Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными механизмами действия (экспериментальное исследование)

□03470065

На правах рукописи

Артюшкова Елена Борисовна

ПРИНЦИПЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ ПРЕПАРАТАМИ С РАЗЛИЧНЫМИ МЕХАНИЗМАМИ ДЕЙСТВИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 4 МДМ 2009

Старая Купавна - 2009

003470065

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научным консультант: доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Утсшсв Даниил Борисович доктор медицинских наук, профессор Мулнр Александр Георгиевич доктор биологических наук Башкатова Валентина Германовна

Ведущая организации:

ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» (РУДН)

Защита состоится » ¿¿¿ШсЯ 2009 г. в -¿ОМшпъ

на заседании диссертационного совета Д 217.004.01 при ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» (ВНЦ БЛВ) (142450, Московская область, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦ БАВ.

Автореферат разослан «г^^"»

2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук,

профессор

Корольчснко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Доказательства ведущей роли дисфункции эндотелия в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, в настоящее время весьма убедительны и представляют значительный теоретический и практический интерес (Белоусов Ю.Б., Намсараев Ж.Н., 2004; Романовская Г.А., Акатова Е.В., Гороховская Г.Н., 2005; Остроумова О.Д., Дубинская Р.Э., 2005). При длительном воздействии повреждающих факторов (атеросклеротическое повреждение эндотелия, гипоксия, воспаление, гемодинамическая перегрузка) происходит изменение эндотелиалыюго ответа с тенденцией к доминированию и хронической гиперактивации вазоконстрикции и гемокоагуляции, факторов роста и пролиферации, способствующих ремоделированию сосудистой стенки, что, в свою очередь, приводит к усугублению эндотелиальной дисфункции (Петрищев H.H., 2003; Ольбинская Л.И., Найманн Ю.И., 2005). Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения эндотелиальной дисфункции являются важными клинико-экспериментальными задачами. В настоящее время стали известны научные факты, позволяющие по-новому взглянуть на парадигму профилактики сердечно-сосудистого континуума и существенного улучшения, таким образом, качества и продолжительности жизни пациентов при целом ряде массовых пандемий. Так, основным механизмом, лежащим в основе эндотелиальной дисфункции, является снижение образования и биодоступности NO при одновременном повышении продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х.М., 2005). При этом основными причинами дефицита NO в эндотелиальных клетках могут быть: сниженное содержание предшественника NO - L-аргинина, снижение экспрессии или активности eNOS, недостаток кофакторов синтеза NO (особенно тетрагидробиоптерина), повышение уровня эндогенных ингибиторов eNOS асимметричного диметиларгинина (АДМА) и монометил-Ь-аргинина (NMMA), повышенное образование реактивных форм кислорода (в частности, супероксид-аниона), а также липопротеидов низкой плотности (особенно их окисленных форм) (Cai С., Harrison D.G., 2000; Werner E.R., Gorren A.C.F., Heller R., 2003; Feletou M., Vanhoutte P.M., 2006).

Оксид азота синтезируется из L-аргинина под влиянием эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) и является одним из наиболее мощных вазодилататоров, кроме того, он опосредует сосудорасширяющие эффекты эндотелийзависимых вазодилататоров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина и др.), тормозит образование эндотелиалыюго сосудосуживающего фактора эндотелина-1 и высвобождение норадреналина окончаниями симпатических нейронов, препятствует осуществлению чрезмерных эффектов других вазоконстрикторов (ангиотензина, тромбоксана А2), обладает противовоспалительным и антитромбогенным эффектами, оказывает антиоксидантное действие (Марков Х.М., 2005; Esper R.J., Nordaby R.A., Vilarino J.O., 2006). Широкий спектр биорегуляторных эффектов сосудистого NO указываег на то, что снижение его уровня в эндотелиальных клетках под влиянием тех или иных

факторов вызывает существенные изменения их функций и системы кровообращения в целом,

Молекулярные основы функционирования и дисфункции сосудистого эндотелия - сложная и не до конца изученная проблема. Многочисленные исследования, проведенные в последние годы, свидетельствуют о ведущей роли в этих процессах системы L-apninnii-NO-NO-синтаза. Значение указанной системы определяется, с одной стороны, многогранным участием N0 в осуществлении эндотелием своих функций, с другой - возможностью коррекции возникающих нарушений путем воздействия на различные звенья этой системы (Зодионченко B.C., Адашева Т.В., Сандомирская А.П., 2002; Бабак О.Я., Шапошникова Ю.Н., Немцова В.Д., 2004; Юшук E.H., Васюк Ю.А., Хадзегова А.Б., 2005; Чернявская Т.К., 2005; Марков Х.М., 2006).

Сегодня известно о положительном влиянии на функциональное состояние эндотелия препаратов различных фармакологических групп. Так нитраты восстанавливают дефицит эндогенного N0, ингибиторы АПФ помимо снижения синтеза AT II препятствуют разрушению кининов, антагонисты кальция тормозят активность AT II и эндотслина в гладких мышцах сосудов, усиливая вазодилататорный эффект N0, ингибиторы эндотелин-превращающего фермента и антагонисты рецепторов эндотелина-1 тормозят активность пептида (Бувальцев В.И., 2001; Бабак О.Я., Шапошникова Ю.Н., Немцова В.Д., 2004; Романовская Г.А., Акатова Е.В., Гороховская Г.Н., 2005; Галенко A.C., Шуленин С.Н., 2006; Hermán A.G., Moneada S„ 2005).

Однако в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции ЭД, поэтому большую ценность представляют данные о влиянии различных лекарственных средств на функциональные характеристики эндотелия. Будущее за препаратами, обладающими не только гипотензивным эффектом, но и органопротективным действием, опосредованным позитивным влиянием на эндотелиальную функцию. Большой практический интерес может представлять комплексное лечение эндотелиальной дисфункции при артериальной гипертензии, когда антигипертензивная терапия будет сочетаться с применением других препаратов-корректоров нарушений функций эндотелия и немедикаментозными методами улучшения эндотелиальной функции.

В связи с вышеизложенным явилось актуальным изучение эндотелиопротективных свойств препаратов с различными патогенетическими механизмами действия: природного донатора оксида азота - аминокислоты L-аргинина SR, активатора фермента NO-синтазы - резвератрола, антиоксиданта оксипиридинового ряда - мексикора, препарата, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, - фосфоглива, цитопротектора метаболического ряда - милдроната, а также афинно очищенных антител к эндотелиальной NO-синтазе - импазы при экспериментальном дефиците оксида азота.

Таким образом, результаты оценки эффективности различных путей фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции на ADMA-подобной модели дефицита оксида азота позволят раскрыть перспективу целенаправленного и патогенетически осмысленного изучения возможностей их использования как существенного дополнения к существующим методам

лечения сердечно-сосудистых заболеваний и создать на их основе новый класс эндотелнотропных аддитивов.

Цель работы. Оценка возможности фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными патогенетическими механизмами действия при Ь^АМЕ-индуцированном дефиците оксида азота.

Основные задачи исследования.

1. Оценить развитие эндотелиальной дисфункции при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, являющегося природным донатором оксида азота, Ь-аргинина 511 при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

Исследовать влияние Ь-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

3. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, являющегося активатором фермента ЫО-синтазы, резвератрола и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

4. Изучить эндотелиопротективную активность антиоксиданта оксипиридинового ряда препарата мексикор при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

5. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды - фосфоглив при Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

6. Изучить эндотелиопротективную активность цитопротектора метаболического действия препарата милдронат при Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

7. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, содержащего в своем составе афинно очищенные антитела к эндотелиальной ЫО-синтазе, импаза при Ь-№АМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

8. Провести интегральный векторный анализ для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, нитроксидергической системы, показателей сократимости и морфометрии миокарда с последующим расчетом вероятностного процента эндотелиопротекции на модели Ь^АМЕ-индуцированного дефицита N0.

Научная новизна. В работе сформировано новое направление в доклинической опенке эндотелиотропной активности фармакологических препаратов с использованием коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведением функциональных проб, определением биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

Впервые предложен способ оценки эндотелиальной дисфункции при Ь-NAME-индyциpoвaннoй модели дефицита оксида азота с помощью расчета КЭД. Продемонстрировано, что эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, резким снижением показателей биохимических маркеров (ЫОх, экспрессия МО-синтазы), а также отрицательной динамикой морфологических показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов).

По совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей подтверждено эндотелиопротективнос действие природного донатора оксида азота Ь-аргинина 811. Ь-аргинин БК 30 мг/кг способствует преобладанию эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, предупреждает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота МОх и предотвращает увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцировапной патологией.

Исследование влияния Ь-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез в сравнении с рекомбинантными генами, кодирующими синтез эндотелиальных факторов роста (УЕОР), показало, что полученные данные позволяют объективно говорить о том, что Ь-аргинин 200 мг/кг при системном введении способен активировать неоангиогенез и улучшать перфузию ишемизированных мышц.

В качестве потенциального эндотелиопротектора экспериментально обосновано использование перспективного препарата резверагрол (природный 3,5,4-тригидрокси-транс-стильбен), являющегося активатором фермента N0-синтазы. Впервые получены данные об эндотелио- и кардиопротективном эффекте резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предупреждении снижения содержания 1ЧОх. При этом нагрузочные пробы и морфометрия выявили уменьшение исчерпания миокардиального резерва, одновременно с ограничением увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов.

В ходе проведенного исследования на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 выявлена эндотелиопротекгивная активность антиоксиданта оксипиридинового ряда мексикора. Мексикор 30 мг/кг снижает КЭД до значения 1,9±0,2 у.е. по сравнению с группой нелеченых животных, где данный показатель равен 5,4±0,6 у.е., а также предупреждает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота ТЧОх.

