Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Рак и регионарные лимфатические узлы



ЦЫПЛАКОВ Дмитрий Эдуардович

РАК И РЕГИОНАРНЫЕ ЛИМФАТИЧЕСКИЕ УЗЛЫ (ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.15 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург, 1997

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском университете им. С.В.Курашова Научные консультанты: доктор медицинских наук,

профессор

Н.Ш.Шамсутдинов

доктор медицинских наук, профессор С.ВЛетров

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В.Л.Белянвн доктор медицинских наук, профессор Н.М.Аничков доктор медицинских наук, профессор М.Г.Рыбакова Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт онкологии им. проф. Н.Н.Петрова, г.Санкг-Петербург

Защита диссертации состоится "16 мая" 1997 г. в 13 час. на заседании специализированного совета Д 074.16.04 Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования (193015, Санкт-Петербург, ул.Салтыкова-Щедрина, 41).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии.

Автореферат разослан " ^ " г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат

медицинских наук А.В.Соболев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рост заболеваемости и высокая смертность больных раком различных органов диктуют необходимость поиска эффективных методов ранней диагностики и лечения злокачественных новообразований, а также изучения факторов, определяющих течение заболевания и его прогноз. Успешное решение этих задач невозможно без тщательного исследования морфологии регионарных к опухоли лимфатических узлов, выступающих в роли первого барьера на пути метастазирования рака.

Для опухоли любой локализации определены группы прогностических критериев, которые постоянно меняются и дополняются, и лишь один параметр остается незыблемым - состояние регионарных лимфоузлов. Этот критерий представляется настолько важным, что в последние годы в онкологии наметился новый подход к определению прогноза и сроков 5-летней выживаемости - выявление факторов, влияющих на поражение лимфатических узлов метастазами (TsubotaN. et al, 1991; Olinici C.D. et al, 1992; GagliaP. et al, 1993). Причем все основные методы лечения больных раком - хирургический, химиотерапевтиче-ский, радиологический, гормональный и др. - определяются наличием или отсутствием метастазов, их количеством и размерами в регионарных лимфоузлах (Antonelli A.R. et al, 1991; Fisher В, Redmond С, 1992; Palmer G.A, 1993; Ackcrman Т.Е. et al, 1994).

Реакции лимфатических узлов при опухолевом росте неоднократно обсуждались в литературе. Однако, проведенные исследования, как правило, посвящены изучению лимфатических узлов одного, самое большее двух регионов, без мор-фометрической оценки обнаруженных изменений, без сравнения полученных данных с контролем, а в некоторых случаях и без учета стадии заболевания. При этом ультраструктурные исследования единичны, а иммуногистохимические практически отсутствуют. Все это не позволило выявить общебиологические закономерности реакций лимфатических узлов различных регионов на рак, определить факторы, которые могут быть ответственны за метастазирование и гене-

рализацию опухолевого процесса и установить четкие прогностические критерии, определяющие 5-летнюю выживаемость онкологических больных.

Таким образом, в настоящее время, несмотря на значительное число исследований, барьерная функция лимфатических узлов оценивается неоднозначно. И если одни авторы считают лимфаденэктомию фактором, препятствующим раковой диссеминации (Kato H. et al., 1993; Keller E. et al., 1994; Vieweg J. et al., 1994), то другие утверждают, что удаление лимфатических узлов приводит к снижению противоопухолевой резистентности и доказывают возможность усиления цито-токсической активности в них локальнымприменснисм некоторых иммуностимулирующих препаратов (Nagaoka T. et al., 1992; Triozzi P.L. et al., 1994). Подобные противоречия объясняются не только сложностью проблемы, но и отсутствием комплексного методического подхода при изучении лимфатических узлов. Предложенная в 1973 году схема ВОЗ (Cottier H. et al.) не может отвечать задачам современных исследований в связи с существенной модификацией традиционных методов изучения лимфоретикулярной ткани (Chilosi M. et al., 1981; Audouin J., Diebold J., 1983) и появлением принципиально новых, прежде всего с применением моноклональных антител, для чего в последние годы предложен ряд алгоритмов (Барышников А.Ю. и соавт., 1989, 1990; Кадагидзе З.Г. и соавт., 1990, 1996; Mason D.Y., 1992; Taylor C.R., Cote R.J, 1994).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось комплексное иммуногистохимическое и ультраструюурное изучение регионарных лимфатических узлов в норме и в процессе развития рака, выявление факторов, способствующих неполноценности местного иммунного ответа, а также определение прогностических критериев 5-лстней выживаемости онкологических больных.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный иммуногистохимический, ультраструктурный и морфометрический анализ лимфатических узлов 5-ти регионов (желудок, легкие, молочная железа, шейка матки, толстый кишечник) в норме.

2. Выявить зависимость иммуноморфологических реакций регионарных лимфатических узлов от пола и возраста больных, локализации и гистологического

типа первичной опухоли, а также наличия и объема метастазов в лимфоидной ткани.

3. С использованием широкой панели моноклональных антител фенотипиро-

вать различные виды специфических иммуноморфологических и неспецифических стромальпо-сосудистых реакций регионарных лимфоузлов при раке и разработать их иммуногистохимическую классификацию.

4. Описать динамику реактивных изменений регионарных лимфатических узлов в процессе развития рака па разных клинических стадиях заболевания.

5. Выявить зависимость 5-летней выживаемости онкологических больных от типов иммуногистохимических реакций регионарных лимфоузлов.

6. Определить наиболее достоверный комплексный метод идентификации скрытых микрометастазов рака в регионарных лимфатических узлах.

7. Установить связь между наличием метастазов в регионарных лимфоузлах и иммуногистохимичсскими реакциями окружающей лимфоидной ткани.

8. Выявить зависимость 5-легнсй выживаемости больных раком от наличия и объема метастазов в регионарных лимфатических узлах.

9. Определить показатель активности (агрессивности) метастазов в лимфоузлах по экспрессии антигена ядерной пролиферации (РСКТА) и протоонкогена, супрессирующсго апоптоз (Вс1-2) в зависимости от иммуногистохимического фенотипа окружающей лимфоидной ткани.

10. Выявить зависимость 5-летней выживаемости онкологических больных от экспрессии РСЫА и Вс1-2 в метастазах рака.

11. Установить факторы, способствующие неполноценности местного иммунного ответа, метастазированию рака и генерализации опухолевого процесса.

Научная новизна. Данная работа является первым систематическим исследованием регионарных лимфатических узлов при раке 5-ти локализаций, выполненная путем комплексного анализа клеточного состава, ультраструктуры и экспрессии широкого спектра иммуногистохимических маркеров. В результате исследования определены общебиологические закономерности реакций лимфоуз-

лов различных регионов на рак и выявлены факторы, способствующие метаста-зированию и генерализации опухоли.

Проведено сравнительное комплексное морфометрическое, ультраструктурное и иммуногистохимическое исследование лимфатических узлов 5-ти регионов в норме. Определен общий стандартный иммуногистохимический фенотип лимфатического узла здорового человека.

Установлена зависимость иммуногистохимического статуса регионарных к раку лимфоузлов от пола и возраста больных, гистологического типа опухоли, клинической стадии заболевания, наличия и объема метастазов в лимфоидной ткани.

Разработана иммуногистохимическая классификация специфических имму-номорфологических реакций лимфатических узлов при раке. При этом впервые выделено 2 иммуногистохимических типа паракортикальной гиперплазии, 4 типа фолликулярной гиперплазии и 3 типа синусного гистиоцитоза.

Описана и иммуногистохимически фенотипирована неспецифическая стро-мально-сосудистая реакция лимфатических узлов.

Выявлены изменения кровеносного микроциркуляторного русла и отложение фибрина в лимфоидной ткани. Установлена роль при этом тучноклеточной реакции и содержания гистамина и серотонина в лимфатических узлах.

Определена динамика специфических иммуноморфологических и неспецифических стромально-сосудистых реакций в процессе развития рака.

Разработаны иммуногистохимические критерии для дифференцировки процессов лимфо- и плазмобласттрансформации.

Определена зависимость 5-летней выживаемости онкологических больных от различных типов иммуногистохимических реакций регионарных лимфоузлов.

Определен оптимальный метод идентификации скрытых метастазов рака в лимфоузлах.

Выявлена корреляция между иммуногистохимическими реакциями регионарных лимфатических узлов и 5-летней выживаемостью больных с наличием метастазов в лимфоузлах.

Иммуногистохимически с использованием антигена ядерной пролиферации (РСМА) и протоонкогена, супрессирующего апоптоз (Вс1-2) определена степень активности (агрессивности) метастазов в регионарных лимфоузлах в зависимости от иммуногистохимического фенотипа окружающей лимфоидной ткани.

Установлены факторы, способствующие неполноценности местного иммунного ответа в регионарных лимфатических узлах при раке.

Практическая и теоретическая значимость. В результате проведенных исследований выявлены общебиологическис закономерности реакций лимфоузлов различных регионов на развитие рака. Описана динамика иммуноморфологиче-ских изменений, определены факторы, способствующие метастазированию, выявлены причины неполноценности местного иммунного ответа, что может быть использовано для дальнейшего изучения патогенеза злокачественных новообразований.

Примененный в работе набор моноклональных антител может служить стандартной панелью при исследовании лимфатических узлов, регионарных к раку других локализаций и гистологических вариантов, поскольку установлено, что иммуногистохимическнй фенотип лимфоузлов мало зависит от пола и возраста больных, локализации и гистологического типа опухоли, но определяется клинической стадией заболевания.

Впервые разработана иммуногистохимическая классификация реактивных изменений лимфоузлов при раке. Установлено, что иммуноморфологические реакции, дающие одинаковую картину при исследовании рутинными гистологическими методами, разнородны по иммуногистохимическому профилю, что приводит к их противоречивой прогностической оценке.

Выявлена зависимость 5-летней выживаемости онкологических больных от различных типов иммуногистохимических реакций. Определен ряд прогностических критериев для больных раком желудка, легкого, молочной железы, толстого кишечника и шейки матки.

Определен наиболее оптимальный метод идентификации скрытых микрометастазов в регионарных лимфоузлах, независимо от локализации опухоли. Для

практического применения в онкоморфологических отделениях может быть рекомендовано сочетание мультисерийных срезов с комплексным иммуногистохи-мическим исследованием (пан-цитокератины и эпителиальный мембранный антиген). Данный метод эффективен в 90-100% случаев.

Доказано, что наличие метастазов, особенно небольшого объема, не всегда следует расценивать как неблагоприятный прогностический признак, поскольку 5-летняя выживаемость при этом определяется не только активностью самих клеток опухоли, но и иммуногистохимическим статусом окружающей лимфоид-ной ткани.

Установлено, что показателем активности (агрессивности) метастазов в лимфатических узлах можно считать экспрессию РСИА и Вс1-2, высокое содержание которых в опухолевых клетках ухудшает прогноз, снижая срок 5-летней выживаемости. Более стабильным критерием при этом является содержание РСЫА, которое не зависит от локализации и гистологического типа опухоли.

