела молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН (протокол № 3 от 22 ноября 2006 года).

Основные результаты исследования были доложены на научных конференциях кафедры фундаментальной и клинической неврологии РГМУ

Публикации' по теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 в центральной отечественной печати.

Объем и структура работы Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков, 13 таблиц Работа состоит из введения, обзора литературы, клинической характеристики больных, описания применяемых методов, 2 глав собственных результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы Список цитируемой литературы состоит их 128 источников, включая 31 отечественный и 97 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика больных и методы исследования

В исследование были включены 60 пациентов с острым ишемическим атеротромботическим инсультом в каротидной системе, поступивших в неврологические клиники РГМУ (ГКБ № 20 и ГКБ № 31 г Москвы) за

период 2001 - 2006 гг., соответствовавших критериям включения в исследование

Возраст больных колебался от 47 до 83 лет (средний возраст 69,6 + 9,98) В исследование вошли 39 женщин и 21 мужчин Все папиенты получали базисную унифицированную терапию, направленную на коррекцию центральной и церебральной гемодинамики, гемореологии, гемостаза, борьбу с отеком мозга

Из исследования исключались больные с перенесенными ранее инсультами, острыми заболеваниями воспалительной и невоспалительной природы, острым инфарктом миокарда, сердечной, печеночной и почечной недостаточностью, эндокринными и аутоиммунными заболеваниями и другими состояниями, сопровождающимися нарушениями системной гемодинамики и метаболизма, а также пациенты с онкологической патологией

Для стандартизации обработки клинического материала и проведения статистического анализа тяжесть состояния больных с острым нарушением мозгового кровообращения (ОНМК) и выраженность у них неврологического дефицита оценивали по шкале Оргогозо [Orgogozo J.M., 1986] на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки от развития ишемического инсульта Степень функционального восстановления у больных с ОНМК оценивали по шкале Бартел [Barthel D., 1965] на 1-е и 21-е сутки инсульта

Всем больным проводились ультразвуковая допплерография (УЗДГ) и дуплексное сканирование магистральных артерий для установления степени стеноза сосудов, проходимости сосудов, а также локализации сосудистого поражения Исследование проводилось пациентам по общепринятой методике на приборе TECHNOS итальянской фирмы "ISAOTE" Сужение просвета сосуда более чем на 70% по данным УЗДГ и дуплексного сканирования МАГ расценивалось как гемодинамически значимое.

Для верификации ишемического инсульта в каротидной системе и измерения объема ишемического повреждения головного мозга всем пациентам проводилась магнитно-резонансная томография (МРТ) головного

мозга и МР-морфометрия на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки от развития инсульта Исследования выполняли на магнитно-резонансном томографе " Эллипс" ТМП-150, с индукцией магнитного поля 0,15 Тесла (научно-производственная фирма "A3", Россия) Морфометрическую обработку полученных изображений выполняли с применением программных пакетов "OSIRIS" и "TOMOSOFT-Net"- комплекса прикладных программ томографа "Эллипс", который включает набор последовательностей сканирования, а также среду для редактирования и анализа получаемых изображений

При проведении генетического анализа экстракцию геномной ДНК производили из лейкоцитов свежей незамороженной венозной крови по стандартной методике. Прямая ДНК-диагностика полиморфных сайтов производилась путем амплификации в ПЦР участков генов FADD, Fas и каспазы-8 с последующей их обработкой эндонуклеазами и электрофорезом в агарозном геле

Распределение аллелей и полиморфных вариантов генов PARP-1, АИФ и р53 представлено на таблице 1

Таблица 1

Распределение аллелей и полиморфных вариантов генов FADD, Fas и

каспазы-8

Гены Полиморфные варианты

G/G A/G А/А Gаллель Ааллель

FADD 18 29 13 64 55

(30%) (48,3%) (21,7%) (54,2%) (45,8%)

Fas 16 35 9 67 53

(26,7%) (58,3%) (15%) (55,8%) (44,2%)

каспаза-8 Т/Т Т/С С/С Т аллель С аллель

13 (21,6%) 46 (76,6%) 1 (1,6%) 72 (60%) 48 (40%)

Статистический анализ проводился с использованием пакета статистической программы Statistica. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов FADD, Fas и каспазы-8, а также их комбинаций с объемом инфаркта мозга выполнялся при помощи критерия Крускала-Уоллиса

Анализ ассоциации комбинаций генотипов FADD, Fas, PARP-1 и р53 с объемом инфаркта головного мозга проводился с использованием критерия Стьюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты клинико-инструментального исследования пациентов На момент поступления в клинику состояние 28 (46,7%) больных расценивалось как тяжелое (< 40 баллов по шкале Оргогозо), у 32 пациентов отмечалось состояние средней тяжести (>40 баллов по шкале Оргогозо), что характеризовалось отсутствием или незначительно выраженными общемозговым и менингеальным синдромами, умеренно выраженным очаговым дефектом

