Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Экспрессия генов программируемой клеточной гибели в опухолях молочной железы

Министерство здравоохранения РФ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ им. проф. Н.Н. Петрова

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ПРОГРАММИРУЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ В ОПУХОЛЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Специальность — 14.00.14 - онкология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

Григорьев Максим Юрьевич

Санкт-Петербург 2002

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте онкологии им. проф. H.H. Петрова Минздрава РФ

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор К.П. Хансон, доктор медицинских наук E.H. Имянитов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор М.Л. Гершанович, доктор биологических наук, профессор В.П. Комов

Ведущее научное учреждение:

Центральный Научно-исследовательский рентгено-радиологический институ

Минздрава РФ

Защита состоится 25 июня 2002 г. в 13.00 на заседании Специализированного Учёного Совета Д 208.052.01 НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова (197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, Ленинградская ул., 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "..." мая 2002 г.

Учёный секретарь Специализированного Совета

доктор медицинских наук, академик РАЕН В.В. Худоле;

f° Sbc). / ра

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Программированная клеточная гибель (ПКГ) - это активный, генетически детерминированный процесс физиологического умирания клетки. ПКГ свойственна всем живым организмам, не исключая человека. Она играет ключевую роль в эмбриогенезе, морфогенезе, поддержании тканевого гомеостаза и т. д. Известно несколько разновидностей ПКГ, отличающихся друг от друга биохимически и по внешним проявлениям [Vaitx D.L., Korsmeyer S.J., 1999]. Для животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, наиболее характерным является процесс апоптоза. Исторически это был первый открытый вариант ПКГ [Kerr J.F.R. et al., 1972], и на сегодняшний день он изучен лучше остальных. Другие типы ПКГ, отличные от апоптоза, -терминальная дифференцировка и физиологический киллинг - у позвоночных распространены в меньшей степени. Они выполняют специализированные функции и представлены лишь в некоторых типах тканей. Растениям свойственны особые механизмы физиологической смерти клеток, мало похожие на таковые у животных.

Баланс между клеточной пролиферацией и гибелью является обязательным условием нормальной жизнедеятельности любой ткани. Процессы отмирания и обновления клеток, обеспечивающие динамическое структурно-функциональное постоянство, происходят непрерывно, и находятся под строгим контролем генетического аппарата. В основе клеточной пролиферации лежит прежде всего деление, т.е. митоз, а в основе гибели -программированный суицид клетки, т.е. апоптоз. Митоз наращивает клеточную массу, тогда как апоптоз аккуратно устраняет всё лишнее, вредное, или ставшее со временем ненужным.

Нарушение оптимального соотношения между этими двумя фундаментальными процессами является материальной основой для возникновения ряда патологических состояний. Например, стимуляция гибели клеток играет основную роль в развитии дегенеративных заболеваний нервной системы, некоторых поражений кожи (пузырчатки и псориаза), СПИДа и др. [BianchiL. et ai, 1994; Arriendóla A. et al., 1996; ChenJ.S., Mehta К, 1998; Les ort M. et al., 2000].

Примером патологии, сопровождающейся усилением пролиферации, являются онкологические заболевания. Опухоли характеризуются бурным, неконтролируемым делением клеток, причём выраженная автономность последних создаёт предпосылки для генерализации процесса. Трансформированные клетки существуют в условиях, по идее способствующих инициации процессов апоптоза: дефицит питания и кислорода, мутации и хромосомные перестройки в геноме и т. д. Действительно, по сравнению с нормальными тканями, в большинстве типов

опухолей наблюдается повышение числа апоптотических клеток. Однако, по каким-то причинам оно не успевает компенсировать прирост клеточной массы. Поэтому, изучение состояния процессов апоптоза в опухоли и их связи с клиническим фенотипом и результатами лечения представляет значительный интерес.

Рак молочной железы (РМЖ) является особым объектом, т. к. клеточная гибель играет исключительно важную роль в процессах ремоделированш ткани этого органа. В нормальной молочной железе пролиферация и гибел! клеток строго сбалансированы - они динамически чередуются, находясь е зависимости от фаз менструального цикла [Ferguson D.J.P., Anderson T.J. 1981; Anderson T.J., 1999]. Ежемесячно большое число клеток отмирает i нарождается вновь. Понятно, что при такой обновляемости даж( незначительные сбои в системе гормональной регуляции могут привести i дисбалансу этих противоположно направленных процессов, чем и объясняете; столь высокая частота возникновения доброкачественных и злокачественны; новообразований молочной железы, особенно в перименопаузальном периоде.

Процесс клеточной гибели при РМЖ отличается выраженное недостаточностью, причём декомпенсация апоптоза нарастает параллельно < прогрессией заболевания. При переходе от доброкачественной гиперплази] через карциному in situ к инвазивному раку соотношение пролиферация апоптоз увеличивается в 4 раза для высокодифференцированных опухолей, и : 2,5 раза для низкодифференцированных [Mommers Е.С. et al., 1999} Установлено, что изменение баланса между пролиферацией и апоптозо? связано с нарушением молекулярных механизмов ПКГ. Эти нарушени обусловлены делециями, точковыми мутациями, метилированием промоторо и другими аномалиями генов апоптоза, что проявляется изменением паттерн их экспрессии: усилением, ослаблением, автономностью, нетипично локализацией в клетке и т. д.

Цель и задачи исследования

Цель - изучить экспрессию ряда ключевых генов ПКГ в первичны инвазивных карциномах молочной железы в зависимости от уровня апоптоза клинических характеристик опухолей.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Оценить уровень апоптоза в РМЖ и нормальном железисто эпителии молочной железы.

2. Оценить уровень экспрессии в РМЖ и нормальных тканях молочно железы некоторых ключевых молекул апоптотического каскада, а имени тканевой трансглутаминазы, каспазы 3, каспазы 7, Вс]-2.

3. Проанализировать взаимосвязь между экспрессией упомянутых гене и уровнем апоптоза в ткани, степенью злокачественности, TNM-статусо!

содержанием рецепторов к стероидным гормонам, менопаузальным статусом, возрастом больных.

Научная новизна работы

В данной работе впервые на репрезентативной группе первичных опухолей молочной железы проанализирована экспрессия ряда ключевых молекул апоптотического каскада, таких как активированная форма каспазы 3, каспаза 7, тканевая трансглутаминаза. Изучена взаимосвязь статуса этих генов с клинико-морфологическими характеристиками карцином, а также с экспрессией некоторых классических регуляторов программируемой клеточной гибели.

