Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Эндотелио- и кардиопротективные эффекты сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалина и препарата "Блоктран А"

На правах рукописи

Терехова Елена Геннадиевна

ЭНДОТЕЛИО- И КАРДИОПРОТЕКТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ИНГИБИТОРА АРГИНАЗЫ Ь-НОРВАЛИНА И ПРЕПАРАТА «БЛОКТРАН А» (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 0 —-о

Курск-2012

005043189

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук Покровская Татьяна Григорьевна

Официальные оппоненты:

Провоторов Владимир Яковлевич - доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии

Филиппова Ольга Всеволодовна — доктор медицинских наук, Федеральное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет», профессор кафедры фармации последипломного образования Учебного центра «Фармация»

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита диссертации состоится <с{8 » СХЛ. 2012 г. в^/часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «

» СХухГ1£.сл^9^ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эндогелиапьная дисфункция (ЭД) рассматривается как предиктор целого ряда заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, а также является патогенетическим компонентом органных повреждений при сахарном диабете, гипоэстрогениых и других состояниях (Бабак О.Я., 2005; Билецкий C.B., 2008).

Согласно современным представлениям, в основе эндотелиальной дисфункции лежит нарушение метаболизма главного вазодилатирующего агента -оксида азота (NO). В организме источником оксида азота служит L-аргиннн. В цикле мочевины метаболизм L-аргинина протекает по двум путям. Первый путь катализирует фермент аргиназа, под действием которого L-аргинин гидролизи-руется в орнитин и мочевину. Другой путь превращения L-аргинина - в оксид азота и цитруллин - катализируется NO-синтазой. Оба фермента конкурируют между собой за общий субстрат L-аргинин. По данным современных исследований, аргиназа по своей активности в тысячу раз превышает NO-синтазу. Таким образом, L-аргинин расходуется на синтез орнитина и мочевины, и лишь небольшая часть - на синтез NO. Возможность блокады аргиназы, позволила бы в значительной мере увеличить биодоступность оксида азота (Bagnost Т., 2010; Ryoo S., 2008).

Наименее изученным среди ингибиторов аргиназ остается L-норвалин. L-норвалин (2-аминопентановая кислота) - неметаболизирующийся аналог L-валина, по данным ряда исследователей, один из самых мощных неселективных ингибиторов аргиназы. Нами использована субстанция производства WIRUD GmgH, Hamburg (Ming X.-F., 2009).

«Блоктран А» - комплексный препарат, содержащий 50 мг лозартана калия и 5 мг амлодипина, проходящий доклиническое исследование заводом «Фармстандарт-Лексредства», г. Курск.

Таким образом, существует необходимость фармакологического изучения эндогелиотропных свойств ингибитора аргиназы L-норвалина в комбинации с кардиотропными препаратами с доказанной эндотелиотропной активностью.

Номер государственной регистрации темы - 01201151655.

Цель исследования: провести комплексное изучение эндотелио- и кар-диопротективного действия сочетанного использования ингибитора аргиназы L-норвалина и препарата «Блоктран А» (50 мг лозартана калия + 5 мг амлодипина) при моделировании L-NAME- и гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Задачи исследования:

1. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность L-норвалина, лозартана, амлодипина и комбинированного препарата «Блоктран А» в качестве монотерапии при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

2. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения L-норвалина и препарата «Блоктран А» при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

3. Изучить эндотелйо- и кардиопротективную активность L-норвалина, лозартана, амлодипина и комбинированного препарата «Блоктран А» в качестве монотерапии при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндоте-лиальной дисфункции.

4. Изучить эндотелйо- и кардиопротективную активность сочетанного применения L-норвалина и препарата «Блоктран А» при моделировании гипер-гомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

5. Провести интегральный векторный анализ гемодинамических и биохимических показателей для комплексной оценки эндотелйо- и кардиопротектив-ной активности сочетанного применения L-норвалина и комбинированного препарата «Блоктран А».

Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции при моделировании дефицита оксида азота с использованием L-норвалина и комбинированного антигипертензивного препарата с доказанной эндотелиотропной активностью «Блоктран А» (50 мг лозартан калия и 5 мг амлодипина в одной таблетке). В работе впервые показано,что L-норвалин в дозе 10 мг/кг при сочетанном использовании с комбинированным препаратом «Блоктран А» (0,16 таб./кг, что соответствует 8 мг/кг лозартана и 0,8 мг/кг амлодипина) оказывают аддитивное эндотелиопротективное действие при однократном внутрижелудочном введении в течение 7 суток при моделировании как L-NAME-индуцированной, так и гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Таким образом, в работе впервые представлены убедительные доказательства необходимости дополнительной эндотелиотропной терапии с использованием L-норвалина и нового комбинированного антигипертензивного препарат «Блоктран А» для коррекции нарушений метаболического пути L-aprnHHH/NO.