Таким образом, результаты проведенных исследований могут бьггь использованы как для дальнейшего изучения патогенеза злокачественных новобразова-ний, так и для определения прогноза заболевания, а также разработки методов комплексного лечения больных раком.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры патологической анатомии Казанского медицинского университета, в практическую работу патологоанатомического отделения 6-ой городской клинической больницы г.Казани и патогистологическую лабораторию республиканского онкодиспансера.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены в докладах на VII Республиканской онкологической конференции (Казань, 1987), региональной научно-практической конференции "Проблемы клинической лимфоло-гии" (Андижан, 1990), Республиканской научно-практической конференции "Новые методы диагностики и лечения" (Казань, 1995, 1996), Международном симпозиуме "Фундаментальная и прикладная гистохимия" (Братислава, Словакия, 1995), Конференции Кембриджского института "Прогностические факторы

при раке" (Арлингтон, США, 1995), 13-ой Азиатской конференции по раку (Пенанг, Малайзия, 1996), XXI Международном конгрессе Международной академии патологии (Будапешт, Венгрия, 1996), 3-ем Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996), I съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996), XVI Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 1996), 1 съезде общества патологоанатомов (Москва, 1997), заседаниях Казанского общества патологоанатомов (1993, 1994, 1995,1996, 1997).

Публикации. Материалы диссертации отражены в 38 опубликованных работах, в том числе 7 за рубежом.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 281 странице машинописи и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и практических рекомендаций. Текст иллюстрирован 55 фотомонтажами, 36 таблицами, 5 схемами. Список литературы содержит 332 наименования, из которЕлх 112 отечественных и 220 иностранных источников.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Лимфатические узлы различных регионов здорового человека имеют строго определенный стандартный иммуногистохимический фенотип.

2. Лимфатические узлы различных регионов отвечают на развитие рака стереотипными иммуноморфологическими реакциями, которые мало зависят от пола и возраста больных, локализации и гистологического типа первичной опухоли, но в решающей степени определяются клинической стадией заболевания, а также наличием и объемом метастазов в лимфоидной ткани.

3. йммупоморфологические реакции лимфатических узлов в процессе развития рака любой локализации имеют определенную динамику.

4. Иммуногистохимический фенотип морфологических реакций лимфатических узлов имеет несколько разновидностей, которые рутинными гистологическими методами не выявляются.

5. Иммуногистохимически идентифицируются 2 типа паракортикалыюй гиперплазии, 4 типа фолликулярной реакции и 3 типа синусного гистиоцитоза.

Градация на Т- и В-зависимые зоны структур узла при этом условна, поскольку иммуногистохимический статус лимфоидной ткани не всегда соответствует данным общепринятых гистологических методов исследования.

6. Иммуногастохимический фенотип регионарных лимфатических узлов во многом определяет 5-летнюю выживаемость онкологических больных, что позволяет выявить четкие прогностические критерии.

7. Оптимальным способом для выявления скрытых микрометастазов в лимфоузлах является сочетание мультисерийных срезов и иммуногистохимического метода (пан-цитокератины и эпителиальный мембранный антиген).

8. Наличие метастазов в лимфоузлах не всегда определяет плохой прогноз. Пятилетняя выживаемость при этом определяется, во-первых, активностью клеток опухоли, а, во-вторых, иммуногистохимическим статусом окружающей лимфоидной ткани.

9. Показателем активности (агрессивности) метастазов в лимфоузлах является экспрессия антигена ядерной пролиферации (РСНА) и протоонкогепа, супресси-рующего апоптоз (Вс1-2).

10. Факторами, определяющими неполноценность местного иммунного ответа в лимфатических узлах, регионарных к раковой опухоли, следует считать:

- уменьшение общего количества Т-клеток: в том числе Т-киллеров, Т-супрессоров и Т-хелперов;

- высокое содержание В-клеток и антителообразующих плазмоцитов;

- уменьшение количества МК-клеток;

- уменьшение количества пришлых свободных макрофагов моноцитар-ного происхождения, эозинофилов и нейтрофилов;

- падение фагоцитарной активности фиксированных макрофагов (гис-тноцитов) синусов;

- высокую функциональную активность дендритных ретикулярных клеток;

- низкую функциональную активность интердигитирующих ретикулярных клеток;

- стромалыю-сосудистые расстройства с отложением внесосудистого

фибрина и склерозом.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Были изучены регионарные лимфатические узлы, полученные во время операций от 721 онкологического больного. Больных раком желудка было 219, легкого - 140, молочной железы -191, толстого кишечника-81, шейки матки-90. Выбор указанных локализаций объясняется их наибольшим вкладом в общемировую (Alberts В. et al., 1994) и российскую (Заридзе А.Г., 1992; Двойрин В.В., Аксель Е.М., 1992, 1996) статистику раковых заболеваний. При оценке каждого случая учитывалась локализация,гистологическая структура и стадия опухоли в соответствии с системой TNM. Использовалась гистологическая классификация ВОЗ (Женева, 1981, 1982, 1984) и пост-хирургическая патогистологическая классификация p.TNM, основанная на сведениях, полученных до начала лечения и дополненная на основании данных, полученных во время хирургических вмешательств и исследования операционного препарата (Ленинград, 1981). В качестве контроля послужили лимфатические узлы соответствующих регионов, полученные от 52 практически здоровых лиц тех же возрастных групп, погибших от случайных причин (судебно-медицинские вскрытия не позднее 12 часов после наступления смерти). Кроме того, для выявления прогностических критериев и определения 5-легней выживаемости использовался архивный материал, полученный в 1986-1990 гг. в городском и республиканском онкологических диспансерах г.Казани. Часть данного материала была залита в парафин, а часть хранилась в жидком азоте.

Исследованию подверглись лимфатические узлы, расположенные на пути лимфогенного метастазирования рака соответств}тощего органа.

Лимфоузел вдоль большой оси разрезался на две части. Одна часть фиксировалась в 10% нейтральном формалине по Лилли или жидкости Карнуа и после соответствующей проводки заливалась в парафин. Вторая часть была использо-

вана для изготовления криостатных срезов, электронной микроскопии, иммуно-гистохимии и других описанных ниже методик.

Парафиновые срезы окрашивались гематоксилин-эозином, по ван Гизону, азур-П-эозином, пиронином по Браше, толуидиновым синим, импрегнировались по Футу и Папу. Применялась модифицированная окраска на фибрин, позволяющая дифференцировать его на "молодой", "зрелый" и "старый" (Зербино Д.Д. и соавт., 1983,1984).

Часть лимфатических узлов больных раком и лиц контрольной группы использовалась для количественной биохимической оценки содержания гистамина и серотонина в лимфоидной ткани. Ставилась реакция конденсации с ортофтале-вым альдегидом гистамина в щелочной, серотонина - в кислой среде по методике, позволяющей выявить оба амина в одной пробе биологического материала (Герасимова Ц.И., 1977).

На гистологических препаратах проводилось морфометрическое изучение структурных компонентов лимфатического узла при помощи морфометрической сетки случайного шага (Стефанов С.Б., 1974). Измерялась площадь капсулы, тра-бекул, кортикальной и паракортикалыюй зон, мякотных тяжей, первичных фолликулов, фолликулов с реактивными центрами и синусов. Раздельно в каждой из указанных структур проводилось количественное изучение клеточного состава по схеме П.М.Трясучева (1983) с использованием морфометрической окулярной сетки (Автандилов Г.Г., 1973, 1984, 1990). Подсчитывались ретикулярные клетки, иммунобласты, большие, средние и малые лимфоциты, тучные клетки, эози-нофилы, нейтрофилы, макрофага и митотически делящиеся клетки. Подсчет проводился на 20-40 полей зрения каждого структурного компонента, при этом учитывалось 500-1000 клеток. Кроме того, определялась площадь кровеносных сосудов, отдельно площадь посткапиллярных венул, а также внутри- и внесосу-дистого фибрина.

На криостатных срезах проводилось гистохимическое выявление кислой и щелочной фосфатаз, АТФ-азы, альфа-нафтол-ацетат эстеразы, пероксидазы и

и

нафтол-AS-D- хлор-ацетат-эстеразы в соответствии с разработкой для лимфоре-тикулярной ткани M.Chilosi et al. (1981).

Часть неокрашенных криостатных срезов подверглась исследованию в ультрафиолетовом спектре люминесцентного микроскопа "Л10МАМ Р2" для выявлена собственного свечения эластических волокон.

Для элекчронномикроскопического исследования материал фиксировался в забуференном 2,5% растворе глютаральдегида, дофиксировался в 1% растворе четырехокиси осмия, обезвоживался и заливался в энон-812 по общепринятой методике (Райхлин Н.Т. и соавт, 1981). Полутонкие срезы окрашивались по J.A.Lynn (1965) раствором толуидинового синего, после чего проводилась заточка пирамид. Ультратонкие срезы контрастировались уранилацетатом и цитратом свинца. Изучение объектов проводилось в электронных микроскопах "ЭМ-200", "ЭММА-4", "ПЭМ-100" и ".ТЕМ 100С".

Для иммуногистохимическнх реакций материал заливался 7% раствора жела-1ина на фосфатном буфере (PBS) и замораживался в жидком азоте, после чего готовились криостатные срезы толщиной 5-7 мкм. Срезы высушивались и фиксировались холодным ацетоном или 4% забуференным раствором параформаль-дегида (Mason D.Y, 1992; Taylor C.R, Cote R.J, 1994). При необходимости использовались другие фиксаторы (Боуэна, Карнуа) или проводилось исследование на нефиксированных срезах. Кроме того, иммуногистохимическне реакции ставились па дспарафинированных срезах архивных блоков, фиксированных 10% формалином.

Исследование проводилось с помощью набора моно- и поликлональных антител (МКАТ) фирм "BioGcncx Laboratories", "DAKO A/S", "Sigma Immuno Chemicals". Название, специфичность первых МКАТ и клеточное распределение представлено в таблице 1. Подбор оптимального разведения антител проводился по результатам инкубации срезов с удваивающимся разведением антисыворотки (Угрюмов М.В., 1996), либо в соответствии с сопроводительным описанием коммерческих МКАТ.

Иммуногистохимические реакции проводились иммунофлюоресцентным, непрямым и прямым иммунопероксидазным (PAP), биотин-стрептавидиновым (В-SA) методами, а также с помощью системы щелочная фосфатаза-анти-щелочная фосфатаза. Предпочтение отдавалось B-SA методу как наиболее чувствительному.

Характер иммуногистохимических реакций оценивали с учетом интенсивности и процента окрашенных клеток (Петров C.B., 1994). В каждом случае подсчитывали 200 клеток. Критерии иммуногистохимического окрашивания представлены в таблице 2.

Все морфометрические данные были обработаны статистически при помощи микроЭВМ "Электроника БЗ-21", компьютера IBM PC 386 с вычислением критерия Стъюдента в величины Р (достоверность различий между изучаемыми группами).

Анализ полученных данных проводился в зависимости от пола и возраста больных, локализации и гистологического типа первичной опухоли. Кроме того, с целью определения динамики процесса были выделены следующие группы: 1) контроль; 2) лимфоузлы без метастазов при I стадии рака; 3) лимфоузлы без метастазов при II стадии рака; 4) пораженные лимфоузлы при II и III стадиях: а) с микрометастазами; б) с метастазами различного объема. Таблица 1.