Научно-практическая значимость работы

1. Принято считать, что каспазы - достаточно специфические белки, активация которых приводит клетку к гибели. Результаты исследования дают повод к пересмотру этой точки зрения, т.к. они указывают на возможное существование у каспаз других функций, не имеющих отношения к апоптозу, и свидетельствуют об общей генетической разрегулированности процессов ПКГ в опухолях молочной железы.

2. Транскрипционная активность гена тканевой трансглутаминазы (тТГ) положительно коррелирует с уровнем апоптоза в опухолях молочной железы. При этом, однако, обнаружена дискордантность между экспрессией тТГ на уровне мРНК и на уровне белка.

3. В работе получены результаты, подтверждающие и дополняющие данные о связи между клиническим фенотипом рака молочной железы и экспрессией апоптотического супрессора Вс1-2, а также уровнем апоптоза в опухоли.

Апробация работы

Основные материалы исследования были представлены на Российско-французском семинаре "Молекулярные аспекты канцерогенеза" (Москва, 1999), Европейских онкологических конференциях ЕССО-Ю (Вена, Австрия,

1999) и ЕССО-11 (Лиссабон, Португалия, 2001), симпозиумах Европейской организации по изучению клеточной гибели ECDO-8 (Давос, Швейцария,

2000) и ECDO-9 (Вена, Австрия, 2001), международном симпозиуме по профилактике опухолей (Париж, Франция, 2002), а также на научном семинаре лаборатории молекулярной онкологии НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 96 страницах машинописного текста и состоит

из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов

с обсуждением, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 2 таблицами; кроме того, 4 таблицы вынесены в приложение. Указатель литературы содержит 132 ссылки на отечественные и зарубежные публикации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы исследования

В качестве материала использовались фрагменты хирургически удалённых первичных опухолей молочной железы от 61 пациентки: инвазивный протоковый рак ~ 56 образцов, дольковый рак -- 3 образца и слизистый рак - 2 образца. 20 опухолей были 1 степени гистологической злокачественности по Bloom-Richardson, 26 опухолей - И степени, и 15 опухолей — III степени. Средний возраст пациенток в выборке 56 лет. До момента операции больные не получали гормонотерапии, химиотерапии, или лучевого лечения.

Кроме того, были исследованы 5 образцов неопухолевых тканей молочной железы от пациенток с фиброаденоматозом различной степени.

Все больные проходили оперативное лечение на 1 хирургическом отделении НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова в 1999-2000 г.г.

Стратегия исследования экспрессии генов апоптоза представлена на рис. 1а и б.

Рис. 1а. Схема исследования экспрессии тканевой трансглутаминазы.

25 больных РМЖ

экспрессия на уровне мРНК: экспрессия на уровне белка:

выделение тотальной РНК иммуногистохимическое окрашивание

+

обратная транскрипция

+

обратная ПЦР

25 карцином молочной железы исследовались на предмет экспрессии тТГ н; уровне мРНК и белка. Из замороженной ткани выделяли тотальную РНК синтезировали на её матрице кДНК и затем ставили обратную полимеразнун цепную реакцию (ПЦР), а на соответствующих гистологических срезах I архивных блоков проводили иммуногистохимическое окрашивание.

Рис. 16. Схема анализа экспрессии каспаз 3 и 7.

61 пациентка РМЖ и 5 больных фиброаденоматозом

экспрессия на уровне белка: иммуногистохимическое окрашивание

Иммуногистохимическая экспрессия каспаз 3 и 7 изучалась для 61 опухоли, а также 5 доброкачественных / неопухолевых образцов ткани молочной железы. Экспрессию белка Вс1-2 определяли у всех больных.

Выделение РНК и обратная ПЦР

Выделение тотальной РНК осуществляли методом кислой фенол-хлороформной экстракции с использованием гуанидин-изотиоцианата по методу Chomczynski & Sacchi [1987]. Степень нативности РНК проверяли электрофоретически в 1% агарозном геле по наличию 28S, 18S, 4S фракций. 5 мкг тотальной РНК подвергали обратной транскрипции в объёме 20 мкл, содержащем в конечных концентрациях 50 мМ трис-НС1, 75 мМ КС1, 3 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 0.5 мМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата (ATP, ТТР, GTP, СТР), 200 нг гексануклеотидной затравки (random primers), 40 ед. ингибитора РНКаз ("Gibco") и 200 ед. обратной транскриптазы ("Gibco"), рН=8.3.

Полимеразную цепную реакцию проводили в смеси следующего состава: 10-х ПЦР-буфер без Mg-ионов ("Perkin Eimer") - 1 мкл

5 mM дезоксирибонуклеозидтрифосфаты: ATP, ТТР, GTP, СТР - по 0,1 мкл 25 мМ MgCl2 ("Perkin Elmer") - 0,6 мкл

30 пМ праймеры (смесь "upstream" + "downstream" 1:1) - 1 мкл

MDP-1, "Hot-start" Taq ДНК-полимераза конц. 5 ед./мкл ("Yours'',Москва)- 0,2 мкл кДНК, разведённая после обратной транскрипции 1:5 дистилл. Н20 - 1 мкл Н2О дистиллированная - до 10 мкл

5'-3' последовательности праймеров приведены ниже.

1. Тканевая трансглутаминаза: Upstream: AGAAGCTGGTGGTGCGAC. Downstream: TGGGGTTGACATCTAGAAGG. Температура отжига: +55°С. Продукт: 528 п.о.

2. GAPDH (контрольный генетический локус для проверки качества кДНК): Upstream: GGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC.

Downstream: AGCAGAGGGGGCAGAGATGAT. Температура отжига: +55°С. Продукт: 375 п.о.

Чтобы избежать амплификации с геномной ДНК, праймеры фланкировали один из интронов каждого гена таким образом, чтобы часть продукта приходилась на конец одного экзона, а оставшаяся - на начало следующего.

Нами были подобраны следующие условия ПЦР-циклирования: --начальная денатурация + активация MDP-полимеразы: 95°С 10 мин. --денатурация: 95°С 35 сек. —

— отжиг: 55°С 1 мин. 35-40 циклов амплификации

— синтез: 72°С 1 мин. _ -- конечный синтез: 72°С 7 мин.

Электрофоретический анализ проводили в 8% полиакриламидном геле.

