Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Клинико-патогенетическая роль структурно-функциональной организации плазматических мембран при псориазе

На правах рукописи

КЛЕМЕНОВА Ирина Александровна

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ РОЛЬ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПРИ ПСОРИАЗЕ

14.00.11 - кожные и венерические болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

11111111111

003 165746

Москва - 2008

Работа выполнена в научно-клиническом и лабораторно-экспериментальном отделах Федерального государственного учреждения Нижегородский научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный консультант

доктор медицинских наук, профессор Никулин Николай Константинович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Маркушева Людмила Игоревна доктор медицинских наук, профессор Матушевская Елена Владиславовна доктор медицинских наук, профессор Халдин Алексей Анатольевич

Ведущая организация

ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов, г Москва

Защита состоится «_»_2008 г в_часов на заседании диссертационного совета Д 208 115 01 при ФГУ «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» 107076 г Москва, ул Короленко, д 3, корп 4

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий»

Автореферат разослан «_»_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Иванова Наталья Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

По данным крупномасштабных эпидемиологических исследований псориаз является наиболее распространенным хроническим дерматозом В различных странах заболевание поражает 1-3% населения (Павлова О В, 2005 г, Шульмак А Я и соавт 2007 г ) Причем в мировой популяции отмечается не только рост заболеваемости псориазом, но и увеличение частоты тяжелых и трудно поддающихся терапии случаев, а также инвалидизирующих форм заболевания, хотя достоверные причины этого явления остаются неизвестными (Перламутров Ю Н, Ольховская К Б , 2007 г Altobelli Е 2007 г)

Псориаз редко приводит к гибели больных, однако значительно ухудшает качество жизни пациентов, их социальную, а нередко и трудовую адаптацию (Сидоров П.И и соавт, 1999 г, Гребенников В.А 2003 г, Керимов, С Г и соавт 2003 г ) Существенными являются финансовые затраты на лечение, являющееся обычно достаточно продолжительным (Коляденко Е.В 2003 г )

Несмотря на продолжающееся интенсивное изучение этиопатогенеза псориаза, в механизмах развития этого заболевания сохраняется много неясного Этиология псориаза в настоящее время остается неизвестной В многочисленных публикациях дерматоз относят к мультифахториальным заболеваниям (Мордовцев В Н и соавт 2002 г, Шульман А .Я и соавт 2007 г) Многофакторность развития псориаза подразумевает реализацию генетической программы под воздействием многочисленных экзо- и эндогенных причин

К настоящему времени описано более 1000 маркеров, подтверждающих генетическую предрасположенность к заболеванию Корреляционный анализ выявил у больных псориазом повышенную частоту антигенов HLA-B13, В17, DR-7, Cw6, В27 (Мордовцев В Н и соавт 2002 г, Павлова О В , 2005 г, Шульман А Я. и соавт 2007 г ) Причем выделяются два типа псориаза I тип, возникающий в молодом возрасте и ассоциированный с генетической предрасполо-

женностью и более тяжелым течением П тип заболевания проявляется у лиц старше 40 лет с отсутствием семейного анамнеза и характеризуется отсутствием связи с наследственными факторами, более благоприятным течением (Ог^ СЕМ 1996 г)

В основе клинических проявлений псориаза находится повышенная репродукция клеток эпидермиса с нарушением процесса дифференцировки, приводящая к формированию дефектного рогового слоя на фоне воспалительных явлений в дерме (Цветкова Г М 1981 г, Волнухин В А и соавт 2007 г)

Несмотря на определенные успехи, достигнутые в лечении псориаза за последнее десятилетие, возможности терапевтических схем все еще остаются ограниченными Во многом такая ситуация обусловлена отсутствием полной картины патогенеза псориаза, сведений о первичных наследуемых биологических дефектах, приводящих к возникновению и хронизации гиперпролиферации кератиноцитов

Особенно интенсивно изучаются иммуннопатологаческое процессы у больных псориазом (Катунина О Р 2005 г . Хайрутдинов В Р 2007 г ) В то же время функциональные возможности иммунокомпетентных клеток определяются состоянием их мембран (Извекова В А 1991 г) Однако мембраны иммунокомпетентных клеток при псориазе ранее не исследованы Имеющиеся в литературе сведения о состоянии плазматических мембран у больных псориазом базируются лишь на изучении эритроцитарных мембран, немногочисленны, противоречивы (Лашманова А П. и соавт 1986г,) Особую актуальность исследованию мембран придает их значение в функционировании всех клеток, систем и организма в целом Плазматические мембраны обеспечивают важнейшее условие существования биологических объектов - автономность и тесную связь с окружающей средой, выполняют барьерную, механическую, энергетическую, коммуникативную и многие другие функции (Владимиров Ю А 1987 г) Роль клеточных мембран в жизненно важных процессах связана также с их совокупной площадью, достигающей в организме человека десятаов тысяч квадратных метров (Геннис Р 1997 г )

Именно поэтому исследование ультраструктурных и функциональных особенностей мембран различных клеток у больных псориазом представляется весьма актуальным Невыясненными остаются конституциональные и приобретенные особенности структуры плазматических мембран, не определены признаки патологии плазматических мембран, характерные как для псориаза в целом, так и для различных стадий данного заболевания, его типов и клинических форм

Недостаточное внимание уделяется поиску системных особенностей плазматической мембраны у больных псориазом Совершенно недостаточно исследованы интегральные характеристики плазматических мембран различных клеток при псориазе Не определено диагностическое и прогностическое значение структурно-функционального состояния плазматических мембран клеток крови и кожи, что затрудняет возможности коррекции предполагаемых мембранопатологических изменений

Уникальную возможность изучения клеток предоставляет новый метод исследования - атомно-силовая микроскопия Данный метод позволяет изучать ультраструктуру плазматической мембраны без предварительной обработки клетки Ранее клетки кожи с помощью атомно-силовой микроскопии не изучались

Все перечисленное определяет безусловную актуальность, перспективность и практическую значимость научного поиска особенностей структурно-функционального состояния плазматических мембран при псориазе, как дополнительных эндогенных наследуемых факторов патогенеза данного заболевания

Исходя из научно-практической значимости указанной проблемы, в настоящей работе поставлена цель работы

Цель исследования на основании определения клинико-патогенетической роли структурно-функциональной организации плазматических мембран клеток крови (эритроцитов, лимфоцитов) и кожи (фибробластов, кератиноцитов) разработать новое перспективное направление терапии больных псориазом.

Задачи исследования

1 Изучить структурное состояние липидного бислоя плазматических мембран эритроцитов, лимфоцитов периферической крови, а также культивируемых дермальных фибробластов больных псориазом путем определения фракций фосфолипидов, неэстерифицированных жирных кислот, глицеролипидов, холестерина, определить динамику показателей в зависимости от типа, стадии и клинической формы заболевания

2 Определить функциональное состояние плазматических мембран лимфоцитов периферической крови у больных псориазом с помощью исследования мембранной экспрессии маркеров дифференцировки, активации, адгезии и апоптоза в зависимости от типа, стадии и клинической формы псориаза

3 Определить возможности использования атомно-силовой микроскопии для исследования нативных культивируемых клеток кожи

4 Исследовать особенности ультраструктуры плазматических мембран дермальных фибробластов, а также кератиноцитов больных псориазом с помощью атомно-силовой микроскопии

5 Путем использования метода многомерной математической статистики -факторного анализа определить, какие из изученных показателей вносят наибольший вклад в формирование механизмов развития патологического процесса при псориазе

6 Провести анализ изменений структурно-функциональных особенностей плазматических мембран различных клеток у больных псориазом, происходящих под влиянием обычной терапии (с использованием дезинтокси-кационных средств, препаратов кальция и витаминов), а также применения метотрексата

7 Разработать пути медикаментозной коррекции выявленных нарушений плазматических мембран у больных псориазом

Научная новизна

Научная новизна и теоретическая ценность выполненного исследования заключается в обосновании и фактическом подтверждении концепции наличия системных наследственно предопределенных особенностей строения плазматических мембран при псориазе, которые являются одним из патогенетических факторов развития заболевания Комплексное исследование липидного спектра мембран эритроцитов и лимфоцитов позволило установить особенности структурной организации плазматических мембран, характерные как для псориаза в целом, так и для отдельных типов, стадий и форм заболевания Выявлен принципиально важный факт системности мембранных нарушений, что позволяет экстраполировать полученные данные на другие типы мембранных структур организма

Впервые у больных псориазом исследовано структурно-функциональное состояние плазматических мембран лимфоцитов, выявившее как нарушение организации липидного бислоя, так и патологические изменения мембранной экспрессии маркеров адгезии, активации и апоптоза

Доказана возможность применения атомно-силовой микроскопии в исследовании нативных культивируемых клеток кожи Впервые с помощью атомно-силовой микроскопии получены изображения плазматических мембран культивируемых клеток кожи (фибробластов и кератиноцитов), показаны характерные особенности ультраструктуры поверхности мембран в норме и при псориазе

Впервые в изучении патогенеза псориаза использован метод многомерной математической статистики - факторный анализ, с помощью которого определены шесть факторов, определяющих развитие псориаза. Показано, что наибольшей вклад в формирование механизмов развития патологического процесса при псориазе вносят изменения, затрагивающие фосфолипидный состав

плазматических мембран, а также мембранную экспрессию маркеров адгезии, активации и апоптоза

Результаты исследования служат теоретическим обоснованием включения в терапию больных псориазом мембранопротекторных терапевтических средств

Практическая значимость

Проведенное комплексное изучение структуры и функции плазматических мембран различных клеток при псориазе с выделением мембранопатоло-гических признаков, характерных для различных типов, стадий и клинических форм псориаза, создало предпосылки использования результатов в клинической практике

Разработана методика изучения нативных культивируемых клеток кожи с помощью атомно-силовой микроскопии Определены возможности и перспективы использования атомно-силовой микроскопии в исследованиях плазматических мембран клеток кожи

Разработан метод прогнозирования тяжести течения псориаза путем определения мембранной экспрессии на лимфоцитах молекул адгезии

Результаты проведенного исследования дают возможность разработки новых лекарственных средств лечения псориаза путем коррекции липидной составляющей плазматических мембран

Основные положения, выносимые на защиту

1 Механизмы формирования псориаза включают конституционально обусловленное звено на уровне плазматической мембраны клеток, маркерами которого являются нарушения молекулярного состава липидного бислоя эритроцитов, лимфоцитов периферической крови, дермальных фибробла-стов, а также повышенная мембранная экспрессия маркеров адгезии, активации и апоптоза на лимфоцитах крови и дермальных фибробяастах

2 Различные клинические типы, стадии и клинические формы псориатиче-ского процесса имеют общие и специфические особенности вовлечения мембранных структур эритроцитов и лимфоцитов периферической крови в патогенез заболевания

3 Новый метод исследования клеток - атомно-силовая микроскопия, позволяет исследовать культивируемое клетки кожи в нативном состоянии и определить особенности поверхности плазматической мембраны на молекулярном уровне

4 Клетки кожи (фибробласты и кератиноциты) при псориазе имеют характерные особенности ультраструктуры поверхности плазматической мембраны.