Специфичность МКАТ, используемых в качестве первых антител

антиген, специфичность МКАТ клеточное распределение

CD45 общелейкоцитарный антиген (все лей-

коциты)

CD2 Т-лимфоциты

CD3

CD4 Т-хелперы/индукторы

CD 8 Т-киллеры/супрессоры

CD 19 В-лимфоциты

CD20

CD10 не ограниченные линией иммунобласты

CD38

CD30 активированные лимфоциты

BLA36 активированные В-лимфошты

lambda-цепи иммуноглобулинов kappa-цепи иммуноглобулинов плазматические клетки

CD56 ЫК-клетки

ВМ1 гранулоциты

лизоцим свободные макрофаги моноцитарного происхождения

альфа-1 -антихимотрипсин фиксированные макрофаги - ретикулярные клетки (гистиоциты)

CD35 дендритные ретикулярные клетки

CD1 белок S100 интердигитируютгеие ретикулярные клетки

FVIIIR:Ag эндотелий сосудов

десмин виментин ламинин коллаген IV типа фибробластические ретикулярные клетки и внеклеточный матрикс

пан-цитокератины эпителиальный мембранный антиген эпителиальные клетки (метастазы рака)

Вс1-2 протоонкогеп, супрсссиругощий апоп-тоз

PCNA антиген ядерной пролиферации (размножающиеся клетки)

Для определения прогностических критериев в зависимости от иммуноморфоло-гическнх реакций лимфатических узлов, проводился расчет показателей 5-летней выживаемости больных раком. Учитывая, что все больные

Таблица 2.

Критерии оценки иммуногистохимических реакций

процент окрашенных клеток интенсивность реакции

отрицательн слабая умеренная выраженная

50 - 100 - + + + + + +

10- 50 - + + + + +

процент окрашенных клеток интенсивность реакции

отрицательн слабая умеренная выраженная

0- 10 - + + +

0 - - - -

были взяты нами под наблюдение не позже момента, от которого к окончанию исследования прошло необходимое для определения полного времени число лет (в данном случае -5), использовался прямой метод определения показателей выживаемости (Березкин Д.П., 1989). Расчет проводился по формуле Р„ = N„ / N0, где Р„ - показатель выживаемости за п интервалов, N0 - число больных на начало периода наблюдения, N„ - число больных, оставшихся живыми по истечении избранного периода наблюдения. При наличии больных, с которыми в течение избранного периода наблюдения контакт был потерян (L„), показатель выживаемости определялся по формуле Pn = N„ / N0-L„.

Формирование групп наблюдений проводилось по иммуногистохимической картине регионарных лимфоузлов и в зависимости от наличия и объема в них метастазов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительная иммуногистохимическая характеристика лимфатических узлов различных регионов в норме. После проведения сравнительного имму-ногистохимического анализа лимфоузлов пяти регионов мы установили, что их фенотип в целом стандартен. В той или иной степени выявляется экспрессия CD45 (общелейкоцитарный антиген), CD2 и CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы/ивдукгоры), CD8 (Т-киллеры/супрессоры), CD19 и CD20 (В-лимфоциты), PCNA (пролиферирукмцие клетки), CD10 и CD38 (не ограниченные линией иммунобласты), CD30 (активированные Т - и В-лимфоциты), BLA36

(активированные В-лимфоциты), lambda- и kappa-цепи иммуноглобулинов (плазматические клетки), CD56 (NK-клеткн), ВМ1 (гранулоциты), лизоцим (свободные макрофаги моноцитарного происхождения), альфа-1-антихимотрипсин (фиксированные макрофаги - гистиоциты синусов), CD35 (дендритные ретикулярные клетки), CD1 и белок S100 (интердигитирующие ретикулярные клетки), FVIIIR:Ag (эндотелий сосудов), дссмин, ламинин, пап-цитокератины, виментин, коллаген Г/ типа (фибробластические ретикулярные клетки и внеклеточный матрикс). Колебания клеточного состава и улы растру к-турных параметров также незначительны, что подтверждается и другими авторами (Сапин М.Р. и соавт., 1978; Трясучев П.М., 1983; Mori Y., Lennert К., 1969; Nopajaroonsri С. et al., 1971).

Зависимость иммуноморфологических реакций лимфатических узлов от пола и возраста больных, локализации и гистологического типа опухоли, клинической стадии заболевания. Реакции регионарных к опухоли лимфатических узлов неоднократно обсуждались в литературе. Предпринимались попытки выявить зависимость реактивных изменений лимфоидной ткани от различных параметров, что приводило к весьма противоречивым результатам. Согласно ряду авторов (Kodama Y. et al., 1976; Kimpton W.G. et al., 1983), имеются выраженные различия между пораженными и интактными узлами, в то же время существуют исследования (Takeuchi Н. et al., 1982), в которых показано, что специфических изменений в структуру лимфатического узла метастаз не вносит. Иногда даже отрицается корреляция между стадией заболевания и реактивными процессами в регионарных лимфоузлах (Oka М. et al., 1992). После проведения много-парамегрового анализа нам удалось установить, что лимфатические узлы различных регионов отвечают на развитие рака соответствующей локализации стереотипными иммуноморфологическими реакциями, которые мало зависят от пола и возраста больных, локализации и гистологического типа первичной опухоли, но в решающей степени определяются клинической стадией заболевания, а также наличием и объемом метастазов в лимфоидной ткани. Имеющиеся отли-

чия незначительны и определяются регионарными и возрастными особенностями лимфатических узлов. Наши данные подтверждаются иммуногистохимиче-ским изучением субпопуляций иммуноцитов в первичной опухоли (Тупицын H.H. и соавт., 1994). На основании идентификации МКАТ кластеров CD8, CD22, CD38, CD7, CD4, CD1 lb, CD37 установлено, что характерные особенности местного иммунитета в зависимости от гистологического типа опухоли отсутствуют. Более определенные взаимосвязи отмечены авторами между уровнем инфильтрации иммунокомпетентными клетками и такими клиническими характеристиками опухоли как ее размер (Т1-3), вовлеченность регионарных лимфоузлов (N0-2), то есть, со стадией заболевания. Учитывая эти факты и с целью определения динамики процесса мы провели анализ реактивных изменений в следующих группах: 1) контроль; 2) лимфоузлы без метастазов при I стадии рака; 3) лимфоузлы без метастазов при II стадии рака; 4) пораженные лимфоузлы при II и III стадии: а) с микрометастазами; б) с метастазами различного объема.

Специфические иммуноморфологические реакции регионарных лимфоузлов и их иммуногистохимическая классификация. На основании многопа-раметрового анализа, включая иммуногистохимические и улътраструктурные методы, мы считаем, что при раке различной локализации в регионарных лимфатических узлах в той или иной степени выражены специфические иммуномор-фологичсские изменения (паракортикальная гиперплазия, фолликулярная гиперплазия, синусный гистиоцитоз) и неспецифические стромально-сосудистые реакции (микроциркуляторные расстройства и фибропластические процессы в кап-сульно-трабекулярной основе и внеклеточном матриксе). Специфические иммуноморфологические реакции по иммуиогистохимичсскому статусу неоднородны и включают в себя несколько типов. Следует отметить, что рутинными гистологическими методами многие изменения не выявляются. Это привело к тому, что из поля зрения большинства исследователей, основывавшихся на хорошо известных постулатах, что паракортикальная зона является ответственной только за клеточные иммунные реакции, а лимфоидные фолликулы и мякотные тяжи -за гуморальные, выпал ряд важных, с нашей точки зрения, моментов. Не отрицая

общепризнанных фактов и учитывая их, мы считаем, что не всегда правильно считать паракортикальную зону исключительно Т-зависимым регионом, а фолликулы и мякотные тяжи - только В-зависимымн зонами. Различные клеточные элементы лимфатического узла в том или ином количестве находятся во всех его структурах и их соотношение при патологических процессах меняется, что соответственно влияет на функциональные особенности структурных компонентов. Это особенно отчетливо выявляется при иммуногистохимическом исследовании. Так, гиперпластическая паракортикальная реакция может развиваться в двух видах (таблица 3). I тип - преимущественно Т-клеточная гиперплазия с преобладанием CD45(+) лейкоцитов, CD1(+) незрелых Т-клеток, CD2 и CD3(+) зрелых Т-клеток, CD4(+) хелперов/индукторов, CD8(+) киллеров/супрессоров, CD56(+) NK-клеток, протеин S100(+) интердигитирующих ретикулярных клеток, FVIIIR:Ag(+) эндотелиоцитов посткапиллярных венул. II тип - Т-клеточная гиперплазия (CD45, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD56, протеин S100, FVIIIR:Ag) с высоким содержанием В-клсточной (гшазмоцитарной) популяции в виде CD19 и CD20(+) В-лимфоцитов, BLA-36(+) активированных В-клеток и антителосодер-жащих плазматических ictctok. Кроме того, при обоих типах гиперплазии в па-ракортикальпой зоне в большей или меньшей степени экспрессируются PCNA (пролиферирующис клетки), CD30 (активированные лимфоциты),

Таблица 3

Иммуногистохимический фенотип специфических иммуноморфологических реакций лимфатических узлов, регионарных к раковой опухоли

Антиген, специфичность МКАТ Клеточное распределение Иммуноморфологические реакции

фолликулярная гиперплазия паракорти-кальная гиперплазия синусный гистиоцитоз

1тип II тип 1П тип IV тип I тип II тип I тип Птип Штип

а б а б в а б

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

CD45 все лейкоциты + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

CD2 CD3 Т-лимфоциты + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

CD4 Т-хелперы/ индукторы + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + -

CD8 Т-киллеры/ супрессоры + + + + + + + + - + + + + - + + + - + - + -

CD19 CD20 В-лимфоциты + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + -

PCNA пролиферирую-щие клетки + + + + + + + + + - + + - + - + - + - V

CD10 CD38 не ограниченные линией иммунобласты + + + + + + + + + + + + - +

CD30 активированные лимфоциты + + + + + + + + - + + - + + - + - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

BLA36 активированные В- + + + ^ + J- + - - - + + + - + - + - -

лимфошггы

lambda- и плазматические + + + + 4- + + - + - + + - + + 4- + + 4- - -

kappa-цепи клетки

иммуногло-

булинов

CD56 №С-клетки + -1- 4- + + 4- + + + + - + - + + - - -

BMI гранулоциты + - + - + - + - + + - 4- - + + + + + + - + -

лизоцим свободные + - + - + - + - + + + + - + +• + + ■ . 4- - + -

макрофаги

моноцичарного

происхождения

a-1- фиксированные + - + - + . + - + + - 4 - + + + + + + + + 4- t- + +

антихимо- макрофаги-

трипсин ГИСI иониты

CD35 дендритные + + + + + + + 4-4- + - + + - + + - + + - 4- - - -

ретикулярные

кие тки

CD1 интердигши- + - + + + + + 4- + + + - + + 4- - 4- - 4- -

белок S100 рующие

ретикулярные

клетки

FVUIR:Ag эндотелий сосудов + + 4- + + + t + + J- - + + + + + - + - + - + - - +

десмин фибробласти- + - -1- - + - + - 1 4 4 - 4 - + - + - + - f- 4- - +

пан-цитоке- ческие

ратины ретикулярные + - + - + - + - + - - + . + - + - 4- - 4- - + -

виментин клетки и + - + - + - + - + + + - + - + - + - 4- - 4- - + - +

ламинин внеклеточный - - - - 4- h - + - + + + + 4- +

коллаген IV матрикс

типа + - 4 - + - + - -1- 4- - + - + + + + 4- +

SO

CD 10 и CD38 (иммунобласты), BMI (гранулоциты), лизоцим (пришлые моноциты-макрофаги). Таким образом, "Т-зависимая" паракортикальная зона может содержать значительное количество B-клеток на различных этапах дифференци-ровки, что зачастую нельзя определить не только по окраске гематоксилин-эозином или по Браше, но даже иммуногистохимически, если не использовать широкую панель МКАТ, поскольку, например, экспрессия CD45 не всегда является показателем активации Т-клеток (Caldwell C.W., 1990).

