Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Комбинированная фармакологическая коррекция метаболического пути L-аргинин/NO при моделировании дефицита оксида азота



На правах рукописи

Покровская Татьяна Григорьевна

КОМБИНИРОВАННАЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПУТИ Ь-АРГИНШШО ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ДЕФИЦИТА ОКСИДА АЗОТА

14.00.2S - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

»с аг;Р

Курск - 2009

003466897

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор

Филиппенко Николай Григорьевич

Белоусов Юрий Борисович Стародубцев Алексей Константинович

Резников Константин Михайлович

Ведущая организация:

ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

Защита состоится « ^С Л^Х^_2009 г. в ^ <^_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Рос-здрава.

Автореферат разослан «

Учёный секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время стало очевидным, что эндотелий сосудов - это активная метаболическая система, которая функционирует как рецепторно-эффекторный орган, реагирующий на любой физический или химический стимул/раздражитель с выделением/секрецией соответствующего вещества, с помощью которого он может поддерживать вазомоторный баланс и сосудисто-тканевый гомеостаз (Гомазков O.A., 2000; Pacher Р., 2007, Esper R.J., 2006, Luscher T.F., 1997). Эндотелий играет ключевую роль в модуляции сосудистого тонуса, продуцируя различные вазоактивные вещества, наиболее важным из которых является оксид азота (NO) - лабильная субстанция, высвобождаемая эндотелиальными клетками во время катаболизма L-аргинина при активном участии NO-синтазы, являющаяся наиболее мощным из известных в настоящее время вазодилататоров (Граник В.Г., 2004; Покровский В.И., 2005; Forstermann U.T., 2006; Rabelink T.J., 2006).

Широкий спектр биорегуляторных эффектов сосудистого NO указывает на то, что снижение его уровня в эндотелиальных клетках (ЭК) под влиянием тех или иных факторов должно вызывать существенные изменения их функций и системы кровообращения в целом. Эти нарушения включают: снижение эффектов эндотелийзависимых вазодилататоров и повышение вазоконстриктор-ных влияний, рост АД, нарушения системной и региональной гемодинамики, функций сердца, увеличение экспрессии адгезивных молекул эндотелия, агрегации тромбоцитов, прилипание их и лейкоцитов к сосудистой стенке, пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток с образованием неоинтимы, синтез внеклеточного матрикса и др. (Shiffrin E.L., 2001; Egashira К., 2002; Fele-tou М., 2006; Cooke J.P., 2003, Endemann D.H., 2004, Зотова И.В., 2000; Марков X.M., 2005).

Исследования последних лет убедительно показали, что в различных комбинациях отмеченные нарушения, составляющие дисфункцию эндотелия в целом, имеют место при многих сердечно-сосудистых заболеваниях (артериальная гипертония, атеросклероз, ИБС, сердечная недостаточность, нарушения кровообращения в почках, легких, головном мозге, конечностях, кишечнике (Белоусов Ю.Б., 2000; Маколкин В.И., 2004; Боровков H.H., 2005; Cooke J.P., 2003; Landmesser U., 2004), а также их факторах риска (гиперхолестеринемия, курение табака, сахарный диабет, резистентность к инсулину, ожирение, гипокинезия, старение организма, наследственная отягощенность) (Шестакова М.В., 2001; Бувальцев В.И., 2002; Петрищев H.H., 2003; Вёрткин A.A., 2005; Мазуров В.И., 2006; Bonetti P.O., 2003; Barbato J.E., 2004; Spieker L.E., 2006;Gian-notti G., 2007).

Эндотелиальные клетки могут предстать и в роли первоочередного этиологического фактора и органа-мишени при развитии сердечно-сосудистых изменений, связанных со снижением уровня эстрогенов (Тюренков И.Н., 2006; Krug Е., 2002; Modena M.G. 2002; Taddei S., 2006). Патогенетические механизмы постменопаузального повышения АД являются достаточно запутанными и многофакторными. Они гораздо более сложные, чем просто влияние сниженно-

го уровня эстрадиола в крови. Но очевидно, что один из них связан с нарушением эндотелийзависимой вазодилатации, вызванной снижением биодоступности N0 (Карпов Ю.А., 2001; Hinojosa-Laborde С., 2004; Zanchetti А., 2005; Rosano G.M., 2007; Coylewright M., 2008). Это может быть обусловлено повышением активности ренина плазмы, стимуляцией окислительного стресса, увеличением соль-чувствительности, ожирением, повышением симпатического тонуса (Majmudar N.G., 2000; Simon T., 2000; Dubey R.K., 2002; Scuteri A., 2003; Teerlink T., 2003; Thompson L.P., 2005; Miller V.M., 2007). Поэтому коррекция эндотелиалыюй дисфункции в постменопаузалышм периоде считается одним из важных аспектов терапии для восстановления баланса регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, предупреждения миграции клеток крови в сосудистую стенку, уменьшения синтеза факторов воспаления, укрепления барьерных функций эндотелия (Сметник В.П., 2001; Ольбинская Л.И., 2001; Herrington D.M., 1999; Diamanti-Kadarakis Е., 2001; Harman S.M., 2005; Min-kin M.J., 2007).

В плазме крови уровень L-аргинина оказывается сниженным при многих болезнях сердечно-сосудистой системы и их факторах риска. Показано, что пероральное и парентеральное введение L-аргинина в организм больных с этими заболеваниями восстанавливает сниженный у них уровень L-аргинина, NO и функции эндотелия, давая соответствующий терапевтический эффект (Степанов Ю.С., 2005; Марков Х.М., 2005, Piatti Р., 2003; Piatti Р., 2000; Hambrecht R., 2000; Lin K.Y., 2002; Tousoulis D. 2007; Bode-Böger S.M., 2003). Это позволяет считать, что дефицит NO и дисфункция сосудистого эндотелия у таких больных могут быть обусловлены в той или иной степени недостатком L-аргинина в качестве субстрата для eNOS (Schiaich M. P., 2004; Nakamura К., 2003; Kawano H., 2002; Breeders M.A., 2002; Pernow J., 2003; Gornik H.L., 2004).

В последнее время в исследованиях причин развития и прогрессирования сердечно-сосудитых заболеваний обращено внимние к асимметричному диме-тиларгинину (АДМА), названного новым маркером и фактором риска развития и прогрессирования эндотелиальной дисфункции и атеросклероза (Boger R.H., 1998,2004; Zoccali С., 2001; Achan V., 2003; Kielstein J., 2003).

Данные клинических и экспериментальных исследований подтверждают предположение, что ферментная активность синтазы окиси азота регулируется соотношением между концентрацией L-аргинина (эндогенный субстрат) и концентрацией ассиметричного диметиларгинина (эндогенный ингибитор). Физиологическая регуляция осуществляется таким образом, что при наличии обычных уровней L-аргинина любое повышение уровней ADMA может стать причиной относительного дефицита L-аргинина в отношении оптимальной активности синтазы окиси азота. Так как ADMA является конкурентным ингибитором синтазы окиси азота, его ингибирующее действие может быть преодолено повышением концентрации ферментного субстрата (L-аргинина) (Lu Т.М., 2003; Böger R.H., 2005; 2004, 2007). Поэтому дополнительное введение L-аргинина может помочь в восстановлении физиологического состояния синтеза оксида азота путём нормализации соотношения «L-apnrami/ADMA». Кроме этого, эстрогены регулируют метаболизм и освобождение асимметричного

диметиларгинина (ADMA) - эндогенного ингибитора NO-синтазы (Teerlink Т., 2003; Post M.S., 2003). Исследования Holden D. P. et al. (2003) продемонстрировали снижение уровня циркулирующего ADMA после эстрогензаместительной терапии у постменопазуальных женщин, кроме того, эстрогены снижают освобождение ADMA из эндотелиальных клеток и стимулируют активность фермента диметиларгининдимстиламиногидролазы, метаболизирующего ADMA в опытах in vivo. Следующим важным фактором, способствующим повышению ADMA у женщин в постменопаузе, является повышение сольчувствительности и, как следствие, артериального давления, что дополнительно усугубляет развитие эндотелиалыюй дисфункции, выражающееся в снижении эндотелийзави-симой вазодилатации (Scuteri А., 2003).

Исходя из вышеизложенного, существует необходимость исследования потенциальной роли и перспективности терапии L-аргинином как дополнение к существующим парадигмам коррекции дефицита оксида азота при сердечнососудистых заболеваниях. И в этой связи фармакологическое изучение эндоте-лиотропных свойств L-аргинина в комбинации с кардиотропными препаратами с доказанной эндотелиотропной активностью является одной из актуальных задач современной экспериментальной кардиофармакологии.

Очевидно, что в настоящее время достаточно большое внимание уделяется изучению роли и места L-аргинина, как предшественника NO, в коррекции эндотелиальной дисфункции (Böger R.H., Bode-Böger S.M., 2001, 2003, 2005; Perticone F., 2005; Siasos G., 2007; Gokce N.L., 2004), а вот сравнительное изучение комбинации L-аргинина с представителями основных групп гипотензивных препаратов, обладающих эндотелиопротективными эффектами - ингибиторы АПФ, блокаторы ATI-рецепторов, антагонисты кальция, /З-блокаторы (Кукес В.Г., Стародубцев А.К., 2003, 2005), при различном экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции в литературе нами не обнаружено.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007-2012 гг., номер госрегистрации 0120. 0 710379. Номер государственной регистрации диссертационной темы - 01.2.00950595.