Оригинальными являются результаты функциональных проб на фоне лечения препаратом фосфоглив, содержащем в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды при Ь-ЙАМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте. При исследовании эндотелио- и кардиопротективного действия препаратов фосфоглив (капсулы) 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) 0,515 г/кг, фосфоглив (лиофилизат) 5,0 мл/кг в дозах, сопоставимых по фосфотидилхолину, выявлено снижение КЭД по сравнению с группой нелеченых животных, предотвращение увеличения адренореактивности и снижения сократительного резерва миокарда.

Впервые установлено выраженное эндотелиопротективное действие цитопротектора метаболического действия препарата милдронат, ингибирующего активность гамма-бутиробетаингидроксилазы и вызывающего индукцию оксида азота в эксперименте. Милдронат 80 мг/кг способствует преобладанию эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных и оказывает положительное влияние на КО-продуцирующую функцию эндотелия.

Впервые показано выраженное эндотелиопротективное действие гомеопатически потенцированных антител к еМОБ (С 12, СЗО, С200) - препарата импаза на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания ЫОх. Одновременно результаты нагрузочных проб свидетельствовали о предотвращении повышения адренореактивности, уменьшении исчерпания миокардиалыюго резерва.

Научная новизна подтверждается получением 10 патентов РФ.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными патогенетическими механизмами действия: природным донатором оксида азота Ь-аргинином 511, активатором фермента МО-синтазы резвератролом, антиоксидантом оксипиридинового ряда мексикором, препаратом, содержащим в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, фосфогливом, цитопротектором метаболического действия милдронатом и гомеопатически потенцированными антителами к е\05 (С12, СЗО, С200) препаратом импаза, для коррекции Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что их использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД.

Одновременно результаты нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований свидетельствовали о положительной динамике морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (снижение адренореактивности, предотвращение исчерпания миокардиалыюго резерва, уменьшение диаметра кардиомиоцитов) и о восстановлении активности N0-

продуцирующей функции эндотелия (повышение продукции нитрит-ионов ЫОх).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные доклинические л клинические испытания исследуемых препаратов в качестве эндотелиотропных аддитивов при лечении патологических состояний, связанных с развитием эндотелиальной дисфункции.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив форте производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008120/08), фосфоглив производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ Р N002528/01), препаратов мексиприм производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛС-001668) и мельдоний производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛСР-006481/08), включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности биологически активной добавки Ь-аргишш (свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.2795.3.05 от 18.03.05), включены в состав документов, поданных на регистрацию в ГУ НИИ питания РАМН. Результаты работы используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии Белгородского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Комплекс методических подходов, включающий расчет коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведение функциональных проб, определение биохимических маркеров и оценку результатов морфологических исследований, является адекватным способом исследования эффективности фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции при Ь-МАМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

2. На основании проведенного комплексного изучения Ь-аргинина вЯ, резвератрола, мексикора, фосфоглива, милдроната, импазы на модели Ь-ИАМЕ-индуцированного дефицита N0 можно в качестве потенциальных эндотелиопротекторов предложить следующие фармако-терапевтические группы:

- донаторы оксида азота

- активаторы эндотелиальной ЫО-синтазы

-антиоксиданты

- мембранопротекторы, содержащие «эссенциальные фосфолипиды»

- цитопротекторы метаболического действия

- гомеопатически потенцированные антитела к еИОв

3. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты исследованных препаратов на модели Ь-НАМЕ-индуцнрованного дефицита оксида азота: природного

донатора оксида азота L-аргинина SR, активатора фермента NO-синтазы резвератрола, антиоксиданта оксипиридинового ряда мексикора, препарата фосфоглив, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, цитопротектора метаболического действия мидцроната, гомеопатически потенцированных антител к eNOS (С 12, СЗО, С200) импазы, свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического и клинического изучения данных препаратов в качестве потенциальных эндотелиопротекторов.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 гг., XIII-XV Национальном конгрессе «Человек и лекарство», I—II Национальном конгрессе терапевтов, VII' съезде аллерголов и иммунологов СНГ, XII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева (2006). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 1, внутренних болезней № 2, гистологии, цитологии и эмбриологии, патофизиологии, НИИ Экологической медицины КГМУ (2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ, 22 из них - в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, получено 10 патентов РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 532 источника, из них 132 отечественных и 400 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 348 страницах машинописи, содержит таблиц - 32, рисунков - 103, формул - 6.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250300 г. Ы-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводили ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг. На 7 день от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы «Bioshell». Эндотелийзависимая (ЭЗР) и эндотелийнезависимая (ЭНЗР) сосудистые реакции оценивались посредством проведения функциональных сосудистых проб с внутривенным введением ацегилхолина (40 мкг/кг) (Laursen J.В., 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P23ID «Gould» (США), АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемодинамики:

левожслудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dlmiJ, максимальную скорость расслабления (-dp/dtmax), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт. ст. х уд. мин)).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида Г10'5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек) (Меерсон Ф.З., 1980).

3. 3-минутная гипоксия (Пашин Е.Н., 1993).

Биохимические маркеры эидотелиапыюй дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (Метельская В.Л., 2004). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски. Уровень метаболитов NO (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaN02 в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения калибровочной кривой.

Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2004) с помощью поликлональных мышиных антител против eNOS (BD Transduction Labs) с последующим проявлением методом усиленной хемилюминесценции ECL.

После выведения животного из эксперимента отрезок крысиной аорты (20-30 мг) промывали в 0,9% р-ре NaCl и хранили в жидком азоте. Подготовленные образцы подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану методом Western-бяоттинга. Мембрану инкубировали с мышиными поликлональными антителами против eNOS, затем обрабатывали по методу ECL и экспонировали с рентгеновской пленкой в течение суток. Затем пленку проявляли и сканировали полосы, рассчитывая их интенсивность с помощью компьютерной программы TotalLab (Amersham). В качестве контроля использовали стандартно приготовленные образцы из 1 млн. культивируемых эндотелиальных клеток бычьей аорты (ВАЕС), интенсивность полос которых принимали за 100%.

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и комплексной оценки эффективности препаратов проводили гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий).

Материал фиксировали в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использовали окраски гематоксилином Pero и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов, по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. При морфометрии сердца использован метод раздельного взвешивания миокарда с определением индексов и определением диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова (1994).

Оценку уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс осуществляли методом лазерной допплеровской флоуметрии. Исследование осуществляли при помощи аппарата - лазерный допплеровский флоуметр «Biopac-systems МР-100» и датчика «TSD-144». Запись и обработка данных осуществлялись при помощи программы AcqKnowledge 38.

Иммуногистохимическую визуализацию сосудов осуществляли на срезах мышц голени крысы моноклональными антителами к CD 31 (BD). Замороженные срезы фиксировали в 4% растворе формалина в фосфатном буфере в течение 5 минут при комнатной температуре, промывали фосфатным буфером (pH 7,4). Для визуализации антител срезы инкубировали в течение 6 минут с комплексом авидин/пероксидаза (Vector Laboratories, в разведениях 1:50 с реагентом а (авидин) и реагентом В (пероксидаза хрена) в фосфатном буфере). Далее на 10-20 секунд наносили раствор тетрахлорида диаминобензидина (Sigma) (0,5 мг/мл с 0,01% раствором перекиси водорода, профильтрованный через 0,22 мкм фильтр (Millipore, USA). Срезы ополаскивали дистиллированной водой, дегидратировали в водных растворах этанола (80%, 96%, 100%) и в толуоле, заливали в канадский бальзам. Подсчет сосудов на окрашенных гистологических срезах мышц крысы осуществляли на световом микроскопе Zeiss Axiovert 200М при увеличении х 20. На 5 срезах, сделанных на разных уровнях мышцы, обсчитывали по 5 полей зрения. Данные для каждого животного усредняли.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота исследуемые вещества вводили в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно или внутрижелудочно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований выполненных на крысах на данной модели патологии (Lopez R.M. et al., 2004; Kataoka С. et al., 2002; Ganzales W. et al., 2000).

При выборе доз исходили из средней терапевтической дозы препаратов, с последующим межвидовым переносом доз, с использованием коэффициента пересчета доз для животных, в частности крыс (Freireich et al., 1966; Уланова И.П. и др., 1968). Эндотелиотропная активность донатора оксида азота L-аргинина производства Ajinomoto Co. INC (Japan), в медленно высвобождающейся форме ("L-аргинин SR®", производства ОАО "ФармстандартЛексредства") исследована в дозе 30 мг/кг при внугрижелудочном введении, что соответствует разрешенной суточной дозе в России по СанПИН - М.Р.2.3.1.1915 (2004) и данным литературы (Alan L.

Miller, ND, 2006), согласно которым, именно в этой дозе L-аргинин SR проявляет эндотелио- и кардиотропные эффекты.

Сравнительную оценку ангиогенного эффекта L-аргинина и сосудистого эндогслиального фактора роста (VEGF) проводили на фоне внутрибрюшинного введения "L-аргинина ", производства Ajinomoto Co. INC (Japan) в виде водного раствора в дозе 200 мг/кг, на 2 сутки после операции моделирования ишемии конечности и транскутанной внутримышечной инъекции в m. tibialis anterior плазмиды гена VEGF на 5 сутки после операции. Раствор плазмиды в стерильном фосфатно-солевом буфере объемом 250 мкл с содержанием плазмидной ДНК 250 мкг вводили в пять точек (по 50 мкл в каждую точку).

Эндогелиотропную активность активатора эндотелиальнои NO-синтазы резвератрола (3,5,4- тригидрокси-транс-стильбеп) производства GreensynrM (Guangzhou)., Ltd, исследовали в дозе 0,15 мг/кг, что соответствует разрешенной суточной дозе в России по СанПИН - М.Р.2.3.1.1915 (2004) и в дозе 2 мг/кг при внутрибрюшинном введении, которая определялась нами с учетом максимального его содержания в экстраординарных сортах вин (10 мкмоль/л, 600 мл/сут.). Согласно литературным данным, именно в дозе 2 мг/кг резвератрол проявляет максимальные эпдотелио- и кардиотропные эффекты (Chen C.K. et al„ 1996; Naderali E.K. et al„ 2000; Oratio F. et al„ 2002).