Еще более сложно организованными иммуногистохимически являются лим-фоидные фолликулы, особенно с герминативными центрами. Нам удалось выявить 4 основных типа гиперпластической фолликулярной реакции. I тип - преимущественно В-клеточные фолликулы с фенотипом: CD45 (общелейкоцитарный антиген), CD19 и CD20 (B-лимфоциты), BLA36 (активированные B-лимфоциты), CD10, CD38 (иммунобласты), PCNA (пролиферирующие клетки), CD30 (активированные лимфоциты), CD1 и CD35 (дендритные ретикулярные клетки), в мантийной зоне и интерфолликулярном регионе - lambda- и kappa-цепи иммуноглобулинов (+) плазмоциты. В отдельных случаях наблюдается экспрессия Bcl-2. II тип - B-клеточные фолликулы (CD45, CD 19, CD20, BLA36, CD10, CD38, PCNA, CD30, CD1, CD35) с повышенным содержанием Т- и NK-клеток (CD2, CD3, CD4, CD8, CD56): а) с преобладанием CD4(+) хелперно/индукторной субпопуляции; б) с преобладанием CD8(+) кил-лерно/супрсссорной субпопуляции. При этом экспрессия BLA36, PCNA, CD10, CD38, lambda- и kappa-цепей иммуноглобулинов особенно во 116 типе значительно ниже, чем в фолликулах I типа. Это объясняется тем фактом, что CD8(+) Т-клетки способны угнетать продукцию иммуноглобулинов разных классов (Alberts В. et al., 1994). Наличие значительной Т-клеточной популяции в лимфо-идных фолликулах отмечено и другими авторами (Jones E.L. et al, 1984; Mackay C.R. et al., 1992; Ree HJ. et al., 1993). К III типу мы отнесли преимущественно Т-клеточные фолликулы, которые, как правило, сочетаются с паракортикальной

гиперплазией и расположены рядом с посткапиллярными венулами. Преобладающей фенотип: CD45, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, протеин S100, в меньшей степени - CD10, CD38, CD30. Т-клеточныс узелки в паракортикалыюй зоне были обнаружены и другими исследователями (Van den Oord J.J. et al, 1985), которые описали здесь протеин S100(+) интердигитирующие ретикулярные клетки, ОКТ6(+) дендритные ретикулярные клетки, высокий эндотелий посткапиллярных венул и большое количество Т-хелперов/индукгоров и Т-киллеров/супрессоров (ОКТ4+, Leu3a+). Авторы по аналогии с В-фолликулами по степени зрелости выделяют первичные и вторичные Т-узелки и делают вывод, что эти образования отражают созревание Т-зоны и стадийность ее изменений в процессе презентации антигена Т-клеткам. Довольно редко, всего в 3% наблюдений иммуногистохимически выявляются преимущественно нелимфоидноклеточ-ные фолликулы (IV тип). При относительно небольшом содержании элементов лимфоплазмоцитарного ряда (CD45) здесь наблюдается высокая экспрессия ли-зоцима, альфа-1-антихимотрипсина, белка S100, десмина, пан-цитокератинов, виментина, ламинина и коллагена IV типа. Такой иммуно-гистохимический фенотип характерен для макрофагов и различных видов ретикулярных клеток, преимущественно фибробластических. Подобные фолликулы встречаются в лимфатических узлах и при других патологических состояниях. Например, при лимфо-мах эти образования экспрессируют CD21, CD23, виментин, CD68, белок S100, ламинин и коллаген IV типа (Gloghini A, Carbone А, 1993). В 18-42% случаев здесь встречаются кератин позитивные и в 23-37% случаев десмин-позитивные ретикулоциты (Domagala W. et al, 1992).

С развитием иммуногистохимических методов более подробно стала изучаться и реакция синусов, однако до настоящего времени отсутствует ее классификация. Проведенный нами анализ выявил несколько разновидностей реакций синусов при раке. I - нетрансформированные синусы (структура соответствует возрастной норме). II тип - синусный гистиоцитоз: а) с увеличением общей клеточ-ности за счет всех имеющихся здесь элементов с преобладанием фиксированных ретикулярных клеток (гистиоцитов), экспрессирующих альфа-1-

антихимотрипсин; б) с высоким содержанием пришлых макрофагов моноцитар-ного происхождения, содержащих лизоцим; в) с преобладанием В-клеточной популяции (CD19, CD20, BLA36, lambda- и kappa-цепи иммуноглобулинов). III тип - дегенеративный синусный гистицитоз, сопровождающийся опустошением и обеднением клеточными элементами или лимфостазом. Часто при этом наблюдается склероз с высоким содержанием фибробластических ретикулярных клеток и истинных фибробластов. Следует отметить, что нам не удалось выявить синусный 1истиоцитоз Т-клеточного типа, наподобие B-клеточной синусной реакции. Это объясняется тем, что моноцитоидные клетки синусов имеют поверхностные маркеры B-лимфоцитов (Sbeibani К. et al., 1984), а различные мононуклеарные элементы при синусном гистиоцитозе являются B-клетками, содержащими IgG (Cordoso de Almeida P. et al., 1984). Литориальные (береговые) клетки синусов также имеют отношение к гуморальным иммунным реакциям, так как их фенотип идентичен дендритным ретикулярным клеткам (Wacker H.H. et al., 1992), которые, как известно (Szakal A.K. et al., 1985), представляют антиген В-лимфоцитам.

Неспецифические стромалыю-сосуднстые изменения регионарных лимфоузлов при раке. Описанные выше иммуноморфологические реакции являются специфическими для местного иммунитета и возникают в ответ на антигенную стимуляцию. В то же время в лимфатических узлах всех исследуемых регионов имеют место неспецифические стромально-сосудисгые процессы, проявляющиеся в виде изменений кровеносного микроциркуляторного русла и капсульно-трабекулярной основы с внеклеточным матриксом. Было установлено, что сосуды резко полнокровны, просвет их расширен, стенки отечны, с низкой фосфатаз-ной активностью, содержат большое количество гликозамингликанов. Ретикулиновые волокна подвержены мультипликации и огрублению, эластические мембраны сосудов артериального типа утолщены, фрагментированы, обладают неравномерным свечением в ультрафиолетовом спектре. Ультраструктурное исследование выявляет гомогенизацию и набухание базалыюй мембраны, активацию эндотелия и отек субэндотелиального пространства. Реакция кровеносного мик-

роциркуляторного русла выражена настолько сильно, что даже синусы иногда подвергаются сосудистой трансформации и могут приобретать признаки кровеносных сосудов, причем лимфатический эндотелий начинает экспрессировать FVIII, что было отмечено и C.Scherrer, R.Maurer (1985), J.K.C.Chan et al. (1991). Наряду с подобными функциональными изменениями сосудистых степок происходит нарушение реологических свойств крови, происходит внутрисосудистое свертывание ее и отложение больших масс внутри- и внесосудистого фибрина, который окружает различные клеточные элементы лимфатического узла, а при метастазировании и клетки опухоли.

Вместе с нарушениями в системе микроциркуляции при I и II стадии рака во всех структурах лимфатических узлов обнаруживалась выраженная тучнокле-точная реакция с параллельным увеличением содержания в лимфоидной ткани гистамина и серотонина. При этом одни исследователи (Burtin С. et al., 1981; Chiara Р. et al., 1985) считают, что тучные клетки участвуют в подавлении опухолевой профессии, а другие (Лопунова Ж.К., 1981; Roche W.R., 1986) утверждают, что масгоциты могут в определенных условиях стимулировать рост новообразования.С нашей точки зрения, функция тучных клеток в противоопухолевой зашитс двояка. С одной стороны, это неблагоприятное влияние на микроциркуляцию, увеличение проницаемости сосудов, с другой, - реализация противосвер-тывающего эффекта и, как следствие, - предотвращение отложения внесосудистого фибрина, роль которого при развитии опухоли значительна.

Известно, что изменения в свертывающей системе крови у онкологических больных являются одним из клинических проявлений заболевания (Зербино Д.Д.. 1994). Обнаруженный нами в лимфатических узлах внесосуднстый фибрин, окружающий опухолевые клетки, может обеспечить не только их консолидацию и питание, по и предохранить от цитотоксического действия иммунокомпетент-ных элементов (Мкртчян Л.Н., 1983, 1991), что делает невозможным проявление иммунного ответа. Это может явиться одним из факторов приживления в лимфатическом узле метастазов. Кроме того, кровеносное микроциркуляторное русло тесно взаимосвязано с клеточными иммунными реакциями. Эндотелий активи-

рует Т-лимфоциты (Кузник Б.И. и соавт., 1981, 1985) и участвует в их рециркуляции (Gloddek В. et al, 1991), которая также может нарушаться при гиперфиб-ринемии.

Микроциркуляторные расстройства во многом определяют и другой вид неспецифических реактивных изменений, проявляющихся в капсульно-трабекулярной основе и межклеточном матриксе. Склеротические процессы реализуются на фоне гипоксических состояний, обусловленных расстройствами кровообращения. Это обнаруживается при ультраструктурном исследовании -выявляются активные фибробласты, синтезирующие коллаген. Усиление склероза в лимфоузлах при раке наблюдали и другие исследователи (Иваниченко И.Ф., Иваниченко Г.Г., 1975; Barsu М. et al., 1982), однако иммуногистохимическая картина при этом не описывалась. Мы установили, что неспецифические изменения капсульно-трабекулярной основы и межклеточного матрикса реализуются в виде экспрессии десмина, ламинина, виментина, коллагена IV типа, пан-цитокератинов, что коррелирует с увеличением числа фибробластических ретикулярных клеток, миофибробластов и истинных фибробластов, синтезирующих коллагеновые волокна. Оценивая эти реакции, отметим, что метастатические элементы взаимодействуют, агрегируются и изолируются стромальными элементами, что является одним из факторов роста опухоли (Gowri Y. et al., 1993), при этом важная роль в адгезии неопластических клеток отводится ламинину (Аничков Н.М., 1986; Islam S.M. et al., 1993). Кроме того, макрофагально-гистиоцитарные элементы, обнаруживаемые в большом количестве при фибро-пластических процессах, обладают выраженной прокоагуляционной активностью и трансформируют фибриноген в фибрин (Semeraro N. et al, 1990; Costantini V. et al, 1992), о роли которого в метастатическом процессе говорилось выше.

Динамика иммуноморфологических и стромально-сосудистых изменений регионарных лимфоузлов в процессе развития рака. Специфические имму-номорфологические изменения и неспецифические стромально-сосудистые реакции в процессе развития рака имеют определенную динамику. На ранних ста-

днях происходит некоторое увеличение общего числа СГ)45(+) клеток. В гипер-плазнрованиой паракортикальной зоне, площадь которой значительно возрастает, наблюдается выраженная экспрессия С02 и СБЗ Т-клеточных антигенов, что реализуется как за счет СБ4(+) хелперов/индукторов, так и С08(+) килле-ров/супрессоров. Увеличивается содержание СБ10(+) и СЭ38(+) лимфобластов, СОЗО(+) активированных лимфоцитов и СБ56(+) ИК-клеток. Кроме того, нарастает- процент СБ1(+) и протеин Б100(+) интердигишрующих ретикулярных клеток, отвечающих за антигенную стимуляцию Т-лимфоцитов. Здесь же появляются в большом количестве лизоцим (+) свободные макрофаги моноцитарного происхождения. Следует отметить и увеличение объема РУПП1:А§(+) посткапиллярных венул, через которые осуществляется рециркуляция лимфоцитов. Описанная картина свидетельствует о выраженном клеточном иммунном ответе у больных с I стадией рака.

Па этом же этапе опухолевого роста происходит манифестация гуморальных иммунных реакций. Лимфоцдные фолликулы пшерплазируютея с появлением реактивных центров, в которых увеличивается число СБ19(+) и С020(+) В-лимфоцитов, в том числе активированных, определяемых по экспрессии ВЬА-36, а также РСЫА(+) нролиферирующих клеток. Имеет место СОЮ(+) и СВ38(+) бласттрансформация. Увеличивается число СО!(+) и СБ35(+) дендритных ретикулярных клеток, которые ответственны за антигенную стимуляцию В-лимфоцитов и имеют общий с ними С020 дифференцировочный антиген. В мя-котных тяжах при этом возрастает процент антителообразующих плазматических клеток.

Не остается шпаклюй при развитии рака и макрофагально-фагоцитарная система лимфатического узла, которая представлена свободными и фиксированными макрофагами. К первым относятся пришлые клетки моноцитарного происхождения, выявляемые как лизоцим (+) элементы, а ко вторым альфа-1-антихимотрипсин(+) фагоцитирующие ретикулярные клетки (гистиоциты) синусов, СБ1(+) и СБ35(+) дендритные ретикулярные клетки фолликулов, а также С01(+) и белок Я100(+) интердиппирующие ретикулярные клетки паракорти-

кальной зоны (Taylor C.R., Cote R.J., 1994). Наиболее выраженным проявлением макрофагальной реакции принято считать синусный гистиоцитоз. Действительно, при развитии опухоли объем синусов значительно расширяется с увеличением в них количества альфа-1-антихимотрипсин(+) ретикулярных клеток и лизо-цим(+) свободных макрофагов. По сравнению с контролем, здесь значительно больше Т- и B-клеток, иммунобластов, плазматических клеток, а также эозино-филов и нейтрофилов. При ультраструктурном исследовании обнаруживается активация ретикулярных клеток, которые переходят в разряд фагоцитирующих. Кроме того, в состоянии фагоцитоза находятся свободные макрофаги и нейтро-филы. При переходе заболевания во II стадию в непораженных метастазами лимфатических узлах происходят существенные изменения. Несмотря на сохранение площади паракортикальной зоны и общего числа CD45(+) клеток, происходит уменьшение процента CD2(+) и CD3(+) Т-лимфоцитов, что реализуется, в основном, за счет CD8(+) киллерно/супрессорной субпопуляции. При сохранении числа CD1(+) и белок S100(+) интердигитирующих ретикулярных клеток, снижается количество CD10(+) лимфобластов, CD30(+) активированных лимфоцитов, а также площади FVIIIR:Ag(+) посткапиллярных венул. Данная картина подтверждается и на ультраструюурном уровне: Т-лимфобласты и трансформированные иммунные клетки встречаются реже, также как и межклеточные контакты. Посткапиллярные венулы при этом зачастую выглядят запустевшими и без признаков миграции через них лимфоцитов.

В то же время гуморальные иммунные реакции при II стадии рака сохраняются в полном объеме. Так, площадь гиперплазированных фолликулов с реактивными центрами имеет тенденцию к увеличению. Здесь наблюдается высокое содержание B-лимфоцитов и плазмобластов. В корковом плато и мякотных тяжах выражена плазмобластгрансформация и илазматизация. Ультраструктура клеток B-ряда свидетельствует об активном синтезе антител.

На этом же этапе опухолевого роста в синусах происходят определенные им-муногистохимические и ультраструктурные изменения, которые при рутинных гистологических методах не видны. При окраске гематоксилин-эозином они рез-

ко расширены, заполнены различными клеточными элементами, что ошибочно расценивается как выраженный синусный гистиоцитоз и приводит к его противоречивой прогностической оценке. Несмотря на сохранение площади синусов н общей их клеточности происходит уменьшение лизоцим (+) свободных макрофагов, перераспределение популяции лимфоцитов в сторону CD20(+) B-клеток за счет CD2(+) и CD3(+) Т-популяции. Что же касается основных элементов синусов - ретикулярных клеток, то при сохранении общего числа альфа-1-аптихимотрипсин (+) форм, происходит снижение их фагоцитарной активности, что обнаруживается на ультраструктурном уровне.

При появлении метастазов в лимфатических узлах происходит снижение площади паракортикальной зоны с уменьшением общего числа CD2(+) и CD3(+) Т-клеток CD4(+) хелперно/индукторной и CD8(+) киллерно/супрессорной субпопуляций. Наши данные не подтверждают гипотезу о возрастании количества клеток-супрсссоров при метастатическом процессе (leger L., 1990). Соответственно падает процент CD30(+) активированных лимфоцитов и CD10(+) лимфоб-ласгов. Редкой находкой являются лизоцим (+) свободные макрофаги. В то же время, при метастазировашш происходит увеличение CD1(+) и белок S100(+) интердигатиругощих ретикулярных клеток, что было отмечено и другими исследователями (Imai Y., Yamakawa М., 1992). Этот факт, видимо, свидетельствует о попытке иммунной системы реализовать антигенную стимуляцию инакгивиро-ваштого Т-клеточного иммунитета, чего, однако не происходит и трансформации лимфоцитов в цитотоксические формы не наблюдается. Более того, электрошю-микроскопическое исследование наряду с петрансформированными Т-клетками в паракортикальной зоне выявляет большое количество дегенерирующих клеточных форм с пикнотичным ядром и разрушенными ультраструктурами в ва-куолизированной цитоплазме. Параллельно ннактивируется и CD56(+) система NK-клеток, которая при развитии опухоли играет защитную роль (Андрианов И.Г. и соавт., 1989; ШпарыкЯ.В. и соавт., 1991).

Резким структурно-функциональным изменениям при появлении метастазов подвержены синусы, что выявляется уже при обычных окрасках срезов. Как пра-

вило, площадь синусов значительно снижается. Если же они остаются расширенными, то на фоне лимфостаза обнаруживается обеднение их клеточными элементами. Иммуногистохимический и ультраструктурный анализ показывает практически полное исчезновение свободных макрофагов и падение фагоцитарной активности фиксированных, а также снижение процента Т-клеток и активированных лимфоцитов. Имеются интересные данные (Ршб М.А. Л а1, 1986; МсОсе 1СШ. й а1, 1992), что при такой картине синусов, большинство находящихся здесь клеток имеет общий фенотип с В-лимфоцитами. Следует отметить и снижение количества ВМ1(+) гранулоцитов, которые необходимы для борьбы с опухолевыми клетками (ЗсЬоПеИ ТВ. е! а1, 1992). Кроме того, на данном этапе опухолевого роста часто обнаруживается склероз синусов, содержащих при ультраструктурном исследовании множество активных фибробластов.

Таким образом, при метастазировании происходит инактивация макрофагаль-но-моноцитарной системы и клеточного иммунитета, чего нельзя сказать о гуморальных иммунных реакциях. Площадь фолликулов с крупными реактивными центрами сохраняется также как и общее число В-клеток. Умеренное снижение числа плазматических клеток в кортикальной зоне и мякотных тяжах носит относительный характер - по сравнению с контролем плазматизация выше более чем в три раза. При иммуногистохимическом и ультраструктурном исследовании выявляется высокая антителообразующая способность плазмоцитов. Подобная В-клеточная (плазмоцитарная) реакция сохраняется практически до полного замещения лимфоузла метастазами и сохранившиеся островки лимфоидной ткани содержат гиперплазированные фолликулы с реактивными центрами. Наши данные подтверждаются и исследованием (Володько Н.А. и соавт, 1989), в котором показано, что экспрессия ИКО-66 (маркера активированных В-лимфоцитов) не меняется при метастатическом поражении лимфоузлов.

Таким образом, при развитии раковой опухоли в регионарных лимфатических узлах уже на ранних стадиях происходит перераспределение иммунокомпетент-ных клеток и сдвиг иммунных реакций в сторону В-клеточного гуморального

иммунитета, что приводит на более поздних стадиях к инактивации Т-клеточного иммунитета.

Прогностическое значение реактивных изменении регионарных лимфатических узлов при раке. Параллельно с изучением иммуноморфологичееких реакций лимфатических узлов предпринимались неоднократные попытки связать их с прогнозом заболевания. Однако, вследствие отсутствия иммуногистохими-ческих данных, это привело к противоречивым результатам. Так, гиперплазия лимфоидиых фолликулов одними авторами (Бугров В.В., Чернов В.П., 1989; Гер-самия Т.К. и соавт., 1996) расценивается как благоприятный прогностический критерий, а другими (Брувере Р.Ж., Витолинь JI.A., 1978) - как весьма неблагоприятный фактор. Синусный гистиоцитоз также считается либо одним из хороших признаков (Cappellari J.O. et al., 1990), либо как процесс, совершенно не влияющий на 5-летнюю выживаемость (Niepolomska W., 1973). В то же время значение паракортикальной гиперплазии трактуется слишком однозначно - всегда как реакция, увеличивающая сроки выживаемости онкологических больных. На основании им.муногистохимического и ультраегруктурного исследования и сравнения полученных данных с 5-летней выживаемостью мы установили, что лучший прогноз, независимо от локализации опухоли, коррелирует с паракортикальной гиперплазией I типа, фолликулярной гиперплазией Иб и Ш типов, а также синусным гистиоцитозом Па и 116 типов. Пятилетняя выживаемость при этом выше среднестатистических показателей для раковой опухоли каждой локализации (таблица 4). Хуже прогноз при фолликулярной гиперплазии Па типа и при наличии нетрансформированных синусов I типа - пятилетняя выживаемость соответствует среднестатистическим показателям. Самая низкая выживаемость онкологических больных коррелирует с паракортикальной гиперплазией II типа, фолликулярной реакцией I и IV типов, а также синусным гистиоцитозом Пв, Illa и III6 типов.