Практическая значимость. В работе установлена и обоснована эффективность сочетанного применения L-норвалина с комбинированным препаратом «Блоктран А» для коррекции L-NAME- и гипергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте. Показано, что их со-четанное использование позволяет улучшать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитро-пруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), который в 5 раз увеличивается при L-NAME- и в 3 раза - при гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO) и повышение концентрации гомоцистеина.

Проведены целенаправленные доклинические исследования эндотелио-протективных эффектов препарата «Блоктран А» (производства ОАО «Фарм-стандарт-Лексредства», г. Курск) при ЭД.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания L-норвалина, препарата «Блоктран А», а также сочетанного применения L-норвалина и препарата «Блоктран А».

Внедрение результатов научных исследований. Данные экспериментального исследования, имеющие отношение к эндотелйо- и кардиопротектив-

ной активности Ь-норвалина и его комбинации с препаратом «Блоктран А» (производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», г. Курск), используются в обучающих лекционных курсах кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ФГАОУ ВПО НИУ БелГУ и кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фармации медицинского института ФГБОУ ВПО «Орловский государственный университет».

Личный вклад автора. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, проведены серии экспериментов, получены и обобщены результаты исследования, проведена статистическая обработка и анализ полученных данных (доля участия 100%).

В публикациях в соавторстве доля участия диссертанта более 80%.

В публикациях № 1, 2, 3 автором лично проведена статистическая обработка полученных результатов, № 5, 6, 7 - моделирование дизайна исследования, в публикации № 4, 5 - научное обоснование и обобщение полученных результатов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на 75-й и 76-й итоговых межвузовских научных конференциях студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2010, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2010, 2011), V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт-Петербург, 2010) молодежном научно-инновационном конкурсе «У.М.Н.И.К.» (Белгород, 2010), Всероссийском молодежном научно-инновационном форуме «Зворыкинский проект» (2010), на межвузовской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы фармакологии и фармации - 2011» (Белгород, 2011). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 2, анатомии человека, биологической химии, инфекционных болезней и эпидемиологии, НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета; фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ФГАОУ ВПО НИУ БелГУ. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ в том числе 7 работ в журналах, рекомендуемых ВАК для диссертационных работ.

Положения, выносимые на защиту

1. Лозартан калия 8 мг/кг, амлодипин 0,8 мг/кг, препарат «Блоктран А» (лозартан калия 8 мг/кг+ амлодипин 0,8 мг/кг) однократно в течение 7 суток оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь^АМЕ-индуцированной ЭД.

2. Ь-норвалин 10 мг/кг, сочетанное использование Ь-норвалина 10 мг/кг и препарата «Блоктран А» (лозартан калия 8 мг/кг + амлодипин 0,8 мг/кг) однократно в течение 7 суток оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЭД.

3. Лозартан калия 8 мг/кг, амлодипин 0,8 мг/кг, препарат «Блоктран А» (лозартан калия 8 мг/кг+ амлодипин 0,8 мг/кг) однократно в течение 7 суток оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели гипрегомоцистеин-индуцированной ЭД.

4. L-норвалин 10 мг/кг, сочетанное использование L-норвалина 10 мг/кг и препарата «Блоктран А» (лозартан калия 8 мг/кг + амлодипин 0,8 м'г/кг) однократно в течение 7 суток оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 183 источника, из них 77 отечественных и 106 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 20, рисунков — 29.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 230-270 г. Блокатор eNOS N-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно внутрибрюшинно один раз в сутки, в дозе 25 мг/кг.

Интактным животным ежедневно, один раз в сутки, в течение семи дней внутрижелудочно с помощью зонда вводили 1% крахмальный раствор в дозе 10 мл/кг.

Моделирование гипергомоцистенн-индуцированнон эндотелиальной дисфункции. Модель гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции начала применяться в нашей лаборатории недавно. Интерес к ней связан с тем, что, по данным литературы, повышенные плазменные уровни го-моцистеина являются фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний.

Эксперименты выполнены на белых крысах-самцах линии Wistar массой 230-270 г. Раствор для внутрижелудочного введения метионина готовили ех tempore с помощью растворителя ТВИН-80 и 1% крахмального раствора.

С целью моделирования эндотелиальной дисфункции метионин (ООО «Полисинтез», г. Белгород) вводили ежедневно, один раз в сутки, внутрижелудочно в дозе 3 г/кг в течение семи дней.

Контрольной группе животных ежедневно, один раз в сутки, в течение семи дней внутрижелудочно вводили 10% раствор ТВИН-80 в дозе 1 мл/кг.