На основании данных МР-морфометрии были сформированы 3 группы пациентов в зависимости от объема инфаркта мозга Первую группу составили пациенты с малым объемом ишемического очага (до 40 см3), вторую - со средним объемом (40 - 90 см3), третью - больные с большим объемом инфаркта (более 90 см3)

Распределение объемов ишемического повреждения головного мозга у пациентов на разные сроки от развития инсульта приведено в таблице 2

Таблица 2

Распределение объемов инфаркта мозга у пациентов на разные сроки от развития инсульта

Время от развития инсульта Объем инфаркта головного мозга

<40 см3 40 - 90 см3 >90 см3

1-е сутки 23 (38,3%) 16 (26,7%) 21 (35%)

3-й сутки 22 (36,7%) 7(11,7%) 31 (51,7%)

7-е сутки 20 (33,3%) 9(15%) 31(51,7%)

21-е сутки 22 (36,7%) 7(11,7%) 23 (38,3%)

По данным УЗДГ и дуплексного сканирования МАГ у 60 пациентов (100%) было выявлено атеросклеротическое поражение МАГ различной степени выраженности 32 пациента (58,3%) имели гемодинамически значимый стеноз МАГ (более 70%).

Данные клинического обследования пациентов и ультразвукового исследования МАГ позволили выделить 3 уровня локализации сосудистого поражения экстракраниальный отдел внутренней сонной артерии (эк-ВСА) -17 пациентов (28,3%), интракраниальный отдел внутренней сонной артерии (ик-ВСА) - 15 пациентов (25%) и ствол средней мозговой артерии (СМА) -28 пациентов (46,7%)

Результаты молекулярно-генетического исследования пациентов Полиморфизм гена FADD.

При анализе однонуклеотидного полиморфизма rs3740720 гена FADD не было выявлено достоверных различий в частоте G/G, A/G и А/A FADD генотипов (р>0,05). Распределение аллелей и полиморфных вариантов гена FADD представлено в таб 1

Анализировали частоту встречаемости основных факторов риска ишемического инсульта у пациентов с разными генотипами FADD Статистически значимых различий в распределении основных факторов риска ишемического инсульта у больных G/G, A/G и А/А FADD генотипами получено не было (р>0,05)

Проводился анализ зависимости объема инфаркта мозга от полиморфных вариантов гена FADD. Все носители аллея А (гомозиготы АА и гетерозиготы AG) были объединены в одну группу

Статистический анализ выявил взаимосвязь между объемом инфаркта головного мозга и полиморфизмом гена FADD У пациентов с гомозиготным G/G генотипом FADD достоверно чаще встречались очаги инфаркта с объемом более 90 см3 по сравнению с носителями A/G и А/А генотипов Данная ассоциация была достоверна на всех сроках исследования пациентов, однако максимальная взаимосвязь наблюдалась на 3-й сутки от развития инсульта (рис 1).

Рисунок 1

Связь объема инфаркта мозга с полиморфизмом гена К/ШО на 3-й сутки развития инсульта.

260 240 220

СО

S 200 -Si (0 180 к

9- ч«1 я

140

3-й сутки

t

S 120

а> fi

Ю 100

О

80 60 40

AA+AG GG

FADD генотипы

Примечания * р = 0,003 по сравнению с G/G генотипом

При анализе распределения генотипов FADD в зависимости от тяжести состояния пациентов было выявлено, что в группе больных с гомозиготным полиморфизмом GG преобладает тяжелое течение заболевания (балл по шкале Оргогозо < 40). В то же время среди носителей аллеля А гена FADD достоверно чаще наблюдалось более легкое течение заболевания (более 40 баллов по шкале Оргогозо). Данное преобладание было одинаково высокодостоверно на 1-е, 3-й и 7-е сутки заболевания (р=0,04) (рис. 2)

Рисунок 2

Связь тяжести состояния по шкале Оргогозо с полиморфизмом гена РА1Ш на 3 сутки развития инсульта.

3-й сутки

AA+AG GG

FADO генотипы

Примечания. *р=0,04 по сравнению с G/G генотипом

Полиморфизм гена Fas.

При анализе однонухлеотидного полиморфизма в 5'фланкирующей области гена -1677 G/A гена Fas не было выявлено достоверных различий в частоте G/G, A/G и А/А Fas генотипов (р>0,05). Распределение аллелей и полиморфных вариантов гена Fas представлено в таб. I.

Анализ частоты встречаемости основных факторов риска у пациентов с разными генотипами Fas не выявил статистически значимых различий в

распределении основных факторов риска ишемического инсульта у больных cG/G, A/G и А/А Fas генотипами (р>0,05)

Анализировалась связь объема очага инфаркта головного мозга от полиморфизма гена Fas Пациенты, имевшие (А) аллель (носители А/А и A/G генотипов) были объединены в одну группу.