Метастатическое поражение лимфатических узлов: иммуногистохимия, реакция окружающей лимфоидной ткани, прогностическое значение. Особую проблему в современной онкоморфологии представляет реакция лимфати-

ческих узлов на метастатическое поражение. Однако анализ литературы показывает, что роль регионарных лимфатических узлов в процессе метастазирования опухоли нельзя считать выясненной. Это объясняется тем, что в большинстве работ для выявления метастазов не применялись высокоспецифичные иммуноги-стохимические методы. При этом в группы наблюдений интакгных лимфоузлов попадали пораженные узлы с невыявленными метастазами, что, естественно, приводило к недостоверным результатам. Сейчас для идентификации опухолевых клеток в лимфоидной ткани применяются моноклональные антитела, в первую очередь, против пан-цитокератинов и эпителиального мембранного антигена (Пугачев К.К., Шимбирева И.Б., 1991; Taylor C.R., Cote R.J., 1994). В то же время одни исследователи (Cote R.J. et al., 1992) утверждают, что наличие даже небольшого скопления опухолевых клеток ухудшает прогноз, но другие (Fisher E.R. et al., 1978; Wilkinson E.J. et al., 1981) считают, что разница в выживаемости у больных с непораженными лимфоузлами и с микрометастазами в них составляет не более 10%. Более того, некоторые авторы (Kainz С. et al., 1993) убеждены, что никакого клинического значения выявление скрытых опухолевых клеток не имеет, поскольку статистически нет достоверных различий в прогнозе между группами больных со свободными и метастатическими лимфоузлами. В связи с этим I.Mittra (1993) задается вопросом: "Метастазирование в регионарные лимфатические узлы по-прежнему является прогностическим критерием или уже устарелым предубеждением?" Таким образом, на первый план, по нашему мненшо, выступает состояние самих лимфоузлов, поскольку именно реакции их

Таблица 4. Пятилетняя выживаемость онкологических больных в зависимости от различных типов иммуногистохимичсских реакций лимфатических узлов

паракор- фолликулярная гиперплазия синусный гистиоцитоз

тикаль-ная

Локализация гиперплазия

опухоли тип тип реакции тип реакции

реакции

I Л 1 На Нб III IV I На Иб Пв Ша Шб

1. 0.97 0.62 0.63 0.71 0.89 0.95 0.32 0.67 0.82 0.93 0.52 0.54 0.32

желудок 2. 0.81 0.41 0.37 0.63 0.77 0.84 0.21 0.61 0.71 0.78 0.46 0.47 0.18

3. 0.76 0.22 0.19 0.58 0.68 0.62 0.04 0.32 0.59 0.78 0.17 0.19 0.09

4. 0.41 0.12 0.05 0.30 0.41 0.38~1 - 0.17 0.34 0.29 0.09 0.03 -

1. 0.85 0.60 0.59 0.79 0.82 0.83 0.19 0.74 0.82 0.93 0.61 0.42 0.30

легкое 2. 0.73 0.37 0.34 0.78 0.80 0.80 0.09 0.71 0.80 0.82 0.54 0.35 0.24

3. 0.46 0.21 0.19 0.39 0.45 0.42 - 0.38 0.40 0.62 0.27 0.11 0.10

4. 0.25 0.10 0.07 0.23 0.27 0.21 - 0.09 0.13 0.22 0.01 0.02 0.01

1. 0.92 0.76 0.83 0.93 0.97 0.97 0.74 0.77 0.85 0.91 0.69 0.41 0.30

молочная железа 2. 0.91 0.64 0.78 0.91 0.95 0.97 0.68 0.70 0.87 0.89 0.57 0.35 0.15

3. 0.61 0.23 0.53 0.82 0.89 0.88 0.27 0.38 0.64 0.65 0.25 0.17 0.03

4. 0.25 0.08 0.17 0.31 0.35 0.37 0.08 0.14 0.29 0.33 0.06 0.05 -

толстый кишечник ]. 0.84 0.52 0.57 0.62 0.67 0.85 0.45 0.64 0.72 0.83 0.57 0.40 0.39

2. 0.85 0.31 0.46 0.58 0.61 0.83 0.33 0.58 0.66 0.81 0.42 0.31 0.27

3. 0.67 0.22 0.19 0.35 0.45 0.65 0.14 0.24 0.39 0.57 0.24 0.14 0.18

4. 0.29 0.07 0.04 0.19 0.21 0.31 0.02 0.11 0.20 0.32 0.08 0.01 0.02

шейка матки 1. 0.98 0.88 0.68 0.70 0.75 0.91 0.54 0.79 0.83 0.95 0.73 0.51 0.48

2. 0.85 0.74 0.53 0.71 0.72 0.90 0.38 0.67 0.79 0.92 0.69 0.43 0.40

3. 0.42 0.27 0.30 0.52 0.48 0.59 0.19 0.40 0.39 0.68 0.37 0.17 0.14

4. 0.37 0.09 0.15 0.29 0.31 0.38 0.07 0.22 0.21 0.45 0.19 0.08 0.02

Примечание: 1 - лимфоузлы без метастазов при I стадии рака;

2 - лимфоузлы без метастазов при II стадии;

3 - лимфоузлы с микрометастазами при II-III стадии;

4 - лимфоузлы с метастазами различного объема при И-Ш стадии.

структурных и клеточных элементов определяют судьбу метастазов и существенно влияют на прогноз при их отсутствии. Как нам удалось установить, наличие метастазов, особенно небольшого объема, в регионарных лимфоузлах не всегда является фатальным признаком, ухудшающим прогноз. Пятилетняя выживаемость, независимо от локализации и гистологической структуры опухоли, определяется реакциями окружающей лимфоидной ткани. При наличии паракорти-кальной гиперплазии 1 типа, фолликулярной гиперплазии 116 и Ш типов, синусного гастиощггоза lia и 116 типов 5-летняя выживаемость больных с метастазами в лимфоузлах выше, чем у больных с непораженными опухолью лимфоузлами, но с наличием паракортикалыюй гиперплазии II типа, фолликулярной гиперплазии I и IV типов, синусного гистиоцитоза Пв, Ша и 1116 типов. Это свидетельствует о том, что микрометастазы и часть макрометастазов могут эффективно уничтожаться иммунокомпетентными клетками лимфатического узла. При этом показателем агрессивности метастазов можно считать экспрессию PCNA (антиген ядерной пролиферации) и Вс1-2 (протоонкоген, супрессирующий апоп-тоз). Содержание PCNA и Вс1-2 зависит от иммуноморфологичсских реакций окружающей лимфоидной ткани и коррелирует с 5-летней выживаемостью. Высокое содержание в опухолевых клетках PCNA и Вс1-2 значительно ухудшает прогноз заболевания. Более достоверным критерием является экспрессия PCNA, которая не зависит от локализации и гистологического типа опухоли, тогда как экспрессия Вс1-2 при раке различной локализации может колебаться в широких пределах. Неоднозначная роль Вс1-2 в разных типах опухоли прослежена и другими авторами (Барышников А.Ю., 1996).

Факторы, определяющие неполноценность местного иммунного ответа в регионарных лимфоузлах при раке. В результате комплексного исследования нам удалось выявить ряд факторов, способствующих неполноценности местного иммунного ответа, определяющих неблагоприятный прогноз и генерализацию опухолевого процесса. 1) Уменьшение уже на ранних стадиях рака общего количества Т-клеток, Т-лимфобластов и, как следствие, активированных (иммунных) лимфоцитов. Известно, что только подобные клетки из всей Т-популяции сио-

собны элиминировать опухолевые элементы, а выраженная инфильтрация новообразования CD4(+), CD7(+), CD8(+) Т-клетками снижает процесс метастазиро-вания в лимфоузлы (Тупицын Н.Н. и соавт., 1994). 2) Высокое содержание на всех этапах опухолевого роста В-клеток, плазмобластов и антителообразующих плазмоцитов, которые могут блокировать гуморальными антителами Т-клеточный цитотоксический эффект (Доросевич А.Е., 1988; Hellstrom К.Е., Hellstrom I., 1974, 1976). Это подтверждается и ультраструкгурным исследованием (Пинчук В.Г., Квачев В.Г., 1980), в котором показано, что при развитии опухоли происходит деструкция лимфоцитов тимусзависимых зон с исчезновением в них Т-лимфобластов, тогда как в мякотных тяжах и корковом плато сохраняются неповрежденные плазматические клетки. 3) Недостаток или снижение числа CD8(+) Т-супрессоров. Данные клеточные элементы регулируют антителоге-нез и способны угнетать продукцию иммуноглобулинов разных классов (Ieger L., 1990; Alberts В. et al., 1994), уменьшая тем самым их блокирующее действие на цитотоксические Т-клетки. Наши данные не подтверждают предположение, что основная цитотоксичность реализуется за счет CD4(+) форм (Yamaki Т. et al., 1990; Fujimoto Т. et al., 1992). He отвергая важной роли CD4(+) элементов, мы склонны согласиться с тем, что большинство лимфокин-активированных киллеров в лимфоузлах при раке, в основном, CD8(+) клетки (Watanabe Y. et al., 1990), причем если мегастаз в лимфоидной ткани некротизируется, то CD8(+) субпопуляция увеличивается на 40% (Ogawara Т. et al., 1992). Нужно учитывать и тот факт, что на некоторые антигены CD4(+) Т-лимфоцигы пролиферируют, а CD8(+) - нет (Parker К.Е. et al., 1992), кроме того, при антигенной стимуляции CD4(+) клетки интенсивно поступают из 1фови (Mackay C.R. et al., 1992). 4) Уменьшение в результате общего снижения числа Т-клеток, хелперной субпопуляции, необходимой для трансформации цитотоксических лимфоцитов. Снижение процента CD4(+) элементов не сказывается на активации В-клеток, поскольку их пролиферация и дифференцировка в ответ на ряд антигенов возможна без помощи Т-хелперов (Alberts В. et al., 1994). 5) Уменьшение количества CD56(+) NK-клеток, а также ВМ1(+) нейтрофилов и эозинофилов, тогда как эти клеточ-

ные элементы обладают неспецифическими опухолелитичсскими свойствами, которые выявлены как у NK-элементов (Андрианов И.Г. и соавт, 1989), так и у гранулоцмтов (Schofietd J.B. et al, 1992). 6) Уменьшение количества пришлых (свободных) фагоцитов моноцитарного происхождения и падение фагоцитарной активности фиксированных макрофаюв - ретикулярных клеток (гистиоцитов) синусов. 7) Высокая функциональная активность дендритных ретикулярных клеток фолликулов. Эти клетки реализуют переработку антигена для B-клеток и включают последние а пролиферацию и дпфферепцировку (Taylor C.R, Cote K.J, 1994), причем дендритные ретикулоциты захватывают антиген в лимфатическом узле первыми (Macatonia S.E. et al, 1986), что в какой-то степени объясняет и "отставание" Т-клсточных иммунных реакций. 8) Нереализованная стимуляция Т-клеточного иммунитета интердипггарующими ретикулярными клетками, которые перерабатывают антиген для Т-лимфоцитов. Несмотря на повышение при развитии рака числа протеин S100(+) ингердигитнрующих рстикулоця-тов (Imai Y, Yamakawa M, 1992), клеточные иммунные реакции инактивируют-ся. Это объясняется блокирующими факторами, циркуляторнымм расстройствами и нехваткой CD4(+) элементов. 9) Стромально-сосудистые реакции с отложением внесосудистого фибрина и склеротическими процессами. Фибрин (Мкртчян Л.Н, 1983, 1991) и соединительная ткань (Barsu M. et al, 1982) в лимфатических узлах способствует фиксации, консолидации и питанию опухолевых клеток, а также изолирует от действия иммунокомпетентных элементов.