Апоптотический индекс (АИ) - это % содержание апоптотических клеток по отношению к общему числу клеток той же гистологическог принадлежности. АИ отражает действительный уровень апоптоза в ткани, \ выражается через среднее арифметическое при оценке минимум 10 поле? зрения при большом увеличении. Мы определяли АИ посредством обычногс гематоксилинового окрашивания гистологических препаратов с использованием стандартных морфологических критериев апоптоза конденсация и фрагментация ядра и цитоплазмы и др. [Kerr J.F.R et al., ¡972} Для подтверждения, на 15 препаратах был применён специальный метод основанный на мечении двунитевых разрывов ДНК (TUNEL-assay). Пол! зрения, расположенные близко к обширным некротическим участкам, и: рассмотрения исключались. Для облегчения трактовки результатов, образць разделили на 3 категории в соответствии с величиной апоптотическоп индекса: низкий (АИ < 0,8%), средний (АИ = 0,8-1,6%) и высокий (АИ > 1,6%)

Иммуногистохимическое окрашивание проводили на срезах опухоле1 и нормальных тканей, приготовленных из фиксированных парафиновые архивных блоков. Сведения об использованных первичных антитела: суммированы в таблице 1.

Антиген Тип антител Разведение Инкубация Производитель

Каспаза-3 активированная моноклональные 1:150 +37°С 90 мин. "Pharmingen"

Каспаза-3 активированная + про-форма поликлональные 1:300 +5°С 14-16 часов "Pharmingen"

Каспаза-7 активированная + проформа пошклональные 1:400 +5°С 14-16 часов "StressGen"

Тканевая трансглугаминаза моноклональные 1:50 +37°С 60 мин. "NeoMarkers"

Вс1-2 моноклональные 1:40 +37°С 90 мин. "Dako"

Процедура окрашивания соответствовала стандартным протоколам. При использовании антител к активированной каспазе 3 и каспазе 7 для увеличения биодоступности антигенов производилась тепловая предобработка срезов в цитратном буфере. Разведения первичных антител подбирали методом титрования с учётом рекомендаций фирм-производителей. Выявление сигнала осуществляли пероксидазным методом с использованием диаминобензидина в качестве субстрата. Каждое окрашивание включало негативный контроль (без первичных антител). Критерии оценки степени иммуноокрашивания соответствовали общепринятым:

А. Интенсивность: Б. Распространённость:

1 (+) - слабая 1 - менее 25% меток

2 (++) - умеренная 2 - 25-50% клеток

3 (+++) - сильная 3 - 50-75% клеток

4 (++++) - очень сильная 4 - более 75% клеток

Совокупный результат = сумма баллов "интенсивность" + "распространённость"

- нет окраски или слабая: 0-2 балла

- умеренная: 3-5 баллов

- сильная: 6-8 баллов

Иммуноокрашивание на тканевую трансглутаминазу отличалось некоторыми особенностями.

1. Экспрессия тТГ обнаруживалась всегда в небольшом числе клеток, поэтому при работе требовался внутренний положительный контроль. Функцию такого контроля выполняли эндотелиоциты капилляров. Полностью тТГ-негативные препараты признавали неинформативными и исключали из работы.

2. Преобладание внеклеточной локализации антигена над внутриклеточной затруднила количественную оценку результатов (подсчёт % клеток с экспрессией тТГ), поэтому мы ограничились только их качественной интерпретацией.

Рецепторы к эстрогенам и прогестерону

По содержанию рецепторов к стероидным гормонам опухоли группировались следующим образом:

1. Эстрогеновые рецепторы: <10 фмоль/л - негативный ЕЯ-статус, 10-13 фмоль/л - слабопозитивный ЕЯ-статус, >13 фмоль/л - высокопозитивный ЕЯ-статус. Стратификация ЕЯ+ опухолей на слабо- и высокопозитивные была вызвана выраженной гетерогенностью экспрессии ЕЯ.

2. Прогестероновые рецепторы: <10 фмоль/л - негативный РЯ-статус, >10 фмоль/л - позитивный РЯ-статус.

Статистическая обработка результатов

Достоверность различий определялась по критерию ^-квадрат и точном) критерию Фишера с помощью компьютерных программ ВЮЗТАТ и Л/У5ТЛТ Значение р<0.05 являлось признаком достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень апоптоза в карциномах и неопухолевых тканях молочной железы

В этой работе оценка уровня апоптоза при РМЖ самостоятельной значения не имела, т.к. в литературе есть достаточно сведений по данном; поводу [см. обзор Lipponen Р., 1999]. Она требовалась для обеспечение трактовки данных по интересующим нас белкам (тканевой трансглутаминазе каспазам 3 и 7). То же самое касается экспрессии Вс1-2, котора: использовалась как дополнительный биологический параметр опухоли i иммуногистохимический контроль.

На основании критериев, указанных в "Методах", в 18 карцинома: апоптотический индекс (АИ) был признан высоким, в 14 - умеренным и в 29 -низким. Во всех образцах неопухолевых тканей интенсивность апоптоза был расценена как низкая. Результаты TUNEL-assay соответствовали данным полученным на основании стандартного гематоксилинового окрашиванш Нередко апоптозные клетки попадались вблизи некротических полей, а такж в зонах с частыми митозами. Солидные карциномы молочной желез! характеризовались максимальным АИ, тогда как в скиррозных раках он бы минимальным.

При соотнесении результатов с клиническими характеристиками РМ> выявились следующие закономерности. АИ положительно коррелировал с степенью злокачественности неоплазм (р=0.000), но был обрати ассоциирован с количеством рецепторов к эстрогенам (р=0.019) и возрастом ( пациенток старше 60 лет уровень апоптоза в ткани был значительно ниж< р=0.034). Результаты представлены графически на рис. 2.

Таким образом, высокий апоптотический индекс сопутствова некоторым неблагоприятным параметрам опухоли - высоко злокачественности и отсутствию рецепторов к эстрогенам, что очевидн согласовывается с данными литературы [Zhang G.J. et al, 1998\ Lipponen P 1999].

Рис. 2. Апоптотический индекс и клинические характеристики РМЖ

П Высокий ЛИ О Умеренный А И О Низкий ЛИ

56%

в

*--<тг<г 21%

-vfi? ** 7%

■ 1-ifl- Тг 1

53%

* 1 36%

-oWSie -i»

Р=0.000

опухоли высокой степени злокачественности по Bloom-Richardson

Р=0.036* ER+ опухоли

""корреляция с ER-статусом выявлена при объединении опухолей с высоким и умеренным АИ в одну группу: "высокий или умеренный АИ" versus "низкий АИ"

Экспрессия Вс1-2 в карциномах и неопухолевых тканях молочной железы

Паттерн экспрессии Вс1-2 в карциномах молочной железы в целом соответствовал ожидаемому. 59 из 61 опухолей были иммунопозитивны (97%). Из них, согласно нашим количественно-качественным критериям (см. "Методы"), в 21 опухоли обнаружена высокая иммуногистохимическая экспрессия Вс1-2, в 32 опухолях-умеренная, для 6 была показана низкая экспрессия. Согласно преимущественной внутриклеточной локализации (митохондрии и эндоплазматический ретикулум), экспрессия обнаруживалась в цитоплазме и имела диффузный характер. Если в препарате присутствовали пренеопластические структуры (дольки с гиперплазией, эктазированные протоки), то по сравнению с опухолевыми элементами количество Вс1-2 в них было выше. Все 5 исследованных нами неопухолевых (доброкачественных)

образцов были иммуиопозитивны в отношении этого белка.