Цель исследования: изучить и обосновать возможности фармакологической коррекции метаболического пути L-аргинин/МО дополнительным введением L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом, лозартаном, амлодипином, индапамидом и небивололом при различных экспериментальных моделях дефицита оксида азота.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Исследовать развитие эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Исследовать развитие эндотелиальной дисфункции при гипоэстроген-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

3. Изучить эндотелиопротективную активность Ь-аргинина, ингибитора АПФ эналаприла, блокатора АТ1-рецепторов лозартана калия, антагониста кальция амлодипина, тиазидоподобного диуретика индапамида, /3-блокатора ие-биволола при Ь-КАМЕ- и гипоэстроген-индуцированной моделях дефицита N0.

4. Изучить эндотелиопротективную активность сочеташгого применения Ь-аргинина и ингибитора АПФ эналаприла при Ь-КАМЕ- и гипоэстроген-индуцированной модели дефицита N0.

5. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения Ь-аргинина и блокатора АТ1-рецепторов лозартана калия при Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированной модели дефицита N0.

6. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения Ь-аргинина и антагониста кальция амлодипина при Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированной модели дефицита N0.

7. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения Ь-аргинина и тиазидоподобного диуретика индапамида при Ь-ИАМЕ- и гипоэстроген-индуцированной модели дефицита N0.

8. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения Ь-аргинина и /З-блокатора небиволола при Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированной модели дефицита N0.

9. Проведение интегрального векторного анализа для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, нитроксидергиче-ской системы, показателей сократимости и морфометрии миокарда с последующим расчётом вероятностного коэффициента аддиции Ь-аргинина в комбинированной фармакологической коррекции нарушений метаболического пути Ь-аргинин/КО.

Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ комбинированной фармакологической коррекции метаболического пути Ь-аргинина/К'О при моделировании дефицита оксида азота с использованием Ь-аргинина и препаратов основных антигипертензивных групп с доказанной эндотелиотропной активностью. Используя впервые объединённый комплекс методов, продемонстрировано, что АЭМА-подобная Ь-ЫАМЕ-индуцированная и гипоэстроген-индуцированная ЫО-дефицитные эндотелиальные дисфункции характеризуются изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхо-лин (эндотелийзависимая вазодилятация) и нитропруссид (эндотелийнезависи-мая вазодилятация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 и 2,1 раза соответственно, повышением адренореактивности и снижением исчерпания миокардиального резерва, резким снижением показателей биохимических маркеров (Т(йа1 N0, экспрессия >Ю-синтазы), а также отрицательной динамикой морфометрических показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов).

В работе впервые показано, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг (однократно внутрибрюшинно в течение 7 суток) при сочетанном использовании с препаратами основных антигипертензивных групп с доказанной эндотелиотропной активностью, вводимых внутрижелудочно однократно в течение 7 суток - ингибитором АПФ эналаприлом (0,5 мг/кг), блокатором ATI-рецепторов лозарта-ном (6 мг/кг), блокатором кальциевых каналов амлодипином (0,5 мг/кг), тиази-доподобным диуретиком индапамидом (2 мг/кг), бета-блокатором небивололом (0,5 мг/кг) оказывают аддитивное эндотелиопротекгивное действие при моделировании дефицита оксида азота. Таким образом, в работе впервые представлены убедительные доказательства необходимости дополнительной целенарав-ленной эндотелиотропной терапии к существующим препаратам основных антигипертензивных групп для коррекции нарушений метаболического пути Ь-аргинин/NO.

Научная новизна подтверждается получением 11 патентов РФ.

Практическая значимость. В работе установлена и обоснована эффективность сочетанного применения L-аргинина с ингибитором АПФ эналаприлом, блокатором ATI-рецепторов лозартаном калия, антагонистом кальция амлодипином, тиазидоподобным диуретиком индапамидом, /3-блокатором небивололом для коррекции L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет улучшать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), который в 5 раз увеличивается при L-NAME- и в 2,1 раза при гипоэст-роген-индуцированной NO-дефицитной эндотелиальной дисфункции, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессию NO-синтетазы), а также добиться положительной динамики морфофукциональ-ных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, диаметр миокардиоцитов и адренореактивности, что подтверждается интегральным расчётным анализом площадей диаграмм данных показателей.

Запланировано проведение целенаправленных клинических исследований L-аргинина при артериальной гипертензии («Протокол клинического испытания L-аргинина при артериальной гипертензии» ГНИЦ ПМ МЗ и CP РФ от 07.05.2004).

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротек-тивной активности лозартана калия «Блоктран», эналаприла малеата «Рени-прил», индапамид «Индапамид» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084/01-2000).

Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения антигипертензивной и эндотелиопротективной активности L-аргинина, включены в

состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (Свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.2795.3.05). Результаты исследования используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых КГМУ в 20042007 гг.; XIII-XV Национальном конгрессе «Человек и лекарство»; I Национальном конгрессе терапевтов; VII съезде аллерголов и иммунологов СНГ; Международной научно-практической конференции «Лекарственные препараты: традиции и новации», апрель 2005 г., г. Белгород; VI Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, патофизиологии, патологической анатомии, биохимии, анатомии, внутренних болезней № 1,2, внутренних болезней ФПО, хирургических болезней ФПО, акушерства и гинекологии ФПО, травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии, спортивной медицины, биоорганической химии, фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, фармацевтической технологии, экономики и управления здравоохранения, фармации ФПО, фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликованы 55 печатных работ, в том числе 20 работ в журналах, рекомендуемых ВАК.

Положения, выносимые на защиту

1. L-NAME-индуцированный и гипоэстроген-индуцированный дефициты оксида азота, характеризующиеся изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эи-дотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением КЭД, снижением показателей биохимических маркеров (Total InO, экспрессия.NO-синтазы), а также динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (увеличением диаметра миокардиоцитов, повышением адренореактивности, снижением миокардиального резерва), являются адекватными и информативными моделями NO-дефицитной эндотелиальной дисфункции.

2. L-аргинин является дополнительной патогенетической опцией коррекции эндотелиальной дисфункции в сочетании с традиционными антигипертен-зивными средствами.

3. L-аргинин потенциирует эндотелиопротективную активность основных антигипертензивных средств с доказанными эндотелиотропными эффектами, и по расчётному значению вероятностного коэффициента аддиции L-аргинина изученные комбинации располагаются в следующий ряд - при L-NAME-

индуцированном дефиците оксида азота: L-аргинин + небиволол < L-аргинин + индапамид < L-аргинин + амлодипин < L-аргинин + лозартан < L-аргинин + эналаприл, а при гипоэстроген-индуцированной патологии соответственно: L-аргинин + небиволол < L-аргинин + эналаприл < L-аргинин + индапамид < L-аргинин + лозартан < L-аргинин + амлодипин.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 615 источников, из них 87 отечественных и 528 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 407 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 52, рисунков - 116, схем - 4.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar и белых крысах-самках массой 250-300 г. hf-Humpo-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился самцам ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг. Для моделирования эстрогендефицитного состояния крыс-самок наркотизировали этаминалом натрия (50 мг/кг) и проводили билатеральную овари-эктомию. На 8 день от начала эксперимента при моделировании L-NAME-индуцированного и на 43 день при моделировании гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей. Болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы "Bioshell". Функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) (Laursen J.B., 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца, и посредством датчика P23ID «Gould» (США), АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелу-дочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt шах), частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность - внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 110 моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Нагрузка сопротивлением - пережатие восходящей аорты на 30 сек (Меерсон Ф.З., 1980).

3. 3-минутная гипоксия (Пашин E.H., 1993).

Биохимические маркеры эндотелиалъноц дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ваннадия и реакции диазотиро-вания с последующим развитием окраски.

Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2002).

Детекцию полосы eNOS проводили методом усиленной хемолюминес-ценции (ECL). После отмывки в фосфатном буфере 7 раз по 10 мин. мембрану обрабатывали соответствующим раствором (ECL, Amersham), как указано производителем, экспонировали на плёнку Hyperfilm-ECL (Amersham, UK) в течение 2 ч в темноте. Полоску, соответствующую eNOS, детектировали в соответствии с её молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Плёнку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab.

Для определения концентрации эндотелина проводилась предварительная преципитация в ЭДТА-плазме. Данный тест основан на методе иммунофер-ментного анализа и разработан для определения эндотелина непосредственно в биологических жидкостях. На первом этапе анализа образец и детектирующие антитела одновременно вносятся в ячейки. Эндотелии, присутствующий в образце, связывается с захватывающими антителами в ячейках и образует сэндвич-комплекс с детектирующими антителами. После промывки ячеек и удаления неспецефически связанного материала в ячейки вносится комплекс перок-сидазы с антителами, обнаруживающий связанные антитела. После удаления несвязавшегося конъюгата в ячейки вносится ферментный субстрат ТМБ. Интенсивность развившейся окраски прямо пропорциональна содержанию эндотелина в плазме/образце/контроле (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005).

