Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Противоишемическое и эндотелиопротективное действие потенцированных антител к эндотелиальному фактору роста сосудов

АРУСТАМОВА Анна Александровна

ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКОЕ И ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПОТЕНЦИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ К ЭНДОТЕЛИАЛЬНОМУ ФАКТОРУ РОСТА СОСУДОВ

Специальность 14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биолопиеских наук

1 2 МАЙ 2011

Белгород - 2011

4846102

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Покровский Михаил Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шапошников Андрей Александрович

доктор биологических наук, профессор Сергеева Светлана Александровна

Ведущая организация: Учреяздение Российской академии наук

«Институт физиологически активных веществ РАН»

Защита состоится £ мая 2011 г. в часов на заседании совега но защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.015.13 при Белгородском государственном национальном исследовательском университете но адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85, корп. 17, зал диссертационных советов.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Автореферат разослан » 2011 г.

Учёный секретарь

совета по защите докторских и кандидатских /; ,

диссертаций, доктор биологических наук /с С/ В.И. Кочкаров

'¿Г'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема изучения возможностей фармакологической коррекции сердечно-сосудистых заболеваний является одной из важнейших задач современной медицины. Эндотелиальная дисфункция (ЭД) является одним из ведущих патогенетических звеньев атеросклероза, артериальной гипертензии (АГ), легочной пшертензии, дилатационной кардиомиопатии, гипергомоцистеинемии и др. (Laufs U., 1998; Белоусов Ю.Б., Намсараев Ж.Н., 2006).

Оксид азота II (NO) - ведущий гуморальный эндотелиальный модулятор дилатации. Фактор вырабатывается эндотелиоцитами (Dzau V.J., 2001). Основным механизмом, лежащим в основе ЭД, является снижение образования и биодоступности NO и продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х.М., 2005).

Лечение хронической артериальной недостаточности нижних конечностей остаётся одной из центральных проблем в ашиотерашш вследствие широкой распространённости данной патологии, неуклонно прогрессирующего течения, высокой степени инвалидизации (Чичерин И.Н., 1996).

В последние 30 лег целью многих исследований стало изучение возможности нормализации кровообращения нижних конечностей путем стимуляции ангиогенеза - процесса развития капиллярной сети от уже существующих сосудов.

Эндотелиальный фактор роста сосудов VEGF индуцирует экспрессию эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) и образование NO, который является регулятором функции эндотелия и медиатором ангиогенеза. VEGF - это гликопротеин, связывающийся только с эндотелиоцитами и стимулирующий их пролиферацию. Этот фактор усиленно продуцируется клетками некоторых опухолей человека, способствуя их неоваскуляризации (Ferrara N., 1999).

Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения ЭД является важной клинико-экспериментальной задачей, однако в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции. Одной из важных точек приложения терапевтического воздействия при ЭД является восстановление дефицита NO, которое возможно путем активации фермента eNOS (Бабак О.Я., 2004).

В настоящее время большое внимание уделяется препаратам на основе сверхмалых доз антител (потенцированных антител) к эндогенным регуляторам. Данные препараты обладают выраженной фармакологической активностью при содержании действующего вещества в сверхмалых дозах (менее 10"24 моль/л) (Сергеева С.А., Эпштейн О.И., 2003).

В гомеопатии применяют сверхразбавленные растворы, подвергшиеся особому процессу - потенцированию, представляющему собой последовательное разведение исходного раствора в сочетании с внешним физическим воздействием (механическое встряхивание, обработка с помощью звукового генератора и др.). Не подвергшиеся процессу потенцирования растворы, содержащие сверхмалые дозы антител (при разбавлении выше числа Авогадро), биологической активностью не обладают (Эпштейн О.И., 2000).

Антитела в сверхмалых дозах (СМД) к эндогенному регулятору не подавляют активность молекулы, а модифицируют ее. Этот феномен, открытый О.И. Эпштейном, М.Б. Штарком, воспроизведен в экспериментальных исследованиях, проведенных в НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН и НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАН, как на молекулярном, так и на системном уровнях с рядом антител.

Как свидетельствуют литературные данные, перспективность в фармакологической коррекции ЭД отводится препарату «Импаза», представителю универсальных регуляторов гомеостаза, в состав которого входят потенцированные антитела к eNOS. Способ лечения данным препаратом заключается в активизации по механизму «обратной связи» выработки контрантител для ликвидации дисбаланса при сниженном количестве eNOS.

Учитывая вышеприведённые данные и свойства VEGF как индуктора экспрессии eNOS и медиатора ангиогенеза, можно предположить, что потенцированные антитела к фактору роста эндотелия VEGF будут обладать противошпемическим и эндотелиопротективным действием вследствие активации ими по принципу «обратной связи» выработки VEGF.

В связи с вышеизложенным явилось актуальным изучение эндотелиотропного и противоишемического действия смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF.

Цель исследования: провести оценку эндотелио- и кардиотропною действия при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции потенцированных антител к VEGF в сравнении с потенцированными антителами к eNOS и их влияния на ашиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Разработать комплекс методических подходов для оценки эндотелиотропного действия фармакологических агентов с изменением режима введения N-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 12,5 мг/кг однократно внутрибрюшинно ежедневно в течение 28-ми суток.

2. Изучить эндотелиопротективную активность смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. (ООО «НПФ Материа-Медика Холдинг», Россия) при моделировании L-NAME-индуциронашюй ЭД.

3. В сравнительном аспекте изучить эндотелиопротективную активность смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) (ООО «НПФ Материа-Медика Холдинг», Россия) при моделировании L-NAME-ицдуцированной ЭД.

4. Исследовать влияние смеси растворов гомеопатичесикх разведений моноклональных антител к VEGF - С12, СЗО, С200 на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

5. В сравнительном аспекте изучить влияние смеси растворов гомеопатичесикх разведений поликлональных кроличьих антител к eNOS -

С12, СЗО, С200 на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Научная новизна исследования. В работе впервые показано, что смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF (С 12, СЗО, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов СМД антител к eNOS (С 12, СЗО, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. интрагастрально в качестве монотерапии на лабораторных крысах оказывают эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированной ЭД, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД).

Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF (Cl2, СЗО, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов СМД антител к eNOS (С 12, СЗО, С200) в дозе 9 Mjj/кг/сут. ишрагас'фально в качестве монотерапии оказывают кардиопротективное действие на 2 8-дневной модели L-NAME-индуцированной ЭД. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «ншрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME - индуцированной патологией.

В работе впервые показано, что смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF (Cl2, СЗО, С200) в дозе 9 мл/кг/суг. и смесь растворов СМД к eNOS (С 12, СЗО, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. интрагастрально в качестве монотерапии позволяют компенсировать признаки хронической ишемии конечности. Результаты, полученные при проведении ЛДФ, подтверждаются данными морфологического исследования: в мышцах ишемизированной голени некротические изменения не обнаруживались. У всех животных этих групп отмечалось усиленное новообразование капилляров.

Подано 3 заявки на изобретения по результатам проведенных экспериментальных исследований:

- Способ коррекции L-NAME - индуцированной эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, СЗО, С200;

- Способ фармакологической коррекции ишемии конечности смесью растворов гомеопатических разведений;

- Способ фармакологической коррекции ишемии конечности.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность

применения смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - Cl2, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) и смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - Cl2, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) в качестве монотерапии для коррекции L-NAME-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что их использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитроируссид нагрия (эндогелийнезависимая вазодилатация) с увеличением КЭД в 3 раза, предотвратить снижение показателей

биохимических маркеров (Total NO), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания исследуемых гомеопатических разведений при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией, и хронической артериальной недостаточности нижних конечностей.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиотропной и противоишемической активности стимулятора VEGF и стимулятора eNOS, используются в «Материа Медика Холдинг» с целью формирования представления о фармакологической активности данных гомеопатических разведений.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2010 г., XVII Российском национальном кошрессе «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО, анатомии и гистологии человека, биохимии и фармакологии, фармацевтической химии и фармакогнозии, фармацевтической технологии, управления и экономики здравоохранения, акушерства и гинекологии, медико-биологических дисциплин БелГУ. По материалам диссертации опубликовано В печатных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - Cl 2, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. при ежедневном инграгастральном введении оказывают в качестве монотерапии эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированной ЭД, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME - индуцированной патологией.

2. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - Cl 2, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. при ежедневном инграгастральном введении в качестве монотерапии увеличивают показатели микроцикуляции в ишемизированной конечности на 28-е сутки за счет уменьшения очага некроза и стимуляции неоангиогенеза. На фоне фармакологической коррекции ишемии мышцы голени уровень микроциркуляции достоверно возрастает (р<0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе животных.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 152 источника, из них 79 отечественных и 73 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 10, рисунков - 39, схем -1.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. N-HHTpo-L-apniHHH метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 12,5 мг/кг/сут. На 29 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса МР100, производства Biopac System, Inc., США. Функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилатация - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг (Laursen J.B., 1997), эндотелийнезависимая вазодилатация - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP 100, производства Biopac System регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), ЧСС и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение ЧСС и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт. ст. х уд. мин).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение 0,9% раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) (Тюренков И.Н., 2005).

2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 10"5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) (Меерсон Ф.З., 1980).

3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек (Меерсон Ф.З., 1980).

4. 3-минугную гипоксию (Пашин E.H., 1993).

Биохимические маркеры эндотелнальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов N0 (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005).

Моделирование хронической ишемии задней конечности. Осуществляли под наркозом хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг после соответствующей подготовки кожи. Затем производили разрез по внутренней поверхности области бедра. Рассекали собственную фасцию. Выделяли элементы основного сосудисто-нервного пучка бедра. Бедренную артерию отделяли от вены и нерва, мобилизовали. Затем накладывали лигатуры на артерию в месте ее начала и пересекали. Перевязывали и пересекали а. saphena. Выделяли подколенную артерию и начальные отделы артерий голени, которые пересекали. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени удаляли. Рану на бедре послойно ушивали непрерывным швом.

Данная модификация модели приводит к развитию ишемии более тяжёлой степени. Методика моделирования описана в работах S. Takeshita et. al.

Оценка уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс осуществлялась методом лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ). Исследование осуществляли при помощи аппарата - лазерный доплеровский флоуметр «Biopac-systems MP 100» и датчика «TSD-144». Исследование проводили под наркозом хлоралгидрат (300 мг/кг). После наступления наркотического сна иссекали участок кожи в передне-наружном участке области правой голени до собственной фасции. Датчик вплотную приставляли к мышце и проводили запись кривой микроциркуляции. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках: 1) середина длины мышцы, точка на 3-4 мм 2) выше, 3) ниже, 4) латеральнее, 5) медиальнее относительно первой. Запись кривой микроциркуляции проводили в течение 30 сек в каждой точке. Из полученных пяти значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в мышцах голени у данного животного.

Методы морфологического исследования. Для морфологического исследования после выведения животных из эксперимента производили забор материала органов: сердце, почки, участок мышцы голени. Материал фиксировали в 10% растворе формалина. Сердца рассекали через середину во фронтальной плоскости в виде пластин толщиной 2 мм, в которых содержались оба предсердия, правый и левый желудочки, межжелудочковая перегородка. Кусочки почек вырезали в поперечном направлении строго через центральную часть, включающую почечный сосочек. Окраску срезов гематоксилином и эозином производили в автоматическом режиме в автостейнере HMS 740 (Microm Int. GmbH, Германия). Определяли диаметры кардиомиоцитов левого желудочка, кровеносных сосудов, в почках измеряли диаметры почечных клубочков. Просмотр, анализ и морфометрию осуществляли с помощью программы просмотра и анализа изображений Mirax Viewer 1.12.

Дизайн эксперимента. Исследована эндотелиотропная и противоишемическая активность потенцированных антител к эндотелиальному фактору роста сосудов VEGF в сравнении со СМД антител к eNOS.

Данные разведения крысы получали внутрижелудочно из расчёта 9 мл/кг/сут. В хроническом эксперименте при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита N0 смеси растворов гомеопатических разведений вводились ежедневно в дозе 4,5 мл/кг 2 раза в сутки в течение 28 дней через 30 минут после введения L-NAME.

С целью коррекции экспериментальной ишемии конечности исследуемые гомеопатические разведения вводили в дозе 4,5 мл/кг 2 раза в сутки в течение 28 дней. Доза 9 мл/кг/сут. внутрижелудочно ежедневно в виде смеси гомеопатических разведений С12+С30+С200 выбрана нами в сотрудничестве с «Материа Медика», исходя из максимально допустимого объёма жидкости при внутрижелудочном введении лабораторному животному.

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на лабораторных крысах.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±ш) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Длительное, в течение 28 суток, однократное внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 12,5 мг/кг привело к стойкому повышению артериального давления (рис. 1).

Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелийза-висимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группе с L-NAME-индуцированной патологией в отличие от интакт-ных животных. На рисунке 2а - верхняя кривая - АД систолическое, далее -АД диастолическое и ЧСС. Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением АД и брадикардией. После окончания миокардиального компонента АД восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления АД рассматривался как площадь эндотелиальной реакции.