Статистический анализ показал тесную взаимосвязь между разными генотипами Fas и объемом очага ишемического повреждения на 3-й и 7-е сутки от развития инсульта. У носителей гомозиготного Fas G/G генотипа выявлено преобладание очагов малого и среднего объемов инфаркта по сравнению с носителями аллеля А, у которых чаще выявлялись очаги инфаркта >90 см3. Данная ассоциация стала статистически достоверной на 3-и 7-е сутки от развития заболевания (р==0,05) (рис. 3).

Рисунок 3

Связь объема инфаркта мозга с полиморфизмом гена Fas на 7-е сутки развития инсульта.

180 160 140

Is

0 -—■

1 120 &

■8- 100 X 5

® 80

40

20

Примечание *р=0,05 по сравнению с А/А и A/G генотипами

При анализе распределения генотипов Fas в зависимости от тяжести состояния среди носителей аллеля А было выявлено статистически значимое преобладание больных с тяжелым течением инсульта (<40 баллов по шкале Оргогозо) по сравнению с пациентами с гомозиготным генотипом G/G на все сроки развития заболевания. Данное преобладание было максимально достоверным на 7-е сутки от развития инсульта (рис 4).

7-е сутки

GG AG+AA

FAS генотипы

Рисунок 4

Связь тяжести состояния по шкале Оргогозо с полиморфизмом гена Fas на 3 сутки развития инсульта.

7-е сутки

GG AG+AA

FAS генотипы

Примечания *р=0,01 по сравнению с G/G генотипом

Полиморфизм гена каспазы-8

При анализе однонуклеотидного полиморфизма ге 3769823 гена каспазы-8 было выявлено достоверное преобладание Т/С генотипа в частоте представленности его основных полиморфных вариантов (р=0,05) Распределение аллелей и полиморфных вариантов гена каспазы-8 представлено в таб. 1.

Анализировали частоту встречаемости основных факторов риска ишемического инсульта у пациентов с разными генотипами каспазы-8. Статистически значимых различий в распределении основных факторов риска ишемического инсульта у больных с Т/Т, Т/С и С/С генотипами

выявлено не было (р>0,05). Не установлено достоверной ассоциации полиморфизма гена каспазы-8 с объемом ишемического повреждения головного мозга и тяжестью состояния пациентов (р>0,05)

Результаты многофакторного анализа.

Был проведен многофакторный анализ ассоциации комбинаций генотипов FADD и Fas с размерами очага поражения Анализ комбинаций, включающих полиморфные варианты гена каспазы-8, не проводился ввиду отсутствия достоверной взаимосвязи между генотипами гена каспазы-8 и объемом ишемического очага.

По данным проведенного анализа была обнаружена статистически значимая связь объема инфаркта головного мозга у пациентов с ишемическим инсультом с полиморфными вариантами генов FADD и Fas

Все пациенты в зависимости от носительства той или иной комбинации генотипов были разделены на 3 группы носители генотипов, ассоциированных с малым объемом инфаркта - генотип G/G FADD и носители аллеля А гена Fas (А/А; A/G), объединение генотипов, один из которых ассоциирован с малым, а другой с большим объемом инфаркта - G/G FADD и G/G Fas генотипов и носители аллеля А генов FADD и Fas (А/А, A/G); носители генотипов, ассоциированных с большим объемом инфаркта-А/А, A/G FADD и G/G Fas генотипов

Установлены высокодостоверные различия в средних объемах инфаркта в крайних группах пациентов- у больных с наиболее неблагоприятной комбинацией генотипов (G/G FADD и А/А; A/G Fas) по сравнению с комбинацией А/А, A/G FADD и G/G Fas (р=0,03). Средний объем инфаркта в этой группе больных составил 176,7 см3 Средние объемы очагов инфаркта представлены в таблице 3

Таблица 3

Распределение средних объемов инфаркта у пациентов с разными комбинациями FADD и Fas генотипов.

Комбинации генотипов Средний объем инфаркта (см3)

G/G FADD и A/A;A/G Fas генотипы* 176,7

G/G FADD и G/G Fas генотипы и A/A;A/G FADD и A/A;A/G Fas генотипы 76,3

A/A,A/G FADD и G/G Fas генотипы 52,6

Примечания *р=0,03 по сравнению с A/A;A/G FADD и G/G Fas генотипами

Таким образом, наличие данной комбинации полиморфных вариантов генов FADD и Fas является наиболее неблагоприятной и ее носительство увеличивает риск развития обширного очага поражения при ишемическом инсульте

Учитывая ранее установленную достоверную связь гомозиготного -/- PARP-1 генотипа и +/- и +/+ генотипов р53 с обширным (>90 см3) ишемическим поражением головного мозга был проведен многофакторный анализ связи комбинаций генов FADD и Fas и полиморфных вариантов PARP-1 и р53 с объемом инфаркта мозга

Были произведены объединения генотипов с формированием 3 групп-носители генотипов, ассоциированных с большим объемом инфаркта; объединение генотипов, один из которых ассоциирован с малым, а другой с большим объемом инфаркта, носители генотипов, ассоциированных с малым объемом инфаркта

Выявлены высокодостоверные различия в средних объемах инфаркта в «крайних» группах пациентов у больных с наиболее неблагоприятными комбинациями генотипов G/G FADD и -/- Rsa-I PARP-1 по сравнению с

комбинацией А/А; A/G FADD и +/-; +/+ Rsa-I PARP-1 (p=0,003), G/G F ADD и +/-, +/+ Bam Ш p53 по сравнению с A/A;A/G FADD и -/- Bam Ш р53 (р=0,02), A/A,A/G Fas и -/- Rsa-I PARP-1 по сравнению с G/G Fas и +/-, +/+ Rsa-I PARP-1 (р=0,01) и A/A;A/G Fas и +/-, +/+ Bam Ш р53 по сравнению с G/G Fas и -/- Ват Ш р53 (р=0,01).