5 Традиционная терапия больных псориазом (с применением дезинтокси-кационных средств, препаратов кальция и витаминов) не приводит к нормализации структуры плазматических мембран при псориазе, а использование метотрексата при высокой клинической эффективности со стороны кожного процесса усугубляет мембранопатологические изменения в организме в целом.

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации представлены и обсуждены на

• Конференции молодых ученых Поволжья и Северного Кавказа Н Новгород, 2000 г.,

• Заседаниях Нижегородского научного общества дерматовенерологов 2000 г и 2007 г,

• VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001).

• Первом Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2003),

• Всероссийской научно-практической конференции «Современные направления развития диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов» (Нижний Новгород, 2004),

» 15-th Congress of the European Academy of Dermatology and Venereology "From Hippocrates to Modern Dermatology" Rhodes-Greece 2006,

• Заседаниях проблемной комиссии ФГУ Нижегородский НИКВИ Росздра-ва 2001 и 2006 гг,

• IX Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2005),

« X Всероссийской конференции дерматовенерологов «Организация оказания дерматовенерологической помощи в современных условиях», (Москва, 2006),

« Втором Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007)

Внедрение результатов исследования в практическое здравоохранение

По материалам диссертации опубликовано 43 печатные работы, в том числе 10 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, получено 3 патента на изобретение, издано 1 пособие для врачей и 1 усовершенствованная медицинская технология

Результаты исследования используются в процессе преподавания на курсах тематического усовершенствования врачей по дерматологии (г Нижний Новгород), при обучении врачей дерматовенерологов, клинических ординаторов и аспирантов, студентов на кафедре кожных и венерических болезней Нижегородской государственной медицинской академии

Результаты исследований внедрены в работу клиник ГУЗ Астраханский областной клинический кожно-венерологический диспансер, ГУЗ Владимирский областной кожно-венерологический диспансер, ГУЗ Воронежский областной клинический кожно-венерологический диспансер, Мордовский республиканский кожно-венерологический диспансер, ФГУ "Нижегородский научно-исследовательский кожно-венерологический институт Росздрава", ГУЗ Нижегородский областной кожно-венерологический диспансер, ГУЗ Самарский об-

ластной кожно-венерологический диспансер, Сергачский кожно-венерологический кабинет Нижегородской области, ГУЗ Кабардино-балкарский кожно-венерологический диспансер, МСЧ завода «Красная Этна», Нижний Новгород

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 6 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы Материал изложен на 276 страницах компьютерного текста, содержит 75 таблиц, 21 рисунок Список литературы включает 458 источников, в том числе 280 работ отечественных и 178 работ иностранных авторов

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования

Для решения поставленных в настоящем исследовании задач за период с 1998 года по 2005 год проведены клинические наблюдения и специальные биохимические, иммунологические и физические исследования Всего выполнено 2895 различных анализов

Всего под наблюдением находились 334 больных (222 мужчины и 112 женщин) в возрасте от 16 до 64 лет Средний возраст пациентов составил 40,2±1,65 лет У 68,9% больных псориатический процесс находился в прогрессирующей стадии заболевания, у 31,1% - в стационарной стадии Псориаз первого типа имел место у 68% пациентов, псориаз второго типа отмечен у 32% больных

Проведено исследование фосфолипидного состава мембран эритроцитов 103 больных псориазом Фосфолипидный состав мембран лимфоцитов изучен у 67 больных псориазом В качестве контроля исследовали аналогичные показатели 15 здоровых лиц, сходных по возрастному и половому составу Для определения фосфолипидного состава мембран клеток крови использовались отмытые гемолизированные эритроциты, а также лимфоциты, полученные в градиенте плотности фиколл-верографин, в количестве 1х10б клеток в мл среды Хен-кса Выделение мембран и экстракция липидов проводились по методу Крылова с соавт

Содержание первичных продуктов ПОЛ в плазме крови определяли по методу В Б Гаврилова, 1983 г, в мембранах клеток - по методу В А Ореховича, 1977 г Определение содержания вторичных продуктов ПОЛ в плазме крови проводили по методу Гаврилова В Б , 1987г, а в клеточных мембранах - по методу Гончаренко М С , 1985г

Содержание основных популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови определяли с помощью моноклональных антител Для оценки клеточного звена иммунитета определяли количество лейкоцитов и лимфоцитов в % и 1 мкл крови, Т-лимфоцитов (ХЮЗ+), их иммунорегуляторных субпопуляций Т-хелперов/индукторов (С04+) и Т-супрессоров/цитотоксических (С08+) и их соотношение, которое показывало величину иммуннорегуляторно-го индекса (ИРИ=СБ4+/СВ8+) Гуморальное звено иммунитета оценивали по относительному и абсолютному содержанию В-лимфоцитов (СБ22+)

Мембранную экспрессию маркеров адгезии, активации и апоптоза на поверхности лимфоцитов периферической крови и дермальных фибробластов определяли иммунофенотипированием с помощью моноклональных антител к СО-антигенам лимфоцитов (СБ 11Ь, 25, 50, 54, 95), согласно инструкции производителя

Проведено исследование цитокинового статуса 75 больных псориазом, включавшее определение концентрации в сыворотке крови ИФ-а, ИФ-у, ФИО-

а, ИЛ-Iß, ИЛ-8 с использованием наборов для иммуноферментного анализа Исследовано апоптогенное действие сыворотки крови больных псориазом на культуру клеток В качестве тест-системы для изучения апоптоз-модулирующих воздействий сывороточных факторов были использованы ней-трофилы крови здоровых доноров. Проведено изучение апоптогенного влияния на культуру нейтрофилов образцов сыворотки крови 16 больных псориазом

Экспериментальная часть работы по культивированию клеток кожи осуществлена в лаборатории культивирования тканей ФГУ Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи Фибробласты культивировали с использованием среды Игла в модификации Дульбекко Для исследования использовали культуру фибробластов 4-5 пассажей, сформировавшую конфлюэнтный монослой, через 24 часа после пассажа

Культуры кератиноцитов получали из биоптата кожи Полученная суспензия кератиноцитов культивировалась с использованием среды DMEM F12 ("Sigma") Для исследования использовали культуры, сформировавшие конфлюэнтный монослой

Впервые для изучения ультраструктуры поверхности мембран фибробластов использована атомно-силовая микроскопия, позволяющая исследовать клетки без предварительной обработки реагентами Для изучения фибробластов и кератиноцитов кожи использован атомно-силовой микроскоп "Solver-P4" (NT-MDT) - исследование клеток кожи проводили в Институте физики микроструктур РАН (г Нижний Новгород) Атомно-силовая микроскопия выполнена совместно с научным сотрудником института Востоковым Н В

Для изучения фибробластов кожи также использован атомно-силовой микроскоп Solver Bio (NT-MDT), базирующийся на инвертированном оптическом микроскопе (Olympus IX-70) - исследование проводили в Центре сканирующей зондовой микроскопии при Нижегородском государственном университете Атомно-силовая микроскопия выполнена совместно с научным сотрудником Центра Гущиной Ю Ю

С целью объективизации проводили математическую обработку результатов исследования поверхности мембран С помощью специальной программы статистической обработки изображений, полученных методом атомно-силовой микроскопии, оценивали максимальные величины микровыростов (Rmax, nm), перепада высот (Rmean, nm)

Статистические методы анализа

Исходные данные накапливались и подвергались статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Excel, Statistica 6 0 for Windows, SPSS Проводилась оценка значимости различий средних значений показателей в независимых выборках с помощью t-критерия Стьюдента (для количественных признаков с нормальным распределением), параметрический корреляционный анализ Пирсона (коэффициент корреляции - г) и непараметрический корреляционный анализ Спирмена (коэффициент корреляции - р) для оценки направления, силы и значимости корреляционной связи между различными клинико-лабораторными признаками Направление корреляционной связи оценивали по знаку коэффициента корреляции Спирмена (+) — прямая (положительная) и (-) - обратная (отрицательная) Силу корреляционной связи определяли по значению коэффициента корреляции (rs) ниже 0,3 зависимость считали слабой, от 0,3 до 0,7 - средней и от 0,7 до 1,0 - сильной Для сравнений был установлен 5%-ный уровень значимости, то есть достоверными считали результат статистических исследований при вероятности ошибки р<0,05, что соответствует критериям, принятым в медико-биологических исследованиях Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде М±т, где M - средняя арифметическая, ш - стандартная ошибка средней, качественных показателей в виде Р±тр%, где Р - процентная доля, шр - стандартная ошибка доли.