Известно, что уровень Вс1-2 в ткани молочной железы понижается п< мере прогрессии от доброкачественной гиперплазии к раку, положителып коррелирует со степенью злокачественности опухолей и обратн< коррелирует с индексом апоптоза \Daidone М. С. е/ а1, 1999; Кга]ешЬ 5. е а1, 1999]. В нашей выборке низкозлокачественные карциномы обнаружил) более высокую экспрессию Вс1-2, что соответствует литературным данным, н< ассоциация не достигла статистической достоверности (р=0.26). Сравнива: результаты с другими клинико-морфологическими параметрами, мы выявил) корреляцию гиперэкспрессии Вс1-2 с низким индексом апоптоза (р=0.036} высокопозитивным ЕЯ-статусом (содержанием рецепторов >13 йпо1/1 р=0.022), возрастом пациенток (старше 70 лет, р-0.045). Не выявилось однако, чёткой связи с ТКМ-статусом, менопаузой и содержанием рецепторо к прогестерону.

Таким образом, удалось подтвердить, что гиперэкспрессия Вс1-2 являете маркером высокой дифференцировки опухолей и сопряжена с низким уровне! апоптоза.

Экспрессия тканевой трансглутаминазы в карциномах молочно железы

Исследование проведено на группе из 25 больных РМЖ и включало себя изучение экспрессии мРНК тканевой трансглутаминазы с помощы обратной ПЦР и иммуногистохимическое определение тТГ-белка.

тТГ-специфичный ПЦР-продукт был амплифицирован в 11 из 2 образцов (44%). Интенсивность сигнала варьировала примерно в 5-10 раз, чт могло быть связано с различным уровнем экспрессии данного гена. Ка положительные, так и отрицательные результаты оказалис воспроизводимыми. Повышение числа циклов до 45 не способствовало какий либо изменениям. ПЦР на контрольный ген ОАРБН была успешно проведен для всех 25 кДНК.

На рис. 3 представлены примеры типичных электрофореграмм.

Рис. 3. Экспрессия мРНК тканевой трансглутаминазы (ТТС) и С АР ОН в опухолях молочной железы.

1 2 3 4 5 6

<— ТТС

^■^»яадвяЕакарр.

<*-— ОАРБН

Из 25 иммуногистохимических препаратов, соответствующих проанализированным образцам кДНК, 5 были признаны неинформативными и исключены из рассмотрения. Об 1« неинформативности говорило отсутствие иммуноокрашивания на тТГ в клетках эндотелия капилляров (внутренний положительный контроль), что свидетельствовало о возможном повреждении антигенных эпитопов в процессе приготовления и хранения материала. Таким образом, для оценки экспрессии трансглутаминазы на уровне белка мы располагали 20 гистологическими препаратами.

Иммуногистохимическая экспрессия тТГ выявлена у 10 из 20 больных (50%). Обнаружились две различных её локализации: (а) строма опухоли (клетки, межклеточные пространства и соединительная ткань), и (б) опухолевые клетки. Экспрессия в стромальных элементах была диффузно распространена в пределах гистологических срезов и присутствовала во всех 10 тТГ-положительных образцах. Напротив, опухолевые клетки, экспрессирующие трансглутаминазу, встречались редкими большими группами (1-2 скопления, в сумме ~ 5-10% клеток на срез), и были найдены всего у 3 больных. Остальные 10 информативных образцов с наличием тТГ-экспрессии лишь в эндотелиоцитах (внутренний контроль) были расценены как тТГ-отрицательные.

При сопоставлении этих результатов с клинико-биологическими параметрами обнаружилось, что экспрессия мРНК трансглутаминазы ассоциирована с интенсивностью апоптоза в ткани: она выявлена в 6 из 8 опухолей (75%) с высоким апоптотическим индексом и в 5 из 17 опухолей

(29%) с умеренным или низким индексом (р=0.030). Это говорит о том, чтс регуляция экспрессии тТГ на уровне мРНК соответствует уровню апоптоза Напротив, между присутствием тТГ-мРНК и белковой экспрессией апоптозного ингибитора Вс1-2 наблюдалась обратная взаимосвязь (р=0.033). что логически вполне ожидаемо. Эти ассоциации были обнаружены только для тТГ экспрессии на уровне мРНК, но не для белка. В отношении други> характеристик, таких как степень злокачественности, ТКМ-статус, содержание рецепторов к стероидным гормонам, менопауза, возраст, никаки? статистически достоверных корреляций обнаружено не было.

Заслуживает отдельного рассмотрения вопрос о несоответствии межд) данными ПЦР и результатами иммуногистохимии. Из 3 образцов с экспрессией тТГ в опухолевых клетках только 2 оказались ПЦР-позитивными а из 10 тТГ-иммуноположительных карцином ПЦР-позитивными были только 4. С другой стороны, ПЦР была способна амплифицировать тТГ специфический фрагмент для 5 из 10 иммунонегативных опухолей. Подобно! несоответствие особенно удивительно, если принять во внимание, что именш для мРНК, а не для белковой экспрессии обнаружились биологичесю значимые корреляции. Имеется несколько возможных объяснений этоп противоречия. Как и в случае с немутантным геном р53, чувствительност] иммуногистохимии может оказаться недостаточной для обнаружения 1 опухоли функционально значимого белка. Другое объяснение предполагает что тТГ-белок стабилен и сохраняется в ткани ещё продолжительное поел' распада соответствующей мРНК (принимая во внимание в основно? внеклеточную локализацию тТГ, данное объяснение представляется весьм вероятным). Кроме того, дискордантность между мРНК и белком может быт следствием общей генетической разрегулированное™, в той или иной мер присущей всем злокачественным новообразованиям и возникающей результате множественных повреждений в геноме опухолевых клеток.

Таким образом, транскрипционная активность гена тканево трансглутаминазы в опухолях молочной железы положительно коррелирует уровнем апоптоза, но обратно ассоциирована с экспрессией апоптотическог супрессора Вс1-2. Обнаруженная дискордантность между мРНК иммуногистохимической экспрессией тТГ-белка, скорее всего, объясняете замедленным распадом последнего в межклеточных пространствах ткани.