На рис. 26 представлена реакция на ацетилхолин при моделировании L-NAME-индуцированной ЭД. При этом видно, что площадь эндотелий-зависимой реакции в несколько раз меньше, чем у интактных животных.

Аналогично оценивали эндотелийнезависимую реакцию на нитропруссид. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в площадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис. 3).

400 350 300 5 250 а. 200 I 150 100 50 0

300 250 200 150 100 50

АД

-1

ДАД 164 '

104 ,

139 САД * 205 :!

/

интактные

Ь-ЫАМЕ

281,1*

3,5 3 2,5

5 2 о

* 1,5 1

0,5 0

3,5*

1,2

□ интактные ■ [_-МАМЕ I

Проба на адренореактивность

Нагрузка сопротивлением

]□ интактные □ [_-МАМЬ

140 120 100 80 60 40 20 0

1\Ог"

м

41,7*

125,8

Ь-ЫАМЕ интактные

ДМ

15,14*

СИ-МАМЕ ■ интактые

Рис. 1. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0. Примечание: * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных.

эндотелийзависимую вазодилатацию (внутривенное введение ацетилхолина 40 мкг/кг) у интактных животных.

Треугольники над кривой артериального давления - объяснение по тексту.

| Рис. 3. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эндотелийнезависимую вазодилатацию (внутривенное введение нитропруссида ' натрия 30 мкг\кг) у интактных животных.

| Треугольники над кривой артериального давления - объяснение по тексту.

Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к I площади среднего артериального давления на ацетилхолин.

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,2, | при ^ЫАМЕ-индуцированном дефиците N0 - в 3 раза больше: ею значение составило 3,5 (рис. 1). Ь-ЫАМЕ-индуцированный дефицит N0 привёл к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивносгь и снижению миокардиалъного резерва в пробе на1рузки сопротивлением (рис. 1). У интактных животных ЛЖД к 25 секунде снижалось до 93,9%, а у животных с

Ь^АМЕ-индуцированной патологией значительно сильнее - до 67,5%.

Характерная динамика биохимических маркеров Ь^АМЕ-индуцированного дефицита N0 представлена на рис. 1. Обнаружено, что моделирование Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологии приводило к снижению содержания нитрит-ионов в 3 раза.

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие Ь^АМЕ-индуцированной ЭД, явились результаты морфологических исследований (рис. 4). На представленных гистологических препаратах, рис. 4а - интактные миокардиоциты, рис. 46 - миокардиоциты животных на 28-е сутки с Ь^АМЕ-индуцированной патологией. Наглядно видно, что площадь поперечного сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер при одном увеличении. Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,91 мкм, а у животных, получавших Ь-ЫАМЕ,- 15,14 мкм (рис. 1).

,п

! /I

С V

V

А'

Рис.

* » I

4. Морфология

миокарда у интактных и опытных животных:

А - гистологическая картина миокарда у интактных крыс на поперечном срезе; Б - гипертрофия кардиомиоцитов и их ядер у крысы с артериальной гипертензией в модели с Е-ЫАМЕ на поперечном срезе. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х400.

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артерий (рис. 5). У интактных животных (а) -клетки эндотелия расположены плоско, при Е^АМЕ-патологии (б) - сосуд спазмирован, стенки утолщены, эндотелий «вздыблен».

Таким образом, ежедневное в течение 28-ми суток внутрибрюшинное введение Е-ЫАМЕ в дозе 12,5 мг/кг массы тела животного вызывает развитие ЭД, характеризующейся резким увеличением КЭД, АД, повышением адренореактивности, характерными биохимическими сдвигами и гистологической картиной гипертрофии миокарда и гиперплазии сосудистого русла.

Рис. 5. Морфологическая картина крупных почечных артерий у интактных и опытных животных: А - неизмененная артерия почки у интактной крысы; Б - перестройка стенки почечной артерии с резким утолщением ее стенки и сужением просвета, гиперплазией эластических структур и гипертрофией гладкомышечных элементов у крысы с артериальной гипертензией в модели с Ь-ЫАМЕ. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х400.

2. Исследование эндотелиопротективной активности потенцированных антител к УЕСР и потенцированных антител к е>Ю8 при Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Наши исследования показали, что потенцированные антитела к УЕСР и потенцированные антитела к еЬЮ8 обладают выраженным эндотелио-протективным эффектом. Так, КЭД у интактных животных составил - 1,2, с Ь-ЫАМЕ патологией - 3,5, Ь-ЫАМЕ + потенцированные антитела к УЕвР -1,7, Ь-ЫАМЕ + потенцированные антитела к еМОБ - 1,8 (рис. 6).

Отмечено, что данные гомеопатические разведения слабо предотвращали повышение адренореактивности, вызванное Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией. У интактных животных показатели сократимости левого желудочка сердца составили 199,8 мм рт.ст., у Ь-МАМЕ - 281,1 мм рт.ст., в группе с коррекцией потенцированными антителами к УЕОР - 273,9 мм рт.ст., в группе с коррекцией потенцированными антителами к еЫОБ - 269,4 мм рт.ст.

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением приём исследуемых растворов гомеопатических разведений предотвращал падение сократимости с 5 на 25 секунду пережатия аорты (рис. 6). Сократимость на 25 сек нагрузки составила у интактных животных - 93,9% к 5-й сек, взятой за 100%. Ь-ЫАМЕ-индуцированная патология - 67,5%, с коррекцией потенцированными антителами к УЕСР - 97,1%, с коррекцией потенцированными антителами к еШБ- 105,6%.

5

н а

Е Е

Иытактные; ЫЧАМЕ; А! к \ТСГ';Л| к ЛОв

Б

Проба на адренореактивность

Интактные; Ь^АМЕ; антитела к \/Ч, Г: антитела и еГч'ОЗ

|в интакшые □ И-НАМЕ а антитела к \ZEGF п антитела к еШЗ

120.00% 100,00% 80 00% ео.ож,

40.00% 20 00% ООО1/«

Интакгаые; ЫЧАМЕ; А1 к \'ЕСГ;Л[ к' с\о4 Нагрузка сопротивлением

и интактные а 1-ЫАМЕ пантитела к \ZEGF 0 антитела к еМК

Рис. 6. Влияние смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных 1 антител к УЕОР (9 мл/кг/сут.) и СМД антител к еМОЭ (9 мл/кг/сут.) на | функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Х^МАМЕ-индуцированного дефицита N0. **- р < 0,05 в сравнении с группой Ъ-МАМЕ животных, * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных.

[я лнтатые □ ЬЫАМЕ я антитепа к УЕвРв ан-щела х еНОЗ |

Результаты исследования функционального состояния миокарда при проведении нагрузочных проб выявили отчетливое кардиопротективное действие смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕСР - С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) и СМД антител к эндотелиальной ]ЧО-синтазе (смеси гомеопатических разведений С12+С30+С200) (9 мл/кг/суг.), выражающееся в предотвращении падения ЛЖД при проведении пробы на нагрузку сопротивлением и увеличении сократимости на пике реоксигенации по сравнению с животными у которых моделировали Ь-ЫАМЕ - индуцированный дефицит N0 (для потенцированных антител к еМОБ).

Концентрация нитрит-ионов под влиянием исследуемых гомеопатических разведений увеличивалась и статистически достоверно не отличалась от показателей интактных животных (рис. 6).

Исследуемые гомеопатические разведения статистически достоверно предотвращали увеличение поперечного диаметра миокардиоцитов (рис. 6). Одновременно более благоприятная картина морфологических изменений под влиянием коррекции обнаруживалась в почках.

Таким образом, смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕйР - С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) и смесь растворов сверхмалых доз антител к еЫОБ (гомеопатические разведения С12, СЗО, С200) (9 мл/кг/сут.) проявляли выраженное эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией.

3. Исследование влияния потенцированных антител к УЕСР и потенцированных антител к еГ<Ю8 на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Данная экспериментальная работа проведена на 50 крысах-самцах линии «\Vistar», половозрелых, массой 250-350 г. У лабораторных животных оценивали уровень микроциркуляции методом лазерной доплеровской флоуметрии и морфологическую картину в мышцах задней конечности.

Среднее значение уровня микроциркуляции в наружной группе мышц правой голени в интактной группе крыс составило 525,7±9,8 п.е. (перфузионных единиц). Уровень микроциркуляции в правой и левой мышцах голени животных не отличался друг от друга (р>0,05). Данное значение было принято в качестве исходной нормы. Среднее значение уровня микроциркуляции в наружной группе мышц правой голени в группе ложнооперированных крыс составляет на 28 сутки 531,8±12,8 п.е.

Результаты достоверно не отличается от данных, полученных в группе интактных животных (р>0,05).

При морфологическом изучении мышц голени интактной группы животных получена следующая картина. Мышечные волокна в препарате располагаются плотно друг к другу, соединительная ткань (строма) между волокнами не выражена. Присутствуют сосуды микроциркуляторного русла, иногда в препарате оказываются более крупные сосуды (артериолы, мелкие артерии, венулы) (рис. 7).

При осмотре контрольной группы животных после операции моделирования ишемии у всех животных были отмечены признаки острой ишемии оперированной конечности. Имели место ишемический отёк, боль в конечности, что проявлялось неучастием конечности в передвижении, а также агрессивной реакцией крысы на касание инструментом до больной конечности.

Рис. 7. Морфологическая картина мышц голени интактного животного. Примечание: миоциты, соединительнотканные прослойки между волокнами, в перимизии сосудистый пучок с умеренным кровенаполнением. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х200

С течением времени появлялись признаки формирующейся хронической ишемии конечности, что характеризовалось наличием таких патогномоничных симптомов, как перемежающаяся хромота, трофические расстройства в дистальных участках конечности.

В контрольной группе животных на 28-е сутки мышца выглядела несколько гипотрофичной. При гистологическом исследовании наблюдаются участки резорбируемого некроза (рис. 8), а в микроциркуляторном русле отмечались полнокровие и новообразование единичных капилляров.

Результаты оценки уровня микроциркуляции у животных на 28 сутки при моделировании ишемии конечности и ее коррекции смесью растворов гомеопатических разведений моноклонапьных антител к УЕвР - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. и смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к е>Ю8 - С12, СЗО, С200 в дозе

9 мл/кг/сут. представлены в таблице 1. Уровень микроциркуляции после операции моделирования ишемии задней конечности составил на 28 сутки 361,3 ±8,7 п.е., что достоверно ниже значения в группе интактных (р<0,001) и ложнооперированных животных (р<0,001).

На фоне коррекции патологии потенцированными антителами к УЕСР уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 486,1 ±18,8 п.е. ( р<0,05).

При коррекции патологии потенцированными антителами к эндоте-лиальной синтазе оксида азота уровень микроциркуляции достоверно возрастает до490,3±18,6 п.е. ( р<0,05).

Рис. 8. Морфологическое исследование мышц голени крыс. Животное контрольной группы, 28 сут. эксперимента. Небольшой участок организующегося некроза, в его центре остатки резорбируемых некротизированных мышечных волокон. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х140.

Таблица 1

Результаты оценки уровня микроциркуляции в мышцах голени на 28 сутки

(М±т), п.е. (перфузионные единицы)

Интактные (п=10) 525,7 ±9,8

Ложнооперированные (п=10) 531,8±12,8

Ишемия конечности (п=10) 361,3 ±8,7*

Ишемия конечности + смесь р-ров потенцированных антител к е!Ч08 -С12, С30, С200 (п=10) 490,3±18,6**

Ишемия конечности + смесь р-ров потенцированных антител к УЕйР -С12, С30, С200 (п=10) 486,1 ±18,8**

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с иитактными; ** - р<0,05 в сравнении с группой с ишемией конечности

При макроскопической оценке мышцы ишемизированной голени в группах с фармакологической коррекцией патологии не отличались по цвету и виду от мышц интактных крыс. При гистологическом исследовании в данных группах некротические изменения и остаточные явления в виде очагов грануляционной или рубцовой ткани не выявлены. Мышечные волокна имели сохранную общую структуру. Саркоплазма характеризовалась однородной окраской, ядра расположены равномерно и типично на периферии. При визуальной оценке степени васкуляризации мышц выявляется относительно равномерное кровенаполнение сосудов различного диаметра. В обеих группах животных очагово выявлена большая концентрация ядер эндотелиальных клеток, что отражает картины формирования капиллярных почек новообразующихся капилляров (рис. 9).

Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать эффективность фармакологической коррекции ишемии конечности

исследуемыми растворами стимуляции неоангиогенеза.

гомеопатических разведении антител за счет

Рис. 9. Морфологическая картина мышц голени на 28-е сутки эксперимента. Группы животных с коррекцией ишемии: А - потенцированными антителами к УЕСР; Б - потенцированными антителами к сЖЖ Мышечные волокна в обеих группах в различных участках равномерного диаметра, тинкториальные свойства саркоплазмы без отличий от интактных животных, между мышечными волокнами очаги скопления ядер эндотелиальных клеток новообразованных капилляров (на стрелках). Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х400.

ВЫВОДЫ

1. Ежедневное введение М-нитро-Ь-аргшшн метилового эфира (Ь-ЫАМЕ) в дозе 12,5 мг/кг в течение 28-ми суток однократно внутрибрюшинно вызывает у крыс-самцов развитие эндотелиальной дисфункции, выражающейся в увеличении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 3 раза по сравнению со значениями в интакгной группе животных; развитие артериальной гипертензии (204,8 / 164,2 мм.рт.ст.); вызывает снижение содержания нитрит-ионов, снижение показателей сократимости при проведении пробы «нагрузка сопротивлением» и гипертрофию кардиомиоцитов.

2. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕОР - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. проявляет эндотелиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0 в течение 28-ми суток, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня ¡штакчных животных, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с Ь-ЫАМЕ - индуцированной патологией. Монотерапия данными гомеопатическими разведениями в изученных дозах не позволяла достичь целевых значений АД.

3. Смесь растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной сингазе оксида азота - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. проявляет эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, достоверно не отличающееся от действия потенцированных антител к УЕОР по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Значения КЭД, АД, поперечного диаметра миокардиоцитов, содержания нитрит-ионов не показали достоверных отличий по сравнению с соответствующими значениями в группе животных, получавших смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕвР - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. В пробе на адренореакгивность коррекция потенцированными антителами к УЕвР в меньшей степени предотвращала развитие типерадренореактивности, чем коррекция потенцированными антителами к еМ)8.

4. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕОР - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. увеличивает показатели микроцикулящш в ишемизированной конечности на 28-е сутки за счет уменьшения очага некроза и стимуляции неоангиогенеза. На фоне фармакологической коррекции ишемии мышцы голени уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 486,1 п.е. (р<0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе животных (361,3 п.е.).

5. При коррекции ишемии конечности смесью растворов

гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к еЖЗЭ -С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 490,3 п.е. (р<0,05) по сравнению с данными контрольной группы (361,3 п.е.) и достоверно не отличается от уровня микроциркуляции в группе с коррекцией потенцированными антителами к УЕОГ (486,1 п.е.). Результаты подтверждаются данными морфологического исследования: в мышцах ишемизированной голени некротические изменения не обнаруживались, отмечалось усиленное новообразование капилляров, что подтверждает положительное влияние исследуемых гомеопатических разведений на ангиогенез в ишемизированной мышце. Достоверных различий в эффективности противоишемического действия исследуемых гомеопатических разведений не обнаружено.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Потенцированные разведения антител к эндогелиальному фактору роста / А. С. Белоус, О. С. Гудырев, А. А. Арустамова [и др.] // Материалы IV международной научной конференции молодых учёных-медиков, Курск, 25-26 февр. 2010 г. : 3 т. / Курск, гос. мед. ун-т, Воронеж, гос. мед. акад. [и др.] ; иод ред. В. А. Лазаренко. - Курск, 2010. - Т. 1. - С. 88-89.

2. Актуальность создания нового препарата на основе потенцированных разведений антител к эндогелиальному фактору роста / А. С. Белоус, О. С. Гудырев, А. А. Арустамова [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В. В. Пичугина и 75-летию КГМУ, Курск, 25 дек. 2009 г. / Курск, гос. мед. ун-т. Центр.-Чернозем, науч. центр РАМН, РАЕН, Всерос. об-во фармакологов-токсикологов. - Курск, 2009. - С. 108-109.

3. Перспективы создания нового препарата на основе потенцированных разведений антител к УЕОБ / А. С. Белоус, М. В. Покровский, А. А. Арустамова [и др.] // Человек и лекарство : XVII Рос. нац. конгр., Москва, 12-16 апр. 2010 г. : сб. материалов конгр. (тез. докл.). - М., 2010. -С. 578-579.

4. Коррекция гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции препаратом импаза в комплексе с эналаприлом и лозартаном / А. С. Белоус, М. В. Покровский, А. А. Арустамова [и др.] // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. - 2010. - Т. 14, № 4. - С. 3-6. (Перечень ВАК)

5. Способ коррекции гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиа.)тьной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота человека - С12, С30, С200 / А. А. Арустамова, А. С. Белоус, М. В. Покровский [и др.] // Инновации в медицине : материалы 3 междунар. диетапц. науч. конф. / КГМУ, Центр.-Чернозем, науч. центр РАМН, Обгцерос. обществ, орг. «Рос. союз молодых учёных» ; под ред. В. А. Лазаренко, П. В. Калуцкого. - Курск, 2010.-С. 12-16.

6. Воспроизведение стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс / А. И. Маяков, М. В. Покровский, А. А. Арустамова [и др.] II Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22, вып. 12. - С. 56-63. (Перечень ВАК)

7. Эндотелиопротективные, кардиопротективные эффекты аторвастатина и его комбинаций с Ь-аргинином и резвератролом в эксперименте / Т. В. Долженкова, В. И. Якушев, А. А. Арустамова [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. -№ 7. - С. 61-65. (Перечень ВАК)

8. Устройство для дистантного прекондиционирования : пат. на полезную модель 97615 Рос. Федерация : МПК А61В17/12. / О. О. Новиков, М. В. Покровский, В. И. Кочкаров [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Белгор. гос. ун-т». - № 2010110708/22 ; заявл. 23.03.2010 ; опубл. 20.09.2010, Бюл. № 26. - 6 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная iwicpicinия АД - артериальное давление АХ - ацетилхолин

ДАД - диастолическое артериальное давление КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции ЛДФ - лазерная допплеровская флоуметрия ЛЖД - левожелудочковое давление НП - нитропруссид

САД - систолическое артериальное давление

ССЗ - сердечно-сосудисше заболевания

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭД - эндотелиальная дисфункция

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота II

L-NAME - N-шпро-L-аргшimi метиловый эфир

NO - оксид азота II

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

+dp/dt - максимальная скорость увеличения левожелудочкового давления

- dp/dt - максимальная скорость снижения левожелудочкового давления

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

р - уровень статистической значимости * - достоверность различий, р<0,05

Подписано в печать 15.04.2011. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 44. Оригинал-макет подготовлен в издательстве Белгородского государственного университета 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

В современном мире, особенно в развитых странах, артериальная гипертензия (АГ) является одним из основных факторов, повышающих инвалидизацию и смертность за счет таких осложнений, как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и инсульт [5, 22, 62, 74, 81]. В России распространенность АГ среди взрослого населения превышает 30 %. Наша страна занимает одно из первых мест в Европе по смертности от инсультов и ИБС [7, 8, 72]. По современным представлениям ЭД является одним из ведущих патогенетических звеньев сердечно-сосудистых заболеваний. Так, роль дисфункции эндотелия доказана в патогенезе ряда наиболее распространенных заболеваний и патологических состояний: атеросклерозе, АГ, легочной гипертензии, сердечной недостаточности, дилатационной кардиомиопатии, ожирении, гиперлипидемии, сахарном диабете, гипергомоцистеинемии (Laufs U., 1998; Белоусов Ю.Б., Намсараев Ж.Н., 2006).

Хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей страдает 2—3% населения, среди которых на долю облитерирующего атеросклероза артерий приходится 80-90%. Из всех пациентов, страдающих этим заболеванием, каждый второй умирает в течение 10 лет от появления первых симптомов, если пациент не начнет лечиться у врача; ежегодно это заболевание становится причиной ампутации конечностей у 35 тыс. пациентов. Социальная значимость проблемы лечения этих больных определяется не только распространенностью данной патологии, но и значительным числом среди этих пациентов людей трудоспособного возраста и их инвалидизацией. Наиболее точным определением следует считать ХОЗАНК (хронические облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей) [3,9].

Следует также отметить, что наличие ХОЗАНК указывает и на высокую вероятность атеросклеротического поражения других артерий, в частности, коронарных и сонных. Риск развития инфаркта миокарда и ишемического инсульта у таких пациентов в разы выше; среди больных с критической ишемией летальность в течение года составляет 20 — 22%, в течение 5 лет - до 70%, причем смертность от сердечно-сосудистой потологии в 5 раз выше, чем при других заболеваниях [16].

Эндотелий - монослой клеток, выстилающих внутреннюю поверхность сосудов и полостей сердца; играет важную роль в поддержании тонуса и структуры сосудов, локального гомеостаза и пролиферации клеток сосудистой стенки [132, 138, 142]. Эндотелий выполняет множество функций: секреторную, барьерную, участвует в фагоцитозе, регулирует транспорт многих биологически активных веществ (факторов роста, вазоактивных веществ, гормонов, анти- и прокоагулянтов), контролирует диффузию воды, электролитов, продуктов метаболизма [10, 29, 31, 47, 90].

Основным механизмом, лежащим в основе ЭД является снижение образования и биодоступности оксида азота II (NO), при одновременном повышении уровня супероксид аниона и продукции мощных вазоконстрикторов [44].

Дисфункция эндотелия проявляется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов [44, 65, 68, 130].

Патогенетическая роль эндотелиальной дисфункции доказана при ряде наиболее распространенных заболеваний ССС. Этому способствуют такие модифицируемые факторы риска, как курение, гипокинезия, солевая нагрузка, различные интоксикации, нарушения углеводного, липидного, белкового обменов, инфекция и др. [22, 41, 42, 90, 97, 145].

NO синтезируется из L-аргинина, являющегося единственным природным донором оксида азота, под влиянием эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы L-аргинина [25, 32, 142].

К настоящему времени идентифицированы три формы NOS. Это -конститутивная нейрональная изоформа (nNOS или NOS I), обнаруженная в нервной ткани центральной и периферической нервной системы [85]. Другой конститутивный изофермент - eNOS или NOS III (также кальмодулин/Са2+-зависимый) обнаружен в сосудистых эндотелиальных клетках. И третий энзим (iNOS или NOS II)- индуцибельная форма, образующаяся в ответ на раздражение и экспрессия которой индуцируется, например, воспалением или бактериальной инфекцией - при этом ее концентрация возрастает на несколько порядков [90].

Ингибиторами NOS могут быть белковые структуры (аутоантитела) продуцируемые в ответ на токсическую гиперпродукцию NO при различных патологических состояниях, таких как ранние этапы воспаления, церебральная ишемия, хронические инфекции, наследственные болезни иммунной системы (болезнь Хантингтона), ревматоидный артрит, злокачественные опухоли, диабет, септический шок, что является одним из биологических механизмов снижения патологической генерации оксида азота в организме. Такое прямое ингибирование ферментов NOS обеспечивает снижение продукции NO в сосудах при продолжительной экспозиции его доноров. В этой связи объясняется механизм биологической защиты организма от избытка NO [119].

В свете представления об ЭД при использовании терапевтического ангиогенеза для лечения окклюзивных заболеваний сосудов необходимо учитывать функциональное состояние сосудистого эндотелия.

Ангиогенез представляет собой образование новых капилляров от посткапиллярных венул, которое осуществляется через активацию эндотелиальных клеток, экспрессию в них протеаз, деградацию внеклеточного матрикса, пролиферацию и миграцию этих клеток, образование ими первичных высокопроницаемых сосудистых структур, последующую стабилизацию и "взросление" этих структур за счет привлечения перицитов и гладкомышечных клеток (ГМК) и организации их в сложную трехмерную сосудистую сеть [56]. Основным стимулом к ангиогенезу при физиологических и патологических состояниях является недостаток кислорода (гипоксия или ишемия), который через активатор транскрипции факторов ангиогенеза — индуцируемый гипоксией фактор-1 (Н]Р-1), индуцирует экспрессию многих ангиогенных факторов и прежде всего основного регулятора ангиогенеза как в эмбриональном, так и в постнатальном периоде развития организма - фактор роста эндотелия сосудов (УЕОБ) и его рецепторов [16].

УЕОБ избирательно стимулирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток (ЭК), их предшественников и моноцитов, экспрессирующих рецепторы к нему, увеличивает сосудистую проницаемость, способствуя пропотеванию белков плазмы в околососудистое пространство, которое необходимо для миграции ЭК, индуцирует экспрессию эндотелиальной МЗ-синтазы и образование N0, что способствует вазодилатации и стимулирует экспрессию протеаз, разрушающих связи между ЭК и внеклеточным матриксом, что необходимо для направленной миграции клеток [113, 124, 149].

Как свидетельствуют литературные данные, несомненная перспективность в фармакологической коррекции ЭД отводится препарату «Импаза», представителю нового класса лекарственных средств универсальных регуляторов гомеостаза, в состав которого входят потенцированные антитела к е>Ю8. Способ лечения данным препаратом заключается в активизации по механизму обратной связи выработки контрантител для ликвидации дисбаланса при сниженном количестве еЖЖ Поэтому смесь растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) (ООО «НПФ Материа-Медика Холдинг», Россия) была выбрана в качестве сравнения.

Учитывая данные экспериментальных исследований феномена модифицирующего действия антител в СМД, можно предположить, что потенцированные антитела к фактору роста эндотелия УЕОР будут обладать противоишемическими и эндотелиопротективными свойствами вследствие активации ими по принципу «обратной связи» выработки УБвР. Данный фактор индуцирует экспрессию эндотелиальной ЫО-синтазы и образование N0, который в свою очередь является регулятором функции эндотелия и медиатором ангиогенеза.

В связи с вышеизложенным явилось актуальным изучение эндотелиотропного и противоишемического действия смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕвР - С12, СЗО, С200 (ООО «НПФ Материа-Медика Холдинг», Россия).

Цель исследования: провести оценку эндотелио- и кардиотропного действия при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции потенцированных антител к УЕОР в сравнении с потенцированными антителами к е!Ч08 и их влияния на ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Разработать комплекс методических подходов для оценки эндотелиотропного действия фармакологических агентов с изменением I режима введения 1Ч-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (Ь-ЫАМЕ) в дозе 12,5 мг/кг однократно внутрибрюшинно ежедневно в течение 28-ми суток.

2. Изучить эндотелиопротективную активность смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕОР - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЭД.

3. В сравнительном аспекте изучить эндотелиопротективную активность смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЭД.

4. Исследовать влияние смеси растворов гомеопатичесикх разведений моноклональных антител к УЕОБ - С12, СЗО, С200 на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

5. В сравнительном аспекте изучить влияние смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к еТчЮ8 -С12, СЗО, С200 на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Научная новизна исследования. В работе впервые показано, что смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕОБ - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов сверхмалых доз антител к эндотелиальной ЫО-синтазе (гомеопатические разведения С12, СЗО, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. интрагастрально в качестве монотерапии на лабораторных крысах оказывают эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной М>дефицитной ЭД, выражающееся в снижении КЭД.

Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕвЕ — С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов сверхмалых доз антител к эндотелиальной ИО-синтазе (гомеопатические разведения С12, СЗО, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. интрагастрально в качестве монотерапии оказывают кардиопротективное действие на 28-дневной модели Ь-МАМЕ-индуцированной МО-дефицитной ЭД, выражающееся в предотвращении развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию и снижения миокардиального резерва. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с Ь-МАМЕ - индуцированной патологией.

В работе впервые показано, что смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕСБ - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов сверхмалых доз антител к эндотелиальной N0-синтазе (гомеопатические разведения С12, СЗО, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. интрагастрально в качестве монотерапии позволяют компенсировать признаки хронической ишемии конечности. Результаты, полученные при проведении ЛДФ подтверждаются данными морфологического исследования: в мышцах ишемизированной голени некротические изменения не обнаруживались. У всех животных этих групп отмечалось усиленное новообразование капилляров.

Подано 3 заявки на изобретения по результатам проведенных экспериментальных исследований:

Способ коррекции Ь-ИАМЕ — индуцированной эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕвЕ - С12, СЗО, С200;

Способ фармакологической коррекции ишемии конечности смесью растворов гомеопатических разведений;

- Способ фармакологической коррекции ишемии конечности.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность применения смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕОБ - С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) и смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) в качестве монотерапии для коррекции Ь-КАМЕ-индуцированной N0-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 3 раза, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечнососудистой системы (диаметр миокардиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания исследуемых гомеопатических разведений при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиотропной и противоишемической активности стимулятора VEGF и стимулятора eNOS, используются в ООО НПФ «Материа Медика Холдинг» с целью формирования представления об фармакологической активности данных гомеопатических разведений.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2010 г., XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». Апробация диссертации проведена на межкафедральной научной конференции кафедр фармакологии и фармацевтических дисциплин, анатомии и гистологии человека, биохимии и фармакологии, фарм. химии и фармакогнозии, фарм. технологии, управления и экономики здравоохранения, акушерства и гинекологии, медико-биологических дисциплин БелГУ. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту

1. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF — С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. при ежедневном интрагастральном введении оказывают в качестве монотерапии эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной ТМО-дефицитной ЭД, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов ЫОх. Результаты нагрузочных проб выявляют предотвращение развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с Ь-ИАМЕ - индуцированной патологией.

2. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕвР - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота — С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. при ежедневном интрагастральном введении в качестве монотерапии увеличивают показатели микроцикуляции в ишемизированной конечности на 28-е сутки за счет уменьшения очага некроза и стимуляции неоангиогенеза. На фоне фармакологической коррекции ишемии мышцы голени уровень микроциркуляции достоверно возрастает (р<0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе животных.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 152 источника, из них 79 отечественных и 73 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 139 страницах машинописи, содержит таблиц -10, рисунков - 39, схем - 1.

ВЫВОДЫ

1. Ежедневное введение М-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (Ь-КАМЕ) в дозе 12,5 мг/кг в течение 28-ми суток однократно внутрибрюшинно вызывает у крыс-самцов развитие эндотелиальной дисфункции, выражающейся в увеличении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 3 раза по сравнению со значениями в интактной группе животных; развитие артериальной гипертензии (204,8 / 164,2 мм.рт.ст.); вызывает снижение содержания нитрит-ионов, снижение показателей сократимости при проведении пробы «нагрузка сопротивлением» и гипертрофию кардиомиоцитов.

2. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕОБ - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. проявляет эндотелиопротективное действие на модели Ь-ИАМЕ-индуцированного дефицита N0 в течение 28-ми суток, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с Ь-1МАМЕ - индуцированной патологией. Монотерапия данными гомеопатическими раз-ведениями в изученных дозах не позволяла достичь целевых значений АД.

3. Смесь растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. проявляет эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, достоверно не отличающееся от действия потенцированных антител к УЕОР по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Значения КЭД, АД; поперечного диаметра миокардиоцитов, содержания нитрит-ионов ЫОх не показали достоверных отличий по сравнению с соответствующими значениями в группе животных, получавших смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕвР - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. В1 пробе на адренореактивность коррекция потенцированными антителами к УЕОР в меньшей степени предотвращала развитие гиперадренореактивности, чем коррекция потенцированными антителами к еЖ)8.

4. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕОР - С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. увеличивает показатели микроцикуляции в ишемизированной конечности на 28-е сутки за счет уменьшения очага некроза и стимуляции неоангиогенеза. На фоне фармакологической коррекции ишемии мышцы голени уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 486,1 п.е. (р<0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе животных (361,3 п.е.).

5. При коррекции ишемии конечности смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к еЖ)8 — С12, СЗО, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 490,3 п.е. (р<0,05) по сравнению с данными контрольной группы (361,3 п.е.) и достоверно не отличается от уровня микроциркуляции в группе с коррекцией потенцированными антителами к УЕОР (486,1 п.е.). Результаты подтверждаются данными морфологического исследования: в мышцах ишемизированной голени некротические изменения1 не обнаруживались, отмечалось усиленное новообразование капилляров, что подтверждает положительное влияние исследуемых гомеопатических разведений на ангиогенез в ишемизированной мышце. Достоверных различий в эффективности противоишемического действия исследуемых гомеопатических разведений не обнаружено.

