Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов ингибиторов фосфодиэстеразы-5 силденафила и тадалафила и их комбинаций с L-аргинином

На правах рукописи

ЧУЛЮКОВА Татьяна Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОТЕЛИО- И КАРДИОПРОТЕКТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ ИНГИБИТОРОВ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ-5 СИЛДЕНАФИЛА И ТАДАЛАФИЛА И ИХ КОМБИНАЦИЙ С Ь-АРГИНИНОМ

Специальность 14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Белгород-2012

005012736

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научный руководитель доктор медицинских наук

Покровская Татьяна Григорьевна

Официальные оппоненты: Шапошников Андрей Александрович

доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биохимии и фармакологии ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Поветкин Сергей Владимирович

доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Ведущая организация ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная

фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита состоится ■/12 г. ъ/^^ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015 г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Автореферат разослан « » ШЬ,М/>т\21

Учёный секретарь

совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор биологических наук

В.И. Кочкаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эндотелий играет ключевую роль в модуляции сосудистого тонуса (Белоусов Ю.Б., Намсараев Ж.Н., 2006), продуцируя различные вазоактивные вещества, наиболее важным из которых является оксид азота (N0) - лабильная субстанция, высвобождаемая эндотелиальными клетками во время катаболизма Ь-аргинина при активном участии >ТО-синтазы, являющаяся наиболее мощным из известных в настоящее время вазодилатато-ров (Граник В.Г., 2004; Покровский В.И., 2005; Ро^егтапп ИТ., 2006; ЯаЬеНпк Т.1„ 2006).

Фармакологическая коррекция ингибиторами фосфодиэстеразы-5 (ИФДЭ-5) эндотелиальной дисфункции объясняется усилением вазорелакси-рующего эффекта N0 в результате ограничения распада цГМФ в гладкомы-шечных клетках. В случае исходного снижения активности синтеза N0 клетками эндотелия ингибиторы фосфодиэстеразы-5 обеспечивают усиление вазоре-лаксации за счёт активации внутриклеточных механизмов (К+дтф-каналов, протеинкиназы в, эндотелиальной и индуцибельной ЫО-синтаз). Можно предполагать, что введение эндотелиопротективных препаратов дополнительно стимулирующих выделение эндотелием N0 совместно с ИФДЭ-5, повышает уровень вазорелаксации и, таким образом, повышается уровень и степень эндотелио- и кардиопротекции (Яс^от й. е! а1., 2007, виг 8. е1 а1., 2007).

В настоящее время достаточно большое внимание уделяется изучению эндотелио- и кардиотропных эффектов Ь-аргинина, как предшественнику N0 (Степанов Ю.С., 2005; Марков Х.М., 2005; Покровский М.В., 2011; ТоивоиИв Б. 2007; Bode-Bбger Б.М., 2003, 2009), в то время как данных по изучению системных дозозависимых эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинации ингибиторов ФДЭ-5 с Ь-аргинином при экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции в литературе нами не обнаружено.

В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение эндотелио- и кардиопротективных свойств ингибиторов фосфодиэстеразы-5 силденафила и тадалафил и их комбинаций с Ь-аргинином при экспериментальном дефиците оксида азота.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Изучение патологических состояний сердечно-сосудистой системы. Разработка современных медицинских технологий профилактики, диагностики и лечения болезней системы кровообращения» на 2006-2012 гг.

Номер государственной регистрации темы - 0120.0850769

Цель исследования: провести оценку эндотелио- и кардиопротективных эффектов ингибиторов фосфодиэстеразы-5 силденафила и тадалафила и их комбинаций с Ь - аргинином при моделировании Ь-^'АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты силденафила при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

2. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты тадалафила при моделировании Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

3. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты комбинаций сил-денафила с L-аргинином при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

4. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты комбинаций тада-лафила с L-аргинином при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Научная новизна исследования. В работе впервые изучена эндотелио- и кардиопротективная активность ингибиторов ФДЭ-5 силденафила и тадалафила в двух дозах и их комбинаций с L-аргинином на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота. Продемонстрировано, что силдена-фил и тадалафил проявляли дозозависимые эндотелио- и кардиопротективные эффекты.

В работе впервые показано, что наибольшее аддитивное эндотелиопро-тективное действие оказывают силденафил и тадалафил в меньших дозах (0,22 мг/кг два раза в сутки и 0,09 мг/кг один раз в сутки соответственно), вводимых внутрижелудочно в течение 7 суток, при сочетанном их использовании с L-аргинином в дозе 200 мг/кг (однократно внутрибрюшинно в течение 7 суток) при моделировании дефицита оксида азота.

В работе продемонстрировано, что силденафил и тадалафил как в больших дозах (2,2 мг/кг два раза в сутки и 0,9 мг/кг один раз в сутки соответственно), так и в меньших дозах (0,22 мг/кг два раза в сутки и 0,09 мг/кг один раз в сутки соответственно), при сочетанном их использовании с L-аргинином в дозе 200 мг/кг оказывают кардиопротективное аддитивное взаимодействие.