Экспрессия каспаз 3 и 7 в карциномах и неопухолевых тканях молочной железы

Экспрессия каспазы 3 при раке молочной железы

Изучение экспрессии каспаз было начато с каспазы 3, так как она является наиболее универсальной и относительно хорошо изученной апоптотической протеазой.

Используя специфические моноклональные антитела к активированной каспазе 3, экспрессию удалось выявить в 56 из 61 опухоли (92%). В том числе: в 14 опухолях - высокая, в 35 - умеренная, в 7 - низкая. Распределение активированной каспазы 3 носило, в основном, диффузный цитоплазматический характер. В пределах каждого образца наблюдалась значительная гетерогенность: встречались негативные и позитивные клетки, среди последних уровень экспрессии варьировал от + до +++. Наиболее распространённый паттерн экспрессии - слабо-умеренный (+/++) в более 75% клеток. Высокая экспрессия +++/++++ наблюдалась нечасто, присутствуя обычно в <15% клеток. Нередко сильное окрашивание локализовалось в апоптотических клетках или телах, хотя среди них было много и негативных.

Ядерное иммуноокрашивание наблюдалось редко - очень слабое, оно обнаружено лишь в 8 карциномах. Примечательно, что 7 из них были скирры низкой степени злокачественности. Если в препарате присутствовали и нормальные компоненты (дольки и протоки), экспрессия в них существенно не отличалась от основной массы опухолевых клеток. Тем не менее, рассматривая эти неопухолевые структуры отдельно, мы обнаружили ассоциацию экспрессии активированной каспазы 3 с гиперплазией ткани и процессами апокринизации, а также обратную ассоциацию с атрофическими проявлениями.

Отсутствие или слабая экспрессия активированной каспазы 3 в опухоли коррелировало с признаками низкой дифференцировки - отсутствием рецепторов к эстрогенам (р=0.009), Вс1-2-негативностью (р=0.004), и наблюдалось чаще у больных моложе 50 лет (р=0.024) и в пременопаузе (р=0.064). Относительно прочих параметров неоплазм, таких как степень злокачественности, TNM-статус, содержание рецепторов к прогестерону, никаких определённых ассоциаций с экспрессией активированной каспазы 3 не найдено.

Несмотря на то, что Вс1-2 способен подавлять лишь митохондриалыю-опосредованный апоптоз (а каспаза 3 может активироваться и без вовлечения митохондрии), ко-экспрессия этих двух противоположных по функциям молекул была весьма неожиданна, тем более, что каспаза 3 in vitro способна лизировать Bcl-2 [Cheng Е.Н. et al., 1997].

Отсутствие ассоциации экспрессии активированной каспазы 3 с апоптотическим индексом ещё более парадоксально. Принято считать, что эта

универсальная апоптотическая протеаза после процессинга и активации очень быстро приводит клетку к гибели. Тем не менее, в исследованных образцах часто попадались группы клеток с сильным иммуноокрашиванием, но без видимых признаков апоптоза.

Правда, следует отметить, что в нашей выборке группу "высокая экспрессия активированной каспазы 3" составляли, в основном, случаи с интенсивностью окрашивания "++" в >75% клеток. Клетки с очень высокой окраской (+++ / ++++) всегда были единичными (<15% в препарате), а образцов с >50% таких клеток было только 2 (оба с умеренным апоптотическим индексом).

Использование поликлональных антител, неспецифически распознающих активированную каспазу 3 вместе с её про-формой, подтвердило полученные результаты. Во всех предыдущих исследованиях, посвящённых экспрессии каспаз в тканях первичных опухолей \Virkajarvi N. ег а!., 1998; Уакка1а М., Раакко Р., Бот У., 1999; Тигипеп N. е/ а!.. 2000, и др.], использовались именно такие антитела, тогда как специфическое окрашивание на активированную каспазу 3 ранее не проводили. Все карциномы молочной железы были иммуноположительны: высокая экспрессия наблюдалась в 33 случаях, умеренная - в 26, низкая - в 2. Как и в случае использования моноклональных антител, экспрессия была в основном диффузной цитоплазматической, и зачастую очень сильное окрашивание локализовалось в апоптотических клетках/телах. Обнаруженные для активированной каспазы 3 ассоциации хоть и сохранились, но перешли в статистически недостоверные. Выявилась хорошая воспроизводимость результатов: для 48 образцов экспрессия осталась на том же уровне или, чаще, становилась чуть сильнее ввиду появления нового антигена (про-каспазы 3).

Однако, для 13 опухолей иммуноокрашивание с неспецифическими антителами было гораздо более интенсивным, что можно расценить как гиперэкспрессию про-формы каспазы 3. Подобное явление наблюдалось чаще среди опухолей без метастазов в лимфоузлы (N0, р=0.056) и Вс1-2-негативных (р-0.008).

Экспрессия каспазы 7 при раке молочной железы

Отсутствие ассоциации между экспрессией каспазы 3 и индексом апоптоза может говорить о том, что этот фермент не играет существенной роли в апоптотическом протеолизе в клетках рака молочной железы. Не исключено, что это связано либо с нарушением реализации программы апоптоза при РМЖ, или изначально ткань молочной железы отличается специфическим механизмом ПКГ, не требующим участия каспазы 3. В любом случае, мы имеем основание допустить, что другая дистальная каспаза может выполнять ключевую функцию на завершающем этапе апоптотического каскада. По данным литературы, в качестве апоптозных эффекторов, кроме

каспазы 3, могут выступать каспазы 2, 6 и 7 [AInemri E.S. et al, 1996; Thornberry N.A., Lazebnik Y, 1998; Nicholson D.W., 1999; Chang H.Y., Yang X., 2000]. По данным Cuvillier О. et al. [2001] и Kagawa S. et al. [200/], в клетках рака молочной железы MCF-7, не экспрессирующих каспазу 3 из-за мутации в гене CASP3, под действием различных апоптотических стимулов активируются каспазы 6 и 7, но не -2. Требуется отметить, что каспаза 6 отличается весьма узким спектром возможных субстратов - с твёрдой уверенностью здесь можно назвать только ламины ядерного матрикса [Lazebnik Y.A. et al, 1995]. Таким образом, наиболее подходящим кандидатом для наших экспериментов оказалась каспаза 7.