Следует отметить, что при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции не происходило повышение АД, однако КЭД повысился до 3,3±0,3 (тогда как в контрольной группе животных данный показатель составил 0,9±0,2), уровень гомоцистеина в плазме крови увеличился более чем в б раз, снизилась концентрация нитрит-ионов.

Оценка эндотелийзависимых и эндотелнйнезависимых сосудистых реакций. На восьмые сутки от начала эксперимента животным под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей гемодинамики.

Проводили функциональные пробы (болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену): эндотелийзависимая ва-

зодилатация (ЭЗВД) в ответ на внутривенное введение раствора ацетилхолина в дозе 40 мг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного (Laursen J.B., 1997) и эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНВД) в ответ на внутривенное введение раствора нитропруссида натрия в дозе 30 мг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного (Галаган М.Е., 1991). Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и аппарата для инвазивного измерения показателей гемодинамики "Biopac" (США) и компьютерной программы AsqKnowIedge 3.8.2.

Степень ЭД у экспериментальных животных, а также степень ее коррекции исследуемыми препаратами оценивали по расчетному коэффициенту ЭД (КЭД). КЭД является отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ (Покровский М.В. и соавт., 2006-2012).

Проведение функциональных нагрузочных проб. Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика и аппарата для инвазивного измерения показателей гемодинамики "Biopac" (США) и компьютерной программы AsqKnowIedge 3.8.2 регистрировали показатели кардио-гемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления, (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности (Покровский М.В. и соавт., 2006-2012):

1. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1-I0"5 моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г массы тела животного). При проведении данной пробы проводилась оценка максимального подъема ЛЖД в ответ на введение адреналина.

2. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 секунд). После проведения данной пробы рассчитывался показатель исчерпания мио-кардиального резерва (выраженный в процентах), равный отношению прироста ЛЖД на 5-й секунде пережатия аорты к приросту ЛЖД на 25-й секунде пережатия аорты.

3. Трехминутная гипоксия посредством выключения аппарата искусственной вентиляции легких с последующей реоксигенацией.

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использованы модификация метода определения стабильных метаболитов NO (Метель-ская В.А., Туманова Н.Г., 2005) и определение концентрации гомоцистеина методом иммунотурбодиметрии с помощью набора фирмы Pliva-Lachema Diag-nostika.

Интегральный векторный анализ гемодннамических и биохимических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротекгивных эффектов исследуемых препаратов. Для комплексной оценки функционапь-

ных характеристик сосудистой реактивности, сократимости миокарда и нитро-ксидергической системы на основе интегрального анализа всего спектра проводимых исследований, мы представили значение каждого показателя в виде вектора. Все векторы, каждый из которых соответствовал определенной нагрузочной пробе, были построены на плоскости в прямоугольной декартовой системе координат Оху, полюсом для всех векторов было выбрано начало прямоугольной декартовой системы координат, полярной осью служило положительное направление оси Оу, длина вектора равнялась величине шести показателей комплексного функционального и биохимического исследования в изучаемых группах. Направление каждого вектора задавалось жестко, первый вектор -САД (систолическое артериальное давление) совпадал с осью Оу, последующие векторы располагались по часовой стрелке, угол между соседними векторами составлял 60°. Следующими векторами соответственно обозначены показатели - ДАД - диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндоте-лиальной дисфункции; Total NO - суммарное количество нитратов и нитритов; Гц - концентрация гомоцистеина; ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия). Координаты вектора каждой нагрузочной пробы изначально выражались как полярные (р0, ф0), где ра - полярный радиус, фа - полярный угол, переход от полярных координат к прямоугольным (х0, у0) осуществлялся по формулам: Хо = Ро COS ф0, Уо = Ро sin фо.

Площадь, векторной диаграммы рассчитывали по формуле:

где Б - площадь векторной диаграммы, х( и у,- — прямоугольные координаты соответствующих векторов, п - количество векторов.

Различия между соответствующими функциональными и биохимическими показателями при проведении исследований между изучаемыми группами животных отражаются площадью диаграмм, образованной соединением конечных точек векторов вышеуказанных показателей.

Дизайн эксперимента. Исследована эндотелио- и кардиопротективная активность ингибитора аргиназы Ь-норвалина, препарата «Блоктран А» и его компонентов (лозартана калия и амлодипина) и сочетанного применения Ь-норвалина и препарата «Блоктран А».

При выборе дозы препарата «Блоктран А» (производства ОАО «Фарм-стандарт-Лексредства», г. Курск) мы опирались на максимальные суточные дозы данного препарата и его компонентов. Данный подход был выбран в связи с тем, что при моделировании Ь^АМЕ-нндуцированной эндотелиальной дисфункции показатели артериального давления соответствовали клиническому понятию значительной артериальной гипертензии. Максимальная терапевтическая доза лозартана калия составляет 100 мг/сут, максимальная гипотензивная доза амлодипина - 10 мг/сут, максимальная терапевтическая доза препарата «Блоктран А» - 2 таб./сут (100 мг лозартана калия и 10 мг амлодипина). Следовательно, после расчета дозировок исследуемых препаратов с учетом соотно-

шения поверхности тела биологического объекта к его массе по общепринятой формуле межвидового переноса доз, с использованием коэффициентов пересчета в зависимости от массы тела (Freireich М. et al., 1966; Уланова И.П. и др., 1968) дозировка лозартана калия составила 8 мг/кг, амлодипина 0,8 мг/кг, что соответствует 0,16 таб./кг препарата «Блоктран А».

L-норвалин (WIRUD GmgH, Hamburg) вводился в дозе 10 мг/кг внутри-желудочно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет способность ингибировать фермент аргиназу.

При комбинированном использовании L-норвалина и препарата «Блоктран А» при L-NAME- и гипергомоцистеин-индуцированной ЭД использовались те же дозы, пути введения и такая же продолжительность применения.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней арифметической (+т) и вероятности возможной ошибки (Р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные, начиная с р<0,05. Для расчетов использовали программу для статистического анализа Microsoft Excel 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов лозартана калия, амлодипина и препарата «Блоктран А» при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Ежедневное, в течение семи дней, внутрибрюшинное введение L-NAME привело к статистически значимому повышению АД (рис. 1). Обнаружено, что изучаемые препараты достоверно снижали САД и ДАД, наиболее выраженный гипотензивный эффект был выявлен в группах животных, получавших препарат «Блоктран А» и лозартан калия в дозе 8 мг/кг, где уровень АД приближался к значениям САД и ДАД у интактных животных. В группе крыс, получавших амлодипин 0,8 мг/кг, отмечался частичный гипотензивный эффект, но показатели САД и ДАД не приближались к значениям интактных животных.

Препарат «Блоктран А» оказывал выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO. При этом КЭД составил 1,9±0,1. Обращает на себя внимание, что достоверного отличия в проявлении эндотелиопротективного эффекта компонентов препарата «Блоктран А» и собственно препарата «Блоктран А» не выявлено, так как КЭД при монотерапии лозартаном калия составил 2,1±0,2, а при монотерапии амлодипином -2,3±0,4.

Исследуемые препараты предотвращали повышение адренореактивности у животных с моделированием L-NAME-индуцированной патологии. Так, в группе L-NAME + лозартан калия ЛДЖ составило 209,6±4,0; L-NAME + амлодипин - 228,3+5,5; L-NAME + «Блоктран А» - !90,9±7,9, тогда как в группе L-NAME - 247,3±4,8, а у интактных - 199,2±8,3 мм рт.ст.

Рис. 1. Функциональные и биохимические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс. Примечание. I -- интактные, 2 - Ь^АМН, 3 — лозартан калия. 4 - амлодипин, 5 — «Блоктран А», * - (р<0,05) - достоверность различий в сравнении с интактными, **- р<0,05 в сравнении с Ь-ЫАМЕ.

Проба на адренореактивность (мм рт.ст.)

Нагрузка сопротивлением (%)

Концентрация стабильных метаболитов N0 (мкМ оль/л)

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением исследуемые препараты предотвращали исчерпание миокардиального резерва. Так, на 25-й секунде проведения пробы данный показатель в контрольной группе животных со-

ставил 83,6±4,6%. В группе животных, получавших Ь-ЫАМЕ, - 65,0±4,3%. Тогда как результату животных, получавших «Блоктран А», составил 84,2±3,4%, а у животных с введением лозартана калия и амлодипина - 79,2±5,0% и 82,4±3,2% соответственно.

Моделирование Ь^АМЕ-индуцированной ЭД привело к уменьшению концентрации стабильных метаболитов оксида азота в 1,9 раза. Следует отметить, что статистически значимого увеличения концентрации стабильных метаболитов оксида азота для исследуемых препаратов не обнаружено.

Таким образом, результаты функциональных проб и биохимических исследований выявили усиление эндотелио- и кардиопротективного действия препарата «Блоктран А» по сравнению с монотерапией лозартаном калия и ам-лодипином при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЭД.

2. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов Ь-норвалина, препарата «Блоктран А» и их комбинации при моделировании Ь^АМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Обнаружено, что Ь-норвалин в качестве монотерапии не влиял на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД достоверно не отличались от таковых значений в группе животных с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции. При применении препарата «Блоктран А» и комбинации препарата «Блоктран А» с Ь-норвапином обнаружено статистически значимое снижение артериального давления. Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг и препарат «Блоктран А» обладали эндотелиопротективным действием, выразившимся в предотвращении повышения коэффициента эндотелиальной дисфункции. Комбинированное применение препарата «Блоктран А» и Ь-норвалина привело к более оптимальному снижению коэффициента эндотелиальной дисфункции (рис. 2).