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и комплексной оценки эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий. Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Pero и эозином. Морфометрия сердца проводилась с использованием окулярмикрометра; определяли абсолютную и относительную массу надпочечников, в почках оценивался диаметр почечных телец и их клубочков; соотношение интима-медиа в участках сонной артерии й брюшной аорты.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. В работе целенаправленно и осознанно использованы минимальные из терапевтических доз основных

антигипертензивных препаратов, пересчитанные с учётом соотношения поверхности тела биологического объекта к его массе по общепринятой формуле межвидового переноса доз, с использованием коэффициентов пересчёта в зависимости от массы тела по РгепеюЬ М. гЛ. а!, и Улановой И.П. и др. (см. рис. 1).

Рисунок 1. Рекомендуемые суточные дозы основных препаратов с доказанными эндотелиопротективными свойствами у больных с артериальной ги-пертензией.

Ингибиторы АПФ эналаприла малеат («Рениприл», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) и лозартан калия («Блоктран», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск), амлодипин («Амлодипин», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск), индапамид («Инда-памид», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск), небиволол («Небилет», производства «Gideon Richter») использовали в дозах 0,5 мг/кг; 6 мг/кг; 0,5 мг/кг; 2 мг/кг; 0,5 мг/кг соответственно и вводили внутрижелудочно 1 раз в сутки, что подтверждается данными литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие препаратов в экспериментах, ранее проведённых в нашей лаборатории.

Согласно данным литературы, кардиотропные эффекты L-аргинина в экспериментах на крысах обнаруживаются в диапазоне доз от 10 до 600 мг/кг (Созыкин A.B., 2000). При этом различают малые дозы - 10-30 мг/кг, что соответствует суточной дозе L-аргинина в качестве биологически активной добавки (БАД). Большие дозы L-аргинина (200 мг/кг) используются в комплексной терапии АГ, ИБС, ХСН для коррекции эндотелиальной дисфункции и в качестве дополнительной терапии к донорам NO-нитратам.

Эналагюил

В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота L-аргинин вводили в дозах 30 и 200 мг/кг один раз в сутки внутрибрюшинно, в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME; Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах (Deng L.Y., 1993).

Комбинированное использование L-аргинина 200 мг/кг и вышеуказанных препаратов основных антигипертензивных групп с доказанной эндотелиотроп-ной активностью проводилось по вышеописанному протоколу один раз в сутки в течение 7 дней на фоне введения L-NAME. При моделировании гипоэстро-ген-индуцированного дефицита оксида азота исследуемые препараты вводились одновременно в одно и то же время в течение 42 суток после овариэкто-мии.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±ш) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита NO.

Показатели гемодинамики сосудистых функциональных проб на эндоте-лийзависимое и эндотелийнезависимое расслабление существенно отличаются в группах с моделированием дефицита оксида азота введением блокатора NO-синтазы - L-NAME и проведением билатеральной овариэктомии.

На рисунке 2 (а, б, в, г) на примере L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота представлены сверху вниз на каждом фрагменте кривые АД систолического, диастолического и ЧСС. Треугольник над кривой восстановления артериального давления после окончания брадикардитического компонента на фоне введения ацетилхолина и после прохождения точки плато на фоне введения нитропруссида принимались нами как площади эндотелийзавйсимой (ЭЗВД) и эндотелийнезависимой вазодилатации (ЭНВД). Отношение площади ЭНВД к ЭЗВД по показателю среднего артериального давления математически представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД). В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1 ±0,09 (усл. ед.), при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота -в 5 раз больше, его значение составило 5,4±0,08, а при гипоэстроген-

индуцированном-2,1±0,2 (усл. ед.) (рис. Зкэд)-

Рисунок 2. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эндотелийзависимую (внутривенное введение ацетилхолина 40 мкг\кг) и эндотелийнезависимую вазодилятацию (внутривенное введение нитропруссида натрия 30 мкг/кг) у интактных животных (а, в) и животных с Ь-НАМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота (б, г) соответственно. Примечание. Здесь и везде далее САД - систолическое артериальное давление (мм рт.ст.); ДАД - диастолическое артериальное давление (мм рт.ст.); ЧСС - частота сердечных сокращений (уд. мин).

При обеих моделях патологии зарегистрировано повышение цифр артериального давления, в случае введения Ь-ЫАМЕ - до 190,3±6,7/145,0±3,9, при оварюктомии - 160,0±6,2/124,9±5,5 мм рт. ст. САД и ДАД соответственно (рис. Здд), Ь-ЫАМЕ-индуцированный дефицит оксида азота и эстрогендефи-цитное состояние привели к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе с нагрузкой

сопротивлением (рис. Зддр, рис. 4нс)- У интактных самцов ЛЖД к 25 секунде пережатия ао.рты снижалось до 83,6±7,7%, у самок - до 89,3±4,2%, а у животных с Ь-ИАМЕ-индуцированной патологией и дефицитом эстрогенов значительно сильнее - до 66,0±5,5% и 67,9±2,1% соответственно.

мм

Рисунок 3. Значения коэффициента эндотелиальной дисфункции, показателей артериального давления и левожелудочкового давления сердца крыс при проведении пробы на адренореактивность на фоне Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; здесь и везде далее: КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции, АД - артериальное давление, АДр - адренореактивность; I - интактные самцы; II - группа Ь-КТАМЕ; III - иктактные самки; IV - группа овариэктомии.

90

85 + 80

75 ■ 70

65 + 60 5"

■Интяктаые самцы ычаме ■Интактные самки 1 Овариэкгомия

10"

83,6% 67,9%

66%

—I

25"

Рисунок 4. Значения показателей левожелудочкового давления сердца крыс при проведении пробы с нагрузкой сопротивлением, экспрессии эндотелиаль-ной NO-синтазы, концентрации эндотелина в плазме крови, стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови и диаметра миокардиоцитов на фоне L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота. Примечание: * р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; здесь и везде далее НС - нагрузка сопротивлением; eNOS - экспрессия эндотелиальной NO-синтазы; NOx -стабильные метаболиты оксида азота (Total NO); ЭН-эндотелин; ДМ - диаметр миокардиоцитов. Расшифровка обозначений групп выше.

Характерная динамика биохимических маркеров Ь-ТчЛМЕ- и гипоэстро-ген-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рисунке 4е1\0§< КОх, эн Так, концентрация нитрит-ионов (]ч10х) у крыс-самцов, получавших Ь-ЫАМЕ, составила б 1,2±3,6 мкМоль, у овариэктомизированных самок - 71,5±4,1, тогда как у интактных животных - 114,1 ±4,1 и 122,8±4,5 мкМоль соответственно.

Экспрессия эндотелиальной МО-синтазы (еКЮ8) сывороткой интактных животных составила 72,9±3,8, тогда как у животных, получающих Ь-ЫАМЕ -21,4±4,7%, в то время как экспрессия еЫОБ Ь содержание эндотелина у самок крыс с недостаточностью половых гормонов не изменялось по сравнению с ингактными.

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции, явились результаты морфологических исследований на примере Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции (рис. 5). На представленных гистологических препаратах: (а) - интактные миокардиоциты, (б) -миокардиоциты животных на 8-е сутки введения Ь-ЫАМЕ видно, что площадь поперечного сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер (при одном увеличении). Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,1±1,1, а у животных, получав-

Рисунок 5 (а, б). Морфология миокарда у интактных и опытных животных: а - гистологическая картина кардиомиоцитов у интактных крыс; б - гистологическая картина кардиомиоцитов у крыс с артериальной гипертензией в модели с Ь-ЫАМЕ. Окр. гематоксилин + эозин, а, б - х 440.

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артериол (рис. 5). У интактных животных (а) - клетки эндотелия расположены плоско, при Ь-1ЧАМЕ-патологии (б) - сосуд спазмиро-ван, стенки утолщены, наблюдается частокольное расположение клеток эндотелия.

Таким образом, ежедневное в течение 7 суток введение Ь-ЫАМЕ 25 мг внутрибрюшинно вызывает развитие эндотелиальной дисфункции, характери-

зующейся резким увеличением КЭД, АД, повышением адренореактивности с развитием скрытой сердечной недостаточности, характерными биохимическими сдвигами и гистологической картиной гипертрофии миокарда и гиперплазии сосудистого русла. Вышеизложенное также свидетельствует о том, что через 6 недель после проведения билатеральной овариэктомии у лабораторных животных развивается аналогичный комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с недостаточностью эндогенных эстрогенов.

Рисунок б (а, б). Морфологическая картина почечных артерий у интактных и опытных животных: а - неизмененная артериола почки у интактной крысы; б - стенка почечной артерии у крысы с артериальной гипертензией в модели с L-NAME. Окр. гематоксилин + эозин, а, б - х 440.

2. Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина, эналаприла, лозартана, амлодипина, небиволола и индапамида при L-NAME- и пшозстроген-индуцированной модели дефицита NO.

Проведённые нами исследования показали, что L-аргинин обладает выраженным дозозависимым эндотелиопротективным эффектом, сопоставимым с остальными изучаемыми препаратами. Так, КЭД у интактных самцов составил - 1,1±0,1, у L-NAME - 5,4±0,6, L-NAME + L-аргинин (30 мг/кг) - 2,7±0,2, L-NAME + L-аргинин (200 мг/кг) - 2,5±0,2, L-NAME + эналаприл (0,5 мг/кг) -3,3±0,3, L-NAME + лозартан (6 мг/кг) - 2,3±0,2, L-NAME + амлодипин (0,5 мг/кг) - 2,1 ±0,1; L-NAME + небиволол (0,5 мг/кг) - 1,7 мг/кг, L-NAME + индапамид (2 мг/кг) - 3,3±0,2 (рис. 7L-name, оэ-кэд)- У овариэкто-мизированных самок КЭД составил соответственно - 0,9±0,09; 1,3±0,1; 1,5±0,1; 1,4±0,1; 1Д ±0,09; 1,4±0,1.

Обнаружено, что изучаемые препараты в условиях первой модели в разной степени снижали АД. Однако целевой уровень АД не достигался ни в одном случае, и значения АД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов. Максимальное снижение САД и ДАД наблюдалось лишь в группе с введением небиволола и САД в группе L-аргинина в дозе 200 мг/кг. При эстрогендефицитном состоянии только в случае терапии небиволом предотвращалось развитие артериальной гипертензии, при этом от-

мечается умеренный гипотензивный эффект остальных препаратов, кроме ин-дап амида (рис..7ычаме, оэ-ад)-

В САД ИДАД

Рисунок 7. Влияние Ь-аргинина 30 и 200 мг/кг, эналаприла 0,5 мг/кг, лозартана 6 мг/кг, амлодипина 5 мг/кг, небиволола 0,5 мг/кг и индапамида 2 мг/кг на показатели коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) и артериального давления (АД) при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуци-рованного и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0. Примечание. * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных или группой овариэктомии. Здесь и на следующих двух рисунках:

I - Интактные самцы;

II - Ь-ЫАМЕ,

Ш - Ь-ЫАМЕ+Ь-аргинин (Ь-арг) 30 мг/кг;

IV - Ь-КАМЕ+ Ь-арг 200 мг/кг;

V - Ь-ЫАМЕ+эналаприл 0,5 мг/кг;

VI - Ь-ЫАМЕ+лозартан 6 мг/кг;

VII - Ь-КАМЕ+амлодипин 0,5 мг/кг;

VIII - Ь-ИАМЕ+небиволол 0,5 мг/кг;

IX - Ь-ЫАМЕ+ индапамид 2 мг/кг.

1 - Интактные самки;

2 - Овариэкгомия (ОЭ);

3 - ОЭ+Ь-аргинин (Ь-арг) 200 мг/кг;

4 - ОЭ+эналаприл 0,5 мг/кг;

5 - ОЭ+лозартан 6 мг/кг;

6 - ОЭ+амлодипин 0,5 мг/кг;

7 - ОЭ+небиволол 0,5 мг/кг;

8 - ОЭ+индапамид 2 мг/кг;

120

I II III IV V VI VII VIII IX

-А— Интактные

Ь-ОДМЕ 1 • Ь-]\АМЕ+ 1.-яргннин 30 мг7?1 ♦ — Ь^АМЕ+Ь-аргинин 200 мг/кг —■ А — Ь-^АМЕ+эналаприл 0,5 мг/кг _— О- • Ь-^АМЕ+лозартан 6 мг/кг ~0— Ь^'АМЕ+амлодипин 0,5 мг/кг —X— ИЧАМЕ+небиволол 0,5 мг/кг —I-Ь^АМЕ+индапамид 2 мг/кг

5"

10"

15"

20"

25"

2 с

—А— Интактные --—Оварнэктомия (ОЭ) ® 0 >+1-Л(ч инин 200 мг/кг

■ ОЭ+эналапрнл 0,5 мг/кг

■ -А — ОЭ+ло.1артан 6 мг/кг

— О- • ОЭ+амлоднпнн 0,5 мг/кг

-О-О)' псомволол 0,5 мг/кг

—X—ОЭ+нидапамид 2 мг/кг

Ч" 1П" 14" 10" 25"

Рисунок 8. Влияние изучаемых препаратов на показатели сократимости миокарда левого желудочка при проведении проб на адренореактивность (АДр) и нагрузку сопротивлением (НС) при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0. Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой Ь^АМЕ животных; ** - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных или группой овариэктомии. Расшифровка обозначений групп выше.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 9. Влияние Ь-аргинина 30 и 200 мг/кг, эналаприла 0,5 мг/кг, лозартана 6 мг/кг, амлодипина 5 мг/кг, небиволола 0,5 мг/кг и индапа-мида 2 мг/кг на концентрацию стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови (МОх) и диаметр кардиомиоцитов (ДМ) при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0.

Примечание. * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных или группой овариэктомии. Расшифровка обозначений групп выше.

Проба на адренореактивность у животных с L-NAME и гипоэстроген-индуцированной патологией на фоне терапии L-аргинином, эналапри-лом, лозартаном также обнаружила снижение максимальных цифр левожелудоч-кового давления (рис. 8L-name, оэ-АДр)- у интактных самцов - 199,2+8,3, у L-NAME- 247,3±4,8; у интактных самок - 203,3±7,1, а у животных с дефицитом эстрогенов - 243,2 ±6,4; при этом добавление исследуемых веществ обнаружило следующие данные: у L-аргинина (30 мг/кг) - 222,7±16,6, у L-аргинина (200 мг/кг) - 201,6±13,1, у эналаприла (0,5 мг/кг) - 216,0±10,8, у лозартана (6 мг/кг) - 242,7±4,7, у амлодипина - 201,3±11,0, у небиволола - 206,б±9,7, у ин-дапамида - 247,9±12,1 мм рт.ст при первой модели патологии, а при второй -наибольшее снижение сократимости миокарда отмечалось при введении L-аргинина (210,9±9,4), небиволола (200,5±8,7), индапамида (210,4±7,6 мм рт.ст.), остальные препараты занимают промежуточное положение (рис. 8l_name, оэ-АДр)-Аналогичная тенденция выявлена в пробе на нагрузку сопротивлением (рис. 8цс). В первой модели максимальное предотвращение исчерпания миокар-диального резерва выявлено у небиволола, L-аргинина в дозе 200 мг/кг и эналаприла (95Д±3,9; 84,3±2,9 и 82,7±3,0% соответственно); во второй эффективны были все изучаемые вещества, несколько меньше - эналаприл и лозартан.

Исследование экспрессии эндотелиальной NO-синтазы выявило, что L-аргинин не увеличивал значений данного показателя в обеих дозах. Концентрация нитрит-ионов в сыворотке крови при монотерапии достоверно увеличивалась при введении L-аргинина (200 мг/кг) и небиволола при первой модели (107,9±15,7 и 99,1±12,1 мкМоль соответственно) (рис. 9l_name-nox)> и в условиях второй наблюдалась аналогичная картина биохимических сдвигов. L-аргшшн и небиволол также выявили максимальное предотвращение снижения концентрации стабильных метаболитов оксида азота (рис. 9o3-no*)-

Данные морфометрических исследований показали, что все изучаемые вещества в разной степени предотвращают развитие миокардиоцитов. На фоне введения L-NAME данный эффект выражен у L-аргинина в дозе 200 мг/кг, амлодипина и небиволола, на фоне овариэктомии - у L-аргинина (200 мг/кг), лозартана и небиволола. Остальные препараты заняли промежуточное положение между интактными и животными с L-NAME- и гипоэстроген-индуцированной патологией, однако не достигли статистически значимых различий диаметра . кардиомиоцитов крыс с моделированием патологии (рис. 9l_name, оэ-дм)-

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей, отражающих эндотелиопротективные эффекты, L-аргинин 200 мг/кг проявил активность, сопоставимую или превосходящую таковую у препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью.

3. Изучение эндотелиопротективной активности сочетанного применения L-аргинина 200 мг/кг и его комбинаций с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью при L-NAME- и гипоэстроген-индуцированной модели дефицита NO.

Значения КЭД приближались к значениям интактных под действием сочетанного применения L-аргинина в сравнении с монотерапией вышеуказанными препаратами при моделировании дефицита оксида азота в условиях пер-

вой модели. Цифровые выражения данного показателя в изучаемых группах составили в комбинации с эналаприлом - 2,6±0,1; лозартаном - 1,7±0,09; амло-дипином- 1,5±0,08; небивололом - 1,5±0,09; индапамидом - 2,3±0,1.

а сад идад

а сад

еэдад

Рисунок 10. Влияние Ь-аргинина 200 мг/кг и его комбинаций с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью на показатели коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) и артериального давления (АД) при моделировании Ь-ЫАМЕ-ицдуцированного и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0.

Примечание. * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных или группой овариэктомии. Здесь и на следующих двух рисунках:

1 - Интактные самцы;

11-L-NAME;

III - L-NAME+Ь-аргинин 200 мг/кг (L-apr.);

IV - L-NAME+эналаприл 0,5 мг/кг+L-apr.;

V - L-NAME+лозартан 6 мг/кг+L-apr.;

VI - L-NAME+амлодипин 0,5 мг/кг+L-apr.;

VII - L-NAME+небиволол 0,5 мг/кг+Ь-арг.;

VIII - L-NAME+ индапамид 2 мг/кг+Ь-арг.;

1 - Интактные самки;

2 - Овариэктомия (ОЭ);

3 - ОЭ+Ь-аргинин 200 мг/кг (Ь-арг.);

4 - ОЭ+эналалрил 0,5 мг/кг+Ь-арг.;

5 - ОЭ+лозартан 6 мг/кг+Ь-арг.;

6- ОЭ+амлодипин 0,5 мг/кг+Ь-арг.;

7 - ОЭ+небиволол 0,5 мг/кг+Ь-арг.;

8 - ОЭ+индапамид 2 мг/кг+Ь-арг.;

ы

г <

г

а

О

ы <

г

Л

I И IV V VI VII VIII IX

—А— Иита1Стнь1^

> Ь-1МАМЕ --♦- Ь^АМЕ+Ь-аргинин

- тА — ИЧАМЕ+энялапрнл 0,5 •

- О- - ¡. АЛМЕ+ло 1;фтян 6 М1К[ - 1ар1 —О— 1-ЛЛМI.*амлодипин 0,5 мг/кг+Ь-арг —X— Ь-КАМЕ+небиволол 0,5 мг/кг+Ь-арг —!-Ь^АМЕ+индапамид 2 мг/кг+Ь-арг

10"

15"

20"

—I 25"

а О

- Интактя! -♦"-Овариэктомия О -»—О НЬ-лргиинм 200 мг/кг1

— ОЭ+эналапрмл 0,5 мгУкг+1,-арг -А — ОЭ+лозартан 6 мг/кг+Ь-арг "1-"- {3- ■ ОЭ+амлоднпин 0,5 мг/кг+Ь-арг -ОЭ+небиволол 0,5 мг/кг+Ь-арг —X—ОЭ+ннлапамид 2 мг/кг+Ь-арг

92,2%*

10"

15"

67,9%**

20"

25"

Рисунок 11. Влияние Ь-аргинина 200 мг/кг и его комбинаций с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью на показатели сократимости миокарда левого желудочка при проведении проб на адренореактивность (АДр) и нагрузку сопротивлением (НС) при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0. Примечание. * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных или группой овариэктомии. Расшифровка обозначений групп выше.

I II Ш IV V VI VII VIII

Я

а

«

и О

щ г,

И

О

г,

§

Рисунок 12. Влияние Ь-аргинина 200 мг/кг и его комбинаций с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью на концентрацию стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови (1\Юх) и диаметр кардиомиоцитов (ДМ) при моделировании Ь-ИАМЕ-индуцированного и гипоэстроген-индуцированного дефицитаN0.

Примечание. * - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных или группой овариэк-томии; ** - р < 0,05 в сравнении с группой интактиых животных. Расшифровка обозначений групп выше.

Такая же положительная тенденция наблюдается и при гипоэстрогепном состоянии, несколько меньшим корригирующим действием проявила себя комбинация Ь-аргинина и индапамида- 1,1±0,1, тогда как значения КЭД в остальных изучаемых группах колебались в пределах 0,6±0,07 (сочетание с амлоди-пином) и 0,9±0,08 (сочетание с небивололом) (рис. Ю^аме, оэ-кэд)-

На фоне введения Ь-ЫАМЕ сочетанное использование Ь-аргинина 200 мг/кг с представителями основных групп антигипертензивных препаратов в отличие от монотерпии приводило к значительному снижению АД. Наибольший гипотензивный эффект достигался при использовании сочетания Ь-аргинина с эналаприлом, амлодипином и небивололом, цифры САД и ДАД в этих группах составили соответственно 143,2±10,1/116,1±7,9; 145,4±9,2/112±8,9; 147,1±11,3/117,3±8,8 мм рт. ст. В условиях снижения уровня половых гормонов такой эффект отмечался практически у всех сочетаний, в несколько меньшей степени - в комбинации с амлодипином и инда-памидом (134,1±9,3/101,4±7,8; 137,2±8,9/97,9±6,7 мм рт. ст. соответственно)

(рис. Ю^дме, оэ-ад)-

Проба на адренореактивность выявила снижение абсолютных значений цифр максимального левожелудочкового давления у животных, получавших Ь-аргишш в сочетании с исследуемыми препаратами, во всех групп-пах в сравнении с соответствующей монотерапией, но в наименьшей степени с индапамидом в первой модели патологии и с лозартаном при второй (рис. Нь-ламе, оэ-Адр)- Нагрузка сопротивлением выявила значительное восстановление миокардиального резерва по сравнению с монотерапией во всех изучаемых группах комбинаций с Ь-аргинином, особенно с лозартаном и индапамидом (в условиях первой модели) до уровня 90,1±7,9% и 88,4±7,7% соответственно. В условиях дефицита эстрогенов комбинированное использование Ь-аргинина также оказалось предпочтительнее монотерапии, наилучший прирост наблюдался в группах с эналаприлом и лозартаном (85,8±6,9% и 81,5±6,1% соответственно) (рис. 11 г-хаме, оэ-нс)- Максимальное сохранение миокардиального резерва наблюдалось при использовании сочетания Ь-аргинина с небивололом.

Концентрация стабильных метаболитов оксида азота при сочетанном использовании была значительно выше, чем при соответствующей монотерапии, приближаясь к значениям у интактной группы, в наибольшей степени в группе комбинации с эналаприлом и небивололом при первой модели, а во второй - дополнительно ещё и с лозартаном (рис. 1оэ-мох)-

Морфометрия диаметра миокардиоцитов также показала преимущество комбинаций Ь-аргинина с антигипертензивными препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью. Сочетания Ь-аргинина с эналаприлом, амлодипином и небивололом полностью предотвращали развитие гипертрофии миокардиоцитов у животных в первой модели. Во второй - сочетания Ь-аргшшна с исследуемыми препаратами практически полностью предотвращали гипертрофию миокардиоцитов (рис. 1 2^-лме, оэ-д,м)-

Таким образом, сочетанное применение эналаприла, лозартана, амлоди-пина, небиволола и индапамида с эндогенным субстратом для образования N0 Ь-аргинином выявило существенные преимущества по сравнению с монотера-

пией указанными препаратами по совокупности функциональных, биохимических и морфологических критериев, характеризующих выраженность и степень экдотелиальной дисфункции, а также сопутствующих ей признаков гипертрофии миокарда и ремоделирования сосудистого русла при L-NAME- и гипоэст-роген-индуцированном дефиците оксида азота. При этом наблюдалось усиление гипотензивного эффекта в условиях комбинированной фармакологической коррекции дефицита оксида азота.

4. Интегральный векторный анализ гемодинамических, биохимических и морфологических показателей в комплексной оценке эндотелио- и карднопротективиой активности L-аргинина, эналаприла, лозартана, ам-лодипина, небиволола и индапамида, а также комбинации L-аргишша с вышеуказанными препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью.

Данный анализ позволяет провести комплексную визуальную характеристику функции эндотелия и сократимости миокарда с использованием нескольких основных параметров, в полной мере характеризующих состояние сердечно-сосудистой системы.

Для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, сократимости миокарда, нитроксидергической системы и морфологических характеристик миокарда на основе интегрального анализа всего спектра проводимых исследований, мы представили значение каждого показателя в виде вектора. Все векторы, каждый из которых соответствовал определенной нагрузочной пробе, были построены на плоскости в прямоугольной декартовой системе координат Оху, полюсом для всех векторов было выбрано начало прямоугольной декартовой системы координат, полярной осью служило положительное направление оси Оу, длина вектора равнялась величине шести показателей комплексного морфофункционального исследования в изучаемых группах. Направление каждого вектора задавалось жестко, 1-й вектор - САД (систолическое артериальное давление) совпадал с осью Оу, последующие векторы располагались по часовой стрелке, угол между соседними векторами составлял 60°. Следующими векторами соответственно обозначены показатели - ДАД -диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; КМЦ - диаметр кардиомиоцитов - нагрузка объемом; N0* - суммарное количество нитратов и нитритов (Total NO); ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия). Координаты вектора каждой нагрузочной пробы изначально выражались как полярные (р0, ф0), где р0 - полярный радиус, ф0 - полярный угол, переход от полярных координат к прямоугольным (х0, у0) осуществлялся по формулам: х0 = р0 cos ф0, у0 = р0 sin ф0.

Векторные значения выбранных показателей были представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, площадь векторной диаграммы выражалась в условных единицах (усл. ед.). Площадь векторной диаграммы рассчитывали по формуле:

где Б - площадь векторной диаграммы, и у; - прямоугольные координаты соответствующих векторов, п - количество векторов.

Различия между соответствующими функциональными, биохимическими и морфологическими показателями при проведении исследований между изучаемыми группами интактных, контрольных и опытных групп животных отражаются площадью диаграмм, образованной соединением конечных точек векторов вышеуказанных показателей.

Сравнивая площади векторных диаграмм, мы получили выраженные различия между группой интактных животных и животных с моделированием Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированиого дефицита оксида азота - в 2 и 1,5 раза соответственно Срис. 13).

Интактные самцы

САД

ПА 5-26 л

L-NAME

САД 500 .

%

ДАД

КЭД

тойц

Интактные самки

зсга

ПА 5-25 v ^ ДАД

200 1 /

Ж

NO ' —' КЭД

S=10,12±l ,2*

кмц

Овариэктомйя

ДАД

КЭД

ПА 5-25

ДАД

КЭД

Рисунок 13. Площади векторных диаграмм функциональных, биохимических и морфологических показателей группы интактных животных и животных с моделированием дефицита оксида азота введением L-нитро-аргинин-метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг внутрибрюшинно и билатеральной овариэкто-мией.

Примечание. *-р<0,05 по сравнению с интакгными; САД - систолическое артериальное давление; ДАД - диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиалыюй дисфункции; КМЦ - диаметр кардиомиоцитов; NO - суммарное количество нитратов и нитритов (Total NO); ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия).

Ь-аргинин при всех сочетаниях усиливает интегральную протективную активность в отношении Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота, что выражается в большем приближении значения площади к группе интактных животных, что представлено на рисунках 14 и 15 в несколько стилизованном виде для большей наглядности.

Рисунок 14. Площади результирующих диаграмм морфофункциональных и биохимических показателей при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота при комбинированной терапии Ь-аргинина 200 мг/кг с изучаемыми препаратами (усл. ед.).

Рисунок 15. Площади результирующих диаграмм морфофункциональных и биохимических показателей при моделировании гипоэстроген-индуцирован-ного дефицита оксида азота при комбинированной терапии Ь-аргинина 200 мг/кг с изучаемыми препаратами (усл. ед.).

Наибольшее относительно монотерапии снижение площади происходило в комбинации Ь-аргинина с энапаприлом и индапамидом в условиях первой и в группе с амлодипином, лозартаном и индапамидом в условиях второй модели.

Лочартан

Эналапрн

Ь-яргпнки

¡.-арпптн »налапр!

[отарт.#

Ш'9г

Амлоди

Ь-аргияю1(

Ь-арпипн

Индапам!

Ь-аргшшн |

Ь-аргшшн

Ь-яргкшш1

Ь-яргнняи

При последующем рассмотрении мы рассчитали дельту аддиции - разность между результирующей площадью векторной диаграммы каждого исследуемого антигипертензивного препарата и площадью его комбинации с Ь-аргинином - (Дшг Зпрегирэт - Зь_арги„ии.препарат ). После проведения соответствующих расчётов, т. е. выражения в процентах отношения дельта аддиции Ь-аргинина к разности между результирующими площадями интактной группы и групп с моделированием дефицита оксида азота, мы получили вероятностный процент аддиции (рис. 16), который упрощённо, но интегративно описывает вклад Ь-аргинина при комбинированном использовании его с каждым препаратом для коррекции Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота.

вычлмЕ, вовар

Радд. —

Аадд.

АшАМЕ(Аовар)

х 100

)препарат

арг. + препарат

SLNAME: О вар — &

х 100

интактные

Рисунок 16. Формула расчёта вероятностного процента аддиции (Р^д) Ь-аргинина в комбинации с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью (в%).

Из рисунка 17 видно, что при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота добавление Ь-аргинина к эналаприлу даёт наиболее существенную аддицию, вероятностный процент которой колеблется или варьирует от 25 до 30%, наименьший прирост аддиции в комбинации Ь-аргинина с небивололом -7%, промежуточное положение занимают комбинации с лозартаном, амлоди-пином и индапамидом (15-20%).

Рисунок 17. Показатели вероятностного процента аддиции (Рам ) комбинаций Ь-аргинина с препаратами с доказанной эндотелиотропной активностью при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота.

При гипоэстроген-индуцированном дефиците оксида азота также происходит уменьшение результирующей площади диаграммы морфофункциональ-ных и биохимических показателей, картина несколько отличается (рис. 18). Наибольшую дельту аддиции Ь-аргинин привносит в сочетании с амлодипином (65%), среднюю - с лозартаном, эналаприлом и индапамидом (30-45%), наименьшую опять с небивололом (13%).

Рисунок 18. Показатели вероятностного процента аддиции (Рщи ) комбинаций Ь~аргинина с препаратами с доказанной эндотелиотропной активностью при гипоэстроген-индуцированном дефиците оксида азота.

На наш взгляд, несмотря на всю упрощённость расчёта, полученный результат поддаётся логичной интерпретации. Аддитивный эффект максимален там, где патогенетически точки приложения фармакодинамического действия L-аргинина, как прекурсора для синтеза NO и конкурентного ингибитора AD-MA, принципиально отличны от механизма эндотелиопротекции традиционными препаратами (рис. 19).

Рисунок 19. Схема механизма возможных путей реализации эндотелиопротек-тивных эффектов L-аргинина, ингибиторов АПФ (ИАПФ), блокаторов ATI рецепторов (БАТ1), блокаторов кальциевых каналов (БКК), небиволола и инда-памида.

Примечание. ЭК - эндотелиальные клетки сосудов, ГК - гладкомышечные клетки сосудов, АПФ - аигиотензинпревращающий фермент, ATI, ATII - ангиотензин I и И, ATI - ангиотен-зиновые рецепторы подтипа 1, БК - брадикининовые рецепторы, БКПД - продукты деградации брадикиника, МП - мембранные потенциалэависимые каналы миоэндотелиатьного взаимодействия, MP - натрийзависимые механорецепторы, НАДФ - кикотииамид-адениндинуклеотид-фосфат, НАДФН - восстановленная форма НАДФ, ФАД - флавин-адениндинуклеотид, 1ТФ - гуанозинтрифосфат, ГЦ - гуанилатциклаза, ЦГМФ - циклический гуанозинмонофосфат, ЭТ1 - эндотелии 1, ЕТА - эндотелиновые рецепторы подтипа А, ONOO" - пероксинитрит, eNOS - эндотедиальная NO-синтаза, АХ - ацетилхолин, HSP - белки теплового шока, CP - серотонин, L-NAME - №-нитро-Ь-аргининметиловый эфир, L-NMMA - №- нитро-Ь-монометиларгинин, ADMA - асимметричный диметиларгинин,

На рисунке 19 представлены разные точки приложения Ь-аргинина и вышеуказанных препаратов, На наш взгляд, помимо действия Ь-аргинина, как прекурсора для синтеза N0 и конкурентного ингибитора АЭМА, существуют и МО-независимые механизмы эндотелиопротекции, связанные с уменьшением количеств АТИ, эндотелина и альдостерона.

Схематично также можно представить точки приложения эналаприла, ло-зартана, индапамида амлодипина и иебиволола. Там, где небиволол сам является модулятором синтеза оксида азота, аддиция Ь-аргинином минимальна. В случае комбинации Ь-аргинина и эналаприла наблюдается наиболее выраженный аддитивный эффект в отношение проявления эндотелиопротективного и кардиогемодинамических корригирующих эффектов при моделировании Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Комбинация Ь-аргинина и амлодипина в наибольшей степени корригирует нарушения метаболического пути Ь-аргинин/Ж) при моделировании гипоэ-строген-индуцированнога дефицита оксида азота, остальные комбинации занимают промежуточное положение по эффективности при обоих способах моделирования дефицита оксида азота.

Данные рассуждения, конечно, имеют строгую привязку к условиям моделирования эндотелиалыюй дисфункции, вызванной дефицитом оксида азота, вследствие введения блокатора е>Ю8 №-нитро-Ь-аргининметилового эфира (Ь-ЫАМЕ), и эстрогендефицитного состояния вследствие билатеральной овари-эктомии. Для более уточнённой оценки роли и места дополнительного экзогенного введения эндогенного донора оксида азота Ь-аргинина к известным кар-диотропным препаратам необходимы дальнейшие исследования как экспериментальные, так и клинические. Очевидно, что будущие исследования должны осуществляться с учётом всех привходящих факторов, могущих повлиять на проявление терапевтической эффективности Ь-аргинина.

Для этого исследования должны контролироваться определением тех маркеров, способных прогнозировать высокую степень вероятности реакции/отклика на дополнительное введение Ь-аргинина (например, повышенные концентрации эндогенного блокатора эндотелиальной еЫ05-ассимстричного диметиларгинина или индукция/стимулирование фермента аргиназы). Не так давно стали доступными диагностические инструмены быстрого и лёгкого определения уровней ассиметричного диметиларгинина. Они должны помочь в преодолении всех возможных препятствий, способных встать на пути будущих исследований. Также необходимо проводить и долгосрочные исследования для определения того, имеют ли место какие-либо отличия в доступности дополнительного введения Ь-аргинина, принимаемого в течение коротких или длительных периодов времени.

Таким образом, наши исследования раскрывают перспективу целенаправленного и патогенетически осмысленного изучения возможностей использования субстрата для синтеза оксида азота Ь-аргинина, как существенного дополнения к существующим парадигмам лечения сердечно-сосудистых заболеваний с учётом неотвратимого всеобщего признания АЭМА, как нового фактора риска сердечно-сосудистого континуума.

выводы

1. Внутрибрюшинное введение в течение 7 суток №-нитро-Ь-аргинин-метилового эфира (Ь-ЫАМЕ) в дозе 25 мг/кг/сут. вызывало у лабораторных животных развитие эндотелиальной дисфункции, выражавшееся в характерной динамике функциональных, биохимических и морфометрических маркеров. Наиболее информативным оказался коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), представляющий собой соотношение площади над кривой сосудистой реакции на эндотелийнезависимую вазодилатацию (нитропруссид натрия) к площади сосудистой эндотелийзависимой вазодилатации (ацетилхолин), который оказался в 5 раз выше, чем у интактных животных. Одновременно развивались выраженная артериальная гипертензия (190,3±6,7/145,0±3,9 мм рт.ст.), повышение адренореактивности и снижение резервов сократимости; резко, в 3,5 раза, уменьшался уровень стабильных метаболитов оксида азота и в 2 раза снижалась экспрессия еТ^ОЗ. Морфометрически определялась гипертрофия миокарда.

2. Через 6 недель после билатеральной овариэктомии у крыс развивался комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, указывающих на развитие эндотелиальной дисфункции. В частности, коэффициент эндотелиальной дисфункции увеличивался в 2,5 раза, повышалось артериальное давление (160±6,2А25±5,5 мм рт.ст), развивалась гиперреактивность на адреналовую пробу, снижалась сократительная способность миокарда при пробе на нагрузку сопротивлением, в 2 раза уменьшался уровень стабильных метаболитов оксида азота при отсутствии изменения содержания эндотелина. Морфометрически диаметры миокардиоцитов также увеличивались. В целом, количественные значения маркеров эндотелиальной дисфункции при эстроген-дефицитном состоянии оказались меньше соответствующих показателей при Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологии.

3. Ь-аргинин 30 и 200 мг/кг/сут. дозозависимо предотвращал развитие Ь-МАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0, что выражалось в приближении коэффициента эндотелиальной дисфункции до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения стабильных метаболитов оксида азота. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение развития гиперадренореактивности, снижения сократительного резерва. Ь-аргинин 200 мг/кг предотвращал увеличение поперечного диаметра миокардиоцитов. Ь-аргинин 30 мг/кг также проявлял эндотелио- и кардиопротективную активность, однако уступал Ь-аргинину 200 мг/кг. Эналаприл 0,5 мг/кг/сут., лозартан калия 6 мг/кг/сут., амлодипин 0,5 мг/кг/сут., небиволол 0,5 мг/кг/сут., индапа-мид 2 мг/кг/сут., как монотерапия, также обладали эндотелиопротективными эффектами на данных моделях патологии. Монотерапия Ь-аргинином и данными препаратами не приводила к достижению целевых значений артериального давления.

4. Сочетанное использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с эналапрнлом (0,5 мг/кг) оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на моделях Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, а также в предотвраще-

нии снижения стабильных метаболитов оксида азота. Показатели АД при L-NAMp патологии достоверно снижались, при эстрогендефицитном состоянии достигали целевых значений. Результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности. Морфо-метрические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинации L-аргинина с эналаприлом увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов.

5. Комбинированное использование L-аргинина (200 мг/кг) с лозартаном калия (6,0 мг/кг) оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME- и гипоэстроген-иидуцированного дефицита NO, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, а также в предотвращении снижения стабильных метаболитов оксида азота. Комбинация не предотвращала развитие гипертензии при L-NAME-индуцированной модели патологии и достигала целевого уровня АД при эстрогендефицитном состоянии, в отличие от монотерапии отдельно L-аргинином и лозартаном. Сходную и сопоставимую с L-аргинином (200 мг/кг) положительную динамику продемонстрировали результаты нагрузочных проб и морф о метрических показателей.

6. Сочетанное использование L-аргинина (200 мг/кг) с амлодипином (0,5 мг/кг) оказывало эндотелиопротективное действие на моделях L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита NO, выражавшееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб и морфометрических показателей, а также в предотвращении снижения стабильных метаболитов оксида азота. Показатели АД при L-NAME патологии достоверно снижались, а при недостаточности эстрогенов достигались целевые цифры АД.

7. Комбинированное использование L-аргинина (200 мг/кг) с небиволо-Лом (0,5 мг/кг) оказывало эндотелиопротективное действие на моделях L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита NO, выражавшееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб и морфометрических исследований, а также в предотвращении снижения стабильных метаболитов оксида азота. Показатели АД при L-NAME патологии достоверно снижались, а при эстрогендефицитном состоянии достигались целевые цифры АД.

8. Комплексное использование L-аргинина (200 мг/кг) с индапамидом (2 мг/кг) оказывало эндотелиопротективное действие на моделях L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0, выражавшееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб и морфометрических исследований, в снижении стабильных метаболитов оксида азота, при этом достигались целевые цифры АД при гипоэстрогении. Комбинация не предотвращала развитие гипертензии при L-NAME-индуцированной модели патологии.

9. Расчёт вероятностного коэффициента аддиции показал, что L-аргинин проявил положительное фармакодинамическое взаимодействие и позволил расположить изученные комбинации в следующей последовательности: при

Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота: Ь-аргинин + небиволол < Ь-аргинин + иидапамид < Ь-аргинин + амлодипин < Ь-аргинин + лозартан < Ь-аргинин + эналаприл, а при гипоэстроген-индуцированной патологии соответственно: Ь-аргинин + небиволол < Ь-аргинин + эналаприл < Ь-аргинин + индапамид < Ь-аргинин + лозартан < Ь-аргинин+амлодипин.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изучение эффектов синтетических доноров оксида азота при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / JI.B. Корокина, В.Г. Гра-ник, В.А. Макаров и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2006. - № 9 (90). -С. 141-145.

2. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2006. - № 10 (91). - С. 72-77.

3. Новый взгляд на коррекцию эндотелиальной дисфункции / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская и др. // Russian journal of immunology. - 2006. - Vol. 9, supp. 3. - P. 59-63.

4. Сравнительное исследование эндотелио- и кардиопротективных свойств фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorea del-toidea и 17-/3-эстрадиола / М.В. Корокин, A.M. Носов, М.В. Покровский и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2006. - № 9 (90). - С. 137-140.

5. Эндотелиопротективные эффекты резвератрола и его комбинаций с энала-прилом и лозартаном при экспериментальном моделировании оксида азота / В.И. Кочкаров, М.В. Покровский, М.М. Корнеев и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2006. - № 9 (90). - С. 150-152.

6. Влияние антиоксидантов pQ510 и резвератрола на регуляторную функцию эндотелия у крыс с моделированной артериальной гипертонией / Н.Г. Туманова, Е.Б. Артюшкова, В.А. Метельская и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, № 6. - С. 619-622.

7. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, Б.С. Суковатых и др. II Кубанский науч. мед. вестн. - 2007. - № 1-2 (94-95). - С. 19-22.

8. Применение Ь-аргинина в комплексе с амлодипином и индапамидом при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / Я.И. Залозных, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2007. - № 1-2 (94-95). - С. 52-55.

9. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2007. - № 1-2 (94-95). - С. 146-150.

10. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты смеси гомеопатических разведений афинно очищенных поликлональных кроличьих антител к эндоте-лиалыюй синтазе оксида азота (eNOS) С12, СЗО, С200 при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцировшшой эидотелиальной дисфункции / A.C. Белоус, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров и др. // Кубанский науч. мед. вести. - 2007. - № 1-2 (94-95). - С. 23-26.

11. Влияние фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dio-scorea Deltoidea на регуляторную функцию эндотелия при моделировании гипоэстроген-индуцированной эидотелиальной дисфункции / Е.Б. Ариош-кова, Н.Г. Туманова, В.А. Метельская и др. // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2008. - № 2. - С. 85-89.

12. Возможности комбинированной фармакологической и хирургической коррекции хронической ишемии конечностей в эксперименте / Е.Б. Артюшко-ва, Д.В. Пашков, А.Д. Мясников и др. // Рос. мед.-биолог. вестн. им. акад. И.П. Павлова. -2008. - № 1. - С.8-13.

13. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, М.В. Покровский и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2008. - Т. 71, № 3. - С. 23-25.

14. Использование L-аргшшна в профилактике нарушений функции эндотелия в условиях ингибирования эидотелиальной и индуцибельной NO-синтаз / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 3. - С. 328.

15. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинаций основных групп аитигипертензивных средств с L-аргинином при эидотелиальной дисфункции в эксперименте / Т.Г, Покровская, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров и др. // Рос. мед.-биолог. вестн. им. акад. И.П. Павлова. -2008.-№2.-С. 126-131.

16. Покровская, Т.Г. Роль фармакологической коррекции метаболического пути Ь-аргиншг/КО при моделировании дефицита оксида азота / Т.Г. Покровская И Кубанский науч. мед. вестн. - 2008. - № 4. - С. 122-125.

17. Способы экспериментального моделирования эидотелиальной дисфункции / М.В. Корокин, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 3. - С. 327.

18. Эндотелиопротективные эффекты L-аргшшна при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова // Эксперим. и клинич. фармакология. -2008.-Т. 71, №2.-С. 29-31.

19. Коррекция эидотелиальной дисфункции препаратом импаза в комплексе с эналаприлом и лозартаном при моделировании дефицита оксида азота / Белоус A.C., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И. и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Т. 148, № 8, приложение. - С. 151-154.