Таким образом, в работе впервые представлены убедительные доказательства необходимости комбинированной эндотелио- и кардиотропной терапии с использованием ингибиторов ФДЭ-5 и эндогенного донатора L-аргинина для сочетанного целенаправленного воздействия на метаболический путь цГМФ/ФДЭ-5 и систему «L-aprniiHH-cNOS».

Научная новизна подтверждается получением 1 патента РФ.

Практическая значимость. В работе установлена и обоснована эффективность сочетанного применения меньших доз ингибиторов ФДЭ-5 силденафила и тадалафила с L-аргинином для коррекции L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет улучшать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO), а также добиться положительной динамики морфо-фукциональных показателей сердечно-сосудистой системы (регрессия гипертрофических изменений кардиомиоцитов, артерий миокарда и почек с сохранением их просвета, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, снижение адренореактивности).

Запланировано проведение целенаправленных клинических исследований сочетанного использования ингибиторов ФДЭ-5 с L-аргинином при артериальной гипертензии в сочетании с эректильной дисфункцией («Протокол клиниче-

ского испытания комбинаций силденафила с L-аргинином и тадалафила с L-аргинином при артериальной гипертензии в сочетании с эректильной дисфункцией» ГНИЦ ПМ МЗ и СР РФ от 07.05.2011 г.).

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе ряда кафедр ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», ГБОУ ВПО ВГМА им. H.H. Бурденко.

Личный вклад автора. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, проведены серии экспериментов, получены и обобщены результаты исследования, проведена статистическая обработка и анализ полученных данных.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на итоговых межвузовских научных конференциях студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2009, 2010 гг.), XIV, XV, XVII национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2008, 2010 гг.), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2010), V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология (Санкт-Петербург 2010). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, нормальной физиологии, инфекционных болезней, анатомии, НИИ Экологической медицины Курского государственного медицинского университета и кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин Института последипломного медицинского образования ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет». По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 5 в журналах, рекомендуемых перечнем ВАК Минобрнауки РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибиторы фосфодиэстеразы-5 силденафил и тадалафил являются дополнительной патогенетической опцией коррекции эндотелиальной дисфункции, как и L-аргинин, и проявляют дозозависимые эндотелио- и кардиопротек-тивные эффекты при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота.

2. Комбинация силденафила в большей дозе (2,2 мг/кг) с L-аргинином (200 мг/кг) проявила только аддитивное кардиопротекторное действие, в то время как комбинация силденафила в меньшей дозе (0,22 мг/кг), два раза в сутки с L-аргинином (200 мг/кг) продемонстрировала аддитивные как эндотелио- , так и кардиопротективные эффекты при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота.

3. Комбинация тадалафила в большей дозе (0,9 мг/кг) с L-аргинином (200 мг/кг) проявила только аддитивное кардиопротекторное действие. Комбинация тадалафила в меньшей дозе (0,09 мг/кг), однократно и L-аргинина (200 мг/кг) продемонстрировала аддитивные и эндотелио- и кардиопротективные эффекты при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 180 источников, из них 34 отечественных и 146 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 147 страницах машинописи, содержит таблиц - 17, рисунков - 38, схем - 2.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar в количестве 110 штук массой 250-300 г. N-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно, внутрибрющинно, в дозе 25 мг/кг/сут. На 8 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP 100, производства «Bioshell» и Biopac System, Inc., США. Функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилата-ция - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг (Laursen J.B., 1997), эндотелийнезависимая вазодилатация — внутривенное введение нитро-пруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца посредством датчика P23ID «Gould», США, АЦП L-154, компьютерной программы «Bioshell» и аппаратно-программного комплекса MP 100, производства Biopac System регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение 0,9 % раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) [Тюренков И.Н., 2005].

2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение

раствора адреналина гидрохлорида Г10"5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) [Меерсон Ф.З, 1980].

3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек [Пашин E.H., 1993].

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов. Исследование проводилось по общепринятой методике (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005).

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патоло-

гических процессов и комплексной оценки эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек по общепринятой методике.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. Для исследования эндотелио-и кардиопротективных эффектов ингибитора ФДЭ-5 силденафила («Виагра» производства Pfizer, Франция) использованы две дозы препарата: большая доза - 2,2 мг/кг 2 раза в сутки, что соответствует средней терапевтической дозе для человека - 25 мг 2 раза в сутки и меньшая (уменьшенная в 10 раз) доза -0,22 мг/кг 2 раза в сутки. При исследовании эндотелио- и кардиопротективных эффектов тадалафила («Сиалис» производства Eli-Lilly, Великобритания) также использованы две дозы препарата: большая доза - 0,9 мг/кг 1 раз в сутки, что соответствует средней терапевтической для человека 10 мг 1 раз в сутки и также меньшая (уменьшенная в 10 раз) доза - 0,09 мг/кг 1 раз в сутки. Большие дозы препаратов пересчитаны по общепринятой формуле межвидового переноса доз по Freireich М. et al. и Улановой И.П. и др. Такой режим доз выбран в соответствии с данными предыдущих исследований эндотелитропной активности препаратов in vitro (Rossoni G. etal.,2007,GurS.etal.,2007,Salloumetal,2003).