Максимальная суточная доза цитопротектора метаболического действия, препарата "Милдронат®" (3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата дигидрат) производства ПАО GRINDEX (Латвия), для человека массой 70 кг равна 500 мг, в результате переноса доз с человека на крысу (Freireich et al., 1966; Уланова И.П. и др., 1968) получали дозу 80 мг/кг, которую применяли при внутрижелудочном введении экспериментальным животным для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности препарата.

Доза антиоксиданта оксипиридинового ряда, препарата "Мексикор®" (2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат) ЭкоФармИнвест ООО, производства Государственный завод медицинских препаратов ГУП (Россия), 30 мг/кг при внутрибрюшинном введении, была определена из средней терапевтической дозы препарата с использованием коэффициента пересчета доз для животных и соответствовала дозе минорного антиоксиданта tcQ5 10 (аскорбиновая кислота, модифицированная титаном), ранее исследованного в нашей лаборатории, для которого были выявлены выраженные эндотелио- и кардиопротективные эффекты.

При изучении эндотелио- и кардиопротективной активности препарата фосфоглив, содержащего в своем составе "эссенциальные" фосфолипиды, животные на фоне L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота, внутрижелудочно получали препарат "Фосфоглив®" (капсулы) производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" в дозе 2,2 г/кг, препарат "Фосфоглив форте®" (капсулы) в дозе 0,515 г/кг, внутрибрюшинно препарат "Фосфоглив®" (лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения) производства Государственное учреждение Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (Россиия) в дозе

5,0 мл/кг и 0,5 мл/кг. Дозы препаратов рассчитывались по входящему в их состав фосфатидилхолипу, равнеэквивалентно содержанию последнего в препарате "Эссенциале® форте Н" (капсулы) производства Санофи-Авентис и последующему пересчету доз с человека на крысу в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Количественное содержание фосфатидилхолина в пересчете на безводное вещество для "Фосфоглива®" (капсулы) и "Фосфоглива®" (лиофилизат) составляло соответственно 73-79% и не менее 94,0%. При расчете доз субстанций глицирата и липоида С80 также учитывалось содержание последних в препарате "Эссенциале® форте Н" (капсулы) с последующим пересчетом с человека на экспериментальное животное.

В качестве потенциального эндотелиотропного средства исследовался препарат "Импаза®" (сверхмалые дозы аффинно очищенных антител к эндотелиальной МО-си нтазс, смесь гомеопатических разведений С12+С30+С200), производства ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг» (Россия). Препарат разводили в поилках из расчёта 1 таблетка на 100 мл воды. Крысы получали импазу в свободном доступе к питью с учётом объема потребляемой жидкости 20±3 мл/животное/сут., что соответствовало суточной дозе 1 габ./кг массы животного.

Статистическая обработка результатов исследования. Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±ш) и оценки достоверности различий сравниваемых параметров между группами с использованием Мее! для групп с разными дисперсиями, достоверными считались различия сравниваемых параметров при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании Ь-1ЧАМЕ-индуцированного дефицита N0.

Длительное, в течение 7 суток, однократное внутрибрюшинное введение Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг привело к стойкому повышению АД (рис. 1). Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелийзависимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группе с Ь-МАМЕ-индуцированпой патологией в сравнении с интактными животными. Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением артериального давления и брадикардией (рис. 2). После окончания миокардиалыюго компонента артериальное давление восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления артериального давления принимался нами как площадь эндотелиальной реакции. При этом очевидно, что площадь эндотелийзависимой реакции при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции в несколько раз меньше, чем у интактных животных.

кэд

300

250

о 200

ь а. 150

г 2 100

50

□ Интактныв ■ |_-ЫАМЕ

АДр

247,3*

Интактные ЬМЛМЕ

НС

100,0%

/ 199,2

/

%

□ Интактные ■ |.-МАМЕ

eNOS

72.9

25"

NOx

□ Интактные И|_-МАМЕ

□ Интактные ■ 1-МАМЕ

кмц

□ Интактныв * Ь-МАМЕ

Рисунок 1. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь^АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота. Примечание. Здесь и везде далее: КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции, АД - артериальное давление, АДр - адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением, е>Ю8 - экспрессия >Ю-синтазы, ЫОх - концентрация стабильных метаболитов оксида азота, КМЦ - диаметр кардиомиоцитов; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных.

Аналогично оценивали эндотелийнезависимую реакцию на нитропруссид. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в площадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис. 3).

Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиапьной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин.

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1±0,1, при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота - в 5 раз больше, его значение составило 5,4±0,6 (рис. 1кэд)-

Развитие патологии привело к увеличению абсолютных значений ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе с нагрузкой сопротивлением (рис. 1ад, Мс)- У интактных животных ЛЖД к 25 секунде снижалось до 83,6±7,7%, а у животных с Ь-МАМЕ-индуцированной патологией до значения - 66,0±5,5%.

Характерная динамика биохимических маркеров Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис. 1 ^ск, ыох- Так, концентрация нитрит-ионов (Ь10х) у животных, получивших Ь-ЫАМЕ, составила 61,2±3,6, тогда как у интактных животных этот показатель был на уровне 114,1±4,1 мкМоль. Экспрессия эндотелиальной ЫО-синтазы (еМОБ) в группе интактных животных и животных с патологией составила соответственно 72,9±3,8% и 21,4±4,7%.

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, явились результаты морфологических исследований (рис. 4). На представленных гистологических препаратах а - интактные кардиомиоциты, б - кардиомиоциты животных с Ь-ЫАМЕ патологией. При этом очевидно резкое увеличение площади поперечного сечения кардиомиоцитов при сохраненном диаметре ядер в группе животных, получавших Ь-ЫАМЕ. Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,1±1,1, а у животных с патологией 18,5±1,1 мкМ (рис. 1).

Таким образом, для оценки эндотелио- и кардиопротективного действия исследуемых препаратов нами был использован комплекс функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований, позволяющий дать интегральную характеристику эндотелиальной и миокардиальной функции сердечно-сосудистой системы. С этой целью значения САД, ДАД, КЭД, диаметра кардиомиоцитов, 1МОх и значение исчерпания миокардиального резерва были представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, с последующим расчетом площадей векторных диаграмм, которые выражались в условных единицах (усл. ед.).

ПЭС1 SYSTOLIC

Площади сосудистых реакций САД на ацетилхолин

«DC1 DIASTOLIC

Площади сосудистых реакций ДАД на ацетилхолин

FTI RATE

Hi ART RÖTE

Интактные животные

ИМ Hi >

IL

S12Hz{ И

Л«ЛЛ~-

Животные с L-NAME-индуцироваиным дефицитом оксида азота

Рисунок 2. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональных проб на эндотелийзависимую вазодилатацию у интактных животных и крыс с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией.

Примечание. Здесь и везде далее: САД - систолическое артериальное давление (мм рт. ст.), ДАД - диастолическое артериальное давление (мм рт. ст.), ЧСС -частота сердечных сокращений (уд./мин).

Площади сосудистых реакций САД на ннтропруссид

НС ) S1 Ячт

Площади сосудистых реакций ДАД на ннтропруссид

Рисунок 3. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональных проб на эндогелийнезависимую вазодилатацию у интактных животных и крыс с Е-ЫАМЕ-индуцированной патологией.

Рисунок 4. (а, б). Морфология миокарда у интактных и опытных животных. Примечание, а - кардиомиоциты у интактных животных на поперечном срезе; б - кардиомиоциты у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота (окр. гематоксилином и эозином; а, б - ув. 440).

При сравнении площадей векторных диаграмм имеют место выраженные различия между группой интактных животных и животных с патологией, которые можно объяснить за счет вклада достоверно более высокого значения систолического и диастолического давлений, КЭД, диаметра кардиомиоцитов, а также увеличения исчерпания миокардиального резерва и снижения N0-продуктивной активности эндотелия, что может соответствовать симптомокомплексу АГ и эндотелиапьной дисфункции в эксперименте (рис. 5).

ПА 5-25

ДАД ПА

КМЦ КМЦ

Мнтактмые животные Животные с Ь-МАМЕ-иидуинроиапным

дефицитом оксида азота Рисунок 5. Векторные диаграммы функциональных, биохимических и морфологических показателей интактных животных и животных с моделированием Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота. Примечание. Здесь и везде далее: N0 - суммарный уровень метаболитов оксида азота, ПА 5-25 — исчерпание миокардиального резерва, Б - площадь векторной диаграммы; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных.

2. Исследование эндотелиопротективной активности Ь-аргинина БЯ при L-NAME-иlIдyциpoвaнIIorl модели дефицита оксида азота.

2.1. Исследование эндотелиопротективной активности Ь-аргинина БЯ с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.

Проведенные нами исследования показали, что донатор оксида азота Ь-аргинин БЯ обладает эндотелиопротективным эффектом, выражающимся в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции. Так, КЭД в группе интактных животных составил 1,1 ±0,1, при Ь-МАМЕ-ипдуцированном дефиците оксида азота - 5,4±0,6, на фоне введения Ь-аргинина БЯ (30 мг/кг) - 2,6±0,2 (рис. бкэд)-Обнаружено, что изучаемый препарат в исследуемых дозах не предотвращал развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов (рис. 6Ад).

При проведении пробы на адренореактивность Ь-аргинин БЯ предотвращал повышение значений левожелудочкового давления, вызванного Ь-МАМЕ-индуцированной патологией, так, на фоне препарата в дозе 30 мг/кг значение данного показателя было на уровне группы интактных животных и составляло 205,7±11,2 мм рт. ст. (рис. бАЛр). Аналогичная тенденция получена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением (рис. 6нс)- Сократимость левого желудочка на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составила 83,6±7,7% от величины 5 секунды, принятой за 100%, у животных с Ь-ЫАМЕ патологией - 66,0±5,5%, в группах, получавших лечение Ь-аргинином БЯ 30 мг/кг данный показатель был на уровне 89,3±3,4%.