20. Сравнительное изучение потенциальных эндотелийпротекторов и препарата Импаза при моделировании дефицита оксида азота / Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г. и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Т. 148, № 8, приложение. - С. 154-158.

21. Методология корреляционной оценки состояния эндотелия сосудистой стенки и сократимости миокарда / Даниленко Л.М., Покровская Т.Г., Артюшкова Е.Б., Лазаренко Г.С. // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. юбилей, науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН, посвящ. 70-летию КГМУ: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2005. -Т. 2. - С. 127.

22. К определению нитратов и нитритов в крови у крыс как биохимических маркеров состояния эндотелия сосудов / В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова, Г.С. Лазаренко, Т.Г. Покровская // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. юбилей, науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН, посвящ. 70-летию КГМУ: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2005. - Т. 2. - С. 132.

23. Протокол исследования: влияние Ь-аргинина на уровень артериального давления и сосудистую реактивность у больных мягкой и умеренной арге-риальной гипертонией / Е.Б. Артюшкова, Т.Г. Покровская, Я.И. Залозных, Е.А. Зубарев // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. юбилей, науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН, посвящ. 70-летию КГМУ: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2005. - Т. 2. - С. 119-120.

24. Исследование эндотелиопротективного эффекта Ь-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский и др. // Биомедицина. - 2006. - № 4. - С. 107-109.

25. К вопросу коррекции эндотелиальной дисфункции с использованием эндогенного донатора оксида азота / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова, Г.С. Лазаренко // Университетская наука: взгляд в будущее: сб. тр. 71-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН. - 2006. - Т. 2. - С. 251-252.

26. Коррекция Ь-ЫАМЕ индуцированной эндотелиальной дисфункции при использовании синтетических доноров оксида азота / Л.В. Корокина, В.Г. Граник, В.А. Макаров и др. // Биомедицина. - 2006 - № 4. - С. 90-92.

27. Методология оценки фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская и др. // Рос. науч. конф. с междунар. участием «Медико-биологические аспекты муль-тифакториальной патологии». - Курск, 2006. - Т. II. - С. 333-336.

28. Оценка эндотелиотропных свойств эндогенного донатора оксида азота Ь-аргинина в условиях овариэктомии / Т.Г. Покровская, М.В. Корокин, Е.Б. Артюшкова и др. // Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации: материалы I Нац. конгр. терапевтов. - М., 2006. - С. 175.

29. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский и др. // Рос. науч. конф. с междунар. участием «Медико-биологические аспекты мультифактори-

, альной патологии», - Курск, 2006. - Т. II. - С. 336-340.

30. Эндотелиопротективное действие Ь-аргинина при фармакологическом способе моделирования дефицита оксида азота / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Л.М. Даниленко и др. // "Научные ведомости" Белгородского гос. ун-та. - 2006. - № 3 (23), Вып. 4. - С. 43-51.

31. Возможности фармакологической коррекции ишемии конечности L-аргинином в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, М.В. Покровский и др. // Шестая междунар. конф. «Клинические исследования лекарственных средств». - М., 2007. - С. 9-11.

32. Возможность использования эндотелиопротекторных аддитивов для массовой профилактики сердечно-сосудистых заболеваний / Т.И. Зеленкова, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров и др. // Междунар. науч.-практ. конф. «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества» (26-27 марта 2007 г., г. Курск). - Курск, 2007. - С. 249-252.

33. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов препарата «Кардионат» при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / М.В. Корокин, Е.В. Артюшкова, М.В. Покровский и др. // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2007. - № 3. - С. 5-9.

34. Исследование эндотелиопротективных эффектов комбинации L-аргннина и резвератрола / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский и др. // Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации: материалы II Нац. конгр. терапевтов. - М., 2007. - С. 178.

35. Исследование эндотелиопротективных эффектов комбинации L-аргинина и резвератрола при моделировании гипоэстроген-индуцированной эндоте-лиалыгой дисфункции / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский и др. // Шестая междунар. конф. «Клинические исследования лекарственных средств». - М., 2007. - С. 91-93.

36. Морфофункциональные изменения миокарда при экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции / Т.Г. Покровская, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации: материалы И нац. конгр. терапевтов. - М., 2007. - С. 177.

37. Возможности коррекции регуляторной функции эндотелия фуростаноло-выми гликозидами из культуры клеток растения Dyoscorea deltoidea / М.В. Корокин, М.В. Покровский, Н.Г. Туманова и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 641.

38. Доноры оксида азота в коррекции хронической ишемии конечности / Е.Б. Артюшкова, М.В. Покровский, Д.В. Пашков и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 581.

39. Изучение кардиопротективных эффектов препарата Импаза в комплексе с лозартаном при экспериментальном моделировании L-NAME индуцированного дефицита оксида азота / A.C. Белоус, Т.Г. Покровская, М.В. Покровский и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 589.

40. К вопросу фармакологической коррекции гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции / М.В. Корокин, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская и др. // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». -2008.-№ 1.-С. 31-35.

41.Эндотелиопротективные эффекты препарата Мексиприм при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте / Т.Г. Покровская, К.Е. Бобраков, М.В. Покровский и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 685.

42. Combination amlodipin and L-arginine at correction of endothelial dysfunction in experiment / T.G. Pokrovskaya, V.I. Kochkarov, M.V. Pokrovskiy, E.B. Art-jushkova // Fundamental pharmacology and pharmacy, materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. -P. 130-131.

43. Endothelioprotective effects L-arginine in the combination with lozartan at experimental deficiency of nitrogen oxide / T.G. Pokrovskaya, V.I. Kochkarov, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. -Perm, 2006. -P. 131-132.

44. Research endothelioprotective effects L-arginine and its combinations with ena-lapril / T.G. Pokrovskaya, V.I. Kochkarov, M.V. Pokrovskiy et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. - P. 128-130.

Патенты

1. Пат. 2271202 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/198. Способ коррекции эндотелиалышй дисфункции / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. -№ 2005113244/14, заявл. 04.05.2005; опубл. 10.03.06, Бюл. №7.-4 с.

2. Пат. 2296566 Российская Федерация МПК7 А61К 31/4422. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией амлодипина и Е-аргинина при Ь-^гАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140965/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 10.04.07, Бюл. № 10. - 4 с.

3. Пат. 2301015 Российская Федерация, МПК7 А61В 5/02. Способ оценки эндотелиальной дисфункции / соавт. М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. -№ 2005113243/14, заявл. 10.1.2006; опубл. 20.06.07, Бюл. № 17. - 7 е.: ил.

4. Пат. 2301670 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/401. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией эналаприла и резвератрола при Ь-ЫАМЕ-индунированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140966/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 27.06.07, Бюл. № 18. - 5 с.

5. Пат. 2302239 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/198. Способ фармакологической коррекции ишемии конечности / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. - № 2006125313/14, заявл. 14.07.2006; опубл. 10.07.07, Бюл. № 19. - 3 с.

6. Пат. 2302241 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/4045. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией индапамида и резвератрола при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140969/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 10.07.07, Бюл. № 19. - 4 с.

7. Пат. 2306924 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/05. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией лозартана и резвератрола при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140967/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 27.09.07, Бюл. Ks 27. - 4 с.

8. Пат. 2306929 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/4045. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией индапамида и L-аргинина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140970/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 27.09.07, Бюл. № 27. - 4 с.

9. Пат. 2306930 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/4178.Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией лозартана и L-аргинина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140968/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 27.09.07, Бюл. № 27. - 4 с.

10. Пат. 2306953 Российская Федерация, МПК7 А61 К 39/395. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений поликлоиальных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота человека - CI2, С30, С200 / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова, A.C. Белоус. - № 2006125314/14, заявл.14.07.2006; опубл. 27.09.07, Бюл. №27.-4 с.

11. Пат. 2329807 Российская Федерация, МПК7 А61 К 36/8945. Способ коррекции гипоэстрогениндуцированной эндотелиальной дисфункции фуро-станоловыми гликозидами из культуры клеток растения Dioscorea deltoid-dea / М. В. Корокин и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Корокин, A.M. Носов - № 2006125310/14, заявл. 14.07.2006; опубл. 27.07.08, Бюл. №21.-4 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление

АГ - артериальная гипертензия

ИБС - ишемичеекая болезнь сердца

ЛЖД - левожелудочковое давление

N0 - оксид азота

АБМА - асимметричный диметиларгинин

ЬИАМЕ - №-нитро-Ь-аршнин метиловый эфир

ОЭ - овариэктомия

эд - эндотелиальная дисфункция

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

АТ - ангиотензин

ЭК — эндотелиальная клетка

ИАПФ - ингибитор ангиотензинпревращающего фермента

Тс*а1 N0, N0, - суммарная концентрация нитратов и нитритов

САД - систолическое артериальное давление

ДАД - диастолическое артериальное давление

ЧСС - частота сердечных сокращений

АДр - адренореакгивность

дм - диаметр кардиомиоцитов

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

НС - нагрузка сопротивлением

е!Ч08 - эндотелиальная синтаза оксида азота

Ь-арг - Ь-аргинин

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 27.03.2009 г. Подписано в печать 02.04.2009 г. Формат 30х421/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 72А. Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.