В наших экспериментах L-аргинин (производства EUROBIOPHARM JmgH, Гамбург) вводили в дозе 200 мг/кг один раз в сутки внутрибрюшинно, в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах (Deng L.Y., 1993). Дизайн эксперимента по исследованию эндотелио и кардиопротек-тивной активности силденафила в двух дозах, тадалафила в двух дозах и их комбинаций с L-аргинином состоит из следующих групп животных (п = 10 в каждой группе):

1. Интактная группа.

2. Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота (контрольная группа).

3. Оценка эндотелио- и кардиопротективных эффектов L-аргинина (1 экспериментальная группа).

4. Оценка эндотелио- и кардиопротективных эффектов силденафила в двух дозах и их комбинаций с L-аргинином (4 экспериментальные группы).

5. Оценка эндотелио- и кардиопротективных эффектов тадалафила в двух дозах и их комбинаций с L-аргинином (4 экспериментальные группы).

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (+т) и вероятности возможной ошибки (Р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные, начиная с р<0,05. Для расчётов использовали программу для статистического анализа Microsoft Excel 7.0

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Длительное, в течение 7 суток, однократное внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг/кг привело к статистически достоверному значительному

повышению артериального давления, по сравнению с группой интактных животных (р<0,05), значения САД и ДАД составили 190,3±6,7 и 145,0±3,9 мм рт. ст. (рис. 1 ад).

Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелий-зависимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группе с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией в отличие от интактных животных. Треугольник над кривой восстановления артериального давления после окончания брадикардитического компонента на фоне введения ацетилхолина и после прохождения точки плато на фоне введения нитропрус-сида принимались нами как площади эндотелийзависимой (ЭЗВД) и эндоте-лийнезависимой вазодилатации (ЭНВД). Отношение площади ЭНВД к ЭЗВД по показателю среднего артериального давления математически представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД). В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1±0,09, при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота - в 5 раз больше, его значение составило 5,4±0,08 (рис. 1 кэд)-

Ь-ЫАМЕ-индуцированный дефицит оксида азота привёл к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению мио-кардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением. У интактных животных значения ЛЖД при введении адреналина увеличивались до значений 199,2+8,3, а на фоне введения Ь-ЫАМЕ - до 247,3±4,8 мм рт. ст. (рис. 1 ддр), что статистически достоверно отличается от группы интактных животных (р < 0,05); отношение прироста значений ЛЖД на 25 секунде к 5 секунде пережатия аорты у интактных животных составляло 83,6±2,1%, а у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией - 66,0±2,3% (р<0,05, рис. 1нс)-

Суммарная концентрация нитрат-нитрит-ионов (>Юх) у животных, получавших ЫЧАМЕ, составила 61,2±3,6 мкм, тогда как у интактных 114,1±4,1 мкм (р<0,05,рис.1КОх).

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, явились результаты морфологических исследований. Толщина цитоплазмы кардиомио-цитов на их продольных срезах в группе животных с введением Ь-ЫАМЕ при сохранённом диаметре ядер резко увеличена в сравнении с интактной группой животных при одном увеличении. Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,1 ±1,1, а у животных, получавших Ь-ЫАМЕ - 18,4±1,1 мкМ (рис.1дм), что статистически достоверно в сравнении с группой интактных животных (р<0,05)

В группе с Ь-ЫАМЕ-патологисй отмечались сосудистые изменения артерий сердца в виде их спастического состояния и утолщения их стенок (рис.2 А).

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артериол. У интактных животных - клетки эндотелия расположены плоско, при Ь-ЫАМЕ-патологии- сосуд спазмирован, стенки утолщены, эндотелиальные клетки дезориентированы (рис.4 А).

Вышеизложенное свидетельствует о том, что длительное, в течение 7 су-

ток, внутрибрюшинное введение Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг вызывает у лабораторных животных комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита N0, вследствие блокады ЫО-синтазы. В частности, на 8-е сутки развивалась выраженная гипертензия и эндотелиальная дисфункция, гиперреактивность на адреналовую пробу, снижалась сократительная способность миокарда при пробе на нагрузку сопротивлением, резко уменьшался уровень нитрит-ионов. Гистологически обнаруживалась гипертрофия миокарда и мышечного слоя сосудистой стенки.

2. Изучение эндотелио- и кардиопротективной активности силдена-фила и его комбинаций с Ь-аргиннпом при Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота.

Силденафил в дозах 2,2 мг/кг и 0,22 мг/кг внутрижелудочно 2 раза в сутки проявлял дозозависимую эндотелио- и кардиопротективную активность, выражающуюся в статистически достоверном снижении КЭД в сравнении с группой получавших Ь-МАМЕ (р<0,05), в предотвращении повышения адрено-реактивности, улучшения результатов пробы на нагрузку сопротивлением, предотвращения гипертрофии кардиомиоцитов и морфологических изменений в артериолах миокарда и почек.