>Ю-продуцирующая функция эндотелия исследована нами на основании определения в сыворотке крови суммарного уровня стабильных конечных метаболитов оксида азота (ИОх). Концентрация нитрит-ионов в сыворотке крови на фоне лечения Ь-аргинином 5К. 30 мг/кг увеличивалась и статистически достоверно не отличалась от уровня интактных животных (рис. бко*)-

Изучение влияния исследуемого нами препарата на диаметр кардиомиоцитов также выявило существенные преимущества Ь-аргинина БЯ 30 мг/кг в способности предотвращать гипертрофию миокарда, что выражалось в уменьшении поперечного сечения кардиомиоцитов до 11,3±1,2 мкМ, по сравнению с группой нелеченых животных - 18,5±1,1 мкМ (рис. 6Кмц)-

В качестве интегральной характеристики для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности Ь-аргинина БЯ нами использовались площади векторных диаграмм, которые позволили представить эффективность действия препарата в соответствующей дозе и наглядно отобразить различия между исследуемыми группами животных. В ходе выполнения исследования мы получили снижение значения площади векторной диаграммы в группе, получавшей Ь-аргинин БЯ 30 мг/кг до 7,41±0,42 усл. ед., против значения 10,12± 1,2 усл. ед. в контрольной группе (рис. 7).

лд............

□ Интактные ■ L-NAME в L-NAME+L-ap

АДР

L-NAME *L-■ ргинин SR 30 wlir

-Интактные

- L-NAME

- L-NAME+L-аргинин SR 30 мг/кг

О Интактные ■ L-NAME □ L-NAME+L-аргинин SR

NOx

25"

кмц

D Интактные ■ L-NAME а L-NAME+L-аргинин SR 30 мг/кг

□ Интактные ■ L-NAME а L-NAME+L-аргинин SR 30 мг/кг

Рисунок 6. Влияние L-аргинина SR 30 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME животных, ** - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных.

Таким образом, анализ совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей свидетельствует о выраженной эндотелио- и кардиопротективной активности донатора оксида азота L-аргинина SR 30 мг/кг при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте.

2.2. Сравнительное исследование влияния L-аргинина и VEGF на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Исследование влияния L-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте показало, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг повышает уровень микроциркуляции на всех сроках

САД

400

300

ПА 5-25

N0

КМЦ

ЫЧАМЕ + Ь-аргшшн 81* 30 мг/кг

Рисунок 7. Площади векторных диаграмм функциональных, биохимических и морфологических показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции Ь-аргинином БИ 30 мг/кг.

Примечание. Здесь и везде далее: контурной линией обозначена площадь векторной диаграммы показателей животных с Ь^АМЕ-индуцированным дефицитом N0; * - р<0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных.

Рисунок 8. Результаты измерения уровня микроциркуляции на различных сроках наблюдения при моделировании ишемии конечности у крыс. Примечание. * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.

наблюдения (10, 21, 28 сутки) после моделирования ишемии (рис. 8), а также активизирует неоангиогенез и улучшает перфузию ишемизированных мышц. Так, в группах животных, получавших Ь-аргинин и УЕвЕ, методом лазер-допгшеровской флоуметрии зафиксирована микроциркуляция соответственно на уровне 271,84±10,94 п.е. и 237,69±7,77 п.е. (14 сутки после моделирования ишемии), а плотность сосудов, полученная с использованием иммуногистохимической визуализации, соответствует значению

781,38±110,99 сосудов для Ь-аргинина и 1203,67±193,28 сосудов для УЕвР в поле зрения, что достоверно превышает данные показатели по сравнению с группой плацебо (рис. 9).

600 ■' = 500

-48МА

10 сутки 21 сутки 26 сутки

□ Контроль □ {--аргинин 200 мг/кг

I 500/1 1600 '•'!............71

. ; 373.12____________________ I 1ьии 1203,7*

I-г •Опгт ЭТРяН I

| 100- §1 § I 1 ' 400Л ив а я 1 о у____Ш.......1.....ж1_______I 5- 0ц_______Ш_____Шл______К ¡.

Ингактныа Ппацабо Ьаргинин УЕвР Интактные Плацебо Ьаргинин \ZEGF

Рисунок 9. Результаты изучения влияния Ь-аршнина 200 мг/кг в сравнении с УЕСР 250 мкг на показатели микроциркуляции и неоангиогенез при коррекции I ишемии конечности на 14 сутки наблюдения.

Примечание. УЕвР - фактор роста эндотелия сосудов; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, # - р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших плацебо.

Полученные данные свидетельствуют о неоангиогенном эффекте Ь-аргинина, который возможно объяснить наличием у него свойств донора N0, оказывающего вазодилатирующее, эндотелиопротективное действие и создающего оптимальные условия для компенсации ишемии - неоангиогенеза.

3. Исследование эндотелиопротективной активности резвератрола при Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота.

Наши дальнейшие исследования по указанному протоколу выявили, что активатор еЫОв резвератрол (2 мг/кг) и резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) не снижают АД до целевых значений, но проявляют выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня ¡,2±0,1 и 1,9±0,2 соответственно (рис. 10КЭд), а также в полном предупреждении снижения содержания нитрит-ионов 1чЮх (рис. 10Шх).

Проба на адренореактивность у животных с Ь-МАМЕ-индуцированной патологией на фоне терапии резвератролом (2 мг/кг) также выявила снижение максимальных цифр левожелудочкового давления до значения 211,9±12,2 мм рт. ст. по сравнению с группой нелеченых животных, у которых этот показатель был на уровне 247,3±4,8 мм рт. ст. (рис. 10АДр).

Аналогичная тенденция получена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением (рис. 10Нс)- Сократимость левого желудочка на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составила 83,6±7,7% от величины 5 секунды, принятой за 100%, у животных с Ь-ЫАМЕ патологией - 66,0±5,5%, в группе, получавшей лечение резвератролом (2 мг/кг) - 74,4±3,0%. При этом особого внимания заслуживает тот факт, что на фоне лечения резвератролом в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) имеет место значительное предотвращение снижения исчерпания миокардиального резерва, значение которого приближается к уровню интактных животных и соответствует 82,9±12,2 (рис. 10нс).

кэд

АД

а Интактные Я ЬМАМЕ О |_-МАМЕ+1 а ЬМАМЕ+П

АДр

-247'3"-228,5-

о Интактаые ■ ЬЫАМЕ а |_-ЫАМЕ+| Я 1_-ЫАМЕ*И

N0*

Л1АЛ-

О Интактные ■ ЬМАМЕ а ЬМАМЕ-И а Ь-МАМЕ+И

Рисунок 10. Влияние резвератрола

□ Интактные ■ Ь№МЕ 01-МАМЕ+| ИЬМАМЕ+И

2 мг/кг и резвератрола в составе

фосфолипидных наночастиц 0,15 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ы^АМЕ-индуцированного дефицита N0.

Примечание. 1 - резвератрол 2 мг/кг, II - резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц 0,15 мг/кг; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, ** - р<0,05 в сравнении с группой Ь^АМЕ животных.

Морфометрические исследования обнаружили способность резвератрола (2 мг/кг) и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) предотвращать гипертрофию миокарда, что выражалось в уменьшении поперечного сечения кардиомиоцитов соответственно до 9,8±1,2 и 11,1±1,1 мкМ по сравнению с группой нелеченых животных - 18,5±1,1 мкМ (рис. Юкмц)-

В качестве интегральной характеристики для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности исследуемого препарата нами использовались площади векторных диаграмм, которые позволили представить эффективность

действия резвератрола и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц в соответствующих дозах и наглядно отобразить различия между исследуемыми группами животных. В ходе выполнения исследования мы получили снижение значений площадей векторных диаграмм в группах, получавших резвератрол (2 мг/кг) и резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг), соответственно до 6,13±0,31 и 7,22±0,42 усл. ед., против значения 10,12±1,2 усл. ед. в контрольной группе, не получавшей лечения (рис. 11).

Таким образом, анализ совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей свидетельствует о выраженной эндотелио- и кардиопротективной активности активатора е>Ю8 резвератрола (2 мг/кг) и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте.

САД

500 у

400 300

САД 500

400

300 ■•

КМЦ КМЦ

ЫЧАМЕ + резвератрол 2 мг/кг Ь-1ЧАМЕ + резвератрол в составе

фосфолипидных наночастиц 0,15 мг/кг

Рисунок 11. Площади векторных диаграмм функциональных, биохимических и морфологических показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции резвератролом 2 мг/кг и резвератролом в составе фосфолипидных наночастиц 0,15 мг/кг.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой Ь^АМЕ животных.

4. Исследование эндотелиопротективнон активности препарата мексикор при Ь^АМЕ-ипдуцпрованной модели дефицита оксида азота.

Установлено, что антиоксидант оксипиридинового ряда мексикор (30 мг/кг) проявляет эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных 1,9±0,2 (рис. 12кэд). При этом определено, что изучаемый препарат в исследуемой дозе не предотвращал развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов (рис. 12АД).

□ Интактные ш 1_-МАМЕ Н 1.-МЛМЕ*мексикор 30 мг/кг

АДр

300 :__ 247,3»

, / 19Я

* - Интактные ■ ИЧАМЕ

*-1-ЫЛМЕ+мексикорЗО мг/кг

□ Интактные ■ [.-ММЕ а |--МАМЕ»мексикор 30 мг/кг

1ЧОх

□ Интактные ■ 1-№МЕ н Ь-МАМЕ+мексикор 30 мг/кг □ Интактные ■ ЬМАМЕ В Ц-МАМЕ+мексикор 30 мг/кг

Рисунок 12. Влияние мекеикора 30 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, ** - р<0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных.