При проведении пробы на адренореактивность установлено статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД в сериях экспериментов с препаратом «Блоктран А» и сочетанным использованием Ь-норвалина и препарата «Блоктран А». Исследуемые препараты предотвращали исчерпание миокарди-ального резерва. Обнаружено, что в группе животных, получавших Ь-норвалин в качестве монотерапии, этот показатель составил 87,6%. В группе животных, получавших препарат «Блоктран А» - 84,2% и комбинацию препарат «Блоктран А» + Ь-норвалин - 86%. В группе животных, получавших комбинацию Ь-норвапина и препарата «Блоктран А», обнаружено статистически значимое увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота, что наряду с нормализацией эндотелийзависимой вазодилатации говорит о выраженном эн-дотелиопротективном действии исследованной комбинации.

Таким образом, комбинацию Ь-норвалина и препарата «Блоктран А» на модели Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции следует рассматривать как оправданную и рекомендовать к широкому клиническому изучению.

Ь^АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота у крыс.

Примечание. 1 интактные, 2 - Ь-ЫАМЕ, 3 - Ь-норвалин, 4 - «Блоктран А», 5 - 1_,-норвалин+«Блоктран А», * - (р<0,05) - достоверность различий в сравнении с интакт-ными, ** — р<0,05 в сравнении с Ь-^АМЕ.

3. Исследование эндотелио- и кардиопротекгнвных эффектов лозартана калия, амлодипина и препарата «Блоктран А» при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Обнаружено, что изучаемые препараты не влияли на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД, достоверно не отличались от таковых значений животных контрольной группы во всех сериях экспериментов (рис. 3).

Все исследуемые препараты в обозначенных дозировках обладали выраженным эндотелиопротективным действием, выражающимся в статистически значимом предотвращении повышения коэффициента эндотелиальной дисфункции.

Анализ полученных экспериментальных данных позволил установить, что исследуемые препараты статистически значимо уменьшали максимальное ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность. Амлодипин и препарат «Блоктран А» полностью предотвращали гипергомоцистеин-индуцированное повышение адренореактивности, и значение ЛЖД при проведении пробы в данных группе животных составило: для амлодипина - 185,6±7,4 мм рт.ст., для препарата «Блоктран А» - 182,5±9,5 мм рт.ст. (в контрольной группе животных данный показатель составил 189,7±9,1 мм рт.ст.

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением лозартан калия, амлодипин и препарат «Блоктран А» предотвращали падение сократимости с 5-й на 25-ю секунду пережатия аорты.

Применение лозартана и препарата «Блоктран А» привело к выраженному и статистически значимому снижению концентрации гомоцистеина в соответствующих группах экспериментальных животных. Концентрация гомоцистеина составила соответственно: 30,6±3,1 мкМоль/л и 24,8±2,2 мкМоль/л. Однако уровень гомоцистеина в сыворотке крови животных указанных групп оставался в 2-2,5 раза выше таковых значений контрольной группы животных (8,6±0,4 мкМоль/л). Применение амлодипина не приводило к статистически значимому снижению концентрации гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных.

Обнаружено, что исследуемые препараты оказывают статистически значимое влияние на увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота. Однако значения ТЧОх (90,1±2,2 мкМоль для лозартана; 88,6±1,7 для амлодипина и 102,3±4,1 мкМоль для препарата «Блоктран А») далеки от соответствующих значений в контрольной группе животных (121,2±12,1 мкМоль).

Таким образом, результаты функциональных проб и биохимических исследований выявили усиление эндотелио- и кардиопротективного действия препарата «Блоктран А» по сравнению с монотерапией лозартаном калия и ам-лодипином при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

Рис. 3. Функциональные и биохимические показатели при моделировании ги-пергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота у крыс. Примечание. I - ТВИН-80, 2 - метионин, 3 - лозартан калия, 4 - амлодипин. 5 - «Блоктран А». * - (р<0,05) - достоверность различий в сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН-80; ** - р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших метионин.

Концентрация стабильных метаболитов N0 (мкМоль/л)

Коэффициент эндотелиальной дисфункции (усл.ед.)

Проба на адренореактивность (мм рт.ст.)

Нагрузка сопротивлением (%)

Концентрация гомоцистеина (мкМоль/л)

Артериальное давление (мм рт.ст.)

4. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов Ь-норвалина, препарата «Блоктран А» и их комбинации при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Обнаружено, что изучаемые препараты не влияли на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД достоверно не отличались от таковых значений животных контрольной группы во всех сериях экспериментов (рис. 4).

Обработка полученных экспериментальных данных позволила установить что Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг и препарат «Блоктран А» предотвращали повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции. Комбинированное применение Ь-норвалина и препарата «Блоктран А» привело к более оптимальному снижению коэффициента эндотелиальной дисфункции, значения которого в указанных группах приближались к таковым в контрольной серии экспериментов.

Анализ полученных экспериментальных данных позволил установить статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность во всех сериях экспериментов.

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением Ь-норвалин, препарат «Блоктран А» и их комбинация предотвращали падение сократимости с 5-й на 25-ю секунду пережатия аорты Наиболее выраженное предотвращение исчерпания миокардиального резерва обнаружено в группе животных, получавших комбинацию Ь-норвалина и препарата «Блоктран А» (88,8±4,2), где данный показатель оказался выше, чем в контрольной группе животных (85,4±3,1).

Применение препарата «Блоктран А» и комбинации Ь-норвалина и препарата «Блоктран А» привело к статистически значимому снижению концентрации гомоцистеина в соответствующих группах экспериментальных животных.

Концентрация гомоцистеина составила соответственно: 24,8± 2,8 мкМоль/л, 18,4±3,1 мкМоль/л. Ь-норвалин также снижал уровень гомоцистеина в сыворотке крови крыс, но данный показатель достоверно не отличался от группы животных с гипергомоцистеин-индуцированной патологией.

Обнаружено, что все препараты и их комбинации, исследованные в данной серии экспериментов, оказывают статистически значимое влияние на увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота.

Концентрация нитрит-ионов (ТЧОх) под влиянием комбинации Ь-норвалина и препарата «Блоктран А» увеличивалась в большей степени, чем в других группах животных.

Таким образом, комбинацию Ь-норвалина и препарата «Блоктран А» на модели гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции следует рассматривать как оправданную и рекомендовать к широкому клиническому изучению.

пергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота у крыс. Примечание. I - ТВИН-80, 2 - метионин, 3 - Ьнорвалин, 4 - «Блоктран А», 5 - Ь-норвалин+«Блоктран А», * - (р<0,05) достоверность различий в сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН-80; ** - р<0,05-в сравнении с группой животных, получавших метионин.

5. Интегральный векторный анализ гемодинамических и биохимических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротектив-ной активности сочетанного применения Ь-норвалина и препарата «Блок-тран А».

Исследуемые препараты оказывали выраженный антигипертензивный эффект на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, характеризующейся развитием стойкой АГ.

При моделировании гипергомоцистеин-индуцированной ЭД не наблюдалось развитие АГ и исследуемые препараты не влияли на исходные показатели гемодинамики. Поэтому для данной модели патологии нами был проведен интегральный векторный анализ гемодинамических и биохимических показателей. Он представляет собой визуальную комплексную характеристику состояния сердечно-сосудистой системы, отражая отличия между группами в степени изменения параметров АД, КЭД, исчерпании миокардиального резерва, МО-продуктивной активности эндотелия, а также способности снижать уровень го-моцистеина.

Векторные значения выбранных показателей были представлены в процентном соотношении от соответствующих значений контрольной группы животных, принятых за 100%, площадь векторных диаграмм выражалась в условных единицах (усл.ед.).

Сравнивая площади векторных диаграмм, мы получили выраженные различия между контрольной группой животных, животных с моделированием ги-пергомоцистеин-индуцированной ЭД и групп животных с фармакологической коррекцией лозартаном калия, амлодипином, препаратом «Блоктран А», Ь-норвалином, также сочетанным применением Ь-норвалина и препарата «Блоктран А». В контрольной группе животных этот показатель составил 5,78±0,51; в группе с моделированием гипергомоцистеин-индуцированной ЭД - 12,2±0,47; в группе с дополнительным введением лозартана - 8,14±0,39; в группе амлодипина - 9,33±0,53; препарата «Блоктран А» - 7,52±0,60; Ь-норвалина - 9,55±0,43; а для комбинации Ь-норвалина и препарата «Блоктран А» - 6,77±0,55 усл.ед. (рис. 5).

Анализируя площади векторных диаграмм по совокупности эндотелио- и кардиотропных эффектов исследуемых лекарственных средств для коррекции гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, следует отметить возрастание активности фармакологической коррекции метаболического пути Ь-аргинина/ЫО при сочетанном использовании Ь-норвалина и препарата «Блоктран А».

Дальнейший анализ данного сочетания позволяет рассчитать дельту ад-диции (Дадд= 8Ь-норвалин - 8Ь-норвалин+препарат «Блоктран А») и её вероятностный процент (Радд), рассчитываемый по формуле: Радц=Дадд /Дмет * 100%. При проведении расчётов получаем.следующие данные: дельта аддиции комбинации равна - Дадд= вЬ-норвалин - ЭЬ-норвалин+препарат «Блоктран А») - 9,55 - 6,77 = 2,78 (усл.ед.); дельта гипергомоцистеин-индуцированной ЭД: Дмет= Змет-8контроль=12,20 - 5,78 = 6,41 (усл.ед.).

Total NO

Теин SO S = 5,78±0,51

Total NO

Амлодипин S=9,33±0,53

Метионин

S-12,20±0,47

Total NO

ПА5-25,

Total NO

Лозартан калия

ДАД

'КЭД

S = 8,14*0,39

САД

500,0 -г 400,0 -•

ПА 5-25/. ■■

КЭД

Total NO препарат «Блоктран А»

S =7,52*0,60

ПА 5-25.

ДАД

'КЭД

Total NO

L-норвалик

S=9,55±0,43

500,0 400,0

ПА 5-25/ 30t>-°

САД

Total NO

L-норвалин + препарат «Блоктран А» S = 6,77±0,55

Рис. 5. Площади векторных диаграмм функциональных и биохимических показателей при коррекции гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции лозартаном калия, амлодипином, препаратом «Блоктран А», L-норва-лином и сочетанным применением L-норвалина и препарата «Блоктран А». Примечание. САД - систолическое артериальное давление; ДАД - диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; Total NO - суммарное количество нитратов и нитритов; Гц - концентрация гомоцистеина; ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия).

После проведения соответствующих расчётов вероятностный процент ад-дицни получается равным 43,4%, что упрощённо, но иитегративно описывает вклад Ь-норвалина при комбинированном использовании его с препаратом «Блоктран А» для коррекции гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

Таким образом, приведенные результаты наглядно демонстрируют, что интегральный векторный анализ гемодинамических и биохимических показателей визуализирует значительную степень нарушений реактивности сосудистой стенки и кардиодинамики, а также возможность фармакологического воздействия при моделировании нарушения метаболического пути Ь-аргинина/ЫО.

ВЫВОДЫ

1. Лозартан калия (8 мг/кг), амлодипин (0,8 мг/кг), Ь-норвалин (10 мг/кг) и препарат «Блоктран А» (лозартан калия 8 мг/кг + амлодипин 0,8 мг/кг) внут-рижелудочно однократно в течение семи суток проявляли эндотелио- и кар-диопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЭД. Наиболее эффективное снижение КЭД обнаружено в группе животных, получавших препарат «Блоктран А». Препарат «Блоктран А» статистически значимо увеличивал концентрацию стабильных метаболитов оксида азота, в сравнении с монотерапией лозартаном калия, амлодипином и Ь-норвалином. Обнаружено предотвращение повышения адренореактивности и исчерпания миокардиалыюго резерва под влиянием всех исследуемых препаратов.

2. Сочетанное применение Ь-норвалина (10 мг/кг) и препарата «Блоктран А» (лозартан калия 8 мг/кг + амлодипин 0,8 мг/кг) внутрижелудочно однократно в течение семи суток оказывало выраженное эндотелиопротективное действие по сравнению с монотерапией Ь-норвалином и препаратом «Блоктран А», что выражапось в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания стабильных метаболитов оксида азота. Выявлена способность данной комбинации предотвращать повышение адренореактивности и исчерпание миокардиалыюго резерва.

3. Лозартан калия (8 мг/кг), амлодипин (0,8 мг/кг), Ь-норвалин (10 мг/кг) и препарат «Блоктран А» (лозартан калия 8 мг/кг + амлодипин 0,8 мг/кг) внутрижелудочно однократно в течение семи суток оказывали эндотелиопротективное действие при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной ЭД, выражающееся в снижении КЭД и нормализации сосудистых реакций. Лозартан калия и препарат «Блоктран А» в изученных дозах статистически значимо предотвращали снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота и повышение концентрации гомоцистеина. Наиболее выраженное кардиопротек-тпзное действие обнаружено в группе животных, получавших препарат «Блок-Tpr.ii А», что проявлялось в снижении адренореактивности, предотвращении исчерпания миокардиалыюго резерва.

4. Сочетанное применение Ь-норвапина (10 мг/кг) и препарата «Блоктран А» (лозартан калия 8 мг/кг + амлодипин 0,8 мг/кг) внутрижелудочно однократно в течение семи суток оказывало дополнительное эндотелиопротективное действие на модели гипергомоцистеин-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания стабильных метаболитов оксида азота и повышения концентрации гомоцистеи-на. По результатам нагрузочных проб выявлена способность комбинации Ь-норвапина и препарата «Блоктран А» предотвращать повышение адренореак-тивности и исчерпание миокардиального резерва.