Таким образом, наличие данных комбинаций является наиболее неблагоприятным и их носительство увеличивает риск развития обширного очага поражения при ишемическом инсульте.

В свою очередь, анализ комбинаций всех 4 генов - F ADD, Fas, PARP-1 и p53 показал, что в исследуемой группе пациентов у носителей 3 и более «неблагоприятных» полиморфных вариантов этих генов достоверно чаще встречались очаги инфаркта головного мозга большого объема по сравнению с комбинациями, объединяющими не более 2 «неблагоприятных» полиморфных вариантов (р=0,01). Средние конечные объемы инфарктов в этих группах пациентов составили 131,7 см3 и 31,8 см3 соответственно. Наибольший объем инфаркта мозга наблюдался в группе пациентов с носительством всех 4 «неблагоприятных» генотипов, а наименьший размер очага выявлен у пациентов с 4 «благоприятными» генотипами (210,1 см3 и 4,5 см3 соответственно) (таблица 4)

Таблица 4

Полиморфные варианты генов Средний объем очага (см3)

FADD FAS PARP р53

1 А/А, A/G G/G -/- +/+,+/- 62,1

2 А/А; A/G А/А; A/G -/- +/+ ; +/- 142

3 G/G А/А; A/G -/- -/- 142,7

4 А/А, A/G G/G +/+, +/- 42,8

5 А/А, A/G А/А, A/G -/- -/- 30,9

б G/G А/А; A/G -/- +/+ ; +/- 210,1

7 А/А, A/G А/А, A/G +/+, +/- +/+, +/- 55,3

8 А/А, A/G G/G -/- -/- 22

9 G/G А/А; A/G +/+ ; +/- +/+ ; +/- 89,5

10 G/G G/G +/+, +/- +/+, +/- 10,5

И А/А; A/G G/G +/+ , +/- -/- 4,5

12 G/G G/G -/- 74,3

13 G/G А/А; A/G +/+, +/- -/- 32,8

14 А/А, A/G А/А, A/G +/+, +/- -/- 16,3

15 G/G G/G +/+ , +/- -/- 28,8

ВЫВОДЫ

1 Комплексный клинико-молекулярно-генетический и МР-морфометрический анализ установил, что у лиц с гомозиготным G/G генотипом по однонуклеотидному полиморфизму rs3740720 в гене FADD средний объем инфаркта при ишемическом поражении головного мозга на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки от развития инсульта достоверно выше (191,43 см3) по сравнению с носителями А/А и A/G генотипами по этому полиморфизму (65,7 см3)

2. Анализ генотипов по полиморфизму rs3740720 гена FADD выявил более частое носительство гомозиготного G/G FADD генотипа у больных с тяжелым инсультом (балл по шкале Оргогозо <40), по сравнению с

генотипами А/А и A/G FADD на 1-е, 3-й и 7-е сутки от развития инсульта (р=0,04 на 1-е сутки, р=0,04 на 3-й сутки и р=0,04 на 7-е сутки развития заболевания).

3. Выявлена высокодостоверная связь объема очага инфаркта на 3-й сутки инсульта- у носителей аллеля А гена Fas (однонуклеотидный полиморфизм в 5'фланкирующей области -1677 G/A) отмечался инфаркт головного мозга со средним объемом 124,7 см3, что достоверно превышало объем инфаркта у носителями гомозиготного G/G генотипа (48,9 см3, р=0,05) 4 Анализ генотипов по однонуклеотидному полиморфизму в 5'фланкирующей области -1677 G/A гена Fas выявил достоверно более частое носительство гомозиготного G/G Fas генотипа у больных с наиболее «благоприятным» течением инсульта (балл по шкале 0ргогозо>40) по сравнению с А/А и A/G Fas генотипами (р=0,02, р=0,02, р=0,01 и р=0,01 соответственно)

5. Анализ однонуклеотидного полиморфизма rs 3769823 гена каспазы 8 не выявил корреляции с объемом инфаркта головного мозга и тяжестью состояния больных

6. Анализ комбинаций генов FADD, Fas, PARP-1 и р53 показал, что в исследуемой группе пациентов у носителей 3 и более «неблагоприятных» полиморфных вариантов этих генов достоверно чаще встречались очаги инфаркта головного мозга большого объема по сравнению с комбинациями, объединяющими не более 2 «неблагоприятных» полиморфных вариантов (р=0,01). Средние объемы инфарктов в этих группах пациентов составили 131,7 см3 и 31,8 см3 соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Целесообразно использовать молекулярно-генетическую диагностику полиморфизмов генов FADD и Fas совместно с ранее исследованными полиморфизмами генов PARP-1 и р53 в качестве молекулярно-генетических маркеров индивидуальной чувствительности ткани мозга к

ишемии с целью выявления групп риска по развитию обширного очага инфаркта в случае острого сосудистого мозгового эпизода 2. В группах повышенного риска по развитию инсульта рекомендуется использовать своевременную превентивную нейропротективную терапию, направленную на торможение процессов гибели клеток и стимулирующую синтез защитных нейротрофических факторов.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В.И. Скворцова, С А Лимборская, ПА. Сломинский, ЕА Кольцова, И.М. Шетова, К.В. Кольцова. Роль Ват Ш КЕЬР полиморфизма гена р53 в формировании инфаркта мозга у пациентов с атероромботическим ишемическим инсультом. Инсульт Приложение к журналу неврологии и психиатрии им С С. Корсакова., вып 9, 2003, с. 123

2 В И Скворцова, С А Лимборская, И М Шетова, К В. Кольцова, Ассоциация Ват Ш МТ,Р полиморфизма гена р53 с объемом инфаркта мозга у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом Труды VI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2003, с. 177-178

3. В.И Скворцова, С.А. Лимборская, ИМ. Шетова, К В Кольцова, Ассоциация Ват Ш ИРЬР полиморфизма гена р53 с объемом инфаркта мозга у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом Труды VI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2003, с 177-178.

4. В.И. Скйорцова, С.А. Лимборская, П А. Сломинский, Е.А. Кольцова ИМ. Шетова, К.В. Кольцова, Н.А. Шамалов. Взаимосвязь ВАМ Н1

RELP полиморфизма гена Р53 с объемом инфаркта мозга при атеротромботическом ишемическом инсульте Сб. тезисов научно-практической конференции "медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины", посвященной 40-летию МВФ РГМУ, Москва, 2004, с.83

5 V.I. Skvortsova, SA. Limborska, Р.А Slominsky, I.M Shetova, E.A. Koltsova, К V. Koltsova, T V Tupitsina. PARP-1 gene TAII polymorphism and the level of PARP-1 in cerebrospinal fluid m formation of the brain infarction m patients with carotid atherothrombotic ischemic stroke Abstracts of 8th Congress of the Europian Federation of Neurological Societies, September 4-7,2004, Paris, P 293

6. VI. Skvortsova, Limborska S A, Slominsky P A, Shetova IM, Koltsova E A, Koltsova K.V., Botsina A.Yu, Tupitsina T.V., The role of genes -regulators of apoptosis polymorphisms (poly (adp-nbose) polymerase-1, apoptosis inducing factor and p53) in the pathogenesis of atherothrombotic ischemic stroke Cerebrovascular disease, Abstracts of the 14th European European Stroke Conference, Bologna, Italy, May 25-28, 2005, Vol 19, Suppl 2, P 73

7. В И. Скворцова, С А Лимборская, П А. Сломинский, К В. Кольцова, ИМ Шетова, Н.А Шамалов, ТИ Тупицына. Ассоциация полиморфизмов генов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD, Fas) и генов митохондриального пути (PARP-1 и р53) с объемом инфаркта мозга у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова, 2007, ВЫП 15, о Ч?

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфорная кислота

ц-АМФ - циклический аденозинмонофосфат

АИФ - апоптоз-индуцирующий фактор

АКТГ — адренокортикотропный гормон

АПФ - ангиотензин превращающий фермент

АТГ - ангиотензиноген

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АФК - активная форма кислорода

ВОЗ — Всемирная Организация Здравоохранения

ГТФ - гуанидинтрифосфорная кислота

ГЭБ - гемато-энцефалический барьер

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЗКГ - запрограммированная клеточная гибель

ИЛ - интерлейкин

КТ - компьютерная томография

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

МАГ - магистральные артерии головы

МРТ - магнитно-резонансная томография

MPC - магнитно-резонансной спектроскопии

НАД - никотинамиддинуклеотид

НАДФ - никотинамиддинуклеотидфосфат

PARP-1 - поли(АДФ-рибоза) полимераза-1

ПГК - программированная клеточная гибель

РАН - Российская Академия Наук

РНК - рибонуклеиновая кислота

м-РНК - матричная рибонуклеиновая кислота

СМА - средняя мозговая артерия

СМЖ - спинно-мозговая жидкость

ТИА - транзиторная ишемическая атака

УЗДГ - ультразвуковая допплерография

ФНО-а - фактор некроза опухолей а

ALF - апоптоз индуцирующий фактор

APAF-1 - фактор, активируюпщй апоптозную протеазу

ASK - киназа, активирующая апоптоз

BI - индекс Бартел

CADAS IL - церебральная аутосомно-доминантная артериопатия субкортикальными инфарктами и лейкоэнцефалопатией DD - смертельный домен

DISC - сигнальный комплекс, индуцированный гибелью

ecNOS - эндотелиальная NO-синтаза

iNOS - индуцибельная NO-синтаза

ЕТА - вазоактивный пептид эндотелина-1

FADD - белок, ассоциированный со смертельным доменом Fas

FLICE - схожий с FADD интерлейкин-превращающий фермент

FLIP - ингибитор FLICE

HIF - индуцируемый гипоксией транскрипционный фактор

HSP - белок теплового шока

MELAS - митохондриальная энцефаломиелопатия

nNOS — нейрональная NO-синтаза

NF-kB - ядерный фактор транскрипции генов-кВ

N0 - оксид азота

NMDA - N-ацетил- D-аспартат

PDGF - тромбоцитарный фактор роста

PUMA - р53 upregulated modulator of Apoptosis

SODD - предотвращающий взаимодействие со смертельным доменом TNFR1 - рецептор фактора некроза опухоли

Заказ № 346 Объем 1 п.л Тираж 100 зкз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Сосудистые поражения нервной системы являются одной из важнейших проблем клинической неврологии. Внимание к сосудистой патологии мозга объясняется ее широкой распространенностью, высоким процентом смертности и инвалидизации.

На протяжении последних 25-30 лет во всем мире ведется активное изучение механизмов развития цереброваскулярных заболеваний и поиск эффективных методов их профилактики и лечения. Так, к примеру, для существенного улучшения качества лечения острого инсульта необходимы информированность широких масс населения об этом заболевании, разработка более эффективных и безопасных методов быстрого восстановления мозгового кровотока и активной нейропротекции в условиях реперфузии [69].

Ишемический инсульт может представлять собой один из синдромов моногенной наследственной патологии, но в большинстве случаев этиология инсульта полигенна.

Проводится изучение роли кандидатных генов, участвующих в формировании основных факторов риска цереброваскулярной патологии [5, 17]. Изучаются гены ренин-ангиотензиновой системы, NO-синтаз, гены системы гемостаза, гены, контролирующие обмен гомоцистеина и липидов, а также гены, вовлеченные в процессы программированной клеточной смерти [60, 115].

Многочисленные исследования позволили выделить ряд кандидатных генов, вовлеченных в патогенез ишемии мозга. Однако выявить конкретные полиморфные варианты генов либо генные мутации, определяющие развитие ишемического инсульта, до сих пор не удалось.

Наряду с изучением молекулярно-генетических аспектов формирования основных факторов риска цереброваскулярной патологии проводится изучение генетических механизмов апоптоза и антиапоптозной защиты, а также исследования генов, определяющих индивидуальную чувствительность ткани мозга к ишемии [20, 28]. Показано, что изменение экспрессии генов, вовлеченных в механизмы регуляции программированной клеточной гибели (семейство bcl-2, каспазы, гены немедленного реагирования, гены белков теплового шока, р53), может играть важную роль в развитии ишемического повреждения мозга.

Объединение усилий фундаментальных нейронаук и клинической неврологии способствовало раскрытию основных механизмов, запускаемых острой фокальной ишемией мозга.

Одним из наиболее существенных достижений в последние годы было раскрытие стадийности патофизиологического каскада острейшего периода ишемического инсульта. Установлены основные механизмы, обусловливающие переход обратимых гемодинамических, клеточных и молекулярных изменений в области ишемической полутени в стойкие, формирование зоны некроза.

Наряду с некрозом, в момент повреждения запускается механизм отсроченного (вторичного) повреждения клеток, в основе которого лежит апоптоз, представляющий собой физиологическую гибель клеток, необходимую для обновления клеточного пула органов, дифференцировки и развития тканей [51, 70, 85]. Помимо этого, апоптоз активируется и тем самым предохраняет ткани от возможных последствий при сублетальных повреждениях, недостаточных для прямого уничтожения клетки путем некроза.

Возможность перехода апоптоза в некроз (апоптозно-некротический континуум, апонекроз) недостаточно изучена, и это является предметом более широкого рассмотрения проблемы.

В то время как некроз представляет собой необратимую гибель клетки, смерть в результате апоптоза на определенных этапах может быть задержана или предупреждена. Поэтому во многих лабораториях мира проводятся исследования с целью изучения механизмов активации апоптоза, его 7 временного и пространственного распространения в клеточной популяции ткани. Выясняются индукторы, супрессоры и исполнители программы апоптоза, а так же возможные пути влияния на этот процесс, и, прежде всего его торможения, с целью повышения выживаемости клеток.

Реализация цитотоксичности связана с индукцией рецептор-опосредованного апоптоза клетки-мишени. Среди огромного множества клеточных рецепторов в особую группу выделяют так называемые рецепторы смерти (death receptors). Они представляют собой трансмембранные гликопротеиды, которые, взаимодействуя со специфическими лигандами, передают апоптотический сигнал в клетку и вызывают активацию каспаз. Большинство смертельных рецепторов относятся к надсемейству рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR) и характеризуются сходными эктрацеллюлярными доменами, богатыми цистеином [81]. Рецепторы смерти также имеют в своей структуре гомологичные цитоплазменные участки, называемые смертельными доменами (death domain), которые принимают непосредственное участие в запуске апоптоза [88].

Наиболее изученными из смертельных рецепторов являются Fas (CD95, или Apol) и TNFR1. Человеческий Fas-рецептор состоит из 335 аминокислотных остатков с сигнальной последовательностью на N-конце и трансмембранным участком в середине молекулы, что позволяет отнести его к мембранным белкам Т типа [40, 106].

Исследования последних лет позволили выявить группу (каскад) цистеиновых протеаз - каспаз, которые активируя друг друга, во многих случаях составляют основу реализации программы клеточной гибели [43, 44]. С появлением каспаз была выделена третья, промежуточная фаза апоптоза, связанная с активацией так называемых исполнителей апоптоза, к которым отнесены нижние каспазы (downstream caspases) и эндонуклеазы

103, 109]. Считают, что эта промежуточная фаза до начала фрагментации ДНК также является обратимой.

Кроме фрагментации ДНК, активация или индукция каспаз также является достаточно надежным признаком апоптоза. Использование иммуногистологического метода с применением антикаспазных антител позволяет регистрировать эти протеиназы на ранних этапах посттравматического апоптоза в спинном мозге

Каспаза 8 рекрутируется лиганд-активированными рецепторами посредством ассоциированного с рецепторами смертельного домена белка FADD, что привело к первой молекулярной модели апоптоза, индуцируемого смертельными рецепторами. i

Хотя FADD необходим для Fas-индуцированной некроз-подобной программируемой клеточной гибели, этот белок блокирует TNFR1-индуцированный некроз, возможно путем активации caspase-8. Следовательно, FADD можно рассматривать как один из переключателей между апоптозом и некрозом, запускаемыми TNF.

Реализация программированной клеточной смерти происходит параллельно по 3 путям:

1. Рецепторный - взаимодействие рецептора и лиганда смерти приводит к последовательной активации инициаторных и эффекторных каспаз (каспазы I и II порядка соответственно), после чего процесс оказывается необратимым.

2. Митохондриальный - под воздействием индукторов апоптоза происходит увеличение проницаемости мембран митохондрий с высвобождением цитохрома С с последующей активацией каспазного каскада. Высвобождение апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ) является митохондриальным эффектором, вызывающий конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК независимо от действия каспаз. 9

3. Прямое повреждение ДНК ведет к активации р53, который стимулирует "рецепторы смерти" и апоптозные гены, а также активирует модулятор суицида PUMA (р53 upregulated modulator of APOptosis), блокирующий антиапоптозный белок Bcl-2, после чего происходит беспрепятственный выход цитохрома с из митохондрий.

Дефекты на любой ступени пути цитохром с или АИФ приводят к переключению с апоптотической гибели на некротическую. Такая гибель соответствует критериям ПКГ, так как может быть блокирована анти-апоптическими онкогенами Вс1-2. Подавление каспазной активности изменяет способ гибели клетки, если сигнал достиг митохондрий. Во многих моделях гибели клеток главные контролеры программируемой клеточной гибели оперируют на митохондриальном уровне, тогда как решения о форме гибели принимаются на уровне активации каспаз.

В случае острой церебральной ишемии нейроны внутри одной области подвергаются воздействию разной интенсивности, что обусловливает разные программы гибели. К примеру, быстрое истощение АТФ или нарушение внутриклеточного распределения ионов нарушают цитохромом с-индуцированную активацию каспаз, а массивная продукция оксида натрия непосредственно инактивирует каспазы. Таким образом, гибель клеток обнаруживает смешанные признаки апоптоза и некроза, в качестве «исполняющих» протеаз выступают каспазы или калпаины, или же обнаруживается активация PARP-1, как контролера запрограммированного некроза [126].

Активное изучение генов, вовлеченных в комплекс генетических реакций, определяющих тканевой ответ на ишемическое повреждение и участвующих в формировании морфологического дефекта, а также их полиморфных вариантов определяет актуальность настоящей работы, ее цель и задачи.

Цель работы: Изучение полиморфных вариантов генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD, Fas и каспазы 8) их влияния на формирование инфаркта мозга, течение и исход острого ишемического атеротромботического инсульта.

Задачи исследования:

1. Изучение клинических особенностей развития ишемического атеротромботического инсульта и МРТ закономерностей формирования инфаркта мозга на протяжении острого периода заболевания.

2. Анализ структурных особенностей однонуклеотидного полиморфизма rs3740720 гена FADD, однонуклеотидного полиморфизма в 5'фланкирующей области -1677 G/A гена Fas и однонуклеотидного полиморфизма rs 3769823 каспазы 8 и их влияния на формирование инфаркта мозга, течение и исход ишемического инсульта.