САД

в = 6,7±0,3*

Рисунок 13. Площадь векторной диаграммы функциональных, биохимических и морфологических показателей при коррекции эндотслиалыюй дисфункции мексикором 30 мг/кг.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой Е-ЫАМЕ животных.

Одновременно нами обнаружено положительное влияние препарата на морфофункциональные показатели экспериментальных животных при коррекции исследуемой патологии.

Так, проба на адренореактивность у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота на фоне терапии мексикором (30 мг/кг) показала снижение максимальных цифр левожелудочкового давления до значения 225,2±5,2 мм рт. ст. по сравнению с группой нелеченых животных, у которых этот показатель был на уровне 247,3±4,8 мм рт. ст. (рис. 12ад,).

Аналогичная тенденция получена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением (рис. 12нс)- Сократимость левого желудочка на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составила 83,6±7,7% от величины 5 секунды, принятой за 100%, у животных с Ь-ИАМЕ патологией - 66,0±5,5%, в группе, получавшей лечение мексикором (30 мг/кг) - 84,2±5,1%.

Морфометрические исследования обнаружили способность мексикора (30 мг/кг) предотвращать гипертрофию миокарда, что выражалось в уменьшении поперечного сечения кардиомиоцитов до 13,0±1,1 мкМ по сравнению с группой нелеченых животных - 18,5±1,1 мкМ (рис. 12кмц)-

ЫО-продуцирующая функция эндотелия исследована нами на основании определения в сыворотке крови суммарного уровня стабильных конечных метаболитов оксида азота (1ЧОх). Получено, что мексикор (30 мг/кг) на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота полностью предотвращает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота, увеличивая их концентрацию до 91,5±7,6 мкМоль (рис. 12мох).

В качестве интегральной характеристики для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности исследуемого препарата нами использовались площади векторных диаграмм, которые позволили представить эффективность действия мексикора (30 мг/кг) в сравнении с контролем и наглядно отобразить различия между исследуемыми группами животных. В ходе выполнения исследования мы получили снижение значения площади векторной диаграммы в группе, получавшей мексикор (30 мг/кг), до 6,72±0,33 усл.ед., в то время как данный показатель в контрольной группе, не получавшей лечения, оставался на уровне 10,12±1,2 усл. ед. (рис. 13).

Таким образом, анализ совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей свидетельствует о выраженной эндотелио- и кардиопротективной активности антиоксиданта оксипиридинового ряда мексикора (30 мг/кг) при Ь-ЫАМЕ-индуцировашюй модели дефицита оксида азота в эксперименте.

5. Исследование эндотелнопротектнвной активности препаратов фосфоглив при Ь^АМЕ-индуцнрованнои модели дефицита оксида азота.

В ходе дальнейшего поиска препаратов с различными механизмами действия в качестве потенциальных эндотелиопротекторов было получено, что препараты на основе фосфатидилхолина сои и глицирризиновой кислоты -фосфоглив, фосфоглив форте и фосфоглив лиофилизат проявляют э ндотелиопротективное действие на модели Ь^АМЕ-индуцированного

дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и значительном снижении КЭД. Так, в группе интактных животных значение КЭД составляет 1,1 ±0,1, при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота - 5,4±0,6, на фоне введения фосфоглива (2,2 г/кг) -2,2±0,3, фосфоглива форте (0,515 г/кг) - 2,2±0,2, фосфоглива лиофилизат (5,0 мл/кг) - 3,1±0,4 и фосфоглива лиофилизат (0,5 мл/кг) - 2,9±0,5, что является достоверным подтверждением наличия эндотелиопротективной активности у исследуемых нами препаратов (рис. 14Кэд).

При этом показано, что фосфоглив, фосфоглив форте и фосфоглив лиофилизат в изучаемых дозах не предотвращали развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов (рис. 14 ад). Но несмотря на отсутствие гипотензивного действия, обнаружено положительное влияние препаратов на функциональные показатели экспериментальных животных при коррекции исследуемой патологии.

Так, проба на адренореактивность у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота на фоне терапии фосфогливом (2,2 г/кг), фосфогливом форте (0,515 г/кг) и фосфогливом лиофилизат (5,0 мл/кг) показала снижение максимальных цифр левожелудочкового давления соответственно до значений 214,5±13,5, 220,9±13,7, 225,4±6,0 мм рт. ст., по сравнению с группой нелеченных животных, у которых этот показатель был на уровне 247,3±4,8 мм рт. ст. (рис. 14лдр).

Аналогичная тенденция получена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением (рис. 14нс). Сократимость левого желудочка на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составила 83,6±7,7% от величины 5 секунды, принятой за 100%, у животных с Ь-ЫАМЕ патологией - 66,0±5,5%, в фуппах, получавших лечение фосфогливом (2,2 г/кг), фосфогливом форте (0,515 г/кг) и фосфогливом лиофилизат (5,0 мл/кг), имело место снижение исчерпания миокардиалыюго резерва соответственно до значений 80,2±6,6%, 79,0±6,6% и 81,8±3,5%. Данный результат свидетельствует о большей биологической доступности препарата фосфоглив лиофилизат, вероятно, за счет входящих в его состав фосфолипидных наночастиц, обеспечивающих высокую эффективность транспортной системы и способность восстанавливать структуру и нарушенные свойства мембран кардиомиоцитов, возникших при моделировании Ь-ЫАМЕ патологии.

Однако биохимическое и морфометрическое исследования не выявили выраженного протективного эффекта препаратов фосфоглив, фосфоглив форте и фосфоглив лиофилизат в отношении влияния на ЫО-продуцирующую функцию эндотелия и способность предотвращать гипертрофию миокарда экспериментальных животных. Содержание нитрит-ионов 1ЧОх в сыворотке животных и поперечное сечение кардиомиоцитов на фоне лечения достоверно не отличались от значений контрольной группы животных (рис. 14мох> Рис- 14кмц).

В качестве интегральной характеристики для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности исследуемых препаратов нами использовались

■ L-NAME В L-NAME+I □ L-NAME+III (] L-NAME+IV

Рисунок 14. Влияние препаратов фосфоглив на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. I - фосфоглив капсулы 2,2 г/кг, II - фосфоглив форте 0,515 г/кг, III - фосфоглив лиофилизат 5,0 мл/кг, IV - фосфоглив лиофилизат 0,5 мл/кг; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, ** - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME животных.

площади векторных диаграмм, которые позволили представить эффективность действия фосфоглива, фосфоглива форте и фосфоглива лиофилизат в сравнении с контролем и наглядно отобразить различия между исследуемыми группами животных. В ходе выполнения исследования мы получили снижение значений площадей векторных диаграмм в группах, получавших фосфоглив (2,2 г/кг), фосфоглив форте (0,515 г/кг), фосфоглив лиофилизат (5,0 мл/кг) и фосфоглив лиофилизат (0,5 мл/кг) соответственно до 7,50±0,49, 7,17±0,39, 8,09±0,92 и 8,18±1,10 усл. ед., в то время как данный показатель в контрольной группе, не получавшей лечения, оставался на уровне 10,12±1,2 усл.ед. (рис. 15).

САД САД

Ь-!\АМЕ + фосфоглив лиофилизат 5,0 мл/кг ЫЧАМЕ + фосфоглив лиофилизат 0,5 мл/кг

Рисунок 15. Площади векторных диаграмм функциональных, биохимических и морфологических показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами фосфоглив.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой Ь-Ь1АМЕ животных.

кмц

Ь^АМЕ + фосфоглив капсулы 2,2 г/кг

кмц

Ь^АМЕ + фосфоглив форте 0,515 г/кг САД

ПА

ПА

Таким образом, анализ совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей свидетельствует о выраженной эндотелио- и кардиопротективной активности препаратов на основе фосфатидилхолина сои и глицирризиновой кислоты - фосфоглива, фосфоглива форте и фосфоглива лиофилизат при Ь-]ЧАМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте.

6. Исследование эидотелиопротективной активности препарата милдронат при Ь^АМЕ-индуцированнои модели дефицита оксида азота.

Полученные данные подтверждают высказанное нами предположение о способности цитопротекторов метаболического действия проявлять эндотелиопротективный эффект на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 в эксперименте. Установлено, что кардиоцито протектор (ингибитор гамма-бутиробетаингидроксилазы) милдронат (80 мг/кг) способствует повышению эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижению КЭД до уровня интактных животных 1,7±0,2 (рис. 16Кэд)- При этом получено, что изучаемый препарат в исследуемой дозе не предотвращал развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов (рис. 16ад).

Одновременно нами обнаружено положительное влияние препарата на морфофункциональные показатели экспериментальных животных при коррекции исследуемой патологии.

Так, проба на адренореактивность у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота на фоне терапии милдронатом (80 мг/кг) показала снижение максимальных цифр левожелудочкового давления до значения 219,9±5,7 мм рт. ст. по сравнению с группой нелеченых животных, у которых этот показатель был на уровне 247,3±4,8 мм рт. ст. (рис. 16Адр).

Аналогичная тенденция получена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением (рис. 16нс). Сократимость левого желудочка на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составила 83,6±7,7% от величины 5 секунды, принятой за 100%, у животных с Ь-1ЧАМЕ патологией - 66,0±5,5%, в группе, получавшей лечение милдронатом (80 мг/кг), - 81,3±5,2%.

Морфометрические исследования обнаружили способность милдроната (80 мг/кг) предотвращать гипертрофию миокарда, что выражалось в уменьшении поперечного сечения кардиомиоцитов до 12,9±1,7 мкМ по сравнению с группой нелеченых животных- 18,5±1,1 мкМ (рис. 16Кмц)-

ЫО-продуцирующая функция эндотелия исследована нами на основании определения в сыворотке крови суммарного уровня стабильных конечных метаболитов оксида азота (1ЧОх). Получено, что милдронат (80 мг/кг) на фоне Ь-КАМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота полностью предотвращает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота, увеличивая их концентрацию до 105,4±8,9 мкМоль(рис. 16мох).