При оценке эндотелиотропной активности на модели Ь-ИАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота в группе животных с введением комбинации силденафила в большей дозе (2,2 мг/кг) с Ь-аргинином 200 мг/кг (первая комбинация) значения КЭД достоверно не изменялись в сравнении с монотерапией соответствующей дозой силденафила и составляли 2,4 ±0,1 и 2,3±0,1 соответственно. В то время как введение комбинации меньшей дозы силденафила (0,22 мг/кг) с Ь-аргинином 200 мг/кг (вторая комбинация), показало лучшую эндотелиопротективную активность, чем монотерапия силденафи-лом в соответствующей дозе и показатели КЭД составили соответственно 2,5±0,1 и 3,2±0,1 (р<0,05; рис. 1 Кэд).

Силденафил в обеих дозах и его комбинации с Ь-аргинином полностью не предотвращали развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно выше соответствующих значений интактных животных. Силденафил в дозе 2,2 мг/кг в большей степени снижал показатели артериального давления в сравнении с меньшей дозой, САД и ДАД составили соответственно 179,8 ± 9,8 / 131,6 ± 6,9 и 189,4 ± 7,1 / 139,1 ± 3,2 мм рт. ст. Как первая, так и вторая комбинации препаратов оказывали дополнительный умеренный гипотензивный эффект, САД и ДАД составили соответственно 168,0 ± 11,5/ 125,3 ± 8,4 и 168,9 ± 4,1 /130,4 ± 7,9 мм рт. ст. (рис. 1 ад).

Проба на адренореактивность выявила сопоставимое снижение абсолютных значений цифр максимального левожелудочкового давления у животных, получавших силденафил в обеих дозах и Ь-аргинин как в виде монотерапии, так и в случае комбинаций силденафила в большей и меньшей дозах с Ь-аргинином. Значения ЛЖД составили при введении первой комбинации -170,1 ± 11,1, а при введении второй комбинации препаратов - 196,7 ± 15,9 мм рт. ст., достоверно не отличаясь от монотерапии соответствующими дозами силденафила (рис. 1ддр)-

113 - 1 Интактные - 2 Ь-ЫАМЕ | - 3 Ь-аогинин-200мг/кг 3 - 4 Силденафил-2,2мг/кг

- 5 Силденафил 2.2 мг/кг + Ь-аогинин

- 6 Силденафил 0,22 мг/кг

- 7 Силденафил 0.22 мг/кг + Ь-аогинин

-Интактные

—......Ь-ЧАМЕ

.......ЬЫАМЕ+силденафил 2,2 мг/кг

-Ь-аргинин 200 мг/кг

------ЬМАМЕ+си/щенафил 0,22 мг/кг

----1_-МАМЕ+силденафил 2,2 мг/кг+Ь-артнин

— • ЬМАМЕ+силденафил 0.22 мг/кг+Ьартонин

5,4** КЭД

В САД ИДАД

84,3%' 83,6% 83,0%* 81,9%*"

95,0%*'

Рис. 1. Влияние силденафила и его комбинаций с Ь-аргинином на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, * - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-КАМЕ животных,** - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных., у -р < 0,05 в сравнении с монотерапией силденафилом.

Аналогичная тенденция выявлена в пробе на нагрузку сопротивлением (рис. 1нс)- Предотвращение исчерпания миокардиального резерва при монотерапии силденафилом в большей дозе было более выражено, чем в меньшей, аддитивное кардиопротективное зарегистрировано при использовании комбинации силденафила в большей дозе с Ь-аргинином (95,0±8,7%), значения прироста сократимости миокарда в группе животных, получавших вторую комбинацию были достоверно ниже, но приближались к таковым в интактной группе (81,9%±7,6%).

Суммарная концентрация стабильных метаболитов оксида азота при со-четанном использовании обеих доз силденафила с Ь-аргинином была значительно выше и составляла 117,3+9,8 и 108,5±8,9 мкМоль, тогда как монотерапия силденафилом как в большей, так и в меньшей дозах не оказывала существенного влияния (р<0,05). Последнее позволяет предполагать, что именно Ь-аргинин увеличивает суммарную концентрацию нитрат-нитрит-ионов (рис. 1]\ох)- Данные морфометрических исследований показали, что использование силденафила в обеих дозах эффективно предотвращало развитие гипертрофии кардиомиоцитов на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота (рис. 1дм). Кроме того, отмечалась регрессия гипертрофических изменений артерии миокарда с сохранением её просвета (рис. 2).

Рис. 2. Морфологическая картина артерии миокарда у животных с L-NAME-патологией и животных, получавших силденафил на фоне введения L-NAME. А - выраженная гипертрофия стенок артерии миокарда у крысы, получавшей L-NAME. Б - незначительные гипертрофические изменения стенки артерии миокарда и ее сохранённый широкий просвет у крысы, получавшей силденафил 2,2 мг/кг. Окр.гематоксилином и эозином. А, Б - х 280.