Заключение

Сосудистый гомеостаз регулируется посредством высвобождения клетками эндотелия ряда вазоактивных веществ, которые поддерживают базальный тонус сосудов, обладают ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов, предотвращают ремоделирование сосудистой стенки, ингибируют агрегацию и адгезию тромбоцитов, лейкоцитарные взаимодействия и миграцию моноцитов, оказывают антиоксидантное действие.

Эндотелиальная дисфункция может быть определена как дисбаланс противоположно действующих начал - релаксирующих и констрикторных, прокоагулянтных и антикоагулянтных, факторов роста и их ингибиторов.

Основным механизмом, лежащим в основе ЭД является снижение образования и биодоступности оксида азота (N0), при одновременном повышении уровня супероксид аниона и продукции мощных вазоконстрикторов [44], т.е. проявляется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов [44, 64, 67, 131].

Методы исследования функции эндотелия периферических и коронарных артерий основываются на оценке его способности продуцировать N0 в ответ на фармакологические (ацетилхолин, метахолин, брадикинин, гистамин) или физические (изменение кровотока) стимулы, а также на прямом определении уровня N0 и оценке уровня косвенных показателей эндотелиальной функции (эндотелии, фактор фон Виллебранда, тканевой активатор плазминогена, тромбомодулин).

Изучение ЭД, состояния сосудистой стенки артерий у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, включая АГ, ИБС и поиск возможностей лечения ЭД являются важными клиническими задачами. Усилия исследователей направлены на поиск препаратов, которые наряду с гипотензивным эффектом могли бы уменьшать выраженность ЭД и способствовать обратному ее развитию.

Вышеизложенное предопределило необходимость разработки и 1 систематизации методологических подходов к оценке эндотелиальной дисфункции, с одной стороны, и последующей оптимизации коррекции ЭД.

Так, в ходе проведенных нами исследований в эксперименте на белых г крысах-самцах линии Wistar был разработан комплекс методических подходов для оценки функционального состояния эндотелия, включающий физиологические, биохимические и морфологические методы.

Физиологические методы исследования включали моделирование эндотелиальной дисфункции ежедневным в/б введением L-NAME в течение 28 суток. Механизм ингибирования выработки NO в данном случае, заключается в конкурентном ингибировании фермента eNOS аналогом L-аргинина — L-NNA. L-NAME фактически является пролекарством: в организме этот эфир гидролизуется с участием специальных ферментов — эстераз, давая активный ингибитор — L-NNA.

На 28-е сутки животных наркотизировали, брали в эксперимент и на первом этапе оценивали реакции АД на эндотелийзависимую (ацетилхолин) и эндотелийнезависимую (нитропруссид) вазодилатацию [21, 140].

Степень эндотелиальной дисфункции рассчитывали как коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) - отношение площадей треугольников над кривой восстановления АД на нитропруссид и ацетилхолин.

Мы рассчитывали КЭД у каждого животного интактной группы и крыс после моделирования блокады NO-синтазы и получили разницу КЭД в 3 раза - соответственно 1,2 у интактных и 3,5 у животных, получавших L-NAME. Данные результаты выявили адекватность выбранной модели патологии для исследования фармакологической активности смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF и смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к еЖ>8.

Данные факты подтвердились при определении биохимических маркеров ЭД. ЫО-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании содержания нитрит-ионов МЭх, и обнаружено, что моделирование Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0 приводило к резкому снижению содержания нитрит-ионов (ЫОх) в 3 раза.

Результаты гистологических исследований обнаружили, что моделирование Ь-ГчГАМЕ-индуцированного дефицита N0 на 28-е сутки приводит к яркой гипертрофии миокардиоцитов, утолщению мышечного слоя сосудистой стенки и спазму артериол, наиболее выраженному в почечных артериях, а также «вздыбливанию» эндотелиоцитов.

Подводя итог вышеизложенному, следует отметить, что предложенный методический комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита N0, вследствие блокады Ж)-синтазы, позволяет в достаточной степени объективно оценивать эндотелиотропное действие фармакологических агентов.

Учитывая данные экспериментальных исследований феномена модифицирующего действия антител в СМД, мы предположили, что потенцированные антитела к фактору роста эндотелия УЕОР будут обладать противоишемическими и эндотелиопротективными свойствами вследствие активации ими по принципу «обратной связи» выработки УЕОР. Данный фактор индуцирует экспрессию эндотелиальной ИО-синтазы и образование N0, который в свою очередь является регулятором функции эндотелия и медиатором ангиогенеза.

С помощью вышеизложенных методологических подходов были проведены сравнительные исследования эндотелиотропного действия смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к УЕОР —

С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) и смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота -С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) (ООО «НПФ Материа-Медика Холдинг», Россия).

Как свидетельствуют литературные данные, несомненная перспективность в фармакологической коррекции ЭД отводится препарату «Импаза», представителю нового класса лекарственных средств универсальных регуляторов гомеостаза, в состав которого входят потенцированные антитела к е!чЮ8 (ООО «НПФ Материа-Медика Холдинг», Россия). Способ лечения данным препаратом заключается в активизации по механизму обратной связи выработки контрантител для ликвидации дисбаланса при сниженном, количестве еЖ)8. Поэтому смесь растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, СЗО, С200 (9 мл/кг/сут.) (ООО «НПФ Материа-Медика Холдинг», Россия) была выбрана в качестве сравнения.

Исследования, проводимые в лаборатории кардиофармакологии Курского государственного медицинского1 университета под руководством профессора М.В. Покровского в области экспериментального обоснования-принципов фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции, выявили, что препарат «Импаза» в дозе 1 таб/кг проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на 7-дневной модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось ~ в преобладании эндотелийзависимого расслабления1 сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до уровня интактных животных, а также в увеличении экспрессии е№Э8 и полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов Ж)х. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием препарата «Импаза» 1 таб/кг увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME-индуцированной патологией (Белоус, A.C. Исследование эндотелиопротективных свойств препарата «Импаза»: дисс. к-та мед. наук).

Результаты наших исследований выявили, что смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, СЗО, С200 9 мл/кг/сут. и смесь растворов сверхмалых доз антител к эндотелиальной NO-синтазе (гомеопатические разведения С12, СЗО, С200) 9 мл/кг/сут. проявляли выраженное эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME -индуцированной патологией. Исследуемые разведения в изученных дозах не достигали заданных значений артериального давления, и, следовательно, не могут рассматриваться для лечения в виде монотерапии на модели с L-NAME-индуцированной артериальной гипертензией.