В качестве интегральной характеристики для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности исследуемого препарата нами использовались площади векторных диаграмм, которые позволили представить эффективность

кэд

□ Интактные ■ ЬЫАМЕ ПО 1_-МАМЕ+милдронзт 80 мг/кг

АДр

247,3« : •19,9'"-

□ Интактные ■ [--МАМЕ: ш ЬМАМЕ+миларонат 80 мг/кг 60 0%

N0*

- ♦ ■ Интактные не- Ь-ИАМЕ

- л 1_-Г^АМЕ*м*гщрокат 80 мг/кг

25"

140

120

100

Л с: 80

п

Ь ВО

5 40

20

0

114.1

У 6172^1

ив

□ Интактные ■ 1_-МАМЕ □ 1_-МАМЕ+миларонат 80 мг/кг □ интактные ■ ИЧАМЕ □ |_-МАМЕ+ми/щронат 80 мг/кг

Рисунок 16. Влияние милдроната 80 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь^АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, ** - р<0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных.

Рисунок 17. Площадь векторной диаграммы функциональных, биохимических и морфологических показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции милдронатом 80 мг/кг.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных.

в = 6,6±0,3

действия милдроната (80 мг/кг) в сравнении с контролем и наглядно отобразить различия между исследуемыми группами животных. В ходе выполнения исследования мы получили снижение значения площади векторной диаграммы в группе, получавшей милдронат (80 мг/кг), до 6,61±0,33 усл. ед., в то время как данный показатель в контрольной группе, не получавшей лечения, оставался на уровне 10,12±1,2усл. ед. (рис. 17).

Таким образом, анализ совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей свидетельствует о выраженной эндотелио- и кардиопротективной активности кардиоцитопротектора милдроната (80 мг/кг) при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте.

7. Исследование эндотелиопротсктнвной активности препарата импаза при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота.

В качестве потенциального эндотелиопротектора нами исследовался гомеопатический препарат импаза, представляющий собой афинно очищенные антитела к эндотелиальной ЫО-синтазе (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С200). Получено, что импаза (1 таблетка/кг, на 100 мл воды при свободном доступе) способствует повышению эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижению КЭД до уровня интактных животных 2,1±0,2 (рис. 18Кэд)- При этом установлено, что изучаемый препарат в исследуемой дозе не предотвращал развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов (рис. 18ад).

В ходе дальнейших исследований нами обнаружено положительное влияние препаратов на функциональные показатели экспериментальных животных при коррекции исследуемой патологии.

Так, проба на адренореактивность у животных с Ь-Ь'АМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота на фоне терапии препаратом импазой показала снижение максимальных цифр левожелудочкового давления до значения 211,1±10,2 мм рт. ст. по сравнению с группой нелеченых животных, у которых этот показатель был на уровне 247,3±4,8 мм рт. ст. (рис. 18АДр).

В пробе на нагрузку сопротивлением выявлено предотвращение исчерпания миокардиапьного резерва при применении исследуемого препарата. Сократимость левого желудочка на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составила 83,6±7,7% от величины 5 секунды, принятой за 100%, у животных с Ь-ЫАМЕ патологией - 66,0±5,5%, в группе, получавшей лечение препаратом импаза - 82,9±2,9%, что соответствует уровню интактных животных (рис. 18нс).

Морфометрические исследования обнаружили незначительную способность импазы предотвращать гипертрофию миокарда, что выражалось в уменьшении поперечного сечения кардиомиоцитов до 16,9±1,1 мкМ по сравнению с группой нелеченых животных - 18,5±1,1 мкМ (рис. 18кмц)-

ЫО-продуцирующая функция эндотелия исследована нами на основании определения в сыворотке крови суммарного уровня стабильных конечных метаболитов оксида азота (МОх). Получено, что импаза на фоне Ь-ЫАМЕ-

КЭД

О Иктактиые ■ 1_-МАМЕ В ИЧАМЕ+импаза 1 табЛг

АДР

247,3*

О Интактные ■ Ь-МАМЕ И [.-МАМЕ+импаэа 1 таб./кг

N0*

- Интактные -»- 1-МА.МЕ

ь-МАМЕ+импаза 1 та8./кг

25"

кмц

□ Интактные И|_-МАМЕ 0 ЬИАМЕ+иыпаза 1 таб /кг

1_-МАМЕ П ЬМАМЕ+импаза 1 табЛг

Рисунок 18. Влияние импазы 1 таб./кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, ** - р<0,05 в сравнении с группой Ь-МАМЕ животных.

индуцированной модели дефицита оксида азота предотвращает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота, увеличивая их концентрацию до 90,2±7,4 мкМоль (рис. 1

В качестве интегральной характеристики для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности исследуемого препарата нами использовались площади векторных диаграмм, которые позволили представить эффективность действия импазы в сравнении с контролем и наглядно отобразить различия между исследуемыми группами животных. В ходе выполнения исследования мы получили снижение значения площади векторной диаграммы в группе, получавшей препарат импазу, до 6,82±0,34 усл. ед., в то время как данный

ДАД

Рисунок 19. Площадь векторной диаграммы функциональных, биохимических и морфологических показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции импазой 1 таб./кг.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных.

показатель в контрольной группе, не получавшей лечения, оставался на уровне 10,12±1,2 усл. ед. (рис. 19).

Таким образом, полученные результаты комплексной оценки САД, ДАД, КЭД, ЫО-продуциругощей функции эндотелия, поперечного сечения кардиомиоцитов, показателей миокардиальной пробы с нагрузкой сопротивлением свидетельствуют о выраженной эндотелио- и кардиопротективной активности гомеопатического препарат импаза при Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте.

8. Использование интегрального анализа совокупности гемодинамических, биохимических и морфологических показателей.

Использование интегрального анализа совокупности гемодинамических, биохимических и морфологических показателей позволило дать визуальную характеристику функции эндотелия и сократимости миокарда, а также представить эффективность действия исследуемых препаратов в интегральном контексте на фоне моделирования Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Дальнейший анализ векторных диаграмм привел к расчету дельты эндотелиопротекции (1) и ее вероятностного процента (2):

1эи

_ С

А!АМЕ препарата , ГД6

(1)

Аэн - дельта эндотелиальной дисфункции,

8ычаме- площадь фигуры при Ь-ЫАМЕ гипертензии,

8препарата- площадь фигуры при коррекции Ь-КАМЕ исследуемым препаратом;

А-

100%

1 эн 1 , где

Рэн - вероятностный процент,

интактных

При проведении расчетов получили, что дельта Ь-МАМЕ-индуцировапного дефицита оксида азота равна 4,64 (усл. ед.), данную величину принимали за 100% при последующих расчетах вероятностного процента эндотелиопротекции для каждого исследуемого препарата (рис. 20).

Данный подход позволил упрощенно, но интегративно представить эффективность действия препаратов в соответствующих дозах при коррекции Ь-ЫАМЕ-индунированного дефицита оксида азота и наглядно отобразить различия между исследуемыми препаратами, которые расположились в следующий ряд: резвератрол > милдронат > мексикор > импаза > резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц > фосфоглив форте > Ь-аргинин $К > фосфоглив > фосфоглив (лиофилизат).

120,0 100,0 80,0 % 60,0 40,0 20,0

0,0

1^0,0

,63,6

86,0*

* _L1_ ¡¿¿¿Я 1^=1 Г^

41,8*43,8

I II III IV

VI VII VIII IX

XI

Рисунок 20. Вероятностный процент эндотелиопротекции исследуемых препаратов при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота. Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных;

I - Интактные

II - L-NAME+Фосфоглив лиофилизат 0,5 мл/кг

III - L-NAME+Фосфоглив лиофилизат 5,0 мл/кг

IV - L-NAME+Фосфоглив 2,2 г/кг

V - L-NAME+L-аргинин SR 30 мг/кг

VI - L-NAME+Фосфоглив форте 0,515 г/кг

VII - L-NAME+Резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц 0,15 мг/кг

VIII - L-NАМЕ+Импаза 1 таб./кг

IX - L-NAME+Мексикор 30 мг/кг

X - L-NAME+Милдронат 80 мг/кг

XI - L-NAME+Резвсратрол 2,0 мг/кг

Таким образом, в результате наших исследований впервые разработаны принципы медикаментозной и немедикаментозной коррекции эндотелиальной дисфункции и проведена оценка эндотелиопротективного действия препаратов с различными механизмами действия на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте.

выводы

1. Введение в течение 7 суток №-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (Ь-ЫАМЕ) в дозе 25 мг/кг/сутки вызывает у лабораторных животных развитие эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся закономерной динамикой функциональных, биохимических и морфометрических маркеров. Наиболее информативным оказался коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), представляющий собой соотношение площади над кривой сосудистой реакции на эндотелийнезависимую вазодилатацию (нитропруссид натрия) к площади сосудистой эндотелийзависимой вазодилатации (ацетилхолин). КЭД при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 оказался в 5 раз выше, чем у интактных животных. Параллельно наблюдалось развитие выраженной артериальной гипертензии (190/145 мм рт. ст.), повышение адренореакгивности, снижение резервов сократимости миокарда, уменьшение в 3,5 раза уровня стабильных метаболитов оксида азота МОх и снижение в 2 раза экспрессии еМОБ, а также развитие гипертрофии миокарда.

2. Донатор оксида азота Ь-аргшшн ЭЯ 30 мг/кг проявляет выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижении КЭД до значения 2,6±0,2, и предупреждении снижения содержания уровня стабильных метаболитов оксида азота ЫОх. Одновременно нагрузочные пробы и морфометрия показали предотвращение повышения адренореактивности, уменьшение исчерпания миокардиального резерва и ограничение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов. Цифры АД не достигали целевых значений.

Исследование влияния Ь-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте показало, что Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг активизирует неоангиогенез и улучшает перфузию ишемизированных мышц.