Одновременно отмечалась регрессия гипертрофических изменений стенок почечных артерий.

Таким образом, по совокупности функциональных сосудистых и нагрузочных сердечных проб, отражающих эндотелио- и кардиопротективные эффекты при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота, силденафил в большей дозе (2,2 мг/кг) проявил активность, превосходящую таковую у силденафила в меньшей дозе (0,22 мг/кг). Комбинация силденафила в болыцей дозе (2,2 мг/кг) два раза в сутки с L-аргинином (200 мг/кг) показала наибольший

прирост сократимости миокарда в пробе на нагрузку сопротивлением, в то время как комбинация силденафила в меньшей дозе (0,22 мг/кг) два раза в сутки с L-аргинином (200 мг/кг) продемонстрировала аддитивные как эндоте-лио- , так и кардиопротективные эффекты. При этом, по совокупности биохимических и морфологических критериев активности (увеличение NOx, регрессия гипертрофических изменений кардиомиоцитов, артерий миокарда и почек с сохранением их просвета), а также антигипертензивного действия существенных преимуществ между эндотелио- и кардиопротективными эффектами комбинаций большей и меньшей дозы силденафила с L-аргинином не обнаружено.

3. Изучение эндотелио- и кардиопротективной активности тадалафи-ла и его комбинаций с L- аргинином при L-NAME индуцированной модели дефицита оксида азота.

Тадалафил в дозах 0,9 мг/кг и 0,09 мг/кг внутрижелудочно один раз в сутки проявлял дозозависимую эндотелио- и кардиопротективную активность, выражающуюся в резком достоверном снижении КЭД (р<0,05), в предотвращении повышения адренореактивности, улучшения результатов пробы на нагрузку сопротивлением, предотвращения гипертрофии кардиомиоцитов и морфологических изменений в артериолах миокарда и почек.

При оценке эндотелиотропной активности на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота в группе животных с введением комбинации тадалафила в большей дозе (0,9 мг/кг) с L-аргинином 200 мг/кг (первая комбинация) значения КЭД достоверно не изменялись в сравнении с монотерапией соответствующей дозой тадалафила и составляли 1,9±0,1 и 2,1 ±0,1 соответственно. В то время как введение комбинации меньшей дозы тадалафила (0,09 мг/кг) с L-аргинином (вторая комбинация) показало лучшую эндотелиопротективную активность, чем монотерапия тадалафилом в соответствующей дозе и показатели КЭД составили соответственно 2,9 ±0,1 и 2,1 ±0,1 (рис. Зкэд)-

Обнаружено, что тадалафил в обеих дозах и его комбинации полностью не предотвращали развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД, были достоверно выше соответствующих значений интактных животных во всех сериях экспериментов. Тадалафил равнозначно как в большей, так и в меньшей дозах умеренно снижал показатели артериального давления, в то время как обе комбинации тадалафила с L-аргинином проявили дополнительное аддитивное антигипертензивное взаимодействие и значения САД и ДАД составили соответственно 162,6 ± 6,3/123,0 ± 8,0 (р<0,05) и 162,9 ± 6,8/ 138,1 ± 7,0 мм рт. ст. (рис.3 ад).

Тадалафил в большей и меньшей дозах предотвращал повышение адренореактивности, значения ЛЖД при этом составили 224,6+9,4 и 235,4+10,9 мм рт. ст. соответственно. Использование как первой комбинации препаратов, так и второй достоверно усиливало предотвращение повышения адренореактивности при введении L-NAME в сравнении с монотерапией, уровень ЛЖД при этом составил 204,6 ± 8,5 и 215,5 ± 9,8 мм рт. ст. соответственно (р<0,05).

I

- 1 Интактные

- 2 Ь-ММЕ

- 3 Ь-аргинин 200мг/кг

- 4 Тадалафил 0,9мг/кг

ш

- 5 Тадалафил 0,9 мг/кг + Ь-аргинин

- 6 Тадалафил 0,09 мг/кг

- Тадалафил 0,09мг/кг + Ь-аргинин

Рис. 3. Влияние тадалафила и его комбинаций с Ь-аргинином на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0.

- р < 0,05 в сравнении с группой 1^АМЕ животных,** - р < 0,05 в сравнении с группой интакт-ных животных. *у - р < 0,05 в сравнении с монотерапией тадалафилом.

-Интактные - _

-Ы4ШЕ

.........|_-№МЕ+тадалафш о,9 ьг/кг\.

-иМ^МЕ+Ьаргинин 200 мг/кг X.

-------1,-№МЕ+тадалэфил 0,9 м"/кг+1--ар™нин

-----1_-МАМЕ+тадалафил 0,9 и7кг

- - 1_-№ШЕ+тадалафмл 0,09 мг/кг+Ьаргинмн

84,3%*

83,7%*'

83,67.