Иммуногистохимическая экспрессия каспазы 7 в ядре и/или цитоплазме опухолевых клеток обнаружена для всех 61 карцином. По локализации она ядерная и, в меньшей мере, цитоплазматическая; по характеру - диффузная, но иногда зернистая (только в цитоплазме). Экспрессия в ядре имела место в 100% образцов: сильная в 46 опухолях и умеренная в 15. Очень сильная экспрессия (++++ в >75% клеток) выявлена в 10 опухолях, 5 из которых относились к высокозлокачественным (р=0.10). Цитоплазматическое иммуноокрашивание - диффузное или зернистое - выявлено в 50 случаях (82%): сильное в 15 опухолях, умеренное в 33, слабое в 2. Иммуноокрашивания в ядре и цитоплазме клеток были часто взаимоассоциированы (р=0.08). Для подавляющего большинства образцов ядерная экспрессия доминировала, хотя почти в каждом опухолевом срезе имелись клетки, где цитоплазматической каспазы 7 было больше.

Никаких существенных ассоциаций между уровнем экспрессии и клинико-морфологическими параметрами, в том числе с индексом апоптоза, не наблюдалось. Цитоплазматическое окрашивание характерно для больных старше 50 лет (р=0.013) и в постменопаузе (р=0.082), для опухолей с гиперэкспрессией Вс1-2 (р=0.001) и активированной каспазы 3 (р=0.087).

Отношение между иммуногистохимической экспрессией изученных апоптотических молекул и индексом апоптоза (АИ) при РМЖ показано графически на рис. 4.

Чтобы определить, специфичны ли обнаруженные особенности экспрессии каспаз 3 и 7 для РМЖ, или они вообще присущи ткани молочной железы, мы провели аналогичное иммуногистохимическое исследование в контрольной группе неопухолевых (доброкачественных) тканей молочной железы от больных фиброаденоматозом.

Рис. 4. Индекс апоптоза и сверхэкспрессия апоптотических белков при РМЖ.

И Высокий А И Г~1 Умеренный АИ П Низкий АИ

48%

36%

11%

Р=0.036 Вс1-2

28%

22%

114%

56%

72%

76%

34%

21%

11%

Активированная Каспаза 7 Каспаза!

каспаза 3 в ядре клетки е цитоплазме

Высокая экспрессия супрессора клеточной гибели Вс1-2 обнаруживает обратную связь с апоптозом, тогда как сверхэкспрессия каспаз 3 и 7 не приводит к усилению апоптоза.

Экспрессия каспазы 3 в неопухолевых тканях молочной железы В среднем, 10-50% неопухолевых клеток экспрессируют каспазу 3 с интенсивностью от + до +++ в каждом из 5 препаратов. Специфические антитела к активированной форме белка дают окраску, сравнимую с антителами, распознающими обе изоформы. Это говорит о существенном количестве активированной каспазы 3, присутствующей в неопухолевой/доброкачественной ткани молочной железы. Иммуноокрашивание диффузно и обнаруживается в цитоплазме, а также, в отличие от клеток рака молочной железы, нередко и в ядре клеток.

Цитоплазматическая экспрессия, как правило, превышает ядерную. Ввиду очень низкого уровня апоптоза во всех препаратах, о какой-либо связи с процессами ПКГ говорить сложно.

Активированная каспаза 3 экспрессировалась как в клетках долек, так и в протоках. В дольках не удалось выявить её чёткой принадлежности к секреторному эпителию или миоэпителию, но прослеживалась положительная связь с гиперпластическими и апокриновыми изменениями, а также с воспалением. У обоих пациенток с грануляционным воспалением в ткани молочной железы активированная каспаза 3 экспрессировалась достаточно интенсивно. В отношении протоков следует заметить, что экспрессия была гораздо ниже, чем в дольках, уменьшаясь с возрастанием калибра протока, также отмечалась прямая ассоциация с гиперплазией. При атрофии ткани, наличии выраженного фиброза и кистозных изменений экспрессия каспазы 3 существенно снижена и в дольках, и в протоках. Следует отметить, что, анализируя экспрессию каспазы 3 в неопухолевых компонентах карцином молочной железы, мы обнаружили сходные закономерности распределения иммуноокрашивания.

Нетипичность ядерной локализации активированной каспазы 3, обнаруженная для опухолевых клеток РМЖ в отличие от неопухолевых, является, по-видимому, важной находкой. Исходя из субстратной специфичности каспазы 3, местонахождение её не только в цитоплазме, но и ядре вполне оправдано [Rathmell J.C., Thompson C.B., 1999]. По наблюдению Nakagawara A. et al. [1997], экспрессия каспазы 3 в ядрах клеток нейробластомы ассоциирована с ранней стадией и благоприятным клиническим течением заболевания, но не характерна для высокоагрессивных неоплазм. Аналогично, Satoh К. et al. [2000] показали взаимосвязь между ядерной локализацией этого белка и доброкачественным течением панкреатических опухолей. Таким образом, потеря способности каспазы 3 к транслокации в ядро является одним из признаков, приобретаемых опухолевыми клетками в процессе злокачественной трансформации.

Экспрессия каспазы 7 в неопухолевых тканях молочной железы

Каспаза 7 в неопухолевых тканях молочной железы экспрессировалась на более высоком уровне, чем каспаза 3, и в большинстве клеток интенсивность её варьировала от + до +++. Каспаза 7 также обнаруживалась в цитоплазме и в ядре, однако её ядерная экспрессия значительно превышала цито плазматическую.

Разница между дольками и протоками менее существенна, чем в случае каспазы 3, но дольковое окрашивание также преобладало. Выявлены некоторые закономерности, сходные с таковыми для каспазы 3: в частности, прямая ассоциация экспрессии с гиперплазией и воспалением, обратная ассоциация с атрофией и наличием выраженного фиброза и кистозных изменений.

Таким образом, в неопухолевых тканях молочной железы на фоне низкого уровня апоптоза изученные протеазы, в том числе активированная

каспаза 3, экспрессируются на достаточно высоком уровне. Обнаружена ассоциация экспрессии каспаз 3 и 7 с морфологическими признаками усиления пролиферации.

В целом, результаты изучения экспрессии каспаз можно трактовать с нескольких позиций.

Первое объяснение подразумевает, что функции эффекторных каспаз 3 и 7 не сводятся только к участию в программированной гибели, а распространяются и на другие клеточные процессы, в том числе противоположные по своему биологическому значению - пролиферацию и дифференцировку.

В литературе имеются данные, говорящие в пользу этого предположения и свидетельствующие об участии каспаз в позитивной регуляции митоза. Активация каспаз сопутствует пролиферации Т-лимфоцитов in vitro и сопровождается элиминацией ряда негативных регуляторов клеточного цикла (таких как ингибиторы циклин-зависимых киназ p21/Wafl, p27/Kipl и Weel), а также активацией топоизомеразы-1 и ядерного фактора репликации МСМЗ [Stroh С., Schulze-OsthoffK., 1998; Kennedy N.J, et al, 1999; Alain A. et al., 1999; Los M. et al., 2001; Suzuki A., Shiraki К., 2001], какие-либо признаки апоптоза при этом отсутствуют. Неизвестно, что лежит в основе ограниченного белкового лизиса и способствует выживанию клеток на фоне активации каспаз.

Другое объяснение предполагает, что основной функцией каспаз 3 и 7, безусловно, является апоптоз. Однако, их активация в нормальной и опухолевой тканях молочной железы может не приводить к соответствующему фенотипу благодаря наличию системы негативной регуляции ПКГ, осуществляемой путём фосфорилирования, нитрозилирования, или действия ингибиторов: например, белков типа IAP, связывающихся с уже активированными протеазами [Chang H. Y., Yang X., 2000; Richter B.W., DuckettC.S., 2000].

Судя по опубликованным данным, отсутствие корреляции между экспрессией каспаз и апоптотическим индексом не является открытием. Подобный феномен был обнаружен для карцином поджелудочной железы [Virkajarvi N. et al., 1998], желчного пузыря [Тигипгп N. et al., 2000], лёгкого [Tormanen-Napankangas U. et al, 2001], простаты [Sohn J.H. et al., 2000]. Тем не менее, в единственной работе, посвящённой РМЖ [Vakkala M., Раакко P. et al., 1999] экспрессия каспазы 3 (про-каспаза + активированная форма) была ассоциирована с апоптозом, но, в отличие от наших данных, не зависела от ER-статуса опухолей. Каспаза 7 в первичных опухолях молочной железы не исследовалась.

Наконец, диссоциация между экспрессией каспаз и интенсивностью процессов программируемой гибели в карциномах молочной железы может

являться следствием общей генетической разрегулированности, которая в той или иной мере свойственна всем злокачественным новообразованиям и возникает в результате множественных повреждений в геноме опухолевых клеток.

ВЫВОДЫ

1. Высокий апоптотический индекс сопутствует неблагоприятным клиническим характеристикам рака молочной железы - высокой степени злокачественности и отсутствию рецепторов к эстрогенам.

2. Гиперэкспрессия супрессора клеточной гибели Вс1-2 коррелирует с невысоким уровнем апоптоза, а также с некоторыми признаками высокой дифференцировки РМЖ (ЕЯ+ статусом и низкой степенью злокачественности).

3. Уровень апоптоза в опухолях молочной железы положительно коррелирует с транскрипционной активностью гена тканевой трансглутаминазы. Последняя, в свою очередь, обратно ассоциирована с экспрессией апоптотического супрессора Вс1-2.

4. РМЖ характеризуется дискордантностыо экспрессии тканевой трансглутаминазы на уровне мРНК и белка.

5. Универсальная эффекторная каспаза 3 экспрессируется и активируется как в карциномах, так и в неопухолевых тканях молочной железы; однако, уровень её экспрессии не коррелирует с интенсивностью процессов апоптоза.

6. Клетки опухолей молочной железы, в отличие от нормальных, характеризуются отсутствием ядерной экспрессии активированной каспазы 3, что может являться одной из причин недостаточности функции программируемой клеточной гибели при РМЖ.

7. Отсутствие активации каспазы 3 часто сочетается с ЕЯ-отрицательным статусом опухоли и характерно для пременопаузальной категории больных.

8. Высокая экспрессия каспазы 7 выявляется в большинстве опухолей и неопухолевых тканей молочной железы. Однако, уровень экспрессии каспазы 7 не коррелирует с интенсивностью процессов апоптоза и клинико-морфологическими характеристиками РМЖ.

9. В злокачественных опухолях молочной железы гиперэкспрессия про-апоптотических молекул (каспаз 3 и 7) нередко обнаруживается параллельно с высокой экспрессией апоптотического супрессора Вс1-2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Того А.В., Илюшин Э.С., Суспицын Е.Н., Григорьев М.Ю., Зайцева О.А., Яцук О.С., Черница О.И., Лаур О.Ю., Бугаев А.И., Трофимова С.А., Хансон К.П., Имянитов Е.Н. "Полиморфизм онкогена L-MYC у онкологически здоровых лиц пожилого возраста". // Успехи геронтол., 1998, №2, с. 98-102.

2. Того А.В., Григорьев М.Ю., Суспицин Е.Н., Зайцева О.А., Яцук О.С., Хансон К.П., Имянитов Е.Н. "Распределение аллелей онкогена L-myc у лиц с онкологической предрасположенностью и онкологической толерантностью". Клинич. геронтол., 1999, №4, с. 36-42.

3. Берштейн Л.М., Имянитов Е.Н., Суспицын Е.Н., Григорьев М.Ю., Соколов Е.П., Того А.В., Хансон К.П., Порошина Т.Е., Гамаюнова В.Б., Васильев Д.А., Ковалевский А.Ю., Волков О.Н. "Изучение полиморфизма гена CYP19 у больных раком эндометрия". Вопр. онкол., 2000, т. 46 (№3), с. 302 -305.

4. Grigoriev M.Yu., Suspitsin E.N., Togo A.V., Pozharisski K.M., Ivanova O.A., Nardacci R., Falasca L., Piacentini M., Imyanitov E.N., Hanson K.P. "Tissue transglutaminase expression in breast carcinomas". J Exp Clin Cancer Res, 2001, v. 20(2), p. 265-268.

5. Togo A.V., Suspitsin E.N., Grigoriev M.Yu., Ilyushik E.S., Karpova M.B., Hanson K.P., Imyanitov E.N. "L-myc polymorphism in cancer patients, healthy blood donors and elderly, tumor-free individuals in Russia". Int J Cancer, 2000, v. 85(6), p. 747-750.

6. Imyanitov E.N., Grigoriev M.Yu., Gorodinskaya V.M., Kuligina E.Sh., Pozharisski K.M., Togo A.V., Hanson K.P. "Partial restoration of degraded DNA from archival paraffin-embedded tissues". Biotechniques, 2001, v. 31(5), p. 10001002.

7. Berstein L.M., Imyanitov E.N., Suspitsin E.N., Grigoriev M.Yu., Sokolov E.P., Togo A.V., Hanson K.P., Poroshina Т.Е., Vasiljev D.A., Kovalevskij A.Y., Gamajunova V.B. "CYP19 gene polymorphism in endometrial cancer patients". J Cancer Res Clin Oncol, 2001, v. 127, p. 135-138.