3. Активатор е>Ю8 резвератрол (2 мг/кг) и резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) проявляют выраженное эндотелиопротективное действие на модели ЫМАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня 1,2±0,1 и 1,9±0,2 соответственно, а также в полном предупреждении снижения содержания Тч'Ох. При этом нагрузочные пробы и морфометрия выявили уменьшение исчерпания миокардиального резерва одновременно с ограничением увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов. Значения АД не достигали заданных величин. Резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц проявлял сопоставимую эндотелиопротекторную активность в дозе 0,15 мг/кг, что почти в 10 раз меньше, чем дозировка традиционной субстанции. Это позволяет предположить его большую биодоступность и активность.

4. Антиоксидант оксипиридинового ряда мексикор 30 мг/кг проявляет эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижении КЭД до значений 1,9±0,2 и предупреждении снижения содержания уровня стабильных метаболитов оксида азота Тч'Ох. Одновременно обнаружено предотвращение повышения адренореактивности и уменьшение исчерпания миокардиального резерва. Морфологические исследования показали ограничение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов. Цифры АД не достигали целевых значений.

5. Препараты, содержащие эссенциальные фосфолипиды, фосфоглив (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) в дозе 0,515 г/кг, фосфоглив (лиофилизат) в дозе 5,0 мл/кг (сопоставимые по фосфотидилхолину), а также 0,5 мл/кг, проявляют эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫЛМП-индуцировапного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД соответственно до 2,21.0,3, 2,2Ю,2, 3,1±0,4 и 2,9±0,5 по сравнению с контрольной группой животных (5,4±1,1). Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение увеличения адренореактивности и снижения сократительного резерва. При исследовании эндотелиопротективного эффекта компонентов в сопоставимых по фосфотидилхолину величинах обнаружено, что основной вклад вносят фосфотидилхолин и глицират при их положительном фармакодииамнческом взаимодействии.

6. Кардиоцитопротектор (ингибитор гамма-бутиробетаингидроксилазы) милдронат 80 мг/кг проявляет выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь^АМЕ-ипдуцироваппого дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижении КЭД до значений 1,7±0,2 и полном предупреждении снижения уровня стабильных метаболитов оксида азота МОх. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение развития гиперадренореактивности и уменьшение исчерпания миокардиального резерва. Морфометрические исследования кардиомиоцитов обнаружили ограничение под влиянием милдроната увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов. Значения АД не достигали целевого уровня.

7. Гомеопатически потенцированные антитела к еМОБ (С12, СЗО, С200) -препарат импаза (1 таблетка/кг, на 100 мл воды при свободном доступе), проявляют выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижении КЭД до уровня 2,1±0,2 и предотвращении снижения содержания ЫОх. Значения АД не достигали заданных величин. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности, уменьшение исчерпания миокардиального резерва при отсутствии достоверной динамики морфометрических показателей кардиомиоцитов.

8. Расчет площадей векторных диаграмм, учитывающих комплекс функциональных, биохимических и морфометрических показателей, обнаружил, что значения интегральных площадей интактных животных (5,5±0,3) и животных с L-NAME-индуцированным дефицитом NO (10,1±1,2) отличаются друг от друга почти в 2 раза. Анализ эффективности изученных путей фармакологических воздействий на патогенетические механизмы развития ЭД показал, что все фармакологические группы проявляют выраженную эндотелиопротективную активность и при интегральной оценке эндотелиопротекции располагаются в следующем порядке:

активатор eNOS резвератрол > кардиоцитопротектор (ингибитор гамма-бутиробетаингидроксилазы) милдронат > антиоксидант оксипиридинового ряда мексикор > гомеопатически потенцированные антитела к eNOS (С 12, СЗО, С200) - препарат импаза > резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц > фосфоглив форте (капсулы) > донатор оксида азота L-аргинин SR > фосфоглив > фосфоглив (лиофилизат).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. К определению нитратов и нитритов в крови у крыс как биохимических маркеров состояния эндотелия сосудов / В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова, Г.С. Лазаренко, Т.Г. Покровская // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. юбилей, науч. конф. КГМУ и сес. ЦентральноЧерноземного науч. центра РАМН, посвящ. 70-летию КГМУ: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2005. - Т. 2. - С. 132.

2. Корреляционные взаимоотношения между гемодинамическими и кардиохронотропными параметрами при L-NAME-индуцированной и вазоренальной гипертензии / Е.Б. Артюшкова, Е.Г. Черных, В.В. Гуреев, М.П. Гладченко // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. юбилей, науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН, посвящ. 70-летию КГМУ: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2005. - Т. 2. - С. 120-121.

3. Методология корреляционной оценки состояния эндотелия сосудистой стенки и сократимости миокарда / JI.M. Даниленко, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова, Г.С. Лазаренко // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. юбилей, науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН, посвящ. 70-легию КГМУ: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2005. - Т. 2. -С. 127-128.

4. Протокол исследования: влияние L-аргинина на уровень артериального давления и сосудистую реактивность у больных мягкой и умеренной артериальной гипертонией / Е.Б. Артюшкова, Т.Г. Покровская, Я.И. Залозных, Е.А. Зубарев // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. юбилей, науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН, посвящ. 70-летию КГМУ: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2005. - Т. 2. -С. 119-120.

5. Сравнительная оценка показателей гемодинамики при L-NAME-индуцированной и вазоренальной гипертонии на фоне проведения нагрузочных проб / Е.Б. Артюшкова, И.А. Лебедева, В.В. Гуреев, М.П. Гладченко // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. юбилей, науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН, посвящ. 70-летию КГМУ: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2005. - Т. 2. - С. 118-119.

6. Изучение эффектов синтетических доноров оксида азота при L-NAME-нндуцированной эндотелиальной дисфункции / JI.В. Корокина, В.Г. Гранин, В.А. Макаров, Е.Б. Артюшкова и др. // Кубанский науч. мед. вести.- 2006. - № 9 (90). - С. 141-145.

7. К вопросу коррекции эндотелиальной дисфункции с использованием эндогенного донатора оксида азота / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова, Г.С. Лазаренко // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. 71-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН. - 2006. - Т. 2. - С. 251-252.

8. Эндотелиотропное действие экстракта листьев винограда / В.И. Кочкаров, В.Ю. Чердаков, Е.Б. Артюшкова // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. 71-й науч. конф. КГМУ и сес. ЦентральноЧерноземного науч. центра РАМН. - 2006. - Т. 2. - С. 240-241.

9. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-нндуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова и др. // Кубанский науч. мед. вестн. -2006.-Х» 10(91).-С. 72-77.

10. Методология оценки фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова и др. // Рос. науч. конф. с междунар. участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии». - Курск, 2006. -Т. II.-С. 333-336.

11. Новый взгляд на коррекцию эндотелиальной дисфункции / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова и др. // Russian journal of immunology. - 2006. - Vol. 9, supp. 3. - P. 59-63.

12. Оценка эндотелиотропных свойств эндогенного донатора оксида азота L-аргинина в условиях овариэктомии / Т.Г. Покровская, М.В. Корокин, Е.Б. Артюшкова и др. // Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации: материалы I Нац. конгр. терапевтов. - М., 2006. - С. 175.

13. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Рос. науч. конф. с междунар. участием «Медико-

биологические аспекты мультифакториалыюй патологии». - Курск, 2006. -Т. II. - С. 336-340.

14. Сравнительное исследование эндотелио- и кардиопрогективных свойств фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorca dcltoiilea и 17-р-эстрадиола / М.В. Корокин, А.М. Носов, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Кубанский науч. мед. вестн. -2006. - № 9 (90). - С. 137-140.

15. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты препаратов с антиоксидантной активностью / JI.M. Даниленко, Э.А. Парфенов, А.И. Елькин, Е.Б. Артюшкова и др. // Прикладные информационные аспекты медицины: науч.-практ. журн. / Воронеж, гос. мед. акад. - 2006. - Т. 9, № 1. - 222 с.

16. Эндотелиопротективное действие L-аргинина при фармакологическом способе моделирования дефицита оксида азота / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Л.М. Даниленко, Е.Б, Артюшкова и др. // «Научные ведомости» Белгородского гос. ун-та. - 2006. - № 3 (23), Вып. 4. -С. 43-51.

17. Эндотелиопротективные эффекты резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном при экспериментальном моделировании оксида азота / В.И. Кочкаров, М.В. Покровский, М.М. Корнсев, Е.Б. Артюшкова и др. // Кубанский науч. мед. вестн. -2006. - № 9 (90). - С. 150-152.

18. Влияние антиоксидантов pQ510 и резвератрола на регуляторную функцию эндотелия у крыс с моделированной артериальной гипертонией / Н.Г. Туманова, Е.Б. Артюшкова, В.А. Метсльская и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, № 6. - С. 619-622.

19. Возможности непрямой реваскуляризации при критической ишемии конечности / Д.В. Пашков, А.Д. Мясников, Б.С. Суковатых, Е.Б. Артюшкова и др. // Бюл. НЦССХ им, А.Н. Бакулева РАМН. XI Ежегод. сес. науч. центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН с Всерос. конф. молодых ученых. - 2007. - Т. 8, № з. - С. 83.

20. Возможности фармакологической коррекции ишемии конечности L-аргинином в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, М.В. Покровский и др. // VI междунар. конф. «Клинические исследования лекарственных средств». - М., 2007. - С. 9-11.

21. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, Б.С. Суковатых и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2007. - Л» 1-2 (94-95). -С. 19-22.

22. Возможность использования эндотелиопротекторных аддитивов для массовой профилактике сердечно-сосудистых заболеваний / Т.И. Зеленкова, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова и др. // Междунар. науч,-практ. конф. «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества» (26-27 марта 2007 г., г. Курск). - Курск, 2007. - С. 249-252.

23. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов препарата «Кардионат» при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / М.В. Корокин, Е.В. Артюшкова, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2007. - № 3. -С. 5-9.