5. Расчет вероятностного коэффициента аддиции показывает, что комбинация Ь-норвалина (10 мг/кг) и препарата «Блоктран А» (лозартан калия 8 мг/кг + амлодипин 0,8 мг/кг) проявляла положительное фармакодинамическое взаимодействие на модели гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Эндотелиопротективные эффекты сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалина и фиксированной комбинации амлодипииа и лозартана в одной таблетке / Е.Г. Терехова, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская |и др.| // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - 2011. - № 22 (117), вып. 16/2. - С. 42-45.

2. Кардио- и эндотелиопротективные эффекты ингибитора аргиназы L-норвалина при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота/ С.А. Цепелева, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Г. Терехова |и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - JY® 4 (127).-С. 185-188.

3. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида в одной таблетке при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте / A.B. Бабко, М.В. Покровский, Е.Г. Терехова |и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 4 (127). - С. 19-24.

4. Влияние сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалина и фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида в одной таблетке на эндотелиальную дисфункцию при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / A.B. Бабко, М.В. Покровский, Е.Г. Терехова [и др.| // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - Л» 4 (127). - С. 24-29.

5. Влияние фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиа-зида в одной таблетке на эндотелиальную дисфункцию при моделировании гипергомоцистсин-индуцнрованного дефицита оксида азота / М.В. Покровский, А.В. Бабко, М.В. Корокин, Е.Г. Терехова |и др.| // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 4 (127). - С. 151-156.

6. Изучение эффектов фиксированной комбинации лозартана и гид-рохлоротиазида в одной таблетке при моделировании L-NAME-нндуцированной эндотелиальной дисфункции / А.В. Бабко, Е.Г. Терехова, М.В. Покровский |и др.| // Научные ведомости Белгородского государственного университета. -2011. - № 22 (117), вып. 16/2. - С. 16-21.

7. Роль сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалнна и фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида в одной таблетке в коррекции L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / А.В. Бабко, Е.Г. Терехова М.В. Покровский |и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - 2011. - № 22 (117), вып. 16/2.-С. 22-27.

8. Эндотелиопротективные эффекты сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалина и фиксированной комбинации лозартана и амлодипи-на при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / Е.Г. Терехова, А.В. Бабко, М.В. Корокин [и др.] П Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. тр. IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Курск, 6-7 июня 2011 г. / Курский гос. мед. ун-т. - Курск, 2011. - С. 145.

9. Эндотелиопротективные эффекты фиксированной комбинации лозартана и амлодипина при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / Е.Г. Терехова, А.В. Бабко, М.В. Корокин [и др.] // Биотехнология и биомедицинская инженерия: сб. тр. IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Курск, 6-7 июня 2011 г. / Курский гос. мед. ун-т. - Курск, 2011. -С. 144.

10. Arginase inhibitor in the pharmacological correction of endothelial dysfunction / M.V. Pokrovskiy, M.V. Korokin, S.A. Tsepeleva, E.G. Terehova [et al.] // Int. J. Hypertens. - 2011. - Vol. 2011. - Art. ID 515047.

I I. Роль ингибитора аргиназы в коррекции гомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции / С.А. Цепелева, М.В. Корокин, A.C. Белоус, Е.Г. Терехова [и др.] // Молодежная наука и современность : материалы 76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, Курск, 19-20 апр. 2011 г. / Курский гос. мед. ун-т, Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, Рос. акад. естеств. наук. - Курск, 2011. - С, 298.

12. Эндотелио- и кардиотропные эффекты L-норвалина в эксперименте / С.А. Цепелева, A.C. Белоус, О.С. Гудырев, Е.Г. Терехова [и др.] // Молодежная наука и современность : материалы 76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, Курск, 19-20 апр. 2011 г. / Курский гос. мед. ун-т, Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, Рос. акад. естеств. наук. - Курск, 2011.-С. 299.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление АХ - ацетилхолин

ДАД - диастолическое артериальное давление ГЦ - гомоцистеин

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛЖД - левожелудочковое давление

НИ - нитропруссид натрия

ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением

САД - систолическое артериальное давление

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭЗВД - эндотелийзависимая вазодилатация

ЭНВД - эндотелийнезависимая вазодилатация

ЭД - эндотелиапьная дисфункция

Ь^АМЕ-]ч[-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир

N0 - оксид азота

N0* - концентрация нитрит-ионов

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

р - уровень статистической значимости * - достоверность различий, р<0,05

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 12.04.20)2 г. Подписано в печать 16.04.2012 г. Формат 30х42'/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 196"А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.