82,4%*

82,0%*

70,3%* 66,0%"

При сравнительной оценке двух доз тадалафила наибольшее предотвращение исчерпания миокардиального резерва выявлено в большей дозе и составило 82,4+4,1%, тогда как в меньшей дозе - 70,3 ±2,4%. Дополнительный прирост миокардиального резерва наблюдался только при использовании комбинации тадалафила в меньшей дозе с Ь-аргинином с 70,3±2,4% до 83,7±6,5%.

Концентрация стабильных метаболитов оксида азота при сочетанном использовании первой и второй комбинации была значительно выше и составляла 119,2+8,8 и 104,7±9,1 мкМоль соответственно, тогда как монотерапия тадала-филом в обеих дозах не оказывала существенного влияния на содержание нитрит-ионов. Последнее позволяет предполагать, что именно Ь-аргинин усиливает данный эффект (рис.З^ох)-

Данные морфометрических исследований показали, что изолированное использование тадалафила в обеих дозах (0,9 и 0,09 мг/кг) дозозависимо предотвращало развитие гипертрофии кардиомиоцитов, при этом комбинации препарата в обеих дозах с Ь-аргинином потенциировали регрессию кардиомиоцитов на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота (рис.Здм). Кроме того, при морфологическом исследовании отмечалась сопоставимая регрессия стенок артерий миокарда и почек, обратное развитие дезориентации эндотелиоцитов стенок артерий с сохранением их просвета в обеих группах монотерапии тадалафилом - как в большей, так и в меньшей дозах (рис. 3 дм) •

Аналогичная морфологическая картина позитивных изменений сосудистой стенки миокардиальных и почечных артериол прослеживалась и под влиянием фармакологической коррекции комбинаций тадалафила с Ь-аргинином в обеих дозах (рис. 4). На представленном рисунке зафиксировано, как гипертрофические изменения сосудистых стенок артерии в почке минимизировались и практически не обнаруживались.

Рис. 4. Морфологическая картина почечных артерий у опытных животных и крыс, получавших тадалафил на фоне введения Ь-ИАМЕ. А - спазм артериолы в почке у крысы с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией. Б - незначительные гипертрофические изменения стенки артерии в почке у крысы, получавшей тадалафил 0,9 мг/кг. Окраска гематоксилином и эозином. А, Б - х 280.

Таким образом, тадалафил проявил дозозависимое эндотелио- и кардио-протективное действие. Комбинация тадалафила в обеих дозах с Ь-аргинином усиливала проявления данных эффектов. При этом комбинация тадалафила в

большей дозе (0,9 мг/кг) один раз в сутки с Ь-аргинином (200 мг/кг) проявила наибольшее аддитивное действие в отношении показателей функциональных сердечных нагрузочных проб, тогда как комбинация тадалафила в меньшей дозе (0,09 мг/кг) один раз в сутки с Ь-аргинином (200 мг/кг), кроме этого, проявляла аддицию и в отношении коэффициента эндотелиальной дисфункции. По совокупности биохимических и морфологических критериев активности (увеличение суммарной концентрации нитрат-нитрит-ионов, регрессия гипертрофических изменений кардиомиоцитов, артерий миокарда и почек с сохранением их просвета), а также антигипертензивного действия существенных преимуществ между эндотелио- и кардиопротективными эффектами комбинаций большей дозы тадалафила с Ь-аргинином и меньшей дозы тадалафила с Ь-аргинином не обнаружено.

На основании проведенных исследований можно предположить, что реализация аддитивных эффектов ИФДЭ-5 и эндогенного донатора оксида азота Ь-аргинина может происходить с участием следующих механизмов:

- во-первых - ингибиторы ФДЭ-5 за счет накопления цГМФ могут оказывать стимулирующее влияние на метаболический путь >ТО/цГМФ/ФДЭ, в то время, как Ь-аргинин, на предложенной модели дефицита оксида азота, вероятно, обладает способностью преодолевать ингибирующее влияние Ь-ЫАМЕ на эндотелиальную ЫО-синтазу, также активируя метаболический путь N0;

- во-вторых, ИФДЭ-5 за счет активации К+АТФ-азных каналов, вероятно, способны уменьшать выработку молекул адгезии УСАМ и 1САМ и, таким образом, предотвращать активацию нейтрофильного звена эндотелиальной дисфункции;

- в-третьих, ИФДЭ-5 в малых дозах, вероятно, активирует протеинкиназу в повышая при этом активность еЖ)8 и ¡N03 (Яо$юп1 О. е1 аЬ, 2007, виг Б. й а1„ 2007, БаИоит е1 а1., 2003).

С практической точки зрения, при внедрении ИФДЭ-5 в клиническую практику лечения легочной гипертензии, чрезвычайного внимания заслуживает информация об их способности предотвращать индукцию ангиотензина II в легочной ткани и, тем самым, предотвращать включение в порочный круг эндотелиальной дисфункции ренин-ангиотензиновой системы.