8. Suspitsin E.N., Grigoriev M.Yu., Togo A.V., Kuligina E.S., Belogubova E.V., Pozharisski K.M., Chagunava O.L., Sokolov E.P., Theillet C., Bershtein L.M., Hanson K.P., Imyanitov E.N."Distinct prevalence of CYP 19 ДЗ (TTTA)7 allele in premenopausal versus postmenopausal breast cancer patients" Eur J Cancer (in press).

СПИСОК ТЕЗИСОВ И СТЕНДОВЫХ СООБЩЕНИЙ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ, ПРЕДСТАВЛЕННЫХ НА КОНФЕРЕНЦИЯХ, СЪЕЗДАХ И СИМПОЗИУМАХ

1. Hanson K.P., Imyanitov E.N., Grigoriev M.Yu., Suspitsin E.N., Togo A.V., Pozharisski K.M., Ivanova O.A., Nardacci R., Falasca L., Piacentini M. "Tissue transglutaminase expression in breast carcinomas" // 8th Euroconference on Apoptosis, 2000, October 14-17, Davos, Switzerland. Poster 78.

2. Imyanitov E.N., Grigoriev M.Yu., Suspitsin E.N., Togo A.V., Pozharisski K.M., Ivanova O.A., Nardacci R., Falasca L., Piacentini M., Hanson K.P. "Expression of apoptotic molecules in breast carcinomas" // 8th Euroconference on Apoptosis, 2000, October 14-17, Davos, Switzerland. Poster 79.

3. Imyanitov E.N., Grigoriev M.Yu., Pozharisski K.M., Ivanova O.A., Piacentini M., Zhivotovski B.D., Hanson K.P. "Expression of apoptotic genes in human breast carcinomas" // 9th Euroconference on Apoptosis, 2001, October 13-16, Vienna, Austria. Poster 31.

4. Suspitsin E.N., Grigoriev M.Yu., Togo A.V., Sokolov E.P., Pozharisski K.M., Chagunava O.L., Berstein L.M., Hanson K.P., Imyanitov E.N. "CYP19 polymorphism is associated with the breast cancer risk" // Российско-французский семинар "Молекулярные аспекты канцерогенеза" 15-16 июня 1999 г., Москва.

5. Togo А.V., Suspitsin E.N., Grigoriev M.Yu., Ilyushik E.S., Karpova M.B., Hanson K.P., Imyanitov E.N. "Study of L-myc polymorphism in elderly tumor-free individuals, healthy donors, and cancer patients" // 10th European Cancer Conference (ECCO-IO), 1999, September 12-16, Vienna, Austria. Abstract 741. Citation: Eur J Cancer 1999, v. 35, suppl. 4, p. 192.

6. Imyanitov E.N., Suspitsin E.N., Grigoriev M.Yu., Togo A.V., Pozharisski K.M., Chagunava O.L., Theillet C., Berstein L.M., Hanson K.P. "Distinct role of the CYP19 del3(TTTA)7 allele in the susceptibility to premenopausal and postmenopausal breast cancer" // 11th European Cancer Conference (ECCO-11), 2001, October 23, Lisbon, Portugal. Citation: Eur J Cancer 2001, v.37, suppl. 6, S176, 643.

7. Imyanitov E.N., Grigoriev M.Yu., Gorodinskaya V.M., Kuligina E.S., Pozharisski K.M., Togo A.V., Hanson K.P. "Partial restoration of degraded DNA from archival paraffin embedded tissues" // 6th International Symposium on Predictive Oncology and Intervention Strategies, 2002, February 11, Paris, France. Abstract 21.

8. Hanson K.P., Suspitsin E.N., Grigoriev M.Yu., Togo A.V., Kuligina E.S., Belogubova E.V., Pozharisski K.M., Chagunava O.L., Sokolov E.P., Theillet C., Bershtein L.M., Imyanitov E.N."Distinct prevalence of CYP19 A3 (TTTA)7 allele in premenopausal versus postmenopausal breast cancer patients" // 6th International Symposium on Predictive Oncology and Intervention Strategies, 2002, February 11, Paris, France. Abstract 283.

ifrTfr * it Tit

Выражаю сердечную признательность моим научным руководителям: чл.-корр. РАМН, проф. К.П. Хансону и д.м.н. Е.Н. Имянитову за постоянное внимание и ценные рекомендации.

Приношу глубокую благодарность чл.-корр. РАМН, проф. В.Ф. Семиглазову и сотрудникам 1 хирургического отделения НИИ онкологии: засл. врачу России к.м.н. И.К. Селезнёву, к.м.н. Н.Ш. Мигмановой, к.м.н. Р.Т. Поповой, к.м.н. А.А. Орлову, к.м.н. О.А. Ивановой, к.м.н. Н.Ю. Бараш, к.м.н. Э.Э. Топузову, к.м.н. В.Г. Иванову, P.M. Палтуеву, С.Г. Петровскому и О.А. Архипченко за помощь в сборе клинического материала, а также руководителю лаборатории эндокринологии, д.м.н. проф. JI.M. Берштейну за предоставление информации о статусе гормональных рецепторов.

Искренне признателен д.м.н. проф. К.М. Пожарисскому, к.м.н. Е.А. Туркевич, к.м.н. Е.Е. Леенман, Н.А. Максимовой и всем сотрудникам патологоанатомической лаборатории за активное содействие в наборе архивного и биопсийного патоморфологического материала и гистологическую оценку результатов иммуногистохимии.

Выражаю великую благодарность проф. B.D. Zhivotovsky (Karolinska Institute, г. Стокгольм) и проф. М. Piacentini (Tor Vergata University, г. Рим) за их вклад в планирование работы, её осуществление и плодотворное обсуждение полученных результатов.

От всей души благодарю своих коллег и друзей к.б.н. А.В. Того, к.б.н. Е.Ш. Кулигину, к.б.н. Е.В. Белогубову, Е.Н. Суспицына, К.Г. Буслова, В.М. Городинскую, М.Б. Карпову, Ю.Г. Ишуткину, Ю.М. Улыбину, Л.В. Рикунову, О. С. Яцук и О.А. Зайцеву за помощь в выполнении работы.

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВ Максим Юрьевич

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ПРОГРАММИРУЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ В ОПУХОЛЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.00.14 —онкология 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЛР № 021251 от 23.10.97. Подписано в печать 22.05.2002. Формат 60 х 90/16. Бумага тип.

_Печать ризограф. Заказ 410. Тираж 100 экз._

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Издательство СПХФА — член Издательско-полиграфической ассоциации вузов Санкт-Петербурга 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14