Факторный анализ - метод многомерной математической статистики был выполнен с помощью пакета программ SPSS

Результаты исследования Особенности структурной организации плазматических мембран различных клеток у больных псориазом

С целью детализации структуры липидного бислоя плазматических мембран различных клеток у больных псориазом исследован липидный спектр мембран эритроцитов, лимфоцитов и плазмы крови В мембранах эритроцитов больных псориазом были выделены пять фракций фосфолипидов (ЛФХ, СМ, ФС. ФХ, ФЭА) Результаты представлены в виде Р±шр%

Проведенное исследование показало наличие существенных нарушений структуры фосфолипидного компонента мембран эритроцитов больных псориазом Особенно резко выраженными при псориазе были изменения уровня ЛФХ - фосфолипида, являющегося вторичным мембранным месенджером У больных псориазом выявлено повышение содержания ЛФХ в мембранах эритроцитов более чем на 50%, что является признаком мембранодеструктивных процессов

Таблица 1

Содержание фосфолипидов в мембранах эритроцитов

Псориаз; п=103 Контроль, п=15

ЛФХ 7,4±0,33, р<0,01 4,8±0,7

см 22,2±0,54 22,2±1,3

ФС 2,6±0,4 2,5±0,6

ФХ 33,5±0,4, р<0,05 31,5±1,3

ФЭА 35,8±0,9; р<0,05 38,8±1,8

р - достоверность различия с группой контроля

В эритроцитарных мембранах больных псориазом также обнаружено достоверное увеличение фракции ФХ, являющегося одним из основных фосфолипидов, формирующих липидный бислой эритроцитарных мембран

Интегральным показателем, характеризующим текучесть липидной составляющей плазматической мембраны, является коэффициент К (коэффициент, равный отношению суммы ЛФХ, СМ и ФХ к сумме ФС и ФЭА). Было обнаружено, что в группе здоровых лиц этот коэффициент равен 1,4; в то время как у больных псориазом - 1,6. Коэффициент СМ/ФХ характеризует липидную жидкостность мембран. У больных псориазом он был ниже показателей контрольной группы (соответственно 0,6 против 0,7). Интегральный показатель проницаемости мембран - соотношение ФХ2/СМ-ЛФХ был на 27% снижен по сравнению с контрольным уровнем. Известно, что нарушение соотношений мембранных липидов может быть предпосылкой к повышению содержания ДНК и созданию условий для гиперпролиферации клеток. Поскольку состав мембран эритроцитов отражает закономерности изменения плазматических мембран других клеток организма, обнаруженное нарушение состава мембран у больных псориазом, по-видимому может служить предпосылкой гиперпролиферации кератиноцитов.

Выявлена высокая теснота прямой связи между уровнем ЛФХ и величиной индекса РАБ1, коэффициент корреляции 0,71 (р< 0,001). Корреляция между уровнем ФЭА и величиной индекса РАв! была обратной (г= -0,50, р<0,001).

81 Тип I Ш Тип II Ш Контроль

Рисунок 1. Содержание фосфолипидов в мембранах эритроцитов в зависимости от типа псориаза

У больных псориазом первого типа содержание ЛФХ значительно превышало как показатели группы контроля, так и уровень ЛФХ в эритроцитарных мембранах у больных псориазом второго типа, причем это различие достигало 60% Также достоверным было различие в содержании СМ и ФЭА в зависимости от типа псориаза Известно, что СМ находится преимущественно в поверхностном слое плазматической мембраны, а ФЭА - во внутреннем, следовательно, у больных псориазом первого типа эритроцитарные мембраны претерпевают изменения на всем протяжении лшщдного бислоя Таким образом, у больных псориазом первого типа мембранодеструктивные процессы достигают максимальной выраженности.

В прогрессирующей стадии заболевания содержание мембранотоксичной фракции ЛФХ в эритроцитарных мембранах (7,29±0,47) было достоверно выше аналогичного показателя, характерного для стационарной стадии псориаза У больных экссудативным псориазом в сравнении с больными обычным псориазом не было достоверных различий в фосфолипидном составе мембран эритроцитов

Таблица 2

Содержание нейтральных липидов в мембранах эритроцитов

Псориаз, п=80 Контроль, п=15

нэжк 9,0±0,7 11,3±2,7

ГЛ 57,1±2,4, р < 0,05 4б,9±5,7

ХС 27,8±1,4,р< 0,001 41,7±5,9

р - достоверность различия с группой контроля

Одновременно с исследованием фосфолипидов в мембранах проводили изучение нейтральных липидов Так, содержание ГЛ было выше нормальных значений на 21% При этом наблюдалось выраженное снижение уровня ХС -липида, определяющего жесткость плазматической мембраны и выполняющего роль регулятора, обеспечивающего правильную упаковку липидной части мембраны Причем, у больных псориазом первого типа снижение уровня ХС было

наиболее выраженным (28,2±1,8 против 34,5±3,4 у больных вторым типом псориаза, р<0,05) Уровень первичных продуктов ПОЛ по содержанию ДК в эрит-роцитарных мембранах составил 7,52±0,39 нмоль/мл эр, а количество МДА 7,90±0,56 нмоль/мл эр

Липидный состав мембран иммунокомпетентных клеток в настоящее время рассматривается в качестве основного матричного субстрата протекания большинства иммунопатологических реакций Для исследования структуры липидного бислоя плазматических мембран лимфоцитов изучен их фосфоли-пидный и липидный состав Определены 4 фракции фосфолипидов мембран лимфоцитов, а именно, ЛФХ, СМ, ФХ и ФЭА

В мембранах лимфоцитов содержание ЛФХ было на четверть ниже уровня контроля (10,3±0,5 против 13,3±1,1 в группе контроля, р<0,01) Снижение содержания ЛФХ, по-видимому, может негативно отразиться на действии ряда мембраноассоциированных ферментов, модуляторами, активности которых он является. Интегральный показатель проницаемости плазматической мембраны коэффициент ФХ2/СМ ЛФХ у больных псориазом на треть превысил показатель контрольной группы (6,9 против 5,2) Фосфолипидный состав плазматических мембран лимфоцитов больных псориазом не имел выраженной зависимости от клинической формы заболевания При псориазе было выявлено достоверное снижение фракции ГЛ в мембранах лимфоцитов (9,81±1,1 против 12,6±1,7 в контрольной группе) У больных псориазом в мембранах лимфоцитов уровень ДК составил 160% от уровня контроля, а содержание МДА 180% показателя контрольной группы

Первый тип псориаза характеризовался более интенсивным снижением уровня ЛФХ в мембранах лимфоцитов по сравнению со вторым типом (соответственно 10,39±0,52 и 11,56±1,56), а также достоверным различием в уровнях НЭЖКиГЛ

Таким образом, при псориазе обнаружены нарушения структурной организации мембран лимфоцитов, что предположительно может неблагоприятно отразиться на функционировании клеток Выявленные различия с характером

нарушения эритроцитарных мембран вполне закономерны, так как эритроциты, в отличие от лимфоцитов, имеющих собственную систему микросомального синтеза фосфолипидов, в большей степени отражают катаболические процессы, связанные с деградацией липидов

У больных псориазом исследовано состояние липидного обмена в сыворотке крови, при этом были выявлены существенные изменения липидного состава Количество ФЭА сыворотки у больных псориазом превышало уровень контроля в 4 раза Можно предположить, что это связано с деградацией плазматических мембран клеток и выходу из них ФЭА У больных псориазом первого типа содержание ФХ, составляющего основную массу фосфолипидов сыворотки, было максимально сниженным (54,84±1,42) и достоверно отличалось от уровня ФХ при втором типе псориаза (58,17±1,07, р<0,05)

Проводили экстракцию фосфолипидов из цитоплазматической мембраны культивируемых дермальных фибробластов Верифицировано 5 фракций фосфолипидов в мембранах фибробластов нормальной и патологически измененной кожи (ЛФХ, СМ, ФХ, ФС, ФЭА) Отмечено уменьшение содержания ЛФХ (11,6±2,1 в фибробластах из псориатического очага и 17,2±1,2 в контрольных штаммах), ФС (10,6±0,8 против 19,7±1,7 в контроле, р<0,05), а также повышение ФХ (20,7±1,2 при 13,1±1,0 в контроле, р<0,05) Таким образом, изменения липидного состава плазматических мембран фибробластов кожи затрагивают как фосфолипиды, расположенные на внутренней, так и на наружной части липидного бислоя

Использование атомно-силовой микроскопии для исследования плазматических мембран клеток кожи

Благодаря современным технологиям, появилась возможность изучения биологических объектов с разрешением на уровне молекулярного, а также исследования отдельных структур живых клеток Ранее клетки кожи путем атом-но-силовой микроскопии не изучались

С помощью атомно-силового микроскопа "8о1уег-Р4" (ЬТТ-МОТ) проводили исследование поверхности фибробластов и кератиноцитов больных псориазом

и здоровых доноров. При изучении объектов с помощью АСМ возникает необходимость равномерного размещения объектов на поверхности. Для этого были выбраны монослойные культуры клеток, представляющие идеальную модель для исследования микрорельефа клеточных мембран. Атомно-силовая микроскопия фибробластов позволила получить двухмерное и трехмерное изображение плазматической мембраны клеток. На трехмерном изображении поверхности плазматической мембраны четко выявлялись глобулы, предположительно, являющиеся частью мембранных интергральных и полуинтегральных белков, а также фрагментов гликокаликса. Также отчетливо контурировались мембранные выросты (рисунок 2).

л-ли-аа«:- -gSfj-'H"-'

а)

б)

Рисунок 2. Поверхность плазматической мембраны фибробласта больного псориазом (а) и здорового донора (б).

Поверхность плазматической мембраны фибробластов, полученных из био-птатов кожи больных псориазом (рисунок 2 а), имела существенные различия с поверхностью плазматической мембраны фибробластов здоровых доноров (рисунок 2 б). В первом случае микровыросты мембраны были более выражены. Плазматическая мембрана контрольных штаммов фибробластов отличалась более ровным, упорядоченным рельефом.

При статистической обработке выявлены достоверные различия характеристик поверхности клеток, полученных из псориатического очага и биоптатов нормальной кожи. Так, микровыросты цитоплазматической мембраны фибробластов были максимальными в клетках, полученных из псориатических очагов

(405,2±65,2 нм) по сравнению со стандартными культурами фибробластов (137,2±35,6 нм), р<0,05. Перепад высот рельефа мембраны фибробластов из псориатических очагов был более выражен в клетках кожи больных псориазом по сравнению со стандартными штаммами (186,6±32,8 нм и 69,3±18,2 нм соответственно, р<0,05). Также достоверно отличался показатель шероховатости поверхности. Шероховатость поверхности плазматической мембраны фибробластов, полученных из псориатических очагов, составила 47,1±11,3 нм. Тот же показатель, характеризующий поверхность фибробластов здоровых доноров, был в среднем 11,3±2,7нм, р<0,05.

Исследование фибробластов на атомно-силовом микроскопе Solver Bio (NT-MDT) позволило выявить следующие особенности: на поверхности фибробластов здоровых доноров хорошо просматривались фибриллярные белки, прочно фиксированные к наружной мембране. На поверхности фибробластов полученных из псориатических очагов наблюдалось нарушение белкового каркаса (рисунок 3 а, б).

При использовании режима Z-modulation, позволяющего определять фазовый состав поверхности, на мембране псориатических клеток определялись более твердые глобулы. Подобного контраста не наблюдалось при исследовании препаратов, полученных от здоровых доноров.

а б

Рисунок 3. Нативный фибробласт кожи человека, полученный от здорового донора (а) и из псориэтического очага (б).

С помощью атомно-силовой микроскопии были получены двухмерные и трехмерные изображения плазматической мембраны кератиноцитов. При статистической обработке выявлены достоверные различия характеристик поверхности плазматической мембраны кератиноцитов, полученных из псориатиче-ского очага и из биоптатов кожи здоровых доноров. Так, микровыросты цито-плазматической мембраны кератиноцитов были максимальными в клетках, полученных из псориатических очагов по сравнению с контролем (соответственно 342,5±4,5нм и 63Д±7,5 нм р<0,05).

а) б)

Рисунок 4. Поверхность плазматической мембраны кератиноцита больного псориазом (а) и здорового донора (б).

Выявленные особенности характеристик рельефа цитоплазматической мембраны культивированных клеток кожи из псориатических очагов были однотипными для культуральных штаммов, полученных от разных больных, что может свидетельствовать о закономерности выявленных особенностей и о системности нарушения структуры плазматических мембран различных клеток при псориазе.

Повторяемость результатов исследования ультраструктурных особенностей плазматических мембран фибробластов кожи и кератиноцитов, проявляющаяся в клетках культур различного возраста и пассажа может свидетельствовать об изменениях в геноме клеток.

Клиническое значение мембранной экспрессии маркеров адгезии, активации и апоптоза у больных псориазом

С целью выяснения патогенетической роли молекул адгезии, активации и апоптоза при псориазе было предпринято определение их мембранной экспрессии на лимфоцитах и фибробластах кожи

В ходе проведенного исследования было установлено, что у 80% больных псориазом мембранная экспрессия 1САМ-1 на лимфоцитах значительно превышала аналогичные показатели у здоровых лиц, причем как в относительных, так и в абсолютных значениях У обследованных пациентов наблюдалось повышение уровня СБ54+ с увеличением тяжести течения псориатического процесса, что нашло отражение в патенте на изобретение

Максимальное количество СБ54 позитивных лимфоцитов зарегистрировано у больных псориазом первого типа (0,66±0,0б х109/л) по сравнению с больными вторым типом псориаза (0,41±0,04 х109/л), р<0,01. Это может свидетельствовать о наследственной предопределенности иммунопатологических нарушений при псориазе. Как в прогрессирующей, так и в стационарной стадии псориатический процесс характеризуется высоким уровнем экспрессии молекул адгезии 1САМ-1 на лимфоцитах, соответственно 0,59±0,05 х109/л и 0,53±0,08 х109/л. Объясняется это, вероятно, тем фактом, что подобная активация клеток является длительной

При изучении мембранной экспрессии 1САМ-3 (СВ50+) на лимфоцитах повышение указанного показателя выявлено у 76% больных псориазом, причем у больных псориазом первого типа экспрессия 1САМ-3 на лимфоцитах была максимально выраженной (0,69±0,05х109/л) и достоверно превышала показатели в группе больных псориазом второго типа (0,54±0,05 х109/л, р<0,05) В стационарной стадии псориатического процесса отмечалась тенденция к снижению относительного количества СБ50+ по сравнению с прогрессирующей стадией, однако это различие было недостоверным. У больных экссудативным и обыч-

ным псориазом относительное и абсолютное количество СБ50+ лимфоцитов не имело достоверных различий

У больных псориазом на мембранах лимфоцитов выявлена гиперэкспрессия интегрина Мас1 (С011Ь+), причем ее выраженность была максимальной у больных псориазом первого типа (0,33±0,03 х109/л по сравнению с 0,22±0,02 х109/л при втором типе, р<0,01), а также в прогрессирующей стадии заболевания (0,32±0,03 х109/л) и у больных экссудативным псориазом (0,28±0,04 х109/л)

Таблица 2

Мембранная экспрессия молекул адгезии активации и алоптоза на лимфоцитах

Псориаз Контроль, п=15

1САМ-1 - СБ54+ (%), 30,45±0,94 19,67±3,9

п-124 р<0,001

1САМ-1 - СБ54+ (х10у/л), 0,59±0,03 0,44±0,05

п=124 р<0,001

1САМ-3 - СВ50+ (%), 32,07±0,66 15,5±1,9

п=134 р<0,001

1САМ-3 - СБ50+ (х10у/л), 0,61±0,02 0,49±0,06

п=134 р<0,001

СБ11Ь+(%), 19,11±0,72 12,36±0,68

п=127 р<0,001

СБ11Ь+(хЮ9/л), 0,36±0,02 0,19±0,07

п=127 р<0,001

СШ5+ (%), 14,70±0,51 9,21±0,04

п=109 р<0,001

СБ25+ (х109/л), 0,27±0,01 0,14±0,01

п=109 р<0,001

СП95+ (%), 13,03±0,58 6,81*0,42

п=94 р<0,001

СБ95+ (х109/л), 0,23±0,01 0,12±0,02

п=94 р<0,001

р - достоверность различия с группой контроля

Исследовали количество лимфоцитов, несущих рецепторы к ИЛ-2, то есть СБ25+ у больных псориазом Наличие рецепторов к ИЛ-2 на мембранах лимфоцитов является маркером активации лимфоцитов Как относительное, так и

абсолютное количество С025+ клеток у больных псориазом достоверно превышало значения группы контроля Абсолютное количество лимфоцитов, несущих рецептор к ИЛ-2, у больных псориазом первого типа (0,29±0,02 х109/л) было достоверно выше, чем в группе больных псориазом второго типа (0,20±0,02 х109/л) В то же время данный показатель не зависел от стадии заболевания, а также от клинической формы псориаза

Было выявлено, что у больных псориазом на мембранах лимфоцитов имела место гиперэкспрессия маркера активации/апоптоза (СБ95), причем выраженность экспрессии не зависела от типа, а также стадии заболевания и клинической формы псориаза В культурах фибробластов, полученных из псо-риатических очагов, количество С050+ клеток вдвое превышало тот же показатель в культурах фибробластов здоровых доноров Количество СБ54 позитивных клеток в культурах клеток из псориатических очагов составило в среднем 31%, а в культурах фибробластов здоровых доноров только 19% Существенно отличалось от нормальных значений и количество фибробластов, несущих на мембране маркер СОНЬ, относящийся к молекулам адгезии семейства интег-ринов На мембранах фибробластов из псориатических очагов данный показатель составил 12%, а в контроле 20%. Различия в экспрессии маркера апоптоза С095 не были столь явно выраженными В культурах фибробластов из псориатических очагов количество СБ95позитивных клеток составило в среднем 47%, а в контроле 54%

Относительное (19,11±0,37%) и абсолютное (0,40±0,03x10%) количество лимфоцитов СБ22+ у больных псориазом статистически достоверно не отличалось от показателей клинически здоровых людей (соответственно 21,0±4,2 и 0,37±0,03х109/л) Относительное и абсолютное содержание Т-лимфоцитов (СБЗ+) у больных псориазом было достоверно ниже нормальных значений (49,08±0,59% и 0,95±0,03х109/л против 58,0±3,45% и 1,05±0,03х109/л в группе контроля, р<0,05) Также существенно сниженным было количество СБ4+, причем как в относительном, так и в абсолютном выражении (в группе больных псориазом 30,92±0,49% и 0,29±0,01х10%, а в группе контроля 41,0±4,2% и

0,74±0,06 х109/л) Относительное содержание CD8+ достоверно не отличалось от показателей клинически здоровых людей, однако абсолютное количество Т-супрессоров было достоверно сниженным (0,19±0,01 х109/л против 0,31±0,02 х109/л в контроле) Поэтому закономерным было уменьшение иммунорегуля-торного индекса (CD4+/CD8+) у больных псориазом по сравнению с референтной группой Полученные данные о снижении популяции Т-лимфоцитов и особенно Т-хелперов в периферической крови могут быть обусловлены перераспределением иммунокомпетентных клеток и их концентрацией в очагах поражения кожи При исследовании содержания иммунокомпетентных клеток в зависимости от типа, стадии и клинической формы псориатического процесса не было выявлено достоверных различий как в относительных, так и абсолютных показателях, лишь показатель CD8+(x109/ji) у больных экссудативным псориазом был достоверно ниже, чем у больных обычной формой заболевания

Проведен анализ корреляции между количеством лимфоцитов, экспрес-сирующих на цитоплазматической мембране кластеры дифференцировки CD3+, CD4+, CD8+, CDllb+, CD25+, CD50+, CD54+, CD95+ Оказалось, что высокая прямая степень связи (коэффициент корреляции Спирмена) имеется между относительными показателями CD3+ и CD4+ (0,89), а также CD22+ и CD8+ (0,91); CD22+ и CD25+ (0,87), между CD22+ и CD9S+ (0,93), CD8+ и CD25+ (0,84), CD8+ и CD95+ (0,91), CD4+ и CD95+ (0,84), CDllb+ и CD95+ (0,84) CD54+ и CD11Ь+ (0,82), CD25+ и CD95+ (0,90) Между абсолютными показателями обнаружена сильная прямая достоверная степень связи между показателями CD3+ и CD4+ (0,88), а также CD3+ и CD50+ (0,83), CD11Ь+ и CD54+ (0,86)

Использование факторного анализа в оценке результатов исследования структурно-функционального состояния плазматических мембран

С целью выявления определенного числа скрытых от непосредственного наблюдения факторов впервые в изучении патогенеза псориаза использован ме-

тод многомерной математической статистики - факторный анализ Цель факторного анализа заключается в разработке моделей, позволяющих анализировать и интерпретировать массивы экспериментальных или наблюдаемых данных вне зависимости от их физической формы Факторный анализ позволяет не просто установить связь изменения одной переменной с изменением другой переменной, а определить меру этой связи, и обнаружить основные факторы, лежащие в основе изменений

Для построения факторной модели был использован ряд клинических показателей (индекс распространенности и тяжести течения псориаза PASI, продолжительность заболевания псориазом, тип, стадия, клиническая форма заболевания, возраст), биохимических тестов, характеризующих структурные особенности плазматических мембран клеток крови у больных псориазом (ЛФХ, ФХ, СМ, ФС, ФЭА, ДК, МДА мембран эритроцитов, ЛФХ, ФХ, СМ, ФЭА, ДК, МДА мембран лимфоцитов), иммунологических показателей, оценивающих состояние рецепторного аппарата лимфоидных клеток по мембранной экспрессии CDllb, CD25, CD50, CD54, CD95, а также биохимических тестов состояния ли-пидного обмена в плазме крови (ЛФХ, ФХ, СМ, ФЭА, ДК, МДА)

Таким образом, для создания факторной модели привлечены показатели, характеризующие как клинические проявления псориатического процесса, так и структурно-функциональное состояние плазматических мембран и липидный метаболизм Из первоначально отобранных 31 показателя по значимости были использованы 22, наиболее полно отражающих структурно-функциональное состояние плазматических мембран, липидного обмена, а также такие клинические характеристики, как индекс PASI и продолжительность заболевания

На основе перечисленных показателей образована первоначальная матрица корреляции Затем было проведено вращение, максимизирующее дисперсию Был выбран метод VARIMAX вращения, удовлетворяющий данным требованиям В итоге после процедуры вращения была получена щестифакторная модель Общий процент объясняемой дисперсии составил - 70,71% Анализируя содержательное наполнение каждого из выделенных факторов, удалось их

идентифицировать и дать интерпретацию с позиции значимости отдельных показателей в механизмах развития псориатического процесса

Первый фактор (fl) был сформирован положительными вкладами от следующих показателей индекс распространенности и тяжести течения псориаза PASI (0,893), ЛФХ мембран эритроцитов (0,95), CDllb (0,871), CD25 (0,619), CD54 (0,849), CD95 (0,451) и отрицательным от ФЭА мембран эритроцитов (0,459) В связи с преобладанием в составе данного фактора положительных вкладов от биохимических и иммунологических тестов, характеризующих структурно-функциональное состояние плазматических мембран как эритроцитов, так и лимфоцитов, он был назван клеточным Первый фактор объясняет 22,05% дисперсии Таким образом, по результатам проведенного факторного анализа можно утверждать, что наибольший вклад в формирование механизмов развития патологического процесса при псориазе вносят изменения, затрагивающие фосфолшгадный состав плазматических мембран (ЛФХ и ФЭА мембран эритроцитов), а также мембранную экспрессию маркеров адгезии, активации и апоптоза Факторный анализ позволил математическими методами подтвердить гипотезу о существовании системного нарушения структурно-функционального состояния плазматических мембран у больных псориазом, играющего важную роль в развитии патологического процесса при данном заболевании

Второй фактор (f2) был сформирован положительными вкладами от следующих показателей ЛФХ сыворотки (0,669), СМ сыворотки (0,807), CD50 (0,537) и отрицательными от ФХ сыворотки (-0,447), ФЭА сыворотки (-0,463), ДК плазмы (-0,479), ДК эритроцитарных мембран (-0,533) В связи с этим, фактор 2, представленный преимущественно показателями состава сыворотки крови и плазмы, был назван гуморальным То есть f2 характеризует вклад гуморальных механизмов в формирование псориатического патологического процесса Следует отметить, что второй фактор объясняет 11,84% дисперсии

Третий фактор (f3) был сформирован положительными вкладами от следующих показателей длительность заболевания (0,61), ФХ эритроцитарных

мембран (0,879), отрицательными вкладами от показателей ФЭА эритроцитар-ных мембран (-0,681), ЛФХ сыворотки (-0,416) В связи с преобладающим весом показателей, характеризующих фосфолипидный состав эритроцитарных мембран, он был назван эритроцитарным Третий фактор по своему весу приближается к второму и объясняет 10,09% дисперсии

Четвертый фактор (f4) сформирован положительными вкладами от следующих показателей- МДА эритроцитов (0,735), ЛФХ мембран лимфоцитов (0,559), СМ мембран лимфоцитов (0,686), отрицательным вкладом от ФЭА мембран лимфоцитов (-0,749) Именно в третьем факторе наибольший вес имели показатели структурного состояния плазматических мембран лимфоцитов, поэтому он был назван лимфоцитарным

Пятый фактор (f5) сформирован положительным вкладом от показателя -ФХ сыворотки (0,732) и отрицательными от ФЭА сыворотки (-0,808) и ФХ лимфоцитарных мембран (-0,632) В связи с преобладающим вкладом показателей сыворотки он был назван сывороточным

Шестой фактор (f6) был сформирован положительным вкладом от двух показателей - ДК плазмы (0,705) и МДА плазмы (0,788) По этой причине он был назван перекисным Четвертый, пятый и шестой факторы объясняют соответственно 10,09, 9,11, 8,16% дисперсии В сумме все шесть факторов составляют 70,71% накопленной дисперсии

Таким образом, на основании представленного факторного анализа определена роль каждой из включенных в анализ переменных в формирование заболевания При этом было выявлено, что наибольший вклад вносит первый фактор, клеточный, характеризующий структурно-функциональное состояние плазматических мембран клеток у больных псориазом

Влияние терапии на состояние плазматических мембран у больных псориазом

Традиционно в терапии больных псориазом используют дезинтоксикаци-онные средства, препараты кальция и витамины Большинство пациентов с рас-

пространенным псориазом получает перечисленные препараты при амбулаторном или стационарном лечении Проведено исследование состояния плазматических мембран у больных псориазом под влиянием данного метода лечения После терапии больных псориазом с применением дезинтоксикационных средств, препаратов кальция и витаминов наблюдалось некоторое снижение фракции ЛФХ в мембранах эритроцитов (до 6,81±0,98), не достигающее нормальных значений Одновременно наблюдалось уменьшение мажорной фракции ФХ в эритроцитарных мембранах (30,11±1,18, р<0,05), а также существенное увеличение содержания ФС (3,42±0,4б, р<0,05) В мембранах лимфоцитов сохранялось снижение фракции ЛФХ (10,26±1,21) Таким образом, традиционная тералия больных псориазом не приводит к нормализации структурного состояния плазматических мембран и частично усугубляет негативные изменения

В качестве системной терапии больных распространенным псориазом чаще всего используется метотрексат, фармакологическое действие которого связано с моделированием иммунных и воспалительных реакций, антипролифератив-ной активностью Исследовано состояние липидного бислоя плазматических мембран клеток больных псориазом до и после курса терапии метотрексатом по схеме Вайнштейна-Фроста После терапии, включавшей метотрексат, наряду с высокой клинической эффективностью наблюдались такие неблагоприятные изменения показателей, как снижение уровня ФЭА в мембранах эритроцитов (35,90±3,81), сопровождающееся увеличением содержания фракции ЛФХ в сыворотке крови Особенно выраженными были изменения в мембранах лимфоцитов после применения метотрексата зафиксировано значительное повышение содержания мембранотоксичной фракции ЛФХ (15,44±1,08, р<0,05), увеличение уровня НЭЖК (14,45±3,67) Так как метотрексат неблагоприятно воздействует на лимфоидные органы, такое влияние на лимфоциты вполне объяснимо

Таким образом, обычная тералия больных псориазом (с применением дезинтоксикационных средств, препаратов кальция и витаминов) не приводит к

нормализации структуры плазматических мембран, а использование метотрек-сата наряду с высокой клинической эффективностью со стороны кожного процесса усугубляет мембранопатологические процессы в организме в целом Все перечисленное аргументирует включение в терапию больных псориазом препаратов мембранопротекторов

32

ВЫВОДЫ

1 Установлены нарушения структурной организации липидного бислоя плазматических мембран клеток крови и кожи у больных псориазом по сравнению с здоровыми, заключающиеся в повышении уровня лизофосфатидилхоли-на в эритроцитарных мембранах на 50%, увеличении фосфатидилхолина и гли-церолипидов, снижении содержания холестерина на 50% и, как следствие, изменениях интегральных показателей - текучести, жидкостности и проницаемости мембран эритроцитов Для больных псориазом характерно уменьшение фракции лизофосфатидилхолина в плазматических мембранах лимфоцитов периферической крови и дермальных фибробластов Наибольшей выраженности мембранодеструктивные процессы достигают у больных псориазом первого типа (с возникновением в молодом возрасте, наследственной предрасположенностью и более тяжелым течением)

2 Доказано наличие нарушений функционального состояния плазматических мембран лимфоцитов больных псориазом, манифестирующее повышением мембранной экспрессии маркеров адгезии (1САМ-1 - С054, 1САМ-3 -СБ50, интегрина Мас1 - СБ11Ь) активации (СБ25) и апоптоза (СБ95) У больных псориазом первого типа экспрессия 1САМ-3, СБ11Ь и СВ25 превышает показатели второго типа (с началом заболевания в зрелом возрасте и более благоприятным течением заболевания)

3 Показано, что с помощью атомно-силовой микроскопии можно получить изображение плазматических мембран нативных культивируемых клеток кожи (фибробластов и кератиноцитов) на молекулярном уровне

4 Доказано, что с помощью атомно-силовой микроскопии выявляются характерные особенности ультраструктуры поверхности плазматической мембраны фибробластов и кератиноцитов при псориазе в виде увеличения микровыростов, перепада высот и шероховатости поверхности, сопровождающиеся нарушением продукции фибронектина Однотипность и повторяемость особен-

ностей плазматической мембраны для различных штаммов клеток кожи свидетельствует о вероятных нарушениях в геноме клеток

5 С помощью метода многомерной математической статистики - факторного анализа впервые определены шесть патогенетических факторов развития псориаза Доказано, что наибольший вклад в формирование механизмов развития патологического процесса при псориазе вносят изменения, затрагивающие фосфолипидный состав плазматических мембран, а также мембранную экспрессию маркеров адгезии, активации и апоптоза

6. Установлено, что терапия больных псориазом (с применением дезин-токсикационных средств, препаратов кальция и витаминов) не приводит к нормализации структуры плазматических мембран, а использование метотрек-сата наряду с высокой клинической эффективностью со стороны кожного процесса усугубляет мембранопатологические процессы в организме в целом

7 Теоретически обосновано новое направление в терапии больных псориазом с использованием средств мембранопротекторного действия

Практические рекомендации

У больных псориазом первого типа (с возникновением в молодом возрасте, наследственной предрасположенностью и более тяжелым течением) мембранопатологические изменения достигают максимальной выраженности, поэтому этой группе пациентов в комплексную терапию особенно рекомендуется включение мембранопротекторных средств

Проведенные исследования позволяют изучать методом атомно-силовой микроскопии клетки кожи в нативном состоянии без предварительной обработки их веществами, изменяющими структуру мембран

Больным псориазом наряду с клинической оценкой рекомендуется проводить прогнозирование течения псориаза путем определения мембранной экспрессии на лимфоцитах периферической крови молекул адгезии

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Каныгина, Э Л Опыт применения препарата Витэкс в терапии псориаза / Э Л Каныгина, И А Клеменова, Г Ю Курников // Человек и лекарство Сб тезисов докладов VI Российского национального конгресса - М, 1999 - С 166

2) Каныгина, Э Л Результаты первого этапа разработки нового средства для лечения псориаза / Э Л Каныгина, И А Клеменова // Материалы конференции, посвященной 60-летию кафедры кожных и венерических болезней Московского медицинского стоматологического института - М, 1999 - С 15-16

3) Никулин, Н К Апоптогенез кератиноцитов и особенности активации иммунной системы при псориазе / Н К Никулин, Л М Скуинь, И А Клеменова и др // Материалы конференции, посвященной 60-летию кафедры кожных и венерических болезней Московского медицинского стоматологического института -М,1999 -С 16

4) Никулин, Н К Возрастные особенности активации иммунной системы в нормальной и патологически измененной коже / НК Никулин, ТЮ Чернова, И А Клеменова // Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии. Сб тезисов научно-практической конференции - Нижний Новгород, 1999 - С 205-206

5) Смирнов, А В Особенности течения хронических дерматозов в пожилом возрасте / А В Смирнов, Г Ю. Курников, И А Клеменова и др // Клиническая геронтология (Материалы IV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной Качество жизни») -1999 - №3 - С 96

6) Каныгина, Э.Л Применение нового липидного комплекса в лечении заболеваний кожи / Э Л Каныгина, И А Клеменова, Г Ю Курников и др // Эколого-гигиенические проблемы сохранения здоровья населения Сборник статей научно-практической конференции - Москва - Нижний Новгород, 1999 - С 335-337

7) Клеменова, И А, Состояние микрофлоры кишечника у больных хроническими дерматозами / И А Клеменова, Г Ю Курников, Г И Жукова и др // Отечественная дерматовенерология-2000. проблемы, поиски, решения Сборник научных трудов Нижний Новгород, 2000 - С 42-43

8) Абалихина, Е П Значение коррекции процессов ПОЛ и фосфолипидного состава крови у больных псориазом / Е П. Абалихина, И А. Клеменова // Тез конф молодых ученых Поволжья и Северного Кавказа - Нижний Новгород,2000 -С 201-202

9) Каныгина, Э Л. Липидный комплекс для лечения хронических дерматозов / Э Л Каныгина, И А Клеменова, Курников Г Ю // Патент № 2159118 от 20 11 2000 г

10) Чернова, Т Ю. Взаимосвязь активации и УФ-индуцированной апоптозной гибели клеток / Т Ю Чернова, К В Дмитренко, И А Клеменова и др // Тез. Конф. молодых ученых Поволжья и Северного Кавказа - Нижний Новгород, 2000 С

11) Курников, Г Ю Новые подходы к коррекции дисбиоза у больных хроническими дерматозами / И А Клеменова, Г Ю Курников, Г И Жукова и др //Сб материалов VIII Съезда дерматовенерологов -М,2001

12) Никулин, НК. Состояние мембран фибробластов кожи больных псориазом / Н К Никулин, И А Клеменова, Д Я Алейник и др // Сб материалов VIII Съезда дерматовенерологов -М,2001 -С 165

13)Никулин, НК Мембранные маркеры апоптотической гибели кератино-цитов при псориазе / Н К Никулин, Л М Скуинь, И А Клеменова // Сб материалов VIII Съезда дерматовенерологов -М, 2001 -С 164

14)Никулин, НК Изменения клеточных мембран у больных псориазом и методы коррекции / Н К Никулин, И.А. Клеменова, Н.В. Востоков и др // Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем и хронических дерматозов Тезисы научных работ - Екатеринбург, 2002 -С 149

15) Курников, ГЮ Состояние микрофлоры толстого кишечника у больных хроническими дерматозами / Г Ю Курников, И.А Клеменова, Г.И Жукова и др // Российский журнал кожных и венерических болезней - 2002 -№3 -С 38-43

16) Клеменова, И А Изучение спектра липидов как способ оценки эффективности лечения больных псориазом / И А Клеменова, Т В Копытова, Е П Абалихина и др // Клиническая лабораторная диагностика - 2002 - № 10 - С 36-36

17) Клеменова, И А Способ лечения больных псориазом / И А Клеменова, Г Ю Курников, Э А Каныгина и др // Патент № 2195299 от 27 12 02 г

18) Никулин, Н.К Состояние клеточных мембран при псориазе и методы коррекции / Н К Никулин, И А Клеменова, Т В Копытова и др // Сборник трудов юбилейной научно-практической конференции, посвященной 10-летию кафедры кожных и венерических болезней педиатрического факультета РГМУ и отделения дерматоаллергологии РДКБ- «Современные вопросы дерматологии и венерологии» - Тверь, 2002 -С 88-89

19)Курников, Г Ю Методы коррекции дисбиоза кишечника у больных хроническими дерматозами / Г Ю Курников, И А Клеменова, Н Ю Воронова // Пособие для врачей - Нижний Новгород, 2002 -10 с

20) Клеменова, И А. Молекулы адгезии 1САМ-1 и 1САМ-3 у больных псориазом / И А Клеменова, Н К Никулин, Т Ю Чернова // Медицинская иммунология -2003 3-4 - С 263-264

21) Клеменова, И А Мембранная экспрессия межклеточных молекул адгезии 1САМ-1 и 1САМ-3 у больных псориазом / Н К Никулин, И А Клеменова, Т Ю Чернова // Иммунопатология Аллергология Инфектология - 2003 -№3 -С24-25

22) Клеменова, И А Использование нанотехнологий в изучении особенностей патогенеза псориаза / И.А Клеменова // Тезисы научных докладов Первого Российского конгресса дерматовенерологов Дерматология - С-Пб,2003 -Т 1 -С 49-50

23) Клеменова, И А Ультраструктурные особенности фибробластов больных псориазом / И А Клеменова, Н К Никулин, Д Я Алейник, Н В Востоков // Тезисы научных докладов Первого Российского конгресса дерматовенерологов Дерматология -С-Пб,2003 -Т1 - С 81-82

24) Алейник, Д Я Характеристика микрорельефа мембран клеток нормальной и рубцовоизмененной кожи / Д.Я Алейник, И А Клеменова, И Н Чарыкова и др // Нижегородский медицинский журнал - 2004 - Приложение Комбустиология - С 189-190.

25) Никулин, Н К. Способ прогнозирования течения псориаза / Н К Никулин, И А Клеменова, Т Ю Чернова // Патент № 2224255 от 20 02 04 г

26) Клеменова, И А Изменения биомембран у больных псориазом / И А Клеменова // Современные направления развития диагностики, лечения и профилактики Ю. 11111 и дерматозов Тезисы научных работ Всероссийской конференции дерматовенерологов - Нижний Новгород, 2004 - С 19

27) Клеменова, И А Метод сканирующей зондовой микроскопии в изучении цитоплазматической мембраны фибробластов кожи / И А Клеменова, Н К Никулин, Д А Алейник и др //IX Всероссийский съезд дерматовенерологов Тезисы научных работ -М,2005 - Т1 -С 107-107

28) Заславская, М И Влияние сыворотки крови больных псориазом на апоп-тоз нейтрофилов /МИ Заславская, И А Клеменова // IX Всероссийская конференция дерматовенерологов, Екатеринбург, 1-2 июня 2006 г Тезисы научных работ - Екатеринбург, 2006 - С 4

29) Клеменова, И А Возможности нанотехнологий в изучении клеток кожи / И А Клеменова, Н К Никулин, Д Я Алейник и др // IX Всероссийская конференция дерматовенерологов, Екатеринбург, 1-2 июня 2006 г- Тезисы научных работ - Екатеринбург, 2006 - С 5.

30) Клеменова, И А Межклеточные молекулы адгезии при псориазе / И.А Клеменова // IX Всероссийская конференция дерматовенерологов, Екате-

ринбург, 1-2 июня 2006 г Тезисы научных работ - Екатеринбург, 2006 -С 9-10

31)Клеменова, И А Изменения цитоплазматических мембран у больных псориазом / И А Клеменова, Ю Ю Гущина, Н К Никулин и др // Социально значимые заболевания в дерматовенерологии Диагностика, терапия, профилактика Сборник тезисов VI научно-практической конференции, 28-29 сентября 2006 - М, 2006 - С 78-79

32) Клеменова, И А Межклеточные молекулы адгезии при псориазе / И А Клеменова Н Социально значимые заболевания в дерматовенерологии Диагностика, терапия, профилактика- Сборник тезисов VI научно-практической конференции, 28-29 сентября2006 -М,2006 - С 75-76

33) Клеменова, И А Псориаз современный подход к диагностике и лечению / И А Клеменова // Нижегородский медицинский журнал - 2006 - № 4 -С 88-91

34) Kiemenova, IА Research of skm cells by an atomic force microscopy /1A Kiemenova, D Y Alemik,NV Vostokov//Abstract EADV 2006 P029.20

35) Клеменова, И А Межклеточные молекулы адгезии (1СAM) при псориазе / И А Клеменова // Организация оказания дерматовенерологической помощи в современных условиях Тезисы научных работ X Всероссийской конференции дерматовенерологов, 23-24 ноября 2006 года, г Москва -М, 2006 - С 30

36) Клеменова, И А Возможности атомно-силовой микроскопии в изучении клеток кожи человека / Д.Я Алейник, Н В Востоков, И А Клеменова // Вестник новых медицинских технологий - 2006 - Т XIII - №3 - С 98-99.

37) Клеменова, И А Лечение больных псориазом с использованием мембра-нопротекторов / Н К Никулин, И А Клеменова, Т В Копытова // Усовершенствованная медицинская технология - Нижний Новгород, 2006 -Юс

38) Клеменова, И А Межклеточные молекулы адгезии при псориазе / И А Клеменова, Д Я Алейник // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2007 - № 2 - С 12-13

39) Клеменова, И А Ультраструктурные особенности мембран фибробластов кожи при псориазе / И А Клеменова, Н К Никулин, Д Я Алейник и др // Вестник дерматологии и венерологии - 2007 - № 4. - С 4-5

40) Клеменова, И А Результаты исследования клеток кожи методом атомно-силовой микроскопии / И А Клеменова, Д Я Алейник, И Н Чарыкова и др. // Российский журнал кожных и венерических болезней - 2007 - № 4 - С 77-79

41) Клеменова, И А Мембранопатологические изменения при псориазе и методы коррекции / И А Клеменова // Материалы II Всероссийского конгресса дерматовенерологов, 25-28 сентября 2007 г - СПб, 2007 - С, 63

42) Клеменова, И.А Маркеры активации, адгезии и апоптоза при псориазе / И А Клеменова // Материалы II Всероссийского конгресса дерматовенерологов, Санкт-Петербург, 25-28 сентября 2007 г - СПб, 2007 - С 63

43) Клеменова, И А Результаты исследования культур клеток кожи от больных псориазом / И А Клеменова, Д Я Алейник, И Н Чарыкова // Социально значимые заболевания в дерматовенерологаи Диагностика, терапия, профилактика Сборник тезисов VII научно-практической конференции, Москва, 6-7 сентября 2007 - М, 2007 - С 44-45

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОС - антиоксидантная система

АСМ - атомно-силовая микроскопия

ГЛ - глицеролипиды

ДК - диеновые конъюгаты

ИЛ - интерлейкин

ИФ - интерферон

ЛФХ - лизофосфатидилхолин

МДА - малоновый диальдегид

НЭЖК - неэстерифицированные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СЗМ - сканирующая зондовая микроскопия

СМ - сфингомиелин

ТГ -триглицерид

ФЛ - фосфолипиды

ФНО - фактор некроза опухолей

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

ХС - холестерин

CD - кластер дифференцировки

Заказ £(?${ Тираж {£0 Экз ООП ВВАГС

603950, Н Новгород-292, пр Гагарина 46

По данным крупномасштабных эпидемиологических исследований псориаз является наиболее распространенным хроническим дерматозом. В различных странах заболевание поражает 1-3% населения [333, 345]. Причем в мировой популяции в последнее время отмечается не только рост заболеваемости псориазом, но и увеличение частоты тяжелых и трудно поддающихся терапии случаев, а также инвалидизирующих форм заболевания, хотя достоверные причины этого явления остаются неизвестными [202, 282].

Псориаз редко приводит к гибели больных, однако значительно ухудшает качество жизни пациентов, их социальную, а нередко и трудовую адаптацию [73, 113, 146, 226, 235, 274, 345]. Существенными являются финансовые затраты на лечение, являющееся обычно достаточно продолжительным [122, 123, 344].

Несмотря на продолжающееся интенсивное изучение этиопатогенеза псориаза, в механизмах развития этого заболевания сохраняется много неясного [46, 47, 93, 295, 414]. Этиология псориаза в настоящее время остается неизвестной [119, 381, 422, 438, 449]. В многочисленных публикациях дерматоз относят к мультифакториальным заболеваниям с полигенной детерминацией наследственной компоненты предрасположения [172, 173]. Многофакторность развития псориаза подразумевает реализацию генетической программы под воздействием многочисленных экзо- и эндогенных причин [4, 76, 114, 214, 408, 416].

К настоящему времени описано более 1000 маркеров, подтверждающих генетическую предрасположенность к заболеванию [174, 252, 273]. Корреляционный анализ выявил у больных псориазом повышенную частоту антигенов HLA-B13, В17, DR-7, Cw6, В27 [273, 276]. Причем выделяются два типа псориаза: I тип, возникающий в молодом возрасте и ассоциированный с генетической предрасположенностью и связью с антигенами HLA-B13, В57, Cw6. II тип заболевания проявляется у лиц старше 40 лет с отсутствием семейного анамнеза и характеризуется отсутствием связи с перечисленными антигенами [131].

В основе клинических проявлений псориаза находится повышенная репродукция клеток эпидермиса с нарушением процесса дифференцировки, приводящая к формированию дефектного рогового слоя на фоне воспалительных явлений в дерме [5, 59, 161,177,181, 197,198,239,249,265,395].

Несмотря на определенные успехи, достигнутые в лечении псориаза за последнее десятилетие [141, 142, 144, 149, 150, 221, 222, 224, 234], возможности терапевтических схем все еще остаются ограниченными. Во многом такая ситуация обусловлена отсутствием полной картины патогенеза псориаза, сведений о первичных наследуемых биологических дефектах, приводящих к возникновению и хронизации гиперпролиферации кератиноцитов.

Особенно интенсивно изучаются иммуннопатологическое процессы у больных псориазом [10, 84, 85, 110, 111, 112, 124, 128, 129, 148, 154, 162, 166, 167, 203, 206]. В то же время функциональные возможности иммунекомпетентных клеток определяются состоянием их мембран [100]. Существуют многочисленные публикации об иммунных нарушениях у больных псориазом [44, 90, 182, 185, 186, 187, 188, 189, 206, 218, 229, 230, 231, 243, 247, 248, 253, 261, 382], однако мембраны иммунокомпетентных клеток при псориазе ранее не исследованы. Имеющиеся в литературе сведения о состоянии плазматических мембран у больных псориазом базируются лишь на изучении эритроцитарных мембран, немногочисленны, противоречивы [153]. Особую актуальность исследованию мембран придает их значение в функционировании всех клеток, систем и организма в целом [52, 53]. Плазматические мембраны обеспечивают важнейшее условие существования биологических объектов - автономность и тесную связь с окружающей средой, выполняют барьерную, механическую, энергетическую, коммуникативную и многие другие функции [54]. Роль клеточных мембран в жизненно важных процессах связана также с их совокупной площадью, достигающей в организме человека десятков тысяч квадратных метров [52].

Именно поэтому исследование ультраструктурных и функциональных особенностей мембран различных клеток у больных псориазом представляется весьма актуальным. Невыясненными остаются конституциональные и приобретенные особенности структуры плазматических мембран, не определены признаки патологии плазматических мембран, характерные как для псориаза в целом, так и для различных стадий данного заболевания, его типов и клинических форм. Недостаточное внимание уделяется поиску системных особенностей плазматической мембраны у больных псориазом. Совершенно недостаточно исследованы интегральные характеристики плазматических мембран различных клеток при псориазе. Не определено диагностическое и прогностическое значение структурно-функционального состояния плазматических мембран клеток крови и кожи, что затрудняет возможности коррекции предполагаемых мембранопатологических изменений.

В последнее время одним из наиболее перспективных направлений развития науки является область нанотехнологий. Благодаря нанотехнологиям, объединяющим фундаментальные достижения науки, техники, биологии и медицины, появилась возможность изучения биологических объектов с разрешением на уровне молекулярного, а также исследовать отдельные структуры живых клеток, нативных молекул белков, вирусов [365, 387]. Уникальную возможность изучения нанообъектов предоставляет метод исследования, относящийся к нанотехнологиям - атомно-силовая микроскопия [298, 299]. Данный метод позволяет изучать ультраструктуру плазматической мембраны. Ранее клетки кожи путем атомно-силовой микроскопии не изучались.

Все перечисленное определяет безусловную актуальность, перспективность и практическую значимость научного поиска особенностей структурно-функционального состояния плазматических мембран при псориазе, как дополнительных эндогенных наследуемых факторов патогенеза данного заболевания.

Исходя из научно-практической значимости указанной проблемы, в настоящей работе поставлена цель исследования.

Цель исследования: на основании определения клинико-патогенетической роли структурно-функциональной организации плазматических мембран клеток крови (эритроцитов, лимфоцитов) и кожи (фибробластов, кератиноцитов) разработать новое перспективное направление терапии больных псориазом.

Задачи исследования:

1. Изучить структурное состояние липидного бислоя плазматических мембран эритроцитов, лимфоцитов периферической крови, а также культивируемых дермальных фибробластов больных псориазом путем определения фракций фосфолипидов, неэстерифицированных жирных кислот, глицеролипидов, холестерина, определить динамику показателей в зависимости от типа, стадии и клинической формы заболевания.

2. Определить функциональное состояние плазматических мембран лимфоцитов периферической крови у больных псориазом с помощью исследования мембранной экспрессии маркеров дифференцировки, активации, адгезии и апоптоза в зависимости от типа, стадии и клинической формы псориаза.

3. Определить возможности использования атомно-силовой микроскопии для исследования нативных культивируемых клеток колеи.

4. Исследовать особенности ультраструктуры плазматических мембран дермальных фибробластов, а также кератиноцитов больных псориазом с помощью атомно-силовой микроскопии.

5. Путем использования метода многомерной математической статистики -факторного анализа определить, какие из изученных показателей вносят наибольший вклад в формирование механизмов развития патологического процесса при псориазе.

6. Провести анализ изменений структурно-функциональных особенностей плазматических мембран различных клеток у больных псориазом, происходящих под влиянием обычной терапии (с использованием дезинтокси-кационных средств, препаратов кальция и витаминов), а также применения метотрексата.

7. Разработать пути медикаментозной коррекции выявленных нарушений плазматических мембран у больных псориазом.

Научная новизна результатов исследования.

Научная новизна и теоретическая ценность выполненного исследования заключается в обосновании и фактическом подтверждении концепции наличия системных наследственно предопределенных особенностей строения плазматических мембран при псориазе, которые являются одним из патогенетических факторов развития заболевания. Комплексное исследование липидного спектра мембран эритроцитов и лимфоцитов позволило установить особенности структурной организации плазматических мембран, характерные как для псориаза в целом, так и для отдельных типов, стадий и форм заболевания. Выявлен принципиально важный факт системности мембранных нарушений, что позволяет экстраполировать полученные данные на другие типы мембранных структур организма.

Впервые у больных псориазом исследовано структурно-функциональное состояние плазматических мембран лимфоцитов, выявившее как нарушение организации липидного бислоя, так и патологические изменения мембранной экспрессии маркеров адгезии, активации и апоптоза.

Доказана возможность применения атомно-силовой микроскопии в исследовании нативных культивируемых клеток кожи. Впервые с помощью атомно-силовой микроскопии получены изображения плазматических мембран культивируемых клеток кожи (фибробластов и кератиноцитов), показаны характерные особенности ультраструктуры поверхности мембран в норме и при псориазе.

Впервые в изучении патогенеза псориаза использован метод многомерной математической статистики - факторный анализ, с помощью которого определены шесть факторов, определяющих развитие псориаза. Показано, что наибольший вклад в формирование механизмов развития патологического процесса при псориазе вносят изменения, затрагивающие фосфолипидный состав плазматических мембран, а также мембранную экспрессию маркеров адгезии, активации и апоптоза.

Результаты исследования служат теоретическим обоснованием включения в терапию больных псориазом мембранопротекторных терапевтических средств.

Практическая значимость исследования:

Проведенное комплексное изучение структуры и функции плазматических мембран различных клеток при псориазе с выделением мембранопатоло-гических признаков, характерных для различных типов, стадий и клинических форм псориаза, создало предпосылки использования результатов в клинической практике.

Разработана методика изучения нативных культивируемых клеток кожи с помощью атомно-силовой микроскопии. Определены возможности и перспективы использования атомно-силовой микроскопии в исследованиях плазматических мембран клеток кожи.

Разработан метод прогнозирования тяжести течения псориаза путем определения мембранной экспрессии на лимфоцитах молекул адгезии.

Результаты проведенного исследования дают возможность разработки новых лекарственных средств лечения псориаза путем коррекции липидной составляющей плазматических мембран.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Механизмы формирования псориаза включают конституционально обусловленное звено на уровне плазматической мембраны клеток, маркерами которого являются нарушения молекулярного состава липидного бислоя эритроцитов, лимфоцитов периферической крови, дермальных фибробла-стов, а также повышенная мембранная экспрессия маркеров адгезии, активации и апоптоза на лимфоцитах крови и дермальных фибробластах.

2. Различные клинические типы, стадии и клинические формы псориатиче-ского процесса имеют общие и специфические особенности вовлечения мембранных структур эритроцитов и лимфоцитов периферической крови в патогенез заболевания.

3. Новый метод исследования клеток - атомно-силовая микроскопия, позволяет исследовать культивируемые клетки кожи в нативном состоянии и определить особенности поверхности плазматической мембраны на молекулярном уровне.

4. Клетки кожи (фибробласты и кератиноциты) при псориазе имеют характерные особенности ультраструктуры поверхности плазматической мембраны.

5. Традиционная терапия больных псориазом (с применением дезинтокси-кационных средств, препаратов кальция и витаминов) не приводит к нормализации структуры плазматических мембран при псориазе, а использование метотрексата при высокой клинической эффективности со стороны кожного процесса усугубляет мембранопатологические изменения в организме в целом.

Апробация материалов диссертации:

Основные положения диссертации представлены и обсуждены на: Конференции молодых ученых Поволжья и Северного Кавказа. Н.Новгород, 2000 г.;

Заседаниях Нижегородского научного общества дерматовенерологов 2000 г. и 2007 г.;

VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001); Первом Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2003);

Всероссийской научно-практической конференции «Современные направления развития диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов» (Нижний Новгород, 2004);

15-th Congress of the European Academy of Dermatology and Venereology "From Hippocrates to Modern Dermatology" Rhodes-Greece 2006; Заседаниях проблемной комиссии ФГУ Нижегородский НИКВИ Росздра-ва 2001 и 2006 гг.;

IX Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2005);

X Всероссийской конференции дерматовенерологов «Организация оказания дерматовенерологической помощи в современных условиях», (Москва, 2006);

Втором Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007).

Внедрение результатов исследования в практическое здравоохранение.

По материалам диссертации опубликовано 43 печатные работы, в т.ч. 10в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, получено 3 патента на изобретение, издано 1 пособие для врачей и 1 усовершенствованная медицинская технология.

Результаты исследования используются в процессе преподавания на курсах тематического усовершенствования врачей по дерматологии (г. Нижний Новгород), при обучении врачей дерматовенерологов, клинических ординаторов и аспирантов, студентов на кафедре кожных и венерических болезней Нижегородской государственной медицинской академии. Результаты исследований внедрены в работу клиник ФГУ "Нижегородский научно-исследовательский кожно-венерологический институт Росздрава", ГУЗ Нижегородский областной кожно-венерологический диспансер, Мордовский республиканский кожно-венерологический диспансер, ГУЗ Воронежский областной клинический кожно-венерологический диспансер, ГУЗ Астраханский областной клинический кожно-венерологический диспансер, Сергачский кожно-венерологический кабинет Нижегородской области, Сормовский кожно-венерологический диспансер, Кабардино-балкарский кожно-венерологический диспансер.

ВЫВОДЫ

1. Установлены нарушения структурной организации липидного бислоя плазматических мембран клеток крови и кожи у больных псориазом по сравнению с здоровыми, заключающиеся в повышении уровня лизофосфатидилхоли-на в эритроцитарных мембранах на 50%, увеличении фосфатидилхолина и гли-церолипидов, снижении содержания холестерина на 50% и, как следствие, изменениях интегральных показателей - текучести, жидкостности и проницаемости мембран эритроцитов. Для больных псориазом характерно уменьшение фракции лизофосфатидилхолина в плазматических мембранах лимфоцитов периферической крови и дермальных фибробластов. Наибольшей выраженности мембранодеструктивные процессы достигают у больных псориазом первого типа (с возникновением в молодом возрасте, наследственной предрасположенностью и более тяжелым течением).

2. Доказано наличие нарушений функционального состояния плазматических мембран лимфоцитов больных псориазом, манифестирующее повышением мембранной экспрессии маркеров адгезии (ICAM-1 - CD54; ICAM-3 -CD50; интегрина Macl - CD1 lb) активации (CD25) и апоптоза (CD95). У больных псориазом первого типа экспрессия ICAM-3; CDllb и CD25 превышает показатели второго типа (с началом заболевания в зрелом возрасте и более благоприятным течением заболевания).

3. Показано, что с помощью атомно-силовой микроскопии можно получить изображение плазматических мембран нативных культивируемых клеток кожи (фибробластов и кератиноцитов) на молекулярном уровне.

4. Доказано, что с помощью атомно-силовой микроскопии выявляются характерные особенности ультраструктуры поверхности плазматической мембраны фибробластов и кератиноцитов при псориазе в виде увеличения микровыростов, перепада высот и шероховатости поверхности, сопровождающиеся нарушением продукции фибронектина. Однотипность и повторяемость особенностей плазматической мембраны для различных штаммов клеток кожи свидетельствует о вероятных нарушениях в геноме клеток.

5. С помощью метода многомерной математической статистики - факторного анализа впервые определены шесть патогенетических факторов развития псориаза. Доказано, что наибольший вклад в формирование механизмов развития патологического процесса при псориазе вносят изменения, затрагивающие фосфолипидный состав плазматических мембран, а также мембранную экспрессию маркеров адгезии, активации и апоптоза.

6. Установлено, что терапия больных псориазом (с применением дезин-токсикационных средств, препаратов кальция и витаминов) не приводит к нормализации структуры плазматических мембран, а использование метотрексата наряду с высокой клинической эффективностью со стороны кожного процесса усугубляет мембранопатологические процессы в организме в целом.

7. Теоретически обосновано новое направление в терапии больных псориазом с использованием средств мембранопротекторного действия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

У больных псориазом первого типа (с возникновением в молодом возрасте, наследственной предрасположенностью и более тяжелым течением) мембранопатологические изменения достигают максимальной выраженности, поэтому этой группе пациентов в комплексную терапию особенно рекомендуется включение мембранопротекторных средств.

Проведенные исследования позволяют изучать методом атомно-силовой микроскопии клетки кожи в нативном состоянии без предварительной обработки их веществами, изменяющими структуру мембран.

Больным псориазом наряду с клинической оценкой рекомендуется проводить прогнозирование течения псориаза путем определения мембранной экспрессии на лимфоцитах периферической крови молекул адгезии.

224