3. Исследование связи комбинаций полиморфных вариантов генов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD, Fas и каспазы-8) и митохондриального пути (PARP-1 и р53) с объемом церебрального инфаркта, течением и исходом ишемического инсульта.

4. Разработка молекулярно-генетических критериев прогнозирования объема инфаркта мозга и исхода ишемического инсульта.

Научная новизна.

1. Впервые проведено комплексное динамическое клиническое, МР-морфометрическое, молекулярно-генетическое исследование пациентов в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта с целью изучения роли полиморфизмов генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза в патогенезе ишемического инсульта.

2. Обнаружена ассоциация комбинаций полиморфизмов генов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD и Fas) и митохондриального пути (PARP-1 и р53) с тяжестью состояния больных в остром периоде ишемического инсульта и объемом инфаркта мозга.

3. Комбинации полиморфных вариантов генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза FADD и Fas могут быть применены в качестве критериев для прогнозирования объема инфаркта головного мозга при ишемическом инсульте.

Практическое значение работы.

1. Обнаруженная взаимосвязь между полиморфными вариантами генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD и Fas), митохондриального пути (PARP-1 и р53), тяжестью состояния больных в остром периоде ишемического инсульта и объемом инфаркта мозга позволяет применять исследование комбинаций генотипов FADD и Fas для раннего прогнозирования течения ишемического инсульта и объема церебрального инфаркта.

2. Выявление генетических маркеров индивидуальной чувствительности головного мозга к ишемии расширяет возможности первичной профилактики ишемического инсульта, позволяет разработать новые подходы к диспансеризации практически здоровых лиц из групп риска с целенаправленным и комплексным их обследованием и превентивным лечением.

3. Изучение генетических основ повреждающего действия ишемии позволяет выявить новые мишени для лечения инсульта. Выявленная ассоциация между полиморфными вариантами генов FADD, Fas и размерами инфаркта головного мозга доказывает перспективность использования нейропротекторов, реализующих свое действие через торможение процессов апоптоза.

выводы

1. Комплексный клинико-молекулярно-генетический и МР-морфометрический анализ установил, что у лиц с гомозиготным G/G генотипом по однонуклеотидному полиморфизму rs3 740720 в гене FADD средний объем инфаркта при ишемическом поражении головного мозга на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки от развития инсульта достоверно выше (191,43 см ) по сравнению с носителями А/А и A/G генотипами по этому полиморфизму (65,7 см ).

2. Анализ генотипов по полиморфизму rs3740720 гена FADD выявил более частое носительство гомозиготного G/G FADD генотипа у больных с тяжелым инсультом (балл по шкале Оргогозо <40), по сравнению с генотипами А/А и A/G FADD на 1-е, 3-й и 7-е сутки от развития инсульта (р=0,04 на 1-е сутки, р=0,04 на 3-й сутки и р=0,04 на 7-е сутки развития заболевания).

3. Выявлена высокодостоверная связь объема очага инфаркта на 3-й сутки инсульта: у носителей аллеля А гена Fas (однонуклеотидный полиморфизм в 5'фланкирующей области -1677 G/A) отмечался инфаркт головного мозга со средним объемом 124,7 см , что достоверно превышало объем инфаркта у носителями гомозиготного G/G генотипа (48,9 см ; р=0,05).

4. Анализ генотипов по однонуклеотидному полиморфизму в 5'фланкирующей области -1677 G/A гена Fas выявил достоверно более частое носительство гомозиготного G/G Fas генотипа у больных с наиболее «благоприятным» течением инсульта (балл по шкале 0ргогозо>40) по сравнению с А/А и A/G Fas генотипами (р=0,02; р=0,02; р=0,01 и р=0,01 соответственно).

5. Анализ однонуклеотидного полиморфизма rs 3769823 гена каспазы 8 не выявил корреляции с объемом инфаркта головного мозга и тяжестью состояния больных.

6. Анализ комбинаций генов FADD, Fas, PARP-1 и р53 показал, что в исследуемой группе пациентов у носителей 3 и более «неблагоприятных» полиморфных вариантов этих генов достоверно чаще встречались очаги инфаркта головного мозга большого объема по сравнению с комбинациями, объединяющими не более 2 «неблагоприятных» полиморфных вариантов (р=0,01). Средние объемы инфарктов в этих группах пациентов составили

3 3

131,7 см и 31,8 см соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Обнаруженная взаимосвязь между полиморфными вариантами генов-регуляторов рецепторного пути индукции апоптоза (FADD и Fas), митохондриального пути (PARP-1 и р53), тяжестью состояния больных в остром периоде ишемического инсульта и объемом инфаркта мозга позволяет применять исследование комбинаций генотипов FADD и Fas для раннего прогнозирования течения ишемического инсульта и объема очага инфаркта головного мозга.

2. Выявление генетических маркеров индивидуальной чувствительности головного мозга к ишемии расширяет возможности первичной профилактики ишемического инсульта, позволяет разработать новые подходы к диспансеризации практически здоровых лиц из групп риска с целенаправленным и комплексным их обследованием и превентивным лечением.