Резюмируя вышеизложенное, представляется необходимым дальнейшее экспериментальное, а затем клиническое изучение комбинированных эффектов ингибиторов ФДЭ-5 и эндотелиотропных препаратов, направленных на активацию метаболического пути Ь-аргшпш/МО/сЫОЗ.

ВЫВОДЫ

1. Силденафил в большей дозе - 2,2 мг/кг и меньшей дозе - 0,22 мг/кг 2 раза в сутки в течение 7 суток внутрижелудочно дозозависимо предотвращал развитие Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в приближении значений коэффициента эндотелиальной дисфункции до уровня интакт-ных животных, которые составляли соответственно 2,3±0,1 и 3,2±0,1. Результаты нагрузочных проб также выявили дозозависимый характер предотвращения гиперадренореактивности, снижения сократительного резерва и регресса гипер-

трофии кардиомиоцитов и стенок артериол миокарда и почек. Монотерапия силденафилом в обеих дозах не приводила к достижению целевых значений артериального давления.

2. Тадалафил в большей дозе - 0,9 мг/кг и в меньшей дозе - 0,09 мг/кг однократно в сутки в течение 7 суток внутрижелудочно дозозависимо предотвращал развитие Ь-Ы АМ Е-индуцированного дефицита N0, что выражалось в приближении значений коэффициента эндотелиальной дисфункции до уровня интактных животных в большей степени по сравнению с соответствующими дозами силденафила и составляли соответственно 1,9±0,1 и 2,9±0,1. Результаты нагрузочных проб также выявили дозозависимый характер предотвращения гиперадренореактивности, снижения сократительного резерва, предотвращения увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов. Монотерапия тадалафилом в обеих дозах не приводила к достижению целевых значений артериального давления.

3. Комбинация силденафила в большей дозе (2,2 мг/кг) два раза в сутки внутрижелудочно с Ь-аргинином (200 мг/кг) внутрибрюшинно в течение 7 суток при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота проявила аддитивное действие в предотвращеии снижения сократительного резерва в пробе на нагрузку сопротивлением, в то время как комбинация силденафила в меньшей дозе (0,22 мг/кг) два раза в сутки с Ь-аргинином (200 мг/кг) продемонстрировала наибольшие аддитивные эндотелиотропные эффекты (КЭД уменьшился с 3,2 ±0,1 до 2,5 ±0,1). При этом, по совокупности биохимических и морфологических критериев активности (увеличение суммарной концентрации нитрат-нитрит-ионов, регрессия гипертрофических изменений кардиомиоцитов, артерий миокарда и почек с сохранением их просвета), а также антигипертензивного действия существенных отличий между комбинаций большей дозы силденафила с Ь-аргинином и меньшей дозы силденафила с Ь-аргинином не обнаружено.

4. Комбинация тадалафила в большей дозе (0,9 мг/кг) один раз в сутки внутрижелудочно с Ь-аргинином (200 мг/кг) внутрибрюшинно в течение 7 суток при Ь-КАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота проявила наибольшее аддитивное действие в отношении показателей функциональных сердечных нагрузочных проб, тогда как комбинация тадалафила в меньшей дозе (0,09 мг/кг) один раз в сутки с Ь-аргинином (200 мг/кг), кроме этого, проявила аддицию и в отношении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД уменьшился с 2,9 ±0,1 до 2,1 ±0,1). При этом, по совокупности биохимических и морфологических критериев активности (увеличение суммарной концентрации нитрат-нитрит-ионов, регрессия гипертрофических изменений кардиомиоцитов, артерий миокарда и почек с сохранением их просвета), существенных отличий между комбинаций большей дозы тадалафила с Ь-аргинином и меньшей дозы тадалафила с Ь-аргинином не обнаружено Изучаемые комбинации проявили сопоставимый дополнительный антигипертензивный эффект, но полностью не предотвращали развитие гипертензии при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели патологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Методические подходы для количественной оценки развития эндоте-лиальной дисфункции при Ь-МАМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М. В. Покровский, В. И. Кочкаров, ...Т.Н. Чулюкова [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. - № 10. - С. 72-77.

2. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Т. Г. Покровская, В. И. Кочкаров, ... Т. А. Чулюкова [и др.] II Кубанский научный медицинский вестник. - 2007. - № 1-2. - С. 146-149.

3. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты смеси гомеопатических разведений афинно очищенных поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота (еКОБ) С12, СЗО, С200 при экспериментальном моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции /

A. С. Белоус, М. В. Покровский, ... Т. Н. Чулюкова [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2007. - № 1-2. - С. 23-25.

4. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции тадалафилом при Ь-ИАМЕ индуцированном дефиците оксида азота : пат. 2364395 Рос. Федерация : МПК7 А61КЗ1/198, А61КЗ1/4985, А61Р9/00 / авторы, заявители и патентообладатели М. В. Покровский, Т. Н. Чулюкова, Т. Г. Покровская [и др.]. -№ 2008110097/14 ; заявл. 19.03.2008 ; опубл. 20.08.2009, Бюл. № 23. - 5 с.

5. Покровская, Т. Г. Эндотелиопротективные эффекты силденафила и та-далафила при экспериментальном моделировании Ь-1ЧАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота / Т. Г. Покровская, Т. Н. Чулюкова, М. В. Покровский // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 4. - С. 136-139.

6. Эндотелиопротективные эффекты силденафила и тадалафила в комбинациях с Ь-аргинином при экспериментальном моделировании Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита оксида азота / Т. Н. Чулюкова, Т. Г. Покровская, Н. Г. Филиппенко [и др.] Н Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В. В. Пичугина и 75-летию КГМУ, Курск, 25 дек. 2009 г. / Курский гос. мед. ун-т [и др.] ; редкол.:

B.А. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2009. - С. 360-362.

7. Фармакологическая коррекция морфологических изменений в сердце и почках при Ь-ЫАМЕ индуцированном дефиците N0 / В. С. Барсуков, В. Т. Дудка, ...Т.Н. Чулюкова [и др.] // Человек и лекарство : XVII Рос. нац. конгр., Москва, 12-16 апр. 2010 г. : сб. материалов конгр. : тез. докл. / РАН, РАМН, Фонд «Здоровье» [и др.] ; науч. ред. А. Г. Чучалин, Ю. Б. Белоусов. -М., 2010.-С. 576.

8. Эндотелиопротективные эффекты тадалафила при моделировании Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте / Т. Г. Покровская, Т. Н. Чулюкова, М. В. Покровский [и др.] // Человек и лекарство : XVII Рос. нац. конгр., Москва, 12-16 апр. 2010 г. : сб. материалов конгр. : тез. докл. / РАН, РАМН, Фонд «Здоровье» [и др.] ; науч. ред. А. Г. Чучалин, Ю. Б. Белоусов. - М., 2010. - С. 703.

9. Чулюкова, Т. Н. Сравнительный анализ аддитивных эндотелиопротек-тивных эффектов комбинаций Ь-аргинина с силденафилом и тадалафилом при экспериментальном моделировании Ь-КАМЕ индуцированного дефицита

оксида азота. / Т. Н. Чулюкова // Биотехнология и биомедицинская инженерия : материалы III всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию КГМУ / Курский гос. мед. ун-т ; под ред.: В. А. Лазаренко [и др.]. -Курск, 2010.-С. 246-247.

10.Сравнительная оценка эндотелиопротективных эффектов ингибиторов ффосфодиэстеразы-5 / Т. Н. Чулюкова, Т. Г. Покровская, М.В. Покровский [и др.] // Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология : V науч. конгр., Санкт-Петербург, окт. 2010 г. : сб. науч. материалов / Ком. по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга, Проф. мед. ассоц. клинич. фармакологов Санкт-Петербурга ; под общ. ред. А. К. Хаджидиса. - СПб., 2010. — С. 304-309.

11. Сравнительный анализ дозозависимых эндотелиопротективных эффектов силденафила в комбинации с Ь- аргинином при экспериментальном моделировании Ь-МАМЕ индуцированного дефицита оксида азота / Т. Г. Покровская, Т. Н. Чулюкова, М.В. Покровский [и др.] // Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология : V науч. конгр., Санкт-Петербург, окт. 2010 г.: сб. науч. материалов / Ком. по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга, Проф. мед. ассоц. клинич. фармакологов Санкт-Петербурга ; под общ. ред. А. К. Хаджидиса. - СПб., 2010. - С. 225-229.

12.Сравнительный анализ дозозависимых эндотелиопротективных эффектов тадалафила в комбинации с Ь- аргинином при экспериментальном моделировании Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита оксида азота. / М.В. Покровский, Т.Н. Чулюкова, Т.Г. Покровская [и др.] // Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология : V науч. конгр., Санкт-Петербург, окт. 2010 г. : сб. науч. материалов / Ком. по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга, Проф. мед. ассоц. клинич. фармакологов Санкт-Петербурга ; под общ. ред. А. К. Хаджидиса. - СПб., 2010. - С. 230-234.

13.Эндотелиопротективные дозозависимые эффекты силденафила в комбинациях с Ь-аргинином при экспериментальном моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота / Т. Г. Покровская, Т. Н. Чулюкова, М.В.Покровский [и др.]//Биомедицина. -2010. -Т. 1,№5.-С. 118-120.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ - артериальная гипертензия ИБС - ишемическая болезнь сердца ЛЖД - левожелудочковое давление

+с!р/ск - максимальная скорость увеличения левожелудочкового давления -<1р/(И- максимальная скорость снижения левожелудочкового давления N0 - оксид азота

Ь^АМЕ - №-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир ЧСС - частота сердечных сокращений КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции ИФДЭ-5 - ингибитор фосодиэстеразы-5 цГМФ - циклический гуанозин - монофосфат САД - систолическое артериальное давление ДАД - диастолическое артериальное давление

Подписано в печать 10.02.2012. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 30. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИПК НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85