24. Исследование эндотелиопротективных эффектов комбинации L-аргинина и резвератрола / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации: материалы И нац. коигр. терапевтов. - М., 2007. - С. 178.

25. Исследование эндотслнопротсктивных эффектов комбинации L-аргинина и резвератрола при моделировании гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции / 'Г.Г.Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. //VI междунар. конф. «Клинические исследования лекарственных средств». - М., 2007. - С. 91-93.

26. Кардиопротсктивпыс эффекты антиоксидантов -металлокомплексных соединений / А.И. Маяков, Т.Г. Покровская, В.А. Малыхин, Е.Б. Артюшкова и др. // Междунар. науч.-практ. конф. «Теоретические к прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества» (26-27 марта 2007 г., г. Курск). - Курск, 2007. - С. 283-284.

27. Кардиопротективные эффекты импазы при экспериментальном моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции / A.C. Белоус, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова и др. //VI междунар. конф. «Клинические исследования лекарственных средств». - М., 2007.-С. 17-18.

28. Комбинированная фармакологическая и хирургическая коррекция хронической ишемии конечности в эксперименте / А.Д. Мясников, Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков и др. // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». -2007. - № 4. - С. 17-21.

29. Коррекция дисфункции эндотелия антителами к ферменту NO-синтазе / A.C. Белоус, Т.Г. Покровская, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Междунар. науч.-практ, конф. «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества» (26-27 марта 2007 г., г. Курск). - Курск, 2007. - С. 213-215.

30. Морфофункциональные изменения миокарда при экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции / Т.Г. Покровская, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации: материалы II нац. конгр. терапевтов. - М., 2007. - С. 177.

31. Применение L-аргинина в комплексе с амлодипином и индапамидом при экспериментальном моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции / Я.И. Залозных, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова и др. // Кубанский науч. мед. всстн. - 2007. - № 1-2 (94-95). - С. 52-55.

32. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Кубанский науч. мед. вести. - 2007. -№ 1-2 (94-95). - С. 146-150.

33. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты смеси гомеопатических разведений афннно очищенных поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота (eNOS) С12, СЗО, С200 при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / A.C. Белоус, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова и др. И Кубанский науч. мед. вести. - 2007. - № 1-2 (94-95). - С. 23-26.

34. Эндотелиопротективные эффекты импазы при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / A.C. Белоус, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова и др. // VI междунар. конф. «Клинические исследования лекарственных средств», - М., 2007.-С. 16-17.

35. Эндотелиопротективные эффекты препарата импаза при длительном применении на фоне экспериментального моделирования L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / A.C. Белоус, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова и др. // Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации: материалы II нац. конгр. терапевтов. - М., 2007. - С. 22.

36. Эндотелиопротективные эффекты препаратов фосфоглив при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / Е.Б. Артюшкова // Кубанский науч. мед. вести. - 2008. - № 3-4 (102-103). -С. 67-73.

37. Влияние фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorea Dcltoidca на регуляторную функцию эндотелия при моделировании гипоэстроген-нндуцированной эндотелиальной дисфункции / Е.Б. Артюшкова, Н.Г. Туманова, В.А. Метельская и др. // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2008. - № 2. - С. 85-89.

38. Возможности комбинированной фармакологической и хирургической коррекции хронической ишемии конечностей в эксперименте / K.U. Артюшкова, Д.В. Пашков, А.Д. Мясников и др. // Рос. мед.-биолог. вести, им. акад. И.П. Павлова. - 2008. - № 1. - С. 8-13.

39. Возможности коррекции регуляторной функции эндотелия фуростаноловыми гликозидами из культуры клеток растения Dyoscorea deltoidea / M.B. Корокин, M.B. Покровский, Н.Г. Туманова, Е.Б. Артюшкова и др. II Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. -С. 641.

40. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, М.В. Покровский и др. И Эксперим. и клннпч. фармакология. - 2008. -Т. 71, №3.-С. 23-25.

41. Доноры оксида азота в коррекции хронической ишемии конечности / Е.Б. Артюшкова, М.В. Покровский, Д.В. Пашков и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 581.

42. Изучение кардиопротсктивпых эффектов препарата импаза в комплексе с лозартаном при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцировапного дефицита оксида азота / Л.С. Белоус, Т.Г. Покровская, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 589.

43. Изучение эндотелиопротсктивных эффектов препарата импаза в комплексе с лозартаном при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / A.C. Белоус, Т.Г. Покровская, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 589.

44. Изучение эффектов фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorea Deltoidea при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Корокин, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 1. - С. 154.

45. Использование потенцированных антител к eNOS для коррекции дисфункции эндотелия / A.C. Белоус, Т.Г. Покровская, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. И Аллергология и иммунология. -2008.-Т. 9, № 1.-С. 153.

46. Исследование кардиопротективных эффектов 3-(2,2,2-триметилгидрозинин) пропионата дигидрата при моделировании дефицита оксида азота с помощью специфической блокады индуцибельной NO-синтазы / Е.Б. Артюшкова, М.В. Корокин, М.В. Покровский и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 1. - С. 157.

47. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинаций основных групп антигипертензивных средств с L-аргинином при эндотелиальной дисфункции в эксперименте / Т.Г. Покровская, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова и др. II Рос. мед.-биолог. вестн. им. акад. И.П. Павлова. -2008. - № 2. - С. 126-131.

48. К вопросу фармакологической коррекции гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции / М.В. Корокин, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова и др. // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2008. - № 1. - С. 31-35.

49. Кардиопротективные эффекты резвератрола при экспериментальной блокаде нндуцибелыюй синтазы оксида азота /

B.И. Кочкаров, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 1. - С. 157.

50. Метаболическая и антиоксидантная терапия L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / Е.Б. Артюшкова, М.В. Покровский, Е.В. Артюшкова и др. II Кубанский науч. мед. вестн. -2008. - № 3-4 (102-103). - С. 73-78.

51. Нарушение микроциркуляции в костной ткани как звено патогенеза остеопороза / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 616.

52. Неоангиогенные эффекты VEGF, L-аргинина и резвератрола в сравнительном аспекте / Д.В. Пашков, М.В. Покровский, З.И. Цоколаева, Е.Б. Артюшкова и др. // Бюл. НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. XII Ежегод. сес. науч. центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН с Всерос. конф. молодых ученых. - 2008. - Т. 9, № 3. - С. 83.

53. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты препарата фосфоглнв при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / Е.Б. Артюшкова, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская и др. // Рос. мед.-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2008. - № 4. - С. 42-47.

54. Эндотслиопротективные эффекты L-аргшшиа при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2008. - Т. 71, № 2. - С. 29-31.

55. Эндотслиопротективные эффекты нового иммуномодулитора фосфоглнв форте, содержащего фосфотидилхолин и тринатриевую соль глициризиновой кислоты / Е.Б. Артюшкова, М.В. Покровский, ILA. Кедровская и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. - Г. 9, № 1. -

C. 153.

56. Эндотелиопротективные эффекты препарата Мексиприм при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте / Т.Г. Покровская, К.Е. Бобраков, М.В. Покровский, Е.Б. Лртюшкова и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 685.

57. Эндотелиопротективные эффекты Силденафила при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / Т.Г. Покровская, Т.Н. Чулюкова, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Сб. материалов XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 685.

58. Application of the admixture of solutions homeopathist of delutions of polyclonal rabbit antibodies to endothelial synthase nitrogen of oxide the person -C12, C30, C200., for correction of endothelial dysfunction / A.S. Belous, T.G. Pokrovskaya, M.V. Pokrovskiy, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. - P. 23-24.

59. Application resveratrol with lozartan at experimental modeling deficiency of nitrogen oxide / V.l. Kochkarov, M.V. Pokrovskiy, M.M. Korneev, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. -P. 97.

60. Correction L-NAME-induced of endothelial dysfunction at application resveratrol in the combination with amlodipin / V.l. Kochkarov, T.G. Pokrovskaya, M.M. Korneev, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. - P. 98,

61. Endothelioprotective action of the extract of leaves of grapes at L-NAME-induced deficiency of nitrogen oxide / V.l. Kochkarov, T.G. Pokrovskaya, M. Stancovich, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. - P. 99-100.

62. Endothelioprotective action resveratrol at L-NAME-induced endothelial dysfunction / V.l. Kochkarov, T.G. Pokrovskaya, M.M. Korneev, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. - P. 98-99.

63. Endothelioprotective effects diathilcarbamates at L-NAME-induced deficiency of nitrogen oxide / L.V. Korokina, V.G. Granik, V.A. Makarov, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. -P. 94-95.

64. Pharmacological correction of extremity ischemia by means of L-arginin / E.B. Artjushkova, D.V. Pashkov, M.V. Pokrovskiy et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. - P. 12-13.

65. Studing of action resveratrol on the background of application indapamid / V.I. Kochkarov, T.G. Pokrovskaya, M.M. Korneev, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. - P. 100-101.

66. Studing of hemodynamic effects of synthetic donors of nitrogen oxide / L.V. Korokina, V.G. Granik, V.A. Makarov, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. - P. 95-96.

67. Use furostanole glycosides from culture of cells dyoscorea deltoidea at experimental endothelial dysfunction / M.V. Korokin, A.M. Nosov, T.G. Pokrovskaya, E.B. Artjushkova et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy: materials of the 2nd Russia-Chinese international scientific conference of pharmacology. - Perm, 2006. - P. 93-94.

Патенты

1. Пат. 2271202 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/198. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции / соавт. М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. - №2005113244/14, заявл. 04.05.2005; опубл. 10.03.06, Бюл. №7.-4 с.

2. Пат. 2296566 Российская Федерация МПК7 А61К 31/4422. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией амлодипина и L-аргинина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140965/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 10.04.07, Бюл. № 10.-4 с.

3. Пат. 2301015 Российская Федерация, МПК7 А61В 5/02. Способ оценки эндотелиальной дