Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Пути фармакологической коррекции патогенетических нарушений метаболизма оксида азота при моделировании эндотелиальной дисфункции

005011569

КОРОКИН Михаил Викторович

ПУТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ МЕТАБОЛИЗМА ОКСИДА АЗОТА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

1 6 ОЕЗ 2012

Москва 2012

005011569

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Белгородском государственном национальном исследовательском университете

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор Покровский Михаил Владимирович

доктор медицинских наук,

профессор Комиссаров Виктор Ильич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН,

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук,

профессор Гуськова Татьяна Анатольевна

доктор медицинских наук,

профессор Чельцов Виктор Владимирович

доктор медицинских наук,

профессор Хохлов Александр Леонидович

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится £0 си&т? _2012 г. в УУ ^ на заседании

диссертационного совета Д. 208.040.13 ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан (/'^//{¿^//иУС С 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор <С_/ Архипов Владимир Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность научного исследования.

В патогенезе и клинике артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции сосудистого эндотелия (Napoli С., 2001; Falk Е., 2006; Чазова И.Е, Маколкин В.И., 2008; Мычкина В.Б., 2002). Развитие эндотелиальной дисфункции при дефиците оксида азота представляются многообразным комплексом соединяющихся и взаимообусловленных механизмов.

Коррекция нарушений метаболизма оксида азота и, как следствие, эндотелиальной дисфункции приводит к снижению риска возникновения, а также предупреждению патогенетических механизмов развития и клинических проявлений артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений (Гомазков О. А., 2000; Мазуров В.И., 2006; Das M., Das D.K., 2008; Lin К.Y., Ito A., 2002).

Сравнительно недавно к потенциальным факторам риска сердечнососудистых заболеваний стали относить гипергомоцистеинемию. Гипергомоцистеинемия может являться независимым фактором развития эндотелиальной дисфункции или усиливать уже имеющееся повреждение эндотелия (J. Zhou, G. H. Werstuck, S. Lhotak, 2008). Известных факторов коррекции гипергомоцистеинемии не так много и, пожалуй, к ним следует отнести лишь экзогенное введение витамина В6 и фолиевой кислоты. В клинических исследованиях применение фолиевой кислоты или 5-метилтетрагидрофолата (5-МТГФ, активная и циркулирующая форма фолиевой кислоты) заслужило наибольшего внимания, так как данные агенты могут оказывать потенциально благоприятное влияние на метаболизм тетрагидробиоптерина (ВН4).

Одновременно, появление в последние годы понятий «эндогенного ингибирования» эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) и «разрыва eNOS» привело к интенсификации исследований, направленных на их предотвращение, как ключевых звеньев в коррекции эндотелиальной дисфункции. Метилированные аналоги L-аргинина - ассиметричный диметиларгинин (ADMA) и монометиларгинин (L-NMMA) - являются эндогенными ингибиторами эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). (Antoniades С., 2006; Bode-Boger S.M., Scalera F, Ignarro L.J., 2007). «Разрыв eNOS» представляет собой переключение ферментной активности eNOS на выработку супероксида, а не окиси азота. При этом на ключевую роль в регуляции функции eNOS выдвигается кофактор птерина тетрагидробиоптерин (ВН4). Дефицит ВН4 при сосудистых заболеваниях вызван, в основном, окислением тетрагидробиоптерина пероксинитритом. Следовательно, стратегии, направленные на защиту эндогенного ВН4 от окислительных атак со стороны пероксинитрита, могут привести к сохранению оптимальной эндотелиальной концентрации тетрагидробиоптерина.

Кроме того, ограничение образования оксида азота может быть

обусловлено высокой активностью аргиназы - фермента, разрушающего L-аргинин в слизистой оболочке тонкого кишечника. Становится очевидной необходимость подавления высокой активности аргиназы для снижения риска и частоты развития болезней сердца и сосудов. С этой целью возможно использовать ингибиторы аргиназы. Среди веществ данной группы наибольший интерес представляет L-норвалин - неселективный ингибитор фермента аргиназы (D. L. Costanzo, М. Ilies, 2010).

В ранее проводимых исследованиях было показано, что L-аргинин как при монотерапии, так и в сочетании с антигипертензивными средствами на ADMA-подобной модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции эффективно увеличивал активность эндотелиальной NO-синтазы и продукцию оксида азота, а также предотвращал развитие эндотелиальной дисфункции в эксперименте (Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., 2008; Корокин М.В., Артюшкова Е.В., 2009; Носов A.M., 2006).

Таким образом, среди нарушений метаболизма NO можно выделить факторы, ведущие к снижению его выработки (пониженное поступление L-аргинина, повышенная активность аргиназ, ингибирование и разобщение eNOS, повреждение эндотелиоцитов и т. д.) и уменьшению биодоступности (окислительный стресс, гиперлипидемия, воспаление). Очевидно, что в настоящее время достаточно большое внимание уделяется изучению путей фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота при эндотелиальной дисфункции. Однако, в доступной литературе не обнаружено сравнительного комплексного изучения эндотелио- и кардиопротективной активности терапевтических подходов, направленных на предотвращение эндогенного ингибирования и разобщения eNOS с субстратом с помощью тетрагидробиоптерина, L-аргинина, L-норвалина, витамина Вб и фолиевой кислоты, а также их комбинаций с представителями основных групп препаратов, обладающих эндотелиопротективными эффектами (эналаприл, лозартан, амлодипин, мексикор, милдронат), при различных экспериментальных моделях эндотелиальной дисфункции.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007-2012 гг., номер госрегистрации 0120.0710379. Исследование поддержано Грантом Президента РФ №МК-905.2012.4. Номер государственной регистрации темы диссертационного исследования 01201055010.

Цель исследования - провести сравнительную оценку фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота с помощью терапевтических подходов, направленных на предотвращение эндогенного ингибирования и разобщения NO-синтазы с субстратом при различных экспериментальных моделях дефицита оксида азота.

Основные задачи исследования.

1. Исследовать развитие эндотелиальной дисфункции при гипергомоцистеин индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность тетрагидробиоптерина, L-аргинина и L-норвалина при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

3. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения L-аргинина с тетрагидробиоптерином и L-норвапином при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

4. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность эналаприла, лозартана и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

5. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и эналаприла при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

6. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и лозартана при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

7. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

8. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность эссенциальных фосфолипидов, потенцированных антител к эндотелиальной NO-синтазе, мельдония и этилметилгидроксипиридина сукцината, витамина Bg и фолиевой кислоты при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Научная новизна исследования.

В работе впервые предложен способ моделирования гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции. Продемонстрировано, что эндотелиальная дисфункция на фоне внутрижелудочного введения метионина связана с гипергомоцистеинемией и характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3,6 раза. Одновременно гипергомоцистеин индуцированная эндотелиальная дисфункция не сопровождается повышением абсолютных значений систолического и диастолического артериального давления. Кроме того, развитие эндотелиальной дисфункции сопровождается снижением показателей биохимических маркеров (концентрация стабильных метаболитов оксида азота (Total NO, NOx), экспрессия эндотелиальной NO-синтазы), повышением концентрации гомоцистеина, а также отрицательной динамикой морфометрических показателей (диаметр кардиомиоцитов).

В работе впервые показано, что преодоление разобщения еЫОБ с субстратом путём введения тетрагидробиоптерина в дозе 10 мг/кг в качестве кофактора и влияние на метаболизм Ь-аргинина путём блокирования фермента аргиназы с помощью Ь-норвалина в дозе 10 мг/кг в качестве монотерапии оказывают эндотелио- и кардиопротективное действие как на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной, так и гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции. При гипергомоцистеин индуцированной патологии продемонстрировано выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие Ь-аргинина.

Впервые предложен способ комбинированной фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота с помощью сочетанного применения тетрагидробиоптерина и Ь-аргинина, Ь-норвалина и Ь-аргинина. При сочетанном применении тетрагидробиоптерина и Ь-аргинина, Ь-норвалина и Ь-аргинина обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном приближении исследуемых показателей функции сосудистого эндотелия к таковым показателям интактных животных.

Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг, амлодипин в дозе 0,5 мг/кг обладают эндотелиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии. Впервые показано, что сочетанное использование тетрагидробиоптерина с вышеперечисленными представителями основных групп антигипертензивных препаратов приводит к положительному фармакодинамическому взаимодействию, что обусловлено различными точками приложения фармакологических эффектов изучаемых препаратов.

Впервые доказано, что комбинация витамина Вб и фолиевой кислоты, эссенциальные фосфолипиды, мельдоний, этилметилгидроксипиридина сукцинат и потенцированные антитела к эндотелиальной МО-синтазс оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие при моделировании эндотелиальной дисфункции с помощью внутрибрюшинного введения Ь-МАМЕ в дозе 25 мг/кг и внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг.

Впервые установлено увеличение экспрессии еМОЯ под влиянием тетрагидробиоптерина в качестве монотерапии и в комбинации с эналаприлом, лозартаном, амлодипином и Ь-аргинином.

Таким образом, на основании выполненных исследований разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицировать как крупное научное достижение, заключающееся в формировании целостных представлений о механизмах нарушения и путях фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида при эндотелий ассоциированной патологии путём предотвращения эндогенного ингибирования, преодоления разобщения еЫОБ с субстратом и увеличения биодоступности оксида азота.

Научно-практическая значимость.

Предложенная модель гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции и комплексный подход к оценке патологии даёт возможность в дальнейшем оценивать эндотелиопротективные свойства фармакологических агентов и проводить скрининг эндотелиопротективной активности новых веществ.

Экспериментально обосновано применение тетрагидробиоптерина в качестве монотерапии и в комбинации с Ь-аргинином, комбинации Ь-аргинина с Ь-норвалином, витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата, мексикора и импазы, а также комбинаций тетрагидробиоптерина с эналаприлом, лозартаном и амлодипином для коррекции выраженной гипергомоцистеинемии, эндотелиальной дисфункции и снижения риска развития сердечно-сосудистой патологии. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки и внедрения фармакологических препаратов на основе тетрагидробиоптерина, Ь-аргинина и Ь-норвалина в качестве средств для профилактики и лечения эндотелий ассоциированной патологии. По результатам проведённых исследований на мощностях ОАО "Новосибхимфарм" готовится к промышленному выпуску препарат, содержащий в своём составе Ь-аргинин и Ь-норвалин.

Сравнительный анализ полученных экспериментальных данных о эндотелио- и кардиопротективной активности традиционных антигипер-тензивных препаратов в комбинации с тетрагидробиоптерином позволяет приступить к разработке новых лекарственных средств для лечения сердечнососудистых заболеваний, их доклиническому и клиническому изучению.

Внедрение результатов научных исследований.

На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований Ь-норвалина, Ь-аргинина, тетрагидробиоптерина, их комбинаций, а также комбинаций тетрагидробиоптерина эналаприлом, лозартаном и амлодипином при эндотелий ассоциированной патологии.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив форте производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008120/08), фосфоглив производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУР N002528/01) и мельдоний (Кардионат) производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛСР-006481/08), включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности комбинации Ь-аргинина и Ь-норвалина включенны в состав документов для промышленного выпуска нового оригинального препарата, содержащего в своём составе Ь-аргинин и Ь-норвалин (ООО "Новосибхимфарм").

Полученные результаты используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и учебных программах кафедр фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии, фармакологии и фармацевтических дисциплин, биохимии и фармакологии НИУ «БелГУ», фармакологии Воронежской медицинской академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гипергомоцистеин индуцированная эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3,6 раза, концентрации гомоцистеина, снижением концентрации стабильных метаболитов оксида азота, характерной динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы.

2. Тетрагидробиоптерин 10 мг/кг, Ь-аргинин 200 мг/кг, Ь-норвалин 10 мг/кг, а также комбинации тетрагидробиоптерина 10 мг/кг и Ь-аргинина 200 мг/кг, Ь-норвалина 10 мг/кг и Ь-аргинина 200 мг/кг оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие при моделировании гипергомоцистеин- и Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

3. Комбинация витамина В6 и фолиевой кислоты, препараты «Фосфоглив», «Кардионат», «Мексикор» и «Импаза» в качестве монотерапии обладают эндотелио- и кардиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии.

4. Эналаприл 0,5 мг/кг, лозартан 6 мг/кг и амлодипин 0,5 мг/кг оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на моделях гипергомоцистеин- и Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции. При комбинированном использовании тетрагидробиоптерина 10 мг/кг с энаиаприлом 0,5 мг/кг, лозартаном 6 мг/кг и амлодипином 0,5 мг/кг на моделях гипергомоцистеин- и Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований.

Апробация диссертации.

Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и Международных конференциях молодых учёных КГМУ в 2005 - 2011 гг., 1-1У Всероссийских конференциях молодых учёных-медиков, Российской научной конференции (с международным участием) «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), VI Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2007), съезде терапевтов юга России «Врач XXI века: сегодня и завтра» (Ростов-на-Дону, 2009), научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2009), XIII - XVII национальных конгрессах «Человек и лекарство», I, II, V национальных конгрессах терапевтов и кардиологов, VII съезде аллерголов и иммунологов СНГ, V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научно-практической конференции (с международным участием) «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Москва, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011).

Апробация диссертации проведена 27 июня 2011 г. на совместном заседании кафедр Курского государственного медицинского университета и Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Диссертационная работа обсуждена на научно-практической конференции кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней Первого МГМУ имени И.М. Сеченова 10 ноября 2011 г. (протокол № 12).

Личный вклад автора.

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке цели и поиске путей её достижения. Им проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, на основании чего выдвинуты рабочие гипотезы о возможных фармакотерапевтических стратегиях и биологических моделях для исследования эндотелио- и кардиопротективной активности выбранных веществ и препаратов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.

В печатных работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, моделирование исследуемой патологии и введение тестируемых препаратов, выведение животных из эксперимента с помощью аппаратного комплекса Biopac, регистрация необходимых показателей гемодинамики (САД, ДАД, ЧСС, интенсивность функционирования структур, ЛЖД, максимальная скорость сокращения и расслабления) on-line с помощью программного комплекса «Asqknowledge 3.8.1», проведение функциональных проб (эндотелийзависимая и эндотелийнезависимая вазодилатация, нагрузка объёмом и сопротивлением, пробы на адренореактивность, гипоксию и реоксигенацию), статистическая обработка, научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, из них 25 в российских рецензируемых научных журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций, отражающих полностью содержание диссертации. Получено 8 патентов РФ на изобретения.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 465 источников, из них 151 отечественных и 314 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 390 страницах машинописного текста, содержит 69 таблиц, 110 рисунков, одну схему.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Опыты проводились на самцах белых крыс линии Wistar массой 180-300 г. Раствор для внутрижелудочного введения метионина готовили ex tempore с помощью растворителя ТВИН-80 и 1 % крахмального раствора. С целью моделирования эндотелиальной дисфункции метионин (ООО «Полисинтез», г. Белгород) вводили ежедневно, один раз в сутки, внутриже луд очно в дозе 3 г/кг в течение 7 дней (п=10 животных).

М-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился самцам ежедневно, один раз в сутки, внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг. На 8 день от начала эксперимента при моделировании L-NAME-индуцированной и гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции вводили под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей гемодинамики. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно, посредством аппаратного комплекса «Biopac» (США) и компьютерной программы «Acqknowledge 3.8.1». Болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Проводили следующие функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) (Laursen J.B., 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством аппаратного комплекса «Biopac» (США), компьютерной программы «Acqknowledge 3.8.1», регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt шах), максимальную скорость расслабления (- dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность - внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1*10"5 моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г массы тела (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Нагрузка сопротивлением - пережатие восходящей аорты на 30 сек (Меерсон Ф.З., 1980).

3. 3-х минутная гипоксия с последующей реоксигенацией (Пашин E.H., 1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована

модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ваннадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски.

Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS)

определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2002). Детекцию полосы eNOS проводили методом усиленной хемолюминесценции (ECL).

Концентрацию гомоцистеина (ГЦ) определяли энзиматическим методом с помощью набора фирмы Pliva-Lachema Diagnostika s.r.o. Для определения концентрации гомоцистеина использовали свежую гепаринизированную плазму крови без гемолиза.

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца и почек во всех сериях экспериментов. Материал фиксирован в 10 % формалине с последующей заливкой в парафин. Использована окраска гематоксилином и эозином. При морфометрии сердца использован метод определения поперечного диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. В рамках данной работы проведено исследование эндотелио- и кардиопротективной активности ряда фармакологических агентов. В хронических экспериментах при моделировании гипергомоцистеин- и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции препараты вводились в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно или внутрижелудочно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME или метионина.

Исследование активности тетрагидробиоптерина (ВН4) (Sigma Aldrich, USA) проводили при внутрибрюшинном введении ВН4 в дозе 10 мг/кг/сутки. Данная доза выбрана в соответствии с литературными данными, где диапазон дозировок при исследовании активности тетрагидробиоптерина находится в пределах от 5 мг/кг до 20 мг/кг.

L-норвалин (WIRUD GmgH, Hamburg) вводился в дозе 10 мг/кг/сутки. Согласно данным современных исследователей, именно, начиная с этой дозировки, L-норвалин способен ингибировать аргиназу.

Исследована эндотелиотропная активность L-аргинина производства EUROBIOPHARM GmgH, Hamburg в дозе 200 мг/кг/сутки, определённая нами по данным литературы, в соответствии с которыми эндотелиопротективные эффекты L-аргинина проявляются в дозах от 30 до 500 мг. В соответствии с исследованиями, проводимыми в лаборатории кардиофармакологии НИИ ЭМ КГМУ, дозозависимые эндотелиопротективные эффекты L-аргинина обнаружены в дозах 30 и 200 мг/кг.

Фолиевую кислоту (Валента Фармацевтика, ОАО) вводили внутрижелудочно в дозе 0,2 мг/кг/сутки в течение 7 дней. Витамин В6 (Верофарм) вводили внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг/сутки.

Эндотелио- и кардиопротективная активность мельдония (Кардионат, производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия) исследовалась в дозе 80 мг/кг/сутки. Максимальная суточная доза мельдония для человека массой 70 кг равняется 1000 мг, т. е. 14,28 мг/кг, коэффициент пересчёта на площадь поверхности тела человека - 39,0, коэффициент для крысы массой 200 г равен 6,5, в результате максимальная терапевтическая доза для крыс с данной массой тела равнялась 84,26 мг/кг/сутки.

Этиметшгидроксипиридина сущинат, препарат «Мексикор» (ООО «ЭкоФармИнвест») вводили внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг. Данная доза препарата определена в соответствии с ранее полученными экспериментальными данными исследования активности препарата «Мексикор».

Для исследования эндотелио- и кардиопротективной активности препарата «Импаза» (сверхмалые дозы аффинно очищенных антител к эндотелиальной 1ЧО-синтазе, смесь гомеопатических разведений С12+С30+С200 производства ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг», Россия) препарат разводили в поилках из расчёта 1 таблетка на 100 мл воды. Крысы получали импазу в свободном доступе к питью, с учётом объёма потребляемой жидкости 20±3 мл/животное/сутки, что соответствовало суточной дозе 1 таб/кг массы животного.

Для изучения эффективности эссенциальных фосфолипидов был выбран препарат «Фосфоглив», капсулы производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» в дозе 2,2 г/кг/сутки. Доза препарата рассчитывалась по входящему в их состав фосфатидилхолину, равноэквивалентно содержанию последнего в препарате эссенциале форте Н (капсулы) и последующему пересчёту доз с человека на крысу в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Препараты с доказанными эндотелиопротективными свойствами вводили внутрижелудочно в течение 7 суток. Эналаприла малеат («Рениприл», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), лозартан калия («Блоктран», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), амлодипин («Амлотоп», производства «Макизфарма») использовали в дозах 0,5 мг/кг/сутки, 6 мг/кг/сутки, 0,5 мг/кг/сутки соответственно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие препаратов в экспериментах. При комбинированном использовании препаратов использовались те же дозы, пути введения, и та же продолжительность применения.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов, изменений параметров как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±т) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием Нее! для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные, при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании гипергомоцистеин- и Ь-^АМЕ-индуцированиого дефицита N0.

Внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг однократно в сутки в течение 7 дней не привело к статистически значимому изменению артериального давления (рис. 1). Внутрибрюшинное введение Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг /кг однократно в сутки в течение 7 дней привело к развитию выраженной артериальной гипертензии у экспериментальных животных (рис. 1 дд).

Проведение функциональных проб с оценкой реакций на эндотелий-зависимое и эндотелийнезависимое расслабление сосудов показало существенные отличия в группах с патологией от группы интактных животных и животных контрольной серии, получавших солюбилизатор ТВИН 80.

Рис. 1. Функциональные показатели при моделировании гипергомоцистеин-и Ь- ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0. 1 - Твин 80 (контроль); 2 - Метионин 3 г/кг; 3 - Интактные; 4 - Ь-ЫАМЕ.

Здесь и далее: САД, ДАД, АД систолическое, диастолическое артериальное давление, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр - адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением.

Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади треугольника над кривой восстановления артериального давления, в ответ на введение нитропруссида к соответствующей площади, в ответ на введение ацетилхолина.

В наших экспериментах КЭД в группе интактных самцов составил 1,1±0,1, при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота - 5,4±0,6, в контрольной группе животных, получавших ТВИН 80 - 0,9±0,2, при гипергомоцистеин индуцированном дефиците оксида азота - 3,3±0,3 (рис. 1кэд)-

Гипергомоцистеин и Ь-МАМЕ-индуцированные модели патологии приводят к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением (рис. 1ддр, рис. 1нс)-

У интактных самцов миокардиальный резерв к 25 секунде проведения пробы составлял 83,6±7,7 относительно значений на 5-й секунде, в контрольной группе животных - 85,4±6,1, а у животных с гипергомоцистеин и Е-ЫАМЕ-индуцированной патологией данный показатель был значительно ниже и составил соответственно 65±5,5 % и 69,8±4,7 % (рис. 1 нехарактерная динамика биохимических маркеров гипергомоцистеин и Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис. 2. Экспрессия эндотелиальной МО-синтазы (еЫ08) при Ь-МАМЕ-индуцированной патологии составила 21,4±4,7 %, тогда как у интактных животных - 72,9±3,8 % (рис. 2емоз)-

e-NOS

NOx

НСу

□ ТВИН 80 S Метионин Зг/кг ОИнтакгные и L-NAME

Рис. 2. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированного дефицита N0.

Здесь и далее: NOS - экспрессия NO-синтетазы, НСу -концентрация гомоцистеина; NOx - суммарная концентрация нитритов и нитратов плазмы, ДК - диаметр кардиомиоцитов. * - р < 0,05 в сравнении с группой

интактных животных.

Концентрация стабильных метаболитов оксида азота (NOx) у животных, получавших L-NAME и метионин, соответственно, составила 61,2±3,6 и 72,9 ±4,6 мкМоль, тогда как соответствующие значения у интактных животных составили 114,1±4,1 и 121,2±7,4 мкМоль (рис. 2Nox)-

Внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг привело к статистически значимому увеличению концентрации гомоцистеина. В контрольной группе животных, получавших ТВИН 80, данный показатель составил 8,6±1,4 мкМоль/л; в группе животных, получавших метионин -53,5±8,1 мкМоль/л (рис. 2Нсу)-

Результаты гистологических исследований показали, что при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции диаметр поперечного сечения кардиомиоцитов статистически достоверно не отличался от такового показателя в контрольной группе животных. При моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота обнаружено статистически достоверное увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов до 18,5±1,1 мкм, тогда как у интактных животных данный показатель составил 9,1±1,1 мкм (рис. 2дК).

При гистологическом исследовании сердца отмечены сосудистые изменения в виде спастического состояния артериол, утолщения их стенок. При окраске гематоксилином Pero выявлялись очаговые сегментарные или тотальные повреждения кардиомиоцитов контрактурного типа.

При моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции морфологическое исследование ткани почек с окраской гематоксилином и эозином позволило выделить участки преобладания тубуло-интерстициального фиброза без признаков вовлечения почечного клубочка (гломерулосклероз), а также у 4 животных из 10 обнаружено сочетание гломерулосклероза с тубуло-интерстициальным фиброзом. Кроме того, наблюдались клиновидные участки некроза, атрофии паренхимы с коллапсом стромы, её лимфоидной инфильтрацией. Эпителий почечных канальцев уплощён, на значительных участках десквамирован.

На представленных гистологических препаратах (рис. 3), слева (а) -интактные миокардиоциты, справа (б) - миокардиоциты животных на 7-е сутки с L-NAME-индуцированной патологией. Наглядно видно, что площадь поперечного сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер при одном увеличении.

цц а

Рис. 3. Морфологическая картина миокарда у интактных и опытных животных: а - гистологическая картина миокарда у интактных крыс на поперечном срезе; б - гипертрофия кардиомиоцитов у крысы с Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункцией на поперечном срезе. Окр. гематоксилином и эозином, а, б - х280.

Таким образом, внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг один раз в сутки на протяжении 7 дней не вызывает статистически значимого повышения артериального давления. Нарушение функции эндотелия проявляется повышением КЭД, увеличением адренореактивности и исчерпанием миокардиального резерва, что свидетельствует о снижении способности миокарда адаптироваться к повышенной постнагрузке при гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Физиологические изменения подтверждаются результатами биохимических исследований. Моделирование метионин индуцированной гипергомоцистеинемии привело к статистически значимому снижению концентрации стабильных метаболитов оксида азота и увеличению концентрации гомоцистеина. Одновременно при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаруживается симтомокомплекс, включающий стойкое повышение артериального давления, увеличение КЭД, адренореактивности падение миокардиального резерва, снижение концентрации стабильных метаболитов оксида азота, экспрессии е1\Ю8, увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов.

2. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов тетрагидробиоптерина, Ь-норвалина, Ь-аргинина и их комбинаций при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Согласно дизайну исследования, эндотелиальную дисфункцию моделировали внутрижелудочным введением метионина в дозе 3 г/кг ежедневно в течение 7 суток.

Исследуемые препараты тетрагидробиопетрин (ВН4) в дозе 10 мг/кг, Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг вводили внутрибрюшинно, Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг - внутрижелудочно, однократно, за 30 мин до введения метионина в течение 7 суток. При изучении эффективности совместного применения субстанций препараты вводили в тех же дозах и теми же путями введения, что и при монотерапии. По протоколу на восьмые сутки наркотизированное животное брали в эксперимент. Влияние исследуемых веществ на исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс с моделированием гипергомоцистеин индуцированной патологии представлены на рис. 4. Обнаружено, что изучаемые препараты не влияли на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД, достоверно не отличались от таковых значений животных контрольной группы во всех сериях экспериментов (рис. 4дд).

На рис. 4Кэд представлены результаты функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у животных с гипергомоцистеин индуцированной патологией на фоне лечения изучаемыми препаратами. Обработка полученных экспериментальных данных позволила установить, что ВН4 в дозе 10 мг/кг, Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг и Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии предотвращали повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции. Комбинированное применение тетрагидробиоптерина и Ь-аргинина, а также Ь-норвалина и Ь-аргинина привело к оптимальному снижению коэффициента эндотелиальной дисфункции, значения которого в указанных группах приближались к таковым в контрольной серии экспериментов (рис. 4кэд)- Анализ полученных экспериментальных данных позволил установить статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность во всех сериях экспериментов с Ь-норвалином, Ь-аргинином, тетрагидробиоптерином и их комбинацией. Максимальное предотвращение повышения адренореактивности, вызванного гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункцией, выявлено при использовании комбинации Ь-норвалина (10 мг/кг) и Ь-аргинина (200 мг/кг) (рис. 4АДр).

Рис. 4. Влияние тетрагидробиоптерина, Ь-аргинина, Ь-норвалина и их комбинаций на функциональные показатели при моделировании гипергомоцистеин индуцированного дефицита оксида азота. 1 - ТВИН 80 (контроль); 2 - метионин 3 г/кг; 3 - метионин + ВН4 10 мг/кг; 4 - метионин + Ь-аргинин 200 мг/кг; 5 - метионин + Ь-норвапин 10 мг/кг; 6 - метионин + ВН4 + Ь-аргинин; 7 - метионин + Ь-аргинин + Ь-норвалин.

Максимальное предотвращение повышения адренореактивности, вызванного гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункцией,

выявлено при использовании комбинации Ь-норвалина (10 мг/кг) и Ь-аргинина (200 мг/кг) (рис. 4ддр). При проведении пробы на нагрузку сопротивлением обнаружены результаты, сопоставимые с таковыми при проведении пробы на адренореактивность (рис. 4Нс). Наиболее выраженное предотвращение исчерпания миокардиального резерва обнаружено в группе животных, получавших комбинацию Ь-аргинина и Ь-норвалина (88,7±5,1 %), где данный показатель оказался выше, чем в контрольной группе животных (85,4±3,1 %).

Применение тетрагидробиоптерина 10 мг/кг, а также комбинаций тетрагидробиоптерина с Ь-аргинином, Ь-аргинина с Ь-норвалином привело к статистически значимому снижению концентрации гомоцистеина в соответствующих группах экспериментальных животных (рис. 5Нсу)-Концентрация гомоцистеина составила соответственно: 27,8±3,1 мкМоль/л, 18,2±2,9 мкМоль/л и 20,1±5,7 мкМоль/л. Однако уровень гомоцистеина в сыворотке крови животных указанных групп оставался в 2,5 раза выше таковых значений контрольной группы животных (8,6±0,4 мкМоль/л).

НСу

е:

с; о

Рис. 5. Влияние тетрагидробиоптерина, Ь-аргинина, Ь-норвалина и их комбинаций на биохимические показатели при моделировании гипергомоцистеин индуцированного дефицита N0.

1 - ТВИН 80 (контроль); 2 - метионин 3 г/кг; 3 - метионин + ВН4 10 мг/кг; 4 - метионин + Ь-аргинин 200 мг/кг; 5 - метионин + Ь-норвалин 10 мг/кг; 6 - метионин + ВН4 + Ь-аргинин; 7 - метионин + Ь-аргинин + Ь-норвалин.

При исследовании концентрации стабильных метаболитов оксида азота обнаружено, что все препараты и их комбинации, исследованные в данной серии экспериментов, оказывают статистически значимое влияние на увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота (рис. 5м0х)-

\\\\ч\

Концентрация стабильных метаболитов оксида азота (ЛОх) под влиянием комбинаций Ь-аргинина с ВН4 и Ь-норвалином увеличивалась и статистически достоверно не отличалась от показателей в контрольной группе животных (рис. 5мох).

Таким образом, тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг, Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг, Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг проявляли выраженное эндотелиопротективное действие при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД. Наиболее эффективное снижение КЭД при анализе данных применения монотерапии обнаружено в группе животных, получавших Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг. При исследовании концентрации стабильных метаболитов оксида азота обнаружено, что тетрагидробиоптерин, Ь- аргинин и Ь-норвалин статистически значимо увеличивают концентрацию стабильных метаболитов оксида азота. Применение тетрагидробиоптерина 10 мг/кг позволило добиться статистически значимого снижения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных. При монотерапии Ь-норвалином и Ь-аргинином статистически значимого снижения концентрации гомоцистеина не обнаружено. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и исчерпания миокардиального резерва под влиянием тетрагидробиоптерина, Ь-норвалина и Ь-аргинина. При изучении эндотелио- и кардиопротективного действия комбинаций Ь-аргинина с тетрагидробиоптерином и Ь-аргинина с Ь-норвалином обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выражающееся в оптимальном снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции и нормализации сосудистых реакций на ацетилхолин и нитропруссид. Одновременно, в данных группах животных обнаружены максимальные значения концентрации 1ЧОх, что говорит о выраженном положительном влиянии исследованных комбинаций препаратов на метаболизм оксида азота.

Таким образом, реализация стратегий фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции, направленных на предотвращение разобщения еМОБ, повышение её активности, влияние на метаболизм оксида азота и его биодоступность по отдельности позволяет добиться положительной динамики при анализе показателей функционирования сосудистого эндотелия и кардиопротективного эффекта препаратов. Реализация комбинированного подхода к коррекции патологических состояний, связанных или сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией, позволяет достичь статистически достоверного влияния на большинство показателей функционирования сосудистого эндотелия и сердечно-сосудистой системы в целом.

3. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов эналапрнла, лозартана и амлоднпина в качестве монотерапии и в комбинации с тетрагидробионтерииом при моделировании гипергомо-цистеин индуцированной эндотелиалыюй дисфункции.

Обнаружено, что изучаемые препараты и их комбинации не влияли на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД, достоверно не отличались от таковых значений животных контрольной группы во всех сериях экспериментов (рис. 6Ад).

Обработка полученных экспериментальных данных позволила установить, что все исследуемые препараты и их комбинации в обозначенных дозировках обладали в различной степени выраженным эндотелиопротективным действием, выражающимся в статистически значимом уменьшении коэффициента эндотелиальной дисфункции. Наименьшая эффективность обнаружена при применении эналаприла в качестве монотерапии, где КЭД составил 2,1±0,2 (в контрольной группе животных -0,9±0,2, при гипергомоцистеин индуцированном дефиците оксида азота -3,3±0,3). При сочетанном применении ВН4 с эналаприлом, лозартаном и амлодипином обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие и значения КЭД в указанных группах составили 1,4±0,1, 1,2±0,1 и 1,3±0,1 соответственно (рис. бкэд).

При проведении пробы на адренореактивность обнаружено статистически значимое уменьшение максимальных значений ЛЖД в сериях экспериментов внутрижелудочным введением лозартана и амлодипина. Амлодипин в дозе 0,5 мг/кг полностью предотвращал гипергомоцистеин индуцированное повышение адренореактивности и значение ЛЖД при проведении пробы в данной группе животных составило 190,7±6,5 мм рт. ст. (189,7±9,1 - в контрольной группе животных и 238,1±9,2 - в группе животных, получавших метионин 3 г/кг) (рис. 6ддр). Эналаприл в виде монотерапии не проявлял протективного действия при проведении пробы с введением адреналина. При комбинированном применении исследуемых препаратов с тетрагидробиоптерином обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в снижении абсолютных значений ЛЖД во всех сериях экспериментов с сочетанным применением препаратов.

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением эналаприл, лозартан и амлодипин в качестве монотерапии и в комбинации с тетрагидробиоптерином предотвращали исчерпание миокардиального резерва. В группе животных, получавших комбинацию амлодипина и ВН4 сократительный резерв к 25-й секунде проведения пробы оказался выше такового значения в контрольной группе животных (86,4±3,1) и составил 87,1±4,9 % (рис. 6Нс)-

кэд

АДр

НС

Рис. 6. Влияние эналаприла, лозартана, амлодипина, тетрагидробиоптерина и их комбинаций на функциональные показатели при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции.

1 - ТВИН 80 (контроль); 2 - метионин 3 г/кг; 3 - метионин + эналаприл 0,6 мг/кг; 4 - метионин + лозартан 5 мг/кг; 5 - метионин + амлодипин 5 мг/кг; 6 - метионин + ВН4; 7 - метиогнин + ВН4 + эналаприл; В - метионин + ВН4 + лозартан; 9 - метионин + ВН4 + амлодипин.

Применение лозартана и амлодипина в качестве монотерапии привело к статистически значимому снижению концентрации гомоцистеина в соответствующих группах экспериментальных животных. Концентрация

гомоцистеина составила соответственно: 29,3±3,1 мкМоль/л и 18,1±2,2 мкМоль/л (рис. 7нсу)- Однако, уровень гомоцистеина в сыворотке крови животных указанных групп оставался в 2-2,5 раза выше таковых значений контрольной группы животных (8,6±0,4 мкМоль/л). При сочетанном использовании ВН4 с эналаприлом, лозартаном и амлодипином концентрация гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных оказалась значительно ниже, чем при монотерапии и максимально низкое значение указанного показателя (15,7±1Д мкМоль/л) обнаружено в группе животных, получавших ВН4 с лозартаном (рис. 7Нсу)-

Обнаружено, что лозартан и амлодипин оказывают статистически значимое влияние на увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота. Однако, значения NOx (89,3±2,9 мкМоль для лозартана и 88,7±3,1 мкМоль для амлодипина) далеки от соответствующих значений в контрольной группе животных (121,2±12,1 мкМоль). Применение эналаприла не привело к изменению концентрации исследуемого показателя. Концентрация стабильных метаболитов оксида азота при сочетанном использовании была выше, чем при соответствующей монотерапии, приближаясь к значениям интактной группы, в наибольшей степени в группе комбинации лозартана с тетрагидробиоптерином (рис. 7NOx).

Рис. 7. Влияние эналаприла, лозартана, амлодипина, тетрагидробиоптерина и их комбинаций на биохимические показатели при моделировании гипергомоцистеин индуцированного дефицита N0.

1 - ТВИН ВО (контроль); 2 - метионин 3 г/кг; 3 - метионин + эналаприл 0,6 мг/кг; 4 - метионин + лозартан 5 мг/кг; 5 - метионин + амлодипин 5 мг/кг; 6 - метионин + ВН4; 7 - метиогнин + ВН4 + эналаприл; 8 - метионин + ВН4 + лозартан; 9 - метионин + ВН4 + амлодипин.

Таким образом, становится понятно, что стратегия применения ингибиторов АПФ, блокаторов ATI рецепторов и блокаторов кальциевых каналов в качестве монотерапии при общем, выраженном эндотелио- и кардиопротективном действии, позволяет корректировать лишь ряд показателей функционирования сосудистого эндотелия и сердечно-сосудистой системы в целом. При сочетанном применении эналаприла, лозартана и амлодипина с тетрагидробиоптерином обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, адренореактивности, сохранении высокого сократительного резерва, положительной динамике биохимических показателей функционирования сосудистого эндотелия.

4. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата, мексикора и импазы при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Установлено, что изучаемые препараты не влияли на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД, достоверно не отличались от таковых значений животных контрольной группы во всех сериях экспериментов (рис. 8дд).

Обработка полученных экспериментальных данных позволила заключить, что все исследуемые препараты в обозначенных дозировках обладали выраженным эндотелиопротективным действием, выражающимся в статистически значимом уменьшении коэффициента эндотелиальной дисфункции, причём наибольшая эффективность обнаружена в группах животных, получавших комбинацию витамина Вб и фолиевой кислоты (1,7±0,1) и монотерпию фосфогливом (1,7±0,1) (рис. 8Кэд).

Анализ полученных экспериментальных данных позволил установить статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность в сериях экспериментов с комбинацией витамина Вб и фолиевой кислоты, фосфогливом и кардионатом. Максимальное предотвращение повышения адренореактивности, вызванного гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункцией, выявлено при использовании кардионата (191,2±13,5 мм рт. ст). Введение мексикора и импазы не предотвращало гипергомоцистеин индуцированного повышения адренореактивности (рис. 8ддр).

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением обнаружены результаты, сопоставимые с таковыми при проведении пробы на адренореактивность (рис. 8нс)-

Статистически значимое предотвращение исчерпания миокардиального резерва при проведении пробы на нагрузку сопротивлением обнаружено в группах животных, получавших фосфоглив и кардионат. Применение витамина В6 и фолиевой кислоты, а также мексикор и импазы не позволило статистически значимо повлиять на исследуемый показатель (рис. 8нс).

Рис. 8. Влияние Витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата, мексикора и импазы на функциональные показатели при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции.

1 - ТВИН 80 (контроль); 2 - метионин 3 г/кг; 3 - метионин + витамин В6 2 мг/кг + фолиевая кислота 0,2 мг/кт; 4 - метионин + фосфоглив 2,2 мг/кг; 5 - метионин +- кардионат 80 мг/кг; 6 - метионин + мекеикор 30 мг/кг; 7 - метионин + импаза 1 таб/кг.

При анализе концентрации гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных обнаружено, что применение импазы и мексикора привело к наиболее выраженному и статистически значимому снижению исследуемого показателя в соответствующих группах экспериментальных животных. Концентрация гомоцистеина составила соответственно: 19,2±1,4 мкМоль/л и 27,3±1,6 мкМоль/л. Однако уровень гомоцистеина в сыворотке крови животных указанных групп оставался в 2-2,5 раза выше таковых значений контрольной группы животных (8,6±0,4 мкМоль/л). Применение фосфоглива и кардионата приводило к статистически значимому снижению концентрации гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных, в меньшей степени, чем мексикор и импаза (рис. 9Нсу)-

Обнаружено, что все препараты, исследованные в данной серии экспериментов, кроме импазы, оказывают статистически значимое влияние на увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота (рис. 9мох)-Концентрация стабильных метаболитов оксида азота (1ЧОх) под влиянием фосфоглива, кардионата и мексикора увеличивалась и статистически достоверно не отличалась от показателей в контрольной группе животных (рис. 9Шх).

НСу

--

с: о

5

*

Е

1 2 3 4 5 6 7

12 3 4 5 6 7

Рис. 9. Влияние витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата, мексикора и импазы на биохимические показатели при моделировании гипергомоцистеин индуцированного дефицита N0. 1 - ТВИН 80 (контроль); 2 - метионин 3 г/кг; 3 - метионин + витамин В6 2 мг/кг + фолиевая кислота 0,2 мг/кг; 4 - метионин + фосфоглив 2,2 мг/кг; 5 - метионин + кардионат 80 мг/кг; 6 - метионин + мексикор 30 мг/кг; 7 - метионин + импаза 1 таб/кг.

5. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов тетрагидробиоптерина, Ь-норвалина, Ь-аргинина и их комбинаций при моделировании Ь^АМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Влияние исследуемых веществ на исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс с моделированием Ь-МАМЕ-индуцированной патологии представлены на рис. 10ад.

Ежедневное, в течение 7 дней, внутрибрюшинное введение Ь-ИАМЕ привело к статистически значимому повышению артериального давления до 190,3±6,7 (САД) и 145,0±3,9 (ДАД), тогда как у интактных животных данный показатель составил 137,7±3,7 и 101,9±4,3 соответственно (рис. Юдд). Обнаружено, что тетрагидробиоптерин, Ь-аргинин и Ь-норвалин в качестве монотерапии не влияли на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД, достоверно не отличались от таковых значений в группе животных с моделированием Ь-ИАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота. При применении комбинации тетрагидробиоптерина и Ь-аргинина, а также Ь-аргинина и Ь-норвалина обнаружено статистически значимое снижение артериального давления и предотвращение развития артериальной гипертензии, наиболее выраженное в группе Ь-аргинин + Ь- норвалин (135,6±10,1 САД и 102,5±5,8 ДАД) (рис. Юдд).

При анализе коэффициента эндотелиальной дисфункции установлено, что ВН4 в дозе 10 мг/кг, Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг и Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии обладают эндотелиопротективным действием, выразившимся в предотвращении повышения коэффициента эндотелиальной дисфункции. Комбинированное применение тетрагидробиоптерина и Ь- аргинина, а также Ь-норвалина и Ь-аргинина привело к оптимальному снижению коэффициента эндотелиальной дисфункции, значения которого в указанных группах приближались к значениям интактной группы (рис. Юкэд).

При проведении функциональной пробы на адренореактивность обнаружено статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД в сериях экспериментов с Ь-аргинином и тетрагидробиоптерином, а также в группах животных с применением комбинаций Ь-аргинина с Ь-норвалином, ВН4+Ь-аргинин. Максимальное предотвращение повышения адренореактивности, вызванного Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункцией, выявлено при использовании комбинации Ь-норвалина и Ь-аргинина (211,4±7,9 мм рт. ст.) (рис. 10Лдр). При проведении пробы на нагрузку сопротивлением обнаружены результаты, сопоставимые с таковыми при проведении пробы на адренореактивность (рис. 10нс).

Наиболее выраженное предотвращение исчерпания миокардиального резерва обнаружено в группах животных, получавших Ь-норвалин в качестве монотерапии (87,6±4,3) и комбинацию Ь-аргинин + Ь-норвалин (86,4±3,9), где данный показатель оказался выше, чем в контрольной группе животных (85,4±3,1) (рис. 10нс).

Рис. 10. Влияние тетрагидробиоптерина, Ь-аргинина, Ь-норвалина и их комбинаций на функциональные показатели при моделировании Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита N0.

1 - Интактные; 2 - Ь-ЫАМЕ 25 г/кг; 3 - Ь-ЫАМЕ + ВН4 10 мг/кг; 4 - Ь-ЫАМЕ + Ь-аргинин 200 мг/кг; 5 - Ь-КАМЕ + Ь-норвалин 10 мг/кг; 6 - Ь-ИАМЕ + ВН4 + Ь-аргинин; 7 - Ь-ЫАМЕ + Ь-аргинин + Ь-норвалин.

Результаты изучения влияния исследуемых препаратов и их комбинаций

на экспрессиию эндотелиальной NO-синтазы представлены на рис. IUnos-Обнаружено, что монотерапия L-аргинином и L-норвалином не приводила к достоверному увеличению экспрессии eNOS, в то время как в группе животных, получавших тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг обнаружено статистически значимое увеличение исследуемого показателя (41,7±4,0 %). В группе животных, получавших ВН4+Ь-аргинин показатель экспрессии eNOS (61,9±6,5 %) максимально приближался к соответствующему показателю интактной группы животных (72,9±3,8%) (рис. 1 Unos)-

Рис. 11. Влияние тетрагидробиоптерина, Ь-аргинина, Ь-норвалина и их комбинаций на биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0.

1 - Интактные; 2 - ЬЫАМЕ 25 г/кг; 3 - 1ЖАМЕ + ВН4 10 мг/кг; 4 - Ь^АМЕ + Ь-аргинин 200 мг/кг; 5 - Ь-КАМЕ + Ь-норвалин 10 мг/кг; 6 - Ь-ИАМЕ + ВН4 + Ь-аргинин; 7 - Ь-ИАМЕ + Ь-аргинин + Ь-норвапин.

ИО-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании данных концентрации стабильных метаболитов оксида азота >Юх (рис. Идах)-Моделирование Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции

привело к уменьшению концентрации стабильных метаболитов оксида более чем в 2 раза. В группах животных, получавших Ь-аргинин как в качестве монотерапии, так и в комбинации с тетрагидробиоптерином и Ь-норвалином обнаружено статистически значимое увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота (рис. 11Шх), что наряду с нормализацией эндотелизависимой вазодилатации говорит о выраженном эндотелиопротективном действии исследованных комбинаций.

На рис. 11дк показано влияние исследуемых препаратов и их комбинаций на диаметр кардиомиоцитов при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Статистически значимое уменьшение диаметра кардиомиоцитов произошло в группах животных, получавших монотерапию Ь-аргинином и его комбинации с тетрагидробиоптерином и Ь-норвалином (рис. 11дк).

6. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов эналаприла, лозартана и амлодипина в качестве монотерапии и в комбинации с тетрагидробиоптерином при моделировании Ь^АМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Влияние исследуемых препаратов на исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс с моделированием Ь-ИАМЕ-индуцированной патологии представлены на рис. 12ад. Обнаружено, что эналаприл, лозартан и амлодипин в качестве монотерапии не предотвращали развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД, были достоверно выше соответствующих значений интактных животных во всех сериях экспериментов. Сочетанное применение тетрагидробиоптерина с указанными препаратами позволило обнаружить положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в статистически значимом снижении артериального давления и приближении показателей САД и ДАД к таковым у интактных животных. Так, в группах животных, получавших ВН4 + эналаприл, ВН4+лозартан, ВН4+амлодипин показатели САД и ДАД составили соответственно: 149,1±7,8 и 103,5±6,8, 141,2±11,4 и 102±10,1, 146,4±9,5 и 110,4±8,9 мм рт. ст. (рис. 12ад), у интактных животных - 137,7 ±3,7 и 101,9 ±4,3.

На рис. 12Кэд представлены результаты функциональных проб на эндотелийзависимое и эндотелийнезависимое расслабление сосудов с последующим расчётом КЭД у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией на фоне введения эналаприла 0,5 мг/кг, лозартана 6 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг, ВН4 10 мг/кг и комбинаций ВН4 с указанными препаратами. На фоне применения препаратов с доказанной эндотелиотропной активностью КЭД составил: эналаприл (0,5 мг/кг) - 3,3±0,3; лозартан (6 мг/кг) -2,5±0,3; амлодипина (0,5 мг/кг) - 2,1 ±0,3.

Сочетанное использование ВН4 и эналаприла, ВН4 и лозартана, ВН4 и амлодипина оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0. При этом КЭД составил 1,9±0,2, 1,4±0,1 и 1,7±0,2 соответственно. Обращает на себя внимание, что

показатели гемодинамики в группах ВН4+эналаприл и ВН4+лозартан статистически достоверно отличаются от таковых показателей при монотерапии эналаприлом, лозартаном и тетрагидробиоптерином (рис. 12Кэд>-

Рис. 12. Влияние эналаприла, лозартана, амлодипина, тетрагидробиоптерина и их комбинаций на функциональные показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0.

1 - Интактные; 2 - Ь-ЫАМЕ 25 мг/кг; 3 - Ь-ЫАМЕ + эналаприл 0,6 мг/кг; 4 - Ь-ЫАМЕ + лозартан 5 мг/кг; 5 - Ь-ИАМЕ + амлодипин 5 мг/кг; 6 - Ь-КАМЕ + ВН4; 7 - Ь-ЫАМЕ + ВН4 + эналаприл; 8 - Ь-ИАМЕ + ВН4 + лозартан; 9 - Ь^АМЕ + ВН4 + амлодипин.

При проведении пробы на аренореактивность максимальное предотвращение повышения адренореактивности, вызванное Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией, выявлено при использовании амлодипина (0,5 мг/кг), значение ЛЖД в данной группе составило 201,3±14,4 мм рт. ст. Применение ингибитора АПФ эналаприла оказалось менее эффективно, ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность составило 216,2±10,8 мм рт. ст. Блокатор АТ1-рецепторов лозартан в дозе 6 мг/кг не проявлял протективного действия на функциональной пробе с введением адреналина. При сочетанном применении ВН4 с исследуемыми препаратами обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимально низких значениях ЛЖД в ответ на внутривенное введение адреналина (рис. 12адр).

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением препараты с доказанной эндотелиопротективной активностью предотвращали падение сократимости с 5 на 25 секунду пережатия аорты. Так, прирост ЛЖД на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составил 83,6 % от величины прироста сократимости миокарда на 5 секунде (что принято за 100 %). В контрольной группе (Ь-ЫАМЕ- индуцированный дефицит N0) -66,0 %. Результаты у животных, где применялись исследуемые соединения, оказались в промежуточном положении. При сочетанном применении тетрагидробиоптерина с эналаприлом, лозартаном и амлодипином сократительный инотропный резерв сохранялся максимально и не отличался от такового показателя у интактных животных (рис. 12Нс).

При анализе биохимических маркеров обнаружено, что эналаприл 0,5 мг/кг, лозартан 6 мг/кг и амлодипин 0,5 мг/кг не оказывают статистически значимого влияния на увеличение экспрессии е-ЫОЗ. Поскольку тетрагидробиоптерин в качестве монотерапии повышает экспрессию еШБ, можно предположить, что ему принадлежит ключевая роль в реализации данного эффекта комбинаций ВН4 с эналаприлом, лозартаном и амлодипином (рис. 13емоз)- Эналаприл 0,5 мг/кг, лозартан 6 мг/кг и амлодипин, 0,5 мг/кг не оказывали статистически значимого влияния на содержание стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови лабораторных животных в условиях Ь-ИАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции. При комбинированном использовании препаратов с ВН4 статистически значимое увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота обнаружено во всех экспериментальных группах (рис. 13КОх).

Амлодипин в дозе 0,5 мг/кг статистически достоверно предотвращал увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов. Эналаприл и лозартан также проявляли протективное действие, однако показатель поперечного диаметра кардиомиоцитов статистически значимо не отличался от таковых значений в группе животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункцией. В группах животных, получавших комбинации препаратов с ВН4, поперечный диаметр кардиомиоцитов статистически достоверно не отличался от такового показателя у интактных животных (рис. 1 Здк).

72,9

eNOS ™

123*56789

Рис. 13. Влияние эналаприла, лозартана, амлодипина, тетрагидробиоптерина и их комбинаций на биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита N0.

1 - Интактные; 2 - L-NAME 25 мг/кг; 3 - L-NAME + эналаприл 0,6 мг/кг; 4 - L-NAME + лозартан 5 мг/кг; 5 - L-NAME + амлодипин 5 мг/кг; 6 - L-NAME + ВН4; 7 - L-NAME + ВН4 + эналаприл; 8 - L-NAME + ВН4 + лозартан; 9 - L-NAME + ВН4 + амлодипин.

Таким образом, очевидно, что стратегия применения ингибиторов АПФ, блокаторов АТ1 рецепторов и блокаторов кальциевых каналов в качестве монотерапии при общем, выраженном эндотелио- и кардиопротективном действии, позволяет корректировать лишь ряд показателей функционирования сосудистого эндотелия и сердечно-сосудистой системы в целом. При сочетанном применении эналаприла, лозартана и амлодипина с тетрагидробиоптерином при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита N0 обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, адренореактивности, сохранении высокого сократительного резерва, положительной динамике биохимических и морфологических показателей функционирования сосудистого эндотелия.

7. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата, мексикора и импазы при моделировании ЫЧАМЕ-нндуцированной эндотелиальной дисфункции.

Изучаемые препараты не влияли на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД, достоверно не отличались от таковых значений в группе животных, получавших Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг (рис. 14Ад).

Обработка полученных экспериментальных данных позволила установить, что все исследуемые препараты в обозначенных дозировках обладали выраженным эндотелиопротективным действием, выражающимся в статистически значимом уменьшении коэффициента эндотелиальной дисфункции и нормализации сосудистых реакций на ацетилхолин и нитропруссид натрия. Наиболее эффективное снижение КЭД на фоне моделирования Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота обнаружено в группе животных, получавших кардионат (1,3±0,1) (рис. 14КЭд).

Анализ полученных экспериментальных данных при проведении нагрузочной пробы на адренореактивность позволил установить статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД в сериях экспериментов с фосфоливом, кардионатом, мексикором и импазой. Введение комбинации витамина В6 и фолиевой кислоты не предотвращало Ь-ЫАМЕ-индуцированного повышения адренореактивности (рис. Над,).

Статистически достоверное предотвращение исчерпания миокардиального резерва обнаружено в группах животных, получавших фосфолив, кардионат, мексикор и импазу (рис. 14Нс).

Результаты изучения влияния исследуемых препаратов на экспрессию еТ-ЮБ представлены на рис. 15емс«. Применение исследуемых препаратов не привело к статистически значимому увеличению экспрессии еМЭБ (рис. 15с^05).

ЫО-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании данных содержания Ж)х. Обнаружено, что применение кардионата, мексикора и импазы привело к статистически значимому увеличению концентрации стабильных метаболитов оксида азота. Применение комбинации витамина В6 и фолиевой кислоты, а также фосфоглива не привело к достоверному изменению исследуемого показателя (рис. 15Шх).

При морфологическом исследовании сердца обнаружен протективный эффект препаратов фосфоглив, кардионат и мексикор. Наиболее выраженное кардиопротективное действие на данной модели патологии обнаружено при гистологическом исследовании миокарда животных, получавших кардионат и мексикор. Диаметр кардиомиоцитов в данных группах животных был статистически достоверно ниже соответствующих значений в группе животных с Ь-ЫАМЕ-ипдуцировашгой патологией (рис. 15дк).

кэд

АДр

НС

£

Рис. 14. Влияние витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата и импазы на функциональные показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0.

1 - Интактные; 2 - Ь-ЫАМЕ 25 мг/кг; 3 - Ь-ЫАМЕ + витамин В6 2 мг/кг + фолиевая кислота 0,2 мг/кг; 4 - ЫЧАМЕ + фосфоглив 2,2 мг/кг; 5 - Ь-КАМЕ + кардионат 80 мг/кг; 6 - 1^-КАМЕ + мексикор 30 мг/кг; 7 - Ь-НАМЕ + импаза 1 таб/кг.

\\4W4V

еИОБ

ДК

Рис. 15. Влияние витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата, мексикора и импазы на биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0. 1 - Интактные; 2 - Ь-ЫАМЕ 25 мг/кг; 3 - Ь-КАМЕ + витамин В6 2 мг/кг + фолиевая кислота 0,2 мг/кг; 4 - Ь-ЫАМЕ + фосфоглив 2,2 мг/кг; 5 - 1_-ЫАМЕ + кардионат 80 мг/кг; 6 - Ь-ЫАМЕ + мексикор 30 мг/кг; 7 - Ь-МАМЕ + импаза 1 таб/кг.

Таким образом, комбинация витамина Вв в дозе 2 мг/кг и фолиевой кислоты в дозе 0,2 мг/кг, фосфоглив капсулы в дозе 2,2 мг/кг, кардионат в дозе 80 мг/кг, мексикор в дозе 30 мг/кг и импаза в дозе 1 таб/кг проявляли выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, нормализации эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых реакций, увеличении концентрации стабильных метаболитов оксида азота, предотвращении исчерпания миокардиального резерва и снижении адренореактивности. Наиболее выраженная эффективность в данной серии экспериментов обнаружена в группах животных, получавших кардионат и мексикор.

юо

Выводы

1. Разработана модель гнпергомоцистеин индуцированного дефицита оксида азота, включающая в себя внутрижелудочное введение аминокислоты метионин в дозе 3 г/кг самцом крыс линии \Vistar, сопровождающаяся повышением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3,6 раза, увеличением адренореактивности, снижением миокардиального резерва, увеличением концентрации гомоцистеина в 6,2 раза и снижением концентрации стабильных метаболитов оксида азота в 2 раза. Значения артериального давления оставались в пределах физиологической нормы для данного вида животных. При морфологическом исследовании почек и сердца обнаружены изменения, указывающие на развитие системной эндотелиальной дисфункции на фоне нормальных для данного вида животных показателей артериального давления.

2. Тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг, Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг и Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг обладали выраженным эндотелио- и кардиопротективным действием при моделировании гипергомоцистеин и Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЫО-дефицитной эндотелиальной дисфункции, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике нагрузочных проб и биохимических показателей, при сохранении высоких значений артериального давления на фоне Ь-ЫАМЕ-патологии.

3. При сочетанном использовании Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг с тетрагидробиоптерином в дозе 10 мг/кг и Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг с Ь-норвалином в дозе 10 мг/кг обнаружено более выраженное, в сравнении с соответствующей монотерапией эндотелиопротективное действие на моделях гипергомоцистеин и Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в достоверном снижении КЭД, предотвращении развития выраженной артериальной гипертензии при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота. Положительную динамику продемонстрировали результаты нагрузочных проб, биохимических и морфометрических показателей.

4. Витамин В6 в дозе 2 мг/кг + фолиевая кислота в дозе 0,2 мг/кг, фосфоглив капсулы в дозе 2,2 мг/кг, кардионат в дозе 80 мг/кг, мексикор в дозе 30 мг/кг и импаза в дозе 1 таб/кг оказывали выраженное эндотелиопротективное действие при моделировании гипергомоцистеин и Ь-ЫАМЕ-индуцированной МО-дефицитной эндотелиальной дисфункции при сохранении высоких значений артериального давления. Наиболее эффективное снижение коэффициента эндотелиальной дисфункции при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено в группах животных, получавших витамин Вв и фолиевую кислоту а также фосфоглив капсулы, при моделировании Ь-ЫАМЕ-патологии - мексикор, кардионат и импазу. Сходная положительная динамика продемонстрирована при проведении нагрузочных проб, биохимических и морфометрических исследований.

5. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг и амлодипин в дозе 0,5 мг/кг при моделировании гипергомоцистеин и Ь-КАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции оказывали эндотелиопротективное действие, выражающееся снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции и нормализации сосудистых реакций. Эналаприл, лозартан и амлодипин в изученных дозах при моделировании Ь-ЫАМЕ-патологии не оказывали статистически значимого влияния на экспрессию е1Ч08 и концентрацию стабильных метаболитов оксида азота. При моделировании гипергомоцистеин индуцированной патологии эналаприл, лозартан и амлодипин уменьшали концентрацию гомоцистеина, а лозартан и амлодипин достоверно увеличивали концентрацию стабильных метаболитов оксида азота. Исследуемые препараты не предотвращали Ь-ЫАМЕ-индуцированной артериальной гипертензии.

6. При сочетанном применении тетрагидробиоптерина (10 мг/кг) с амлодипином (0,5 мг/кг) на моделях гипергомоцистеин и Ь-МАМЕ-индуцированной МО-дефицитной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб и морфометрических показателей. Применение комбинации тетрагидробиоптерина и амлодипина привело к статистически значимому увеличению экспрессии еШБ, концентрации стабильных метаболитов оксида азота и снижению артериального давления при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

7. При исследовании совместного применения тетрагидробиоптерина (10 мг/кг) с лозартаном калия (6 мг/кг) на моделях гипергомоцистеин и Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, адренореактивности, сохранении высокого сократительного резерва положительной динамике биохимических и морфологических показателей. Применение комбинации тетрагидробиоптерина и амлодипина привело к статистически значимому снижению артериального давления при Ь-МАМЕ-патологии.

8. При сочетанном применении тетрагидробиоптерина (10 мг/кг) с амлодипином (0,5 мг/кг) на моделях гипергомоцистеин и Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб, биохимических и морфометрических показателей. Применение комбинации тетрагидробиоптерина и амлодипина привело к статистически значимому снижению артериального давления при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Практические рекомендации

В практике фармакологических лабораторий при изучении эндотелиопротективной активности фармакологических агентов рекомендуется использовать методику исследования эндотелиальной дисфункции, включающий комплекс физиологических, биохимических, морфологических методов, показателя эндотелиальной дисфункции -коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД).

Для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности фармакологических средств при нарушениях метаболизма оксида азота на фоне гипергомоцистеинемии рекомендовано использовать экспериментальную модель, связанную с внутрижелудочным введением аминокислоты метионин в дозе 3 г/кг.

Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать внедрение в промышленное производство оригинальных лекарственных средств и проведение широких доклинических и клинических исследований тетрагидробиоптерина и L-норвалина, а также комбинаций тетрагидробиоптерин+Ь-норвалин и Ь-аргинин+Ь-норвалин на добровольцах с сердечно-сосудистыми заболеваниями, сахарным диабетом, дислипопро-теинемией, атеросклерозом.

С целью повышения эффективности антигипертензивной терапии и коррекции нарушений функционирования сосудистого эндотелия и нитроксидэргической системы рекомендуется проведение клинических исследований у пациентов с данной патологией комбинаций тетрагидробиоптерина с эналаприлом, лозартаном калия, амлодипином.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. М.В. Корокин, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская и др. Новый взгляд на коррекцию эндотелиальной дисфункции // Russian journal of immunology. - 2006. - Vol. 9, supp. 3. - P. 59-63.

2. М.В. Корокин, E.B. Арпошкова, М.В. Покровский и др. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов препарата «Кардионат» при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2007. - № 3. - С. 5-10.

3. М.В. Корокин, Е.Б. Арпошкова, Н.Г. Туманова и др. Влияние фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorea Deltoidea на регуляторную функцию эндотелия при моделировании гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2008. - № 2. - С. 85-89.

4. М.В. Корокин, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова, В.И. Кочкаров и др. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции // Кубанский научный медицинский вестник. -2007. -№ 1-2. - С. 146-150.

5. M.B. Корокин, M.B. Покровский, E.B. Артюшкова и др. Метаболическая и антиоксидантная терапия L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции II Кубанский научный медицинский вестник. -2008. - № 3-4. - С. 73-78.

6. М.В. Корокин, Т.Г. Покровская, M.B. Покровский, В.И. Кочкаров и др. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинаций основных групп антигипертензивных средств с L-аргинином при эндотелиальной дисфункции в эксперименте // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. - 2008. - № 2. -С. 126-131.

7. M.B. Корокин, E.H. Пашин, K.E. Бобраков и др. Изучение эндотелиопротективного и коронарного действия производных 3- оксипиридина // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 4 (109).-С. 104-109.

8. М.В. Корокин, В.Ю. Цепелев, М.В. Покровский, М.В. Корокин и др. Роль антиагрегантных препаратов в коррекции эндотелиальной дисфункции // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 4 (109). -С. 149-153.

9. М.В. Корокин, K.B. Полонская, М.В. Покровский и др. Возможности моделирования гомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 5 (110). -С. 43-48.

10. М.В. Корокин, Л.В. Корокина, И.М. Колесник, М.В. Покровский и др. Фармакологическая коррекция L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота рекомбинантным эритропоэтином // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 9 (114). - С. 66-70.

11. M.B. Корокин, A.C. Белоус, М.В. Покровский и др. Сравнительное изучение потенциальных эндотелийпротекторов и препарата Импаза при' моделировании дефицита оксида азота // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - № 8, Том 148. - С. 154-158.

12. M.B. Корокин, E.H. Пашин, К.Е. Бобраков и др. Эндотелиопро-тективные, кардиопротективные и коронаролитические эффекты производных 3-оксипиридина // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2009. - № 4. - С. 11-20.

13. M.B. Корокин, E.B. Артюшкова, М.В. Покровский др. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты мельдония и триметазидина при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2010. - № 3. -С. 5-10.

14. М.В. Корокин, A.C. Белоус, A.A. Арустамова, М.В. Покровский и др. Оценка коррекции L-NAME и гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции препаратом импаза // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2011. - № 4 (99). Выпуск 13.-С. 116-121.

15. М.В. Корокнн, Н.В. Юдина, М.В. Покровский и др. Эндотелиопротективное действие эналаприла и милдроната // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2011. - № 4 (99). Выпуск 13/2. - С. 57-61.

16. М.В. Корокнн, А.С. Белоус, А.А. Арустамова, М.В. Покровский и др. Сравнительная оценка эндотелио- и кардиопротективных эффектов препарата импаза на моделях L-NAME-индуцированной и гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2011. - № 4 (99). Выпуск 13/2. - С. 69-73.

17. М.В. Корокин, Н.В. Стабровская, В.А. Рагулина и др. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов препаратов этоксидол и резвератрол при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота // Врач-аспирант. - 2011. - №1.2(44). - С. 304-310.

18. М.В. Корокин, Н.В. Стабровская, В.А. Рагулина и др. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты препарата этоксидол при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2011. - № 4 (99). Выпуск 13/2. - С. 78-83.

19. М.В. Корокин, М.В. Покровский, Н.Г. Филиппенко и др. Реалии и перспективы фармакологической коррекции ADMA-eNOS ассоциированных путей при преэклампсии // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. -2010.-№6(6).-С. 882-887.

20. M.V. Korokin, M.V. Pokrovskiy, S.A. Tsepeleva at al. Arginase Inhibitor in the Pharmacological Correction of Endothelial Dysfunction // International Journal of Hypertension. - 2011. - Vol. 2011. - Article ID 515047, doi: 10.4061/2011/515047.

21. M.B. Корокин, М.В. Покровский, O.O. Новиков и др. Модель гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152. -№8.-С. 173-176.

22. М.В. Корокин, М.В. Покровский, О.О. Новиков и др. Влияние L-аргинина, витамина Вб и фолиевой кислоты на показатели эндотелиальной дисфункции и микроциркуляции в плаценте при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152. - №7. - С. 77-80.

23. М.В. Корокин, А.В. Бабко, М.В. Покровский, и др. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида в одной таблетке при 1-паше-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте // Кубанский научный медицинский вестник. -2011. -№ 4 (127). - С. 19-24.

24. М.В. Корокин, А.В. Бабко, М.В. Покровский, Е.Г. Терехова и др. Влияние сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалина и фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида в одной таблетке на эндотелиальную дисфункцию при экспериментальном моделировании

L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 4 (127). - С. 24-29.

25. М.В. Корокин, М.В. Покровский, A.B. Бабко, Е.Г. Терехова/ Влияние фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида в одной таблетке на эндотелиальную дисфункцию при моделировании гипергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 4 (127). - С. 151-156.

26. М.В. Корокин, С .А. Цепелева, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская и др. Кардио- и эндотелиопротективные эффекты ингибитора аргиназы 1-норвалина при моделировании 1-name индуцированного дефицита оксида азота // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 4 (127). -С. 185-188.

27. М.В. Корокин, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская и др. Способ оценки эндотелиальной дисфункции // XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - Москва, 2005.

28. М.В. Корокин, Л.В. Корокина, В.Г. Граник, В.А. Макаров. Коррекция L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции при использовании синтетических доноров оксида азота // Биомедицина. - 2006. - № 4. - С. 90-92.

29. М.В. Корокин, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова и др. Оценка эндотелиотропных свойств эндогенного донатора оксида азота // I Национальный конгресс терапевтов. - Москва, 2006. - С. 175.

30. М.В. Корокин, Л.В. Корокина, М.В. Покровский и др. Исследование эффектов синтетических доноров оксида азота при экспериментальной эндотелиальной дисфункции // Научно-медицинский вестник Центрального Черноземья. - Воронеж, 2006. - С. 83-87.

31. М.В. Корокин, Т.Г. Покровская, Т.Н. Чулюкова, М.В. Покровский и др. Эндотелиопротективные эффекты Силденафила при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота // XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (14-18 апреля 2008 г., г. Москва). - Москва, 2008. - С. 685.

32. М.В. Корокин, М.В. Покровский, Н.Г. Туманова и др. Возможности коррекции регуляторной функции эндотелия фуростаноловыми гликозидами из культуры клеток растения Dyoscorea deltoidea // XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (14-18 апреля 2008 г., г. Москва). - Москва, 2008.-С. 641.

33. М.В. Корокин, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская и др. Кардиопротективные эффекты резвератрола при экспериментальной блокаде индуцибельной синтазы оксида азота // Аллергология и иммунология. - 2008. -Т. 9., № 1.-С. 157.

34. М.В. Корокин, Т.Г. Покровская, Т.Н. Чулюкова, М.В. Покровский и др. Эндотелиопротективные эффекты препарата Мексиприм при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте // XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (14-18 апреля 2008 г., г. Москва). - Москва, 2008. - С. 685.

35. М.В. Корокин, Е.В. Артюшкова, М.В. Покровский и др.

Исследование кардиопротективных эффектов 3- (2, 2, 2-триметилгидразиний) пропионата дигидрата при моделировании дефицита оксида азота с помощью специфической блокады индуцибельной NO-синтазы // Аллергология и иммунология.-2008.-Т. 9,№1. - С. 157.

36. М.В. Корокин, Е.Б. Артюшкова, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская. Коррекция NO-дефицитной эндотелиальной дисфункции с помощью 3- (2,2,2-триметилгидразиний) пропионата дигидрата // 73 научная конференция КГМУ и сессии Центрально-Чернозёмного научного центра РАМН «Университетская наука: теория, практика, инновации». - Курск, 2008. -Т. III.-С. 189-193.

37. М.В. Корокин, К.Е. Бобраков. Эндотелиопротективные эффекты препарата мексиприм при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте // Всероссийская научно-практическая конференция «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (29-30 апреля

2008 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2008. - С. 145-146.

38. М.В. Корокин, М.В. Покровский, Е.В. Артюшкова и др. Изучение эндотелиопротективных свойств препарата кардионат при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (6-10 апреля 2009 г., г. Москва). -Москва, 2009. - С. 679.

39. М.В. Корокин, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. Влияние препарата Фосфоглив-форте на эндотелиальную дисфункцию // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (6-10 апреля

2009 г., г. Москва). - Москва, 2009. - С. 718.

40. М.В. Корокин, К.В. Полонская, JI.B. Корокина. Исследование кардиопротективного действия препарата «Фосфоглив» капсулы при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции // IV Международная научная конференция молодых учёных-медиков (25-26 февраля 2010 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2010. - Т. 3. -С. 25-27.

41. М.В. Корокин, Е.В. Артюшкова, О.С. Гудырев и др. Влияние метаболических цитопротекторов мельдония, триметазидина и их комбинаций с L-аргинином на NO-продуцирующую функцию эндотелия при экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции // 75 Всероссийская научная конференция студентов и молодых учёных с международным участием, посвященная 75-летию КГМУ, «Молодежная наука и современность» (20-21 апреля 2010 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2010. - Ч. I. -С. 277.

42. М.В. Корокин, Е.В. Артюшкова, О.С. Гудырев и др. Возможности фармакологической коррекции морфологических изменений метаболическими цитопротекторами в комбинации с L-аргинином при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / // 75 Всероссийская научная конференция студентов и молодых учёных с международным участием, посвященная 75-летию КГМУ, «Молодежная наука и современность» (20-21 апреля 2010 г, г. Курск). - Курск: КГМУ, 2010. - Ч. I. - С. 278.

43. M.B. Корокин, E.B. Артюшкова, O.C. Гудырев. Исследование NO-продуцирующей функции эндотелия на фоне введения комбинаций мельдония и триметазидина с L-аргинином при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (20-22 мая 2010 г., г. Москва). - Москва, 2010. - С. 11-12.

44. М.В. Корокин, Е.В. Артюшкова, О.С. Гудырев. Фармакологическая коррекция морфологических изменений метаболическими цитопротекторами мельдонием и триметазидином в комбинации с L-аргинином при экспериментальном дефиците оксида азота // Всероссийская научнопрактическая конференция с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (20-22 мая 2010 г., г. Москва). -Москва, 2010. - С. 12.

45. М.В. Корокин, К.В. Полонская, М.В. Покровский и др. Оценка функции сосудистого эндотелия при гипергомоцистеинемии // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (20-22 мая 2010 г., г. Москва). -Москва, 2010.-С. 108.

46. М.В. Корокин, К.В. Полонская, М.В. Покровский и др. Кардиопротективные эффекты эссенциальных фосфолипидов // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). - Москва, 2010. - С. 219.

47. М.В. Корокин, М.В. Покровский, О.С. Гудырев и др. Моделирование метионин индуцированной эндотелиальной дисфункции // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). - Москва, 2010. - С. 646-647.

48. М.В. Корокин, В.А. Рагулина, М.В. Покровский и др. Кардиопротективные эффекты нового производного 3-оксипиридина // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). - Москва, 2010. - С. 708.

49. М.В. Корокин, Е.В. Артюшкова, М.В. Покровский и др. Кардиопротективные эффекты мельдония и триметазидина при экспериментальном дефиците оксида азота // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). - Москва, 2010.-С. 571.

50. М.В. Корокин, Е.В. Артюшкова, М.В. Покровский и др. Эндотелиопротекгивные эффекты цитопротектора метаболического действия триметазидина и его комбинаций с L-аргинином при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота // V Национальный конгресс терапевтов. -Москва, 2010.-С. 11.

51. М.В. Корокин, К.В. Полонская, М.В. Покровский и др. Кардиопротективное действие эссенциальных фосфолипидов при

моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции // III Всероссийская научно- практическая конференция с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (7-8 июня 2010 г., г. Курск). - Курск, 2010. - С. 203-204.

52. М.В. Корокин, В.А. Рагулина, М.В. Покровский и др. Изучение кардиопротективной активности производного 3-оксипиридина // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. -2011. -№ 3. - С. 118.

53. М.В. Корокин, Н.В. Стабровская, В.А. Рагулина и др. Исследование эндотелиопротективных свойств этоксидола при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011. - №3. -С. 123-124.

54. М.В Корокин, A.B. Бабко, Е.Г. Терехова. Кардиопротективные эффекты фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции // III Всероссийский научно-практический семинар для молодых учёных «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (19-22 сентября 2011 г., г. Волгоград). - Волгоград: ВолГМУ, 2011.-С. 22-24.

55. М.В. Корокин, С.А. Цепелева, В.Ю Цепелев и др. Сравнительная оценка эндотелиопротективных эффектов L-норвалина при различных моделях эндотелиальной дисфункции // III Всероссийский научно-практический семинар для молодых учёных «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (19-22 сентября 2011 г., г. Волгоград). -Волгоград: ВолГМУ, 2011. - С. 77-79.

56. М.В. Корокин, Н.В. Юдина, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова. Эндотелиопротективные эффекты лозартана, милдроната и их комбинации // III Всероссийский научно-практический семинар для молодых учёных «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (19-22 сентября 2011 г., г. Волгоград). - Волгоград: ВолГМУ, 2011.-С. 88-90.

Патенты РФ на изобретения

1. Патент 2414755. Способ моделирования гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции / С.Г. Емельянов, М.В. Корокин, М.В. Покровский и др.; заявитель и патенообладатель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Юго-Западный государственный университет» - № 2009138369/14; опубл. 20.03.2011 Бюл. №8.-4 с.

2. Патент 2433486. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции препаратом этоксидол при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявители и патентообладатели: Государственное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию - № 2010110900/14; опубл. 10.11.11,Бюл.№31. - 4 с.

3. Патент 2301670. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией эналаприла и резвератрола при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявители и патентообладатели: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Арттошкова. - № 2005140966/14; опубл.27.06.07, Бюл. №18. - 4 с.

4. Патент 2430428. Способ коррекции гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции препаратом «Фосфоглив» капсулы / М.В. Покровский, М.В. Корокин, Е.Б. Артюшкова и др.; заявители и патентообладатели: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. - № 2010114476/14; опубл. 27.09.2011, Бюл. № 27. - 6 е.: ил.

5. Патент 2421822. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией триметазидина и Ь-аргинина при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявители и патентообладатели: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.В. Артюшкова. -№ 2009130489/14; опубл. 20.06.11, Бюл. № 17. - 6 е.: ил.

6. Патент 2372078. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции препаратом Фосфоглив лиофилизат при Е-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота/ М.В. Покровский и др.; заявители и патентообладатели: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. - № 2008110101/14; опубл. 10.11.2009, Бюл. №31. - 4 с.

7. Патент 2306924. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией лозартана и резвератрола при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявители и патентообладатели: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. -№ 2005140967/14; опубл. 27.09.07, Бюл. №27. - 5 с.

8. Патент 2359668. Способ коррекции эндотелиальной препаратом фосфоглив при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота/ М.В. Покровский и др.; заявители и патентообладатели: М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. - № 2008110102/14; опубл. 27.06.09, Бюл. № 18.-5 с.

Список сокращений

АД - артериальное давление АДр - адренореактивность

ДАД - диастолическое артериальное давление (мм рт. ст.)

ДМ - диаметр кардиомиоцитов

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛЖД - левожелудочковое давление

НС - нагрузка сопротивлением

РФК - реактивные формы кислорода

САД - систолическое артериальное давление (мм рт. ст.)

ЧСС - частота сердечных сокращений (уд. мин)

ЭД - эндотелиальная дисфункция

eNOS - эндотелиальная NO-синтаза

L-NAME - N-HHTpo-L-аргшши метиловый эфир

ADMA - ассиметричный диметиларгинин

L-NMMA - монометиларгинин

5-МТГФ - 5-метилтетрагидрофолат

NF-kB - нуклеарный фактор каппа - В

N0 - оксид азота

NOx, total NO - сумма нитритов и нитратов НАДФН - никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат ФАД - флавинадениндинуклеотид ФМН - флавинмононуклеотид ВН4 - тетрагидробиоптерин

Подписано в печать 27.01.2012.Times New Roman. Формат 60x84/16. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 20. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИПК НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

В патогенезе и клинике артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции эндотелия [4, 6, 14, 125, 145, 259, 341, 362, 382]. Развитие эндотелиальной дисфункции при дефиците оксида азота представляются многообразным комплексом соединяющихся и взаимообусловленных механизмов.

Эндотелий - это тонкий, моноклеточный слой, покрывающий всю внутреннюю поверхность кровеносных сосудов и отделяющий циркулирующую кровь от тканей. В настоящее время стало очевидным, что эндотелий сосудов - это активная метаболическая система, поддерживающая сосудистый гомеостаз путём осуществления ряда важнейших функций: модулирования тонуса сосудов; регуляции транспорта растворенных веществ в клетки сосудистой стенки, роста этих клеток; формирования внеклеточного матрикса; защиты сосудов от возможного неблагоприятного действия циркулирующих клеток и субстанций; регуляции хемотаксических, воспалительных и репаративных процессов в ответ на локальное повреждение.

Исследования последних лет убедительно свидетельствуют о том, что в небольших концентрациях оксид азота (NO) - представляет уникальный по своей природе и механизмам действия вторичный мессенджер в большинстве клеток организма. Оксид азота (N0) - ведущий гуморальный эндотелиальный модулятор дилатации, релаксирующий сосуды, который вырабатывается эндотелиоцитами [107, 210, 215]. Клетки эндотелия выделяют большое количество различных веществ как в кровь, так и в окружающие ткани, поэтому их можно рассматривать как самую большую эндокринную систему [223, 251, 269,376,377,416, 455].

В свободном состоянии N0 — короткоживущая молекула, период полужизни которой колеблется от 6 до 30 с, после чего она быстро разрушается. Однако NO может стабилизироваться путем включения в динитрозольиые комплексы железа с тиоловыми лигандами, образуя депо в тканях. Из этого депо N0 высвобождается постепенно, выполняя ауто- и паракринные функции. Нитрозилирование с тиоловыми группами в плазменных белках, таких как альбумин, генерирует циркуляторный пул N0; 5-нитрозилирование же гемоглобина в легких поставляет нитрозотиоловые группы периферическим сосудам и регулирует доставку кислорода.

В настоящее время под дисфункцией эндотелия понимают дисбаланс между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов [34, 78, 119, 127, 135, 261, 341, 342, 426].

Коррекция эндотелиальной дисфункции и, как следствие, нарушений метаболизма оксида азота (снижение его синтеза эндотелиоцитами и снижение биодоступности) приводит к снижению риска возникновения, а также предупреждению патогенетических механизмов развития и клинических проявлений артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений [4, 14, 30, 68, 88, 103, 223, 304, 343, 380, 389].

Нарушения продукции, взаимодействия, разрушения эндотелиальных вазоактивных факторов наблюдаются одновременно с аномальной сосудистой реактивностью, изменениями в структуре и росте сосудов, которым сопутствуют сердечно-сосудистые заболевания [88, 107, 330, 346, 352, 359].

Сравнительно недавно к потенциальным факторам риска сердечнососудистых заболеваний стали относить гипергомоцистеинемию. Гипергомоцистеинемия может являться независимым фактором развития эндотелиальной дисфункции или усиливать уже имеющееся повреждение эндотелия [299, 371, 407].

Предполагается, что эффекты гомоцистеина связаны с его склонностью к образованию дисульфидных связей и способностью образовывать свободные радикалы, вступающие в реакцию с N0, снижающие его биологическую активность. Кроме того, возможно нарушается и синтез N0 [299, 371, 407]. К настоящему моменту описан целый ряд причин, приводящих к повышению концентрации гомоцистеина, в том числе мутации определенных генов, особенности питания, прием некоторых лекарственных препаратов. В то же время известных факторов коррекции гипергомоцистеинемии не так много и, пожалуй, к ним следует отнести лишь экзогенное введение витамина В6 и фолиевой кислоты.

Для согласованной работы eNOS требуется много совместно действующих факторов, таких как никотинамиддифосфат (NADPH), флавин-аденин-динуклеотид (FAD), кальций, кальмодулин и тетрагидробиоптерин. N0 диффундирует в сосудистые гладкомышечные клетки и стимулирует гуанилатциклазу, что приводит к увеличению продукции cGMP и вазодилатации [266, 304, 400, 419].

Появление в последние годы понятий «эндогенного ингибирования» эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS) и «разрыв eNOS» привело к интенсификации исследований, направленных на их предотвращение, как ключевых звеньев в коррекции эндотелиальной дисфункции.

Метилированные аналоги L-аргинина - ассиметричный диметиларгинин (ADMA) и монометиларгинин (L-NMMA) - являются эндогенными ингибиторами эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). В последние годы обнаружено, что концентрации ADMA при артериальной гипертензии, гестозе, диабете, гипергомоцистеинемии, эндотоксиновом шоке увеличивается и что повышенные концентрации ADMA являются одними из ключевых факторов риска середчно-сосудистого континуума [190, 245, 304, 319, 406, 411].

Разрыв eNOS» представляет собой переключение ферментной активности eNOS на выработку супероксида, а не оксида азота. При этом, на ключевую роль в регуляции функции eNOS выдвигается кофактор птерина -тетрагидробиоптерин (ВН4). [155, 357, 353, 431].

Для обеспечения оптимальной активности eNOS предложены две стратегии - экзогенное введение L-аргинина и тетрагидробиоптерина [155, 357].

В ранее проводимых исследованиях было показано, что L-аргинин как монотерапия, так и в сочетании с антигипертензивными средствами на ADMAподобной модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции эффективно увеличивал активность эндотелиальной МЭ-синтазы и продукцию оксида азота и предотвращал развитие эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных [43, 46, 86, 113, 131, 133, 149, 139].

В течение последних десяти лет многочисленные исследования изучали влияние дополнительного введения ВН4 на эндотелиальную дисфункцию, обусловленную различными сосудистыми заболеваниями. Сначала данные исследования включали в себя ограниченное количество пациентов, принимавших ВН4 однократно или в течение короткого периода времени. Примечательно, что дополнительное введение ВН4 улучшало эндотелиальную функцию в различных состояниях (в том числе при гиперхолестеринемии, диабете, гипертензии, заболевании коронарной артерии и сердечной недостаточности); подобное дополнительное введение ВН4 также улучшало эндотелиальную функцию у курильщиков и у лиц пожилого возраста. По-видимому, благоприятный эффект ВН4 был связан со спецификой эндотелия, так как дополнительное введение ВН4 не оказывало никакого влияния на эффекты не зависящих от эндотелия сосудорасширяющих средств/вазодилататоров (например, нитроглицерина). Благоприятные эффекты ВН4 возникали в результате активации еЖ)8 или противоокислительного эффекта ВН4 [276].

Дефицит ВН4 при сосудистых заболеваниях вызван, в основном, окислением тетрагидробиоптерина пероксинитритом. Следовательно, стратегии, направленные на защиту эндогенного ВН4 от окислительных атак со стороны пероксинитрита, могут привести к сохранению оптимальной эндотелиальной концентрации кофактора, необходимого для поддержания активности е>Ю8 и биосинтеза окиси азота.

В клинических исследованиях применение фолиевой кислоты или 5-метилтетрагидрофолата (5-МТГФ, активная и циркулирующая форма фолиевой кислоты) заслужило наибольшего внимания, так как данные агенты/средства могут оказывать потенциально благоприятное влияние на метаболизм ВН4. Несмотря на то, что механизм оказания данного влияния остаётся не до конца понятным [460], недавние открытия наводят на предположение о том, что 5-МТГФ является мощным скевинжером пероксинитрита. Кроме того, 5-МТГФ и фолиевая кислота [356] снижают уровень аниона супероксида и улучшают зависящую от эндотелия релаксацию (вазодилатацию) артерий человека ex vivo и in vivo. Более важно, что применение 5-МТГФ пациентами с атеросклерозом и заболеванием коронарной артерии приводит к повышенному содержанию ВН4 в тканях артерий и вен (реверсирование разрыва eNOS), а также к нормализации производства окиси азота. Таким образом, применение фолатов предоставляет эффективную стратегию для предотвращения окисления ВН4 и последующего разрыва eNOS. Несмотря на то, что обычно благоприятные влияния фолатов объясняются их способностью снижать уровни гомоцистеина, недавно сделанные открытия указывают на то, что сохранение сосудистого содержания ВН4 и эффективная связь/сцепление eNOS способствуют вазопротективным эффектам фолатов.

Кроме того, ограничение образования оксида азота может быть обусловлено высокой активностью аргиназы - фермента, разрушающего L-аргинин в слизистой оболочке тонкого кишечника. Становится очевидной необходимость подавления высокой активности аргиназы для снижения риска и частоты развития болезней сердца и сосудов. С этой целью возможно использовать ингибиторы аргиназы. Среди веществ данной группы наибольший интерес представляет L-норвалин - неселективный ингибитор фермента.

Таким образом, среди нарушений метаболизма NO можно выделить факторы ведущие к снижению его выработки (пониженное поступление L-аргинина, повышенная активность аргиназ, ингибирование и разобщение eNOS, повреждение эндотелиоцитов и т.д.) и уменьшению биодоступности (окислительный стресс, гиперлипидемия, воспаление). Очевидно, что в настоящее время достаточно большое внимание уделяется изучению путей фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота при эндотелиалыюй дисфункции. Однако, в доступной литературе не обнаружено сравнительного комплексного изучения эндотелио- и кардиопротективной активности тетрагидробиоптерина, Ь-аргинина, Ь-норвалина, витамина В6 и фолиевой кислоты, а также их комбинаций с представителями основных групп препаратов, обладающих эндотелиопротективными эффектами (эналаприл, лозартан, амлодипин, мексикор), при различном экспериментальном моделировании эндотелиалыюй дисфункции.

Работа выполнена по инициативному плану КГМУ, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007-2012 гг., номер госрегистрации 0120.0710379. Исследование поддержано Грантом Президента Российской Федерации номер МК-905.2012.4. Номер государственной регистрации диссертационной темы -01201055010.

Цель исследования: провести сравнительную оценку фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота с помощью терапевтических подходов, направленных на предотвращение эндогенного ингибирования и разобщения 1ЧО-синтазы с субстратом при различных экспериментальных моделях дефицита оксида азота.

Задачи исследования:

1. Исследовать развитие эндотелиальной дисфункции при гипергомоцистеин индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность тетрагидробиоптерина, Ь-аргинина и Ь-норвалина при моделировании гипергомоцистеин и Ь-КАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

3. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения Ь-аргинина с тетрагидробиоптерином и Ь-норвалином при моделировании гипергомоцистеин и Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

4. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность эналаприла, лозартана и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин и Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

5. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и эналаприла при моделировании гипергомоцистеин и Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

6. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и лозартана при моделировании гипергомоцистеин и Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

7. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин и Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

8. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность эссенциальных фосфолипидов, потенцированных антител к эндотелиальной Ж)-синтазе, мельдония и этилметилгидроксипиридина сукцината, витамина Вб и фолиевой кислоты при моделировании гипергомоцистеин и Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ моделирования гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции. Продемонстрировано, что эндотелиальная дисфункция на фоне внутрижелудочного введения метионина связана с гипергомоцистеинемией и характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3,6 раза. Одновременно гипергомоцистеин индуцированная эндотелиальная дисфункция не сопровождается повышением абсолютных значений систолического и диастолического артериального давления. Кроме того, развитие эндотелиальной дисфункции сопровождается снижением показателей биохимических маркеров (концентрация стабильных метаболитов оксида азота (Total NO, NOx), экспрессия эндотелиальной NO-синтазы), повышением концентрации гомоцистеина, а также отрицательной динамикой морфометрических показателей (диаметр кардиомиоцитов).

В работе впервые показано, что преодоление разобщения eNOS с субстратом путём введения тетрагидробиоптерина в дозе 10 мг/кг в качестве кофактора и влияние на метаболизм L-аргинина путём блокирования фермента аргиназы с помощью L-норвалина в дозе 10 мг/кг в качестве монотерапии оказывают эндотелио- и кардиопротективное действие как на модели L-NAME-индуцированной, так и гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции. При гипергомоцистеин индуцированной патологии продемонстрировано выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие L-аргинина.

Впервые предложен способ комбинированной фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота с помощью сочетанного применения тетрагидробиоптерина и L-аргинина, L-норвалина и L-аргинина. При сочетанном применении тетрагидробиоптерина и L-аргинина, L-норвалина и L-аргинина обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном приближении исследуемых показателей функции сосудистого эндотелия к таковым показателям интактных животных.

Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг, амлодипин в дозе 0,5 мг/кг обладают эндотелиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии. Впервые показано, что сочетанное использование тетрагидробиоптерина с вышеперечисленными представителями основных групп антигипертензивных препаратов приводит к положительному фармакодинамическому взаимодействию, что обусловлено различными точками приложения фармакологических эффектов изучаемых препаратов.

Впервые доказано, что комбинация витамина В6 и фолиевой кислоты, эссенциальные фосфолипиды, мельдоний, этилметилгидроксипиридина сукцинат и потенцированные антитела к эндотелиальной 1\Ю-синтазе оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие при моделировании эндотелиальной дисфункции с помощью внутрибрюшинного введения Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг и внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг.

Впервые установлено увеличение экспрессии еЫОБ под влиянием тетрагидробиоптерина в качестве монотерапии и в комбинации с эналаприлом, лозартаном, амлодипином и Ь-аргинином.

Таким образом, на основании выполненных исследований разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицировать как крупное научное достижение, заключающееся в формировании целостных представлений о механизмах нарушения и путях фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида при эндотелий ассоциированной патологии путём предотвращения эндогенного ингибирования, преодоления разобщения е>Ю8 с субстратом и увеличения биодоступности оксида азота.

Научно-практическая значимость. Предложенная модель гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции и комплексный подход к оценке патологии даёт возможность в дальнейшем 1 оценивать эндотелиопротективные свойства фармакологических агентов и проводить скрининг эндотелиопротективной активности новых веществ.

Экспериментально обосновано применение тетрагидробиоптерина в качестве монотерапии и в комбинации с Ь-аргинином, комбинации Ь-аргинина с Ь-норвалином, витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата, мексикора и импазы, а также комбинаций тетрагидробиоптерина с эналаприлом, лозартаном и амлодипином для коррекции выраженной гипергомоцистеинемии, эндотелиальной дисфункции и снижения риска развития сердечно-сосудистой патологии. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки и внедрения фармакологических препаратов на основе тетрагидробиоптерина, Ь-аргинина и Ь-норвалина в качестве средств для профилактики и лечения эндотелий ассоциированной патологии. По результатам проведённых исследований на мощностях ОАО "Новосибхимфарм" готовится к промышленному выпуску препарат, содержащий в своём составе Ь-аргинин и Ь-норвалин.

Сравнительный анализ полученных экспериментальных данных о эндотелио- и кардиопротективной активности традиционных антигипер-тензивных препаратов в комбинации с тетрагидробиоптерином позволяет приступить к разработке новых лекарственных средств для лечения сердечнососудистых заболеваний, их доклиническому и клиническому изучению.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и Международных конференциях молодых учёных КГМУ в 2005 -2011 гг., І-ІУ Всероссийских конференциях молодых учёных-медиков, Российской научной конференции (с международным участием) «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), VI Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2007), съезде терапевтов юга России «Врач XXI века: сегодня и завтра» (Ростов-на-Дону, 2009), научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2009), XIII - XVII национальных конгрессах «Человек и лекарство», І, II, V национальных конгрессах терапевтов и кардиологов, VII съезде аллерголов и иммунологов СНГ, V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научно-практической конференции (с международным участием) «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Москва, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011).

Апробация диссертации проведена 27 июня 2011 г. на совместном заседании кафедр Курского государственного медицинского университета и

Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Диссертационная работа обсуждена на научно-практической конференции кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней Первого МГМУ имени И.М. Сеченова 10 ноября 2011 г. (протокол № 12).

Внедрение результатов научных исследований.

На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований Ь-норвалина, Ь-аргинина, тетрагидробиоптерина, их комбинаций, а также комбинаций тетрагидробиоптерина эналаприлом, лозартаном и амлодипином при эндотелий ассоциированной патологии.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив форте производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008120/08), фосфоглив производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУР N002528/01) и мельдоний (Кардионат) производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛСР-006481/08), включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности комбинации Ь-аргинина и Ь-норвалина включенны в состав документов для промышленного выпуска нового оригинального препарата, содержащего в своём составе Ь-аргинин и Ь-норвалин (ООО "Новосибхимфарм").

Полученные результаты используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и учебных программах кафедр фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии, фармакологии и фармацевтических дисциплин, биохимии и фармакологии НИУ «БелГУ», фармакологии Воронежской медицинской академии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гипергомоцистеин индуцированная эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3,6 раза, концентрации гомоцистеина, снижением концентрации стабильных метаболитов оксида азота, характерной динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы.

2. Тетрагидробиоптерин 10 мг/кг, Ь-аргинин 200 мг/кг, Ь-норвалин 10 мг/кг, а также комбинации тетрагидробиоптерина 10 мг/кг и Ь-аргинина 200 мг/кг, Ь-норвалина 10 мг/кг и Ь-аргинина 200 мг/кг оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие при моделировании гипергомоцистеин- и Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

3. Комбинация витамина В6 и фолиевой кислоты, препараты «Фосфоглив», «Кардионат», «Мексикор» и «Импаза» в качестве монотерапии обладают эндотелио- и кардиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии.

4. Эналаприл 0,5 мг/кг, лозартан 6 мг/кг и амлодипин 0,5 мг/кг оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на моделях гипергомоцистеин- и Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции. При комбинированном использовании тетрагидробиоптерина 10 мг/кг с энаиаприлом 0,5 мг/кг, лозартаном 6 мг/кг и амлодипином 0,5 мг/кг на моделях гипергомоцистеин- и Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, из них 25 в российских рецензируемых научных журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций, отражающих полностью содержание диссертации. Получено 8 патентов РФ на изобретения

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 465 источников, из них 151 отечественных и 314 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 390 страницах машинописного текста, содержит 69 таблиц, 110 рисунков, одну схему.

выводы

1. Разработана модель гипергомоцистенн индуцированного дефицита оксида азота, включающая в себя внутрижелудочное введение аминокислоты метионин в дозе 3 г/кг самцом крыс линии Wistar, сопровождающаяся повышением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3,6 раза, увеличением адренореактивности, снижением миокардиального резерва, увеличением концентрации гомоцистеина в 6,2 раза и снижением концентрации стабильных метаболитов оксида азота в 2 раза. Значения артериального давления оставались в пределах физиологической нормы для данного вида животных. При морфологическом исследовании почек и сердца обнаружены изменения, указывающие на развитие системной эндотелиальной дисфункции на фоне нормальных для данного вида животных показателей артериального давления.

2. Тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг, Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг и Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг обладали выраженным эндотелио- и кардиопротективным действием при моделировании гипергомоцистенн и Ь-]ЧГАМЕ-индуцированной МО-дефицитной эндотелиальной дисфункции, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике нагрузочных проб и биохимических показателей, при сохранении высоких значений артериального давления на фоне Ь-ЫАМЕ-патологии.

3. При сочетанном использовании Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг с тетрагидробиоптерином в дозе 10 мг/кг и Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг с Ь-норвалином в дозе 10 мг/кг обнаружено более выраженное, в сравнении с соответствующей монотерапией эндотелиопротективное действие на моделях гипергомоцистенн и Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в достоверном снижении КЭД, предотвращении развития выраженной артериальной гипертензии при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота. Положительную динамику продемонстрировали результаты нагрузочных проб, биохимических и морфометрических показателей.

4. Витамин В6 в дозе 2 мг/кг + фолиевая кислота в дозе 0,2 мг/кг, фосфоглив капсулы в дозе 2,2 мг/кг, кардионат в дозе 80 мг/кг, мексикор в дозе 30 мг/кг и импаза в дозе 1 таб/кг оказывали выраженное эндотелиопротективное действие при моделировании гипергомоцистеин и Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЫО-дефицитной эндотелиальной дисфункции при сохранении высоких значений артериального давления. Наиболее эффективное снижение коэффициента эндотелиальной дисфункции при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено в группах животных, получавших витамин В6 и фолиевую кислоту а также фосфоглив капсулы, при моделировании Ь-ЫАМЕ-патологии - мексикор, кардионат и импазу. Сходная положительная динамика продемонстрирована при проведении нагрузочных проб, биохимических и морфометрических исследований.

5. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг и амлодипин в дозе 0,5 мг/кг при моделировании гипергомоцистеин и Ь-КАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции оказывали эндотелиопротективное действие, выражающееся снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции и нормализации сосудистых реакций. Эналаприл, лозартан и амлодипин в изученных дозах при моделировании Ь-ЫАМЕ-патологии не оказывали статистически значимого влияния на экспрессию еЫОЗ и концентрацию стабильных метаболитов оксида азота. При моделировании гипергомоцистеин индуцированной патологии эналаприл, лозартан и амлодипин уменьшали концентрацию гомоцистеина, а лозартан и амлодипин достоверно увеличивали концентрацию стабильных метаболитов оксида азота. Исследуемые препараты не предотвращали Ь-КАМЕ-индуцированной артериальной гипертензии.

6. При сочетанном применении тетрагидробиоптерина (10 мг/кг) с амлодипином (0,5 мг/кг) на моделях гипергомоцистеин и Ь-КАМЕ

332 индуцированной ИО-дефицитной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб и морфометрических показателей. Применение комбинации тетрагидробиоптерина и амлодипина привело к статистически значимому увеличению экспрессии е1Ч08, концентрации стабильных метаболитов оксида азота и снижению артериального давления при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

7. При исследовании совместного применения тетрагидробиоптерина (10 мг/кг) с лозартаном калия (6 мг/кг) на моделях гипергомоцистеин и Ь-КАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, адренореактивности, сохранении высокого сократительного резерва положительной динамике биохимических и морфологических показателей. Применение комбинации тетрагидробиоптерина и амлодипина привело к статистически значимому снижению артериального давления при Ь-ЫАМЕ-патологии.

8. При сочетанном применении тетрагидробиоптерина (10 мг/кг) с амлодипином (0,5 мг/кг) на моделях гипергомоцистеин и Ь-КАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб, биохимических и морфометрических показателей. Применение комбинации тетрагидробиоптерина и амлодипина привело к статистически значимому снижению артериального давления при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Практические рекомендации

В практике фармакологических лабораторий при изучении эндотелиопротективной активности фармакологических агентов рекомендуется использовать методику исследования эндотелиальной дисфункции, включающий комплекс физиологических, биохимических, морфологических методов, показателя эндотелиальной дисфункции -коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД).

Для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности фармакологических средств при нарушениях метаболизма оксида азота на фоне гипергомоцистеинемии рекомендовано использовать экспериментальную модель, связанную с внутрижелудочным введением аминокислоты метионин в дозе 3 г/кг.

Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать внедрение в промышленное производство оригинальных лекарственных средств и проведение широких доклинических и клинических исследований тетрагидробиоптерина и Ь-норвалина, а также комбинаций тетрагидробиоптерин+Ь-норвалин и Ь-аргинин+Ь-норвалин на добровольцах с сердечно-сосудистыми заболеваниями, сахарным диабетом, дислипопро-теинемией, атеросклерозом.

С целью повышения эффективности антигипертензивной терапии и коррекции нарушений функционирования сосудистого эндотелия и нитроксидэргической системы рекомендуется проведение клинических исследований у пациентов с данной патологией комбинаций тетрагидробиоптерина с эналаприлом, лозартаном калия, амлодипином.