ВЫВОДЫ:

1. Лимфатические узлы различных регионов здорового человека имеют строго определенный стандартный иммуногистохимический фенотип. В той или иной степени в лимфоузлах экспрессируются: CD45 (общелейкоцшарный антиген), CD2 и CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы/ицдукгоры), CD8 (Т-киллеры/супрессоры), CD19 и CD20 (B-лимфоциты), PCNA (иролиферируюгцие клетки), CD10 и CD38 (не ограниченные линией иммунобласты), CD30

(активированные лимфоциты), BLA36 (активированные B-лимфоциты), lambda-и kappa-цепи иммуноглобулинов (плазматические клетки), CD56 (NK-клетки), ВМ1 (гранулоциты), лизоцим (свободные макрофаги моноцитарного происхождения), альфа- 1-ашихимотрипсин (фиксированные макрофаги - гистиоциты синусов), CD35 (дендритные ретикулярные клетки), CD1 и белок S100 (интердиштирующие ретикулярные клетки), FVIIIR:Ag (эндотелий сосудов), десмин, ламинин, виментин, пан-цитокератины, коллаген IV типа (фибробластические ретикулярные клетки, миофибробласты и внеклеточный матрикс).

2. Регионарные лимфатические узлы отвечают на развитие рака соответствующей локализации стереотипными иммуноморфологическими реакциями, которые мало зависят от пола и возраста больных, локализации и гистологического типа первичной опухоли, но в решающей степени определяются клинической стадией заболевания, а также наличием и объемом метастазов в лимфоидной ткани. Имеющиеся отличия незначительны и определяются регионарными и ин-волютивпыми особенностями лимфатических узлов.

3. При раке различной локализации в регионарных лимфатических узлах в той или иной степени выражены специфические иммуноморфологические изменения и неспецифические стромально-сосудистыс реакции. К первым относятся пара-кортикальная гиперплазия, фолликулярная гиперплазия и синусный гистиоцитоз, ко вторым - микроциркуляторные расстройства и фибропластические процессы в капсульно-трабекулярной основе и межклеточном матриксе.

4. Специфические иммуноморфологические реакции (паракортикальная и фолликулярная гиперплазия, синусный гистиоцитоз) разнообразны по иммуно-гистохимическому профилю и включают в себя несколько типов, которые рутинными гистологическими методами не выявляются.

5. Паракортикальная гиперплазия иммуногистохимически классифицируется следующим образом: I тип - преимущественно Т-клеточная гиперплазия с преобладающим фенотипом: CD45, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD56, протеин S100, FVIIIR:Ag; II тип - Т-клеточная гиперплазия с высоким содержанием В-

клеточной (плазмоцптарной) популяции: CD19, CD20, BLA36, lambda- и карра-цепн иммуноглобулинов. При обоих типах гиперплазии в паракортикальной зоне в большей или меньшей степени экспрессируготся PCNA, CD30, CD10, CD38, ВМ1 и лизоцим.

6. Гиперпластическая фолликулярная реакция иммутгогистохимически подразделяется на: 1 тип - преимущественно B-клеточные фолликулы с фенотипом: CD45. CD 19, CD20, BLA36, CD10, CD38, PCNA, CD30, CD1, CD35, lambda- и kappa-цепи иммуноглобулинов; II тип - В-клсточныс фолликулы с высоким содержанием Т- и NK-клеток (CD2, CD3, CD4, CD8, CD56): а) с преобладанием CD4(+) хелперно/индукгорной субпопуляции; б) с преобладанием CD8(+) киллерно/супрессорной субпопуляции; Экспрессия BLA3 6, PCNA, CD 10, CD38, lambda- и kappa-цепей иммуноглобулинов в фолликулах II типа, особенно 116, снижена. III тип - преимущественно Т-клеточпые фолликулы, сочетающиеся с паракортикальной гиперплазией и расположенные рядом с посткапиллярными венулами. Преобладающий фенотип: CD45, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, протеин S100, в меньшей степени - CD10, CD38, CD30. IV тип - преимущественно ие-лимфоцдноклеточные фолликулы - на фоне низкой экспрессии CD45 преобладает следующий фенотип: лизоцим, альфа-1-антихимотрипсин, протеин S100, дес-мин, виментин, коллаген IV типа, ламшшн, иногда - пан-цитокератины.

7. Реакция сштусов иммутгогистохимически классифицируется как: I тип - ¡^трансформированные синусы; II тип - синусный гистиоцитоз: а) с увеличением общей клеточности за счет всех имеющихся здесь элементов с преобладанием альфа- 1-антихимотрипсин (+) фиксированных ретикулярных клеток (гистиоцитов); б) с высоким содержанием пришлых лизоцим (+) клеток - свободных макрофагов моноцитарного происхождения; в) с высоким содержанием ß-клеточной популяции, включая антителопродуценты (CD19, CD20, BLA36, lambda- и kappa-цепи иммуноглобулинов); III тип - дегенеративный синусный гистиоцитоз: а) опустошение и обеднение клеточными элементами; б) лимфо-стаз или склероз с высоким содержанием фибробластических ретикулярных клеток и истинных фибробластов.

8. Бласпрансформация, наблюдаемая при специфических иммуноморфоло-гических реакциях, выявляется по экспрессии СБ 10 и СБ38 (не ограниченные линией иммунобласты) и СБЗО (активированные лимфоциты), что может быть реализовано за счет как лимфо-, так и плазмобластов. Для их идентификации дополнительно необходимо иммуногистохимическое исследование клеточного окружения: при лимфобласпрансформации возрастает количество СШ(+) и протеин Б100(+) интердигитирующих ретикулярных клеток, отвечающих за представление антигена Т-лимфоцитам; при плазмобласпрансформации возрастает число СБ35(+) дендритных ретикулоцитов, стимулируюпщх пролиферацию В-клеток.

9. Неспецифическая реакция кровеносного микроциркуляторного русла проявляется в виде увеличения общей площади РУПЖ:Ад(+) сосудов, дистрофических изменений эндотелиоцитов и повышения проницаемости сосудистых стенок, что, в конечном итоге, приводит к отложению больших масс внутри- и вне-сосудистого фибрина. Подобные циркуляторные расстройства определяются содержанием в лимфоидной ткани биологически активных веществ - гистамина и серотонина, что, в свою очередь, обусловлено тучноклеточной реакцией.

10. Неспецифические реакции капсульно-трабекулярной основы и межклеточного матрикса реализуются в виде экспрессии десмина, ламинита, виментина, коллагена IV типа, панцитокератинов, что коррелирует с увеличением числа фибробластических ретикулярных клеток и истинных фибробластов, синтезирующих коллаген.

11. Специфические иммуноморфологические изменения и неспецифические стромально-сосудистые реакции в процессе развития рака имеют определенную динамику. На фоне нарастающих микроциркуляторных расстройств и склеротических процессов происходит перераспределение иммунокомпетентных клеток и сдвиг иммунных реакций в сторону В-клеточного гуморального иммунитета, что приводит на более поздних стадиях к инактивации Т-клеточных иммунных реакций и макрофагально-моноцитарной системы при сохранении плазмоцитарной реакции с высокой антителообразующей способностью клеток.

12. Иммуногистохимические реакции регионарных лимфатических узлов являются одним из ключевых параметров, определяющих 5-летнюю выживаемость больных раком. Лучший прогноз, независимо от локализации опухоли, коррелирует с паракортикальной гиперплазией I тина, фолликулярной гиперплазией 116 и ТП типов, а также синуспьтм гистиоцитозом IIa и Пб типов - пятилетняя выживаемость при этом выше среднестатистических показателей. Хуже прогноз при фолликулярной гиперплазии IIa типа и нетрансформированных синусах I типа -пятилетняя выживаемость соответствует среднестатистическим показателям. Самая низкая выживаемость онкологических больных коррелирует с паракортикальной гиперплазией II типа, фолликулярной реакцией I и IV типов, а также синусным гистиоцитозом IIb, Illa и Шб типов.

13. Выявление скрытых микрометастазов рака в лимфатических узлах требует комплексного подхода. При рутинных гистологических методах отдельные опухолевые клетки не выявляются в 50-70% случаев, при использовании тех же методов на серийных срезах - в 20-30%, а иммуногистохимнческий метод (пан-цитокератины) в ряде случаев даст положительную реакцию в дендритных и фибробластических ретикулярных клетках, а таюке во внеклеточном матриксе. Лучшим сочетанием является использование мультисерийных срезов с иммуно-гистохимическим исследованием (пан-цитокератииы и эпителиальный мембранный антиген), что позволяет выявить даже единичные злокачественные элементы в 90-100% случаев.

14. Наличие метастазов, особенно небольшого объема в регионарных лимфоузлах не всегда является неблагоприятным прогностическим признаком, поскольку 5-летняя выживаемость при этом во многом определяется реакциями окружающей лимфоидной ткани. При наличии паракортикальной гиперплазии I типа, фолликулярной гиперплазии Пб и III типов, синусного гистиоцитоза IIa и Пб типов 5-летняя выживаемость больных с метастазами в лимфоузлах выше, чем у больных с непораженными опухолью лимфоузлами, но с наличием паракортикальной гиперплазии II типа, фолликулярной реакции I и IV типов, синусного гистиоцитоза IIb, Illa и Шб типов. Это свидетельствует о том, что местный

иммунный ответ в лимфатических узлах может эффективно реализовываться и при метастатическом процессе.

15. Показателем активности (агрессивности) метастазов следует считать экспрессию РС]чГА (антиген ядерной пролиферации) и Вс1-2 (протоонкоген, супрес-сирующий апоптоз), которая зависит от иммуногистохимических реакций окружающей лимфоидной ткани и коррелирует с 5-летней выживаемостью. Высокое содержание в опухолевых клетках РСЫА и Вс1-2 значительно ухудшает прогноз заболевания. Более достоверным критерием является экспрессия РСЫА, которая не зависит от локализации и гистологического типа опухоли, тогда как содержание Вс1-2 при раке различной локализации колеблется в широких пределах.

16. В случае неблагоприятного прогноза и генерализации опухолевого процесса факторами, способствующими неполноценности местного иммунного ответа являются: 1) Уменьшение уже на ранних стадиях рака общего количества Т-клеток, Т-лимфобластов и, как следствие, активированных (иммунных) лимфоцитов-киллеров - основных цитотоксических противоопухолевых элементов; 2) Высокое содержание на всех этапах опухолевого роста В-клеток, плазмобла-стов и антителообразующих плазмоцитов, которые могут блокировать гуморальными антителами Т-клеточный цитотоксический эффект; 3) Недостаток или снижение числа Т-супрессоров, способных угнетать продукцию иммуноглобулинов разных классов; 4) Уменьшение в результате общего снижения числа Т-клсток, хелперной субпопуляции, необходимой для трансформации цитотоксических лимфоцитов (что не сказывается на активации В-клеток, поскольку их пролиферация и дифференцировка в ответ на ряд антигенов возможна без помощи Т-хелперов); 5) Уменьшение количества 1ЧК-клсток, эозинофилов и нейтро-филов, обладающих неспецифическими опухолелитическими свойствами; 6) Уменьшение количества пришлых свободных фагоцитов моноцитарного происхождения; 7) Падение фагоцитарной активности фиксированных макрофагов-ретикулярных клеток (гистиоцитов) синусов; 8) Высокая функциональная активность дендритных ретикулярных клеток фолликулов, реализующих переработку антигена для В-клеток; 9) Нереализованная стимуляция Т-клеточного

иммунитета интердигатирующими ретикулярными клетками ларакортикальной зоны; 10) Стромально-сосудистые реакции с отложением внесосудистого фибрина и склерозом, что изолирует опухолевые клетки от цитотоксического действия иммунокомпетентных клеток, а также обеспечивает их фиксацию, консолидацию и питание.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Примененный в работе набор моноклональпых антител может применяться как стандартная панель при исследовании лимфатических узлов, регионарных к раку других локализаций и гистологических типов, а также при других патологических процессах с вовлечением лимфоузлов.

2. Для идентификации скрытых метастазов рака в регионарных лимфатических узлах может быть рекомендован метод, основанный на сочетании мульти-серийных срезов в комплексе с иммуногистохимическим выявлением нан-цптокератинов и эпителиального мембранного антигена.

3. В качестве показателя активности (агрессивности) метастазов рака в лимфоузлах возможно считать экспрессию антигена ядерной пролиферации (РСЫА) и протоонкогена, супрессирующего апоптоз (Вс1-2).

4. Выявленная зависимость 5-летней выживаемости больных от различных типов иммуногистохимичсскнх реакций регионарных лимфоузлов может использоваться в качестве критериев при определении прогноза заболевания.

5. Результаты исследования могут быть использованы для определения прогноза у больных с наличием метастазов в регионарных лимфоузлах, поскольку в работе установлены критерии 5-летней выживаемости на различных этапах ме-тастазирования в зависимости от объема опухолевой ткани в лимфатических узлах.

6. Впервые разработанная иммуногистохимическая классификация реактивных изменений лимфатических узлов при раке может быть использована в про-

цессе преподавания соответствующих дисциплин в медицинских ВУЗах, а также для дальнейшего изучения патогенеза злокачественных новообразований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цыплаков Д.Э. Иммунные реакции в регионарных лимфатических узлах при раке // Тез. докл. VII Респ. онкол. конф. - Казань, 1987.- С.41-42.

2. Цыплаков Д.Э. Изменения микроциркуляторного русла регионарных лимфатических узлов в процессе метастазирования рака // Казанский мед. журнал,- 1987.-№ 1.- С.29-31.

3. Цыплаков Д.Э. О взаимоотношениях иммуноморфологических реакций в строме опухоли и регионарных лимфатических узлах при раке // Казанский мед. журнал,- 1987,- № 4,- С.292-293.

4. Цыплаков Д.Э., Зиганшина JI.E. Влияние тучноклеточной реакции и некоторых вазоактивных веществ на кровеносное микроциркуляторное русло лимфатических узлов, регионарных к раковой опухоли // Казанский мед. журнал.-1988,-№1,- С.73.

5. Цыплаков Д.Э., Зиганшина JI.E. Роль микроциркуляторных факторов в метастазировании рака // Вопр. онкол.- 1988.- № 8.- С.932-936.

6. Цыплаков Д.Э., Добрынин В.А. Динамика и прогностическое значение морфологических изменений регионарных к раковой опухоли лимфатических узлов // Казанский мед. журнал.- 1989.- № 6,- С.453-456.

7. Цыплаков Д.Э., Цыплакова А.В. Морфометрический анализ структурных и клеточных элементов регионарных лимфоузлов при раке // Деп. в ВИНИТИ,- 1990,- № 1576-В90,- 24 с.

8. Цыплаков Д.Э., Петров C.B. Электронномикроскопическая характеристика структурных компонентов лимфатических узлов, регионарных к раковой опухоли // Ден. в ВИНИТИ,- 1990.- № 1575-В90.- 20 с.

9. Цыплаков Д.Э. Функциональная морфология лимфатических узлов некоторых регионов у человека // Деп. в ВИНИТИ.- 1990,- № 1574-В90,- 39 с.

10. Цыплаков Д.Э., Петров С.В. Ультраструктура регионарных лимфатических узлов в процессе метастазирования рака // Казанский мед. журнал.- 1990.-№ 4,- С.302-303.

11. Цыплаков Д.Э. Метастазирование рака и В-клеточная (плазмоцитарная) реакция регионарных лимфатических узлов // Казанский мед. журнал,- 1990.- № 5.- С.388-389.

12. Цыплаков Д.Э., Добрынин В.А. Иммуноморфологические изменения регионарных лимфатических узлов как прогностический критерий при лимфо-генном метастазировании рака // Тез. докл.Н региональн. научно-практ. конф. "Проблемы клинической лимфологии",- Андижан, 1990,- С.23 8-240.

13. Цыплаков Д.Э. Эозинофильная и нейтрофильная реакции регионарных лимфатических узлов при раке//Казанский мед. журнал.- 1992.-№ 1.- С.64-65.

14. Байкеев Р.Ф., Цыплаков Д.Э., Бубякин А.Н., Хайруллина В.Р., Мазито-ва Ф.М., Цыплакова А.В. Тромбопластическая активность нормальных и опухолевых тканей человека // Гематол. и трансфузиол,- 1993.- № 2.- С.26-31.

15. Цыплаков Д.Э., Филимонов А.Г. Зависимость 5-летней выживаемости онкологических больных от количества пораженных регионарных лимфоузлов и объема метастазов в них // Тез. докл. Рссп. научно-практ. конф. "Новые методы диагностики и лечения".- Казань, 1995,- С.286-287.

16. Цыплаков Д.Э. Содержание антителообразующих клеток в лимфатических узлах как прогностический критерий при раке // Тез. докл. Респ. научно-практ. конф. "Новые методы диагностики и лечения".- Казань, 1995.- С.333-334.

17. Tsyplakov D.E., Petrov S.V. Immunohistochemical study of blood microcirculation in regional lymph nodes assotiated with cancer // Abstr. of Intern. Symp. " Basic applied and diagnostic histochemistry"'.- Bratislava, Slovak republic, 1995.-P.61.

18. Tsyplakov D.E., Petrov S.V. Immunohistochemical characteristic of the immune response in regional lymph nodes assotiated with cancer // Abstr. of Intern. Symp. "Basic applied and diagnostic histochemistry".- Bratislava, Slovak republic, 1995,- P.60.

19. Цыплаков Д.Э., Петров С.В. Влияние кровеносного микроциркулятор-ного русла на клеточный иммунный ответ в лимфатических узлах, регионарных к раковой опухоли (иммуногистохимическое и ультраструкгурное исследование) II Гематол. и трансфузиол.- 1995.- № 6.- С.3-7.

20. Tsyplakov D.E., Petrov S.V. Prognostic significance of morphology of regional lymph nodes in cáncer (immunohistochemical study) // Abstr. of Cambridge Healthech Inst. Conference "Prognostic factors in cáncer".- Arlington, USA, 1995.-P.508.

21. Цыплаков Д.Э., Петров С.В. Использование моноклональных антител для выявления свободных и фиксированных макрофагов в лимфоузлах, регионарных по отношению к раковой опухоли // Тез. докл. Респ. научно-практ. конф. "Новые методы диагностики и лечения",- Казань, 1996.- С.128-129.

22. Цыплаков Д.Э., Петров С.В. Выявление микрометастазов рака в регионарных лимфатических узлах при помощи моноклональных антител // Тез. докл. Респ. научно-практ. конф. "Новые методы диагностики и лечения".- Казань, 1996.- С.100-101.

23. Цыплаков Д.Э., Зайцева Л.Ю., Шамсутдинов Н.Ш. Гистохимия ферментов нормальной и ассоциированной с раковой опухолью лимфоидной ткани // Тез. докл. Респ. научно-практ. конф. "Новые методы диагностики и лечения".-Казань, 1996,- С.126-128.

24. Tsyplakov D.E., Petrov S.V. Lymph node reaction to cáncer (immunohistochemical study) // Abstr. of VII Congreso Argentino de Cancerologica, I Congreso Panamericano de Cancerologica/- Buenos-Aires, Argentina, 1996.

25. Цыплаков Д.Э., Шамсутдинов Н.Ш. Структура синусов лимфатических узлов в норме и в процессе метастазирования рака // Казанский мед. журнал.-1996.-№4,- С.290-294.

26. Цыплаков Д.Э., Петров С.В., Шамсутдинов Н.Ш. Иммуногистохимиче-ская характеристика регионарных лимфатических узлов при раке // Казанский мед. журнал.- 1996,- № 5.- С.354-356.

27. Tsyplakov D.E., Pctrov S.V. Immunohistochemical changes in regional lymph nodes associated with cancer// Abstr. of 13 th Asia Pacific Cancer Conference.-Penang, Malaysia, 1996.-P.259.

28. Цыплаков Д.Э., Петров C.B. Иммуногистохимическое и ультраструктурное исследование регионарных лимфатических узлов при раке // Тез. докл. I съезда онкологов стран СНГ.- Москва, 1996.- С.131-132.

29. Цыплаков Д.Э., Шамсутдииов H.ILI., Петров С.В. Зависимость иммуно-гистохимических реакций регионарных лимфатических узлов от пола, возраста больных, локализации, гистологического типа опухоли, клинической стадии заболевания и наличия метастазов в лимфоидной ткани // Тез. докл. I съезда онкологов стран СНГ.- Москва, 1996.- С.132.

30. Цыплаков Д.Э., Петров С.В., Зайцева Л.Ю. Морфометрическая имму-погистохимня регионарных лимфатических узлов при раке // Тез. докл. Респ. на-учно-иракт. конф. "Современные методы диагностики и лечения больных в клинике",- Казань, 1996,- С.77-78.

31. Цыплаков Д.Э., Петров С.В., Зайцева Л.Ю. Иммуногистохимическая характеристика кровеносной микроциркуляции и клеточного иммунитета в регионарных лимфоузлах при раке //Тез. докл. Респ. научно-практ. конф. "Современные методы диагностики и лечения больных в клинике",- Казань, 1996.- С.79-80.

32. Tsypiakov D.E., Pelrov S.V. Lymph nodes reaction to cancer (immunohistochemical and ultrastructural study) // Pathology International.- 1996.-V.46(Suppl.l).- P.458.

33. Tsyplakov D.E.. Shamsutdinov N.Sh., Petrov S.V.. Nazipov R.N. Blood microcirculation and cell-mediated immunity in regional lymph nodes associated with cancer.- Pathology International.- 1996,- V.46(Suppl.l).- P.506.

34. Цыплаков Д.Э. Тучные клетки, содержание вазоактивных веществ и состояние кровеносного микроциркуляторного русла в регионарных лимфоузлах при раке // Тез. докл. 3-го Всероссийск. съезда гематол. и трансфузиол.- Санкт-Петербург, 1996.

35. Цыплаков Д.Э, Петров С.В, Шамсутдинов Н.Ш. Кровеносная микроциркуляция и клеточный иммунный ответ регионарных лимфатических узлов при раке // Тез. докл. 3-го Всероссийск. съезда гематол. и трансфузиол.- Санкт-Петербург, 1996.

36. Цыплаков Д.Э. Ультраструктурная характеристика регионарных лимфатических узлов при раке и ее прогностическое значение // Тез. докл. XVI Рос-сийск. конф. по электронной микроскопии.- Черноголовка, 1996.- С.241.

37. Цыплаков Д.Э, Петров С.В, Шамсутдинов H.HI. Иммуногистохимия и ультраструктура регионарных лимфатических узлов при раке // Труды 1-го съезда Российск. общества пат.анатомов.- Москва, 1997.- С.232-233.

38. Цыплаков Д.Э, Петров С.В. Рак и регионарные лимфатические узлы (иммуногистохимическое и ультраструктурное исследование) // Архив патол.-

1997.-№ 1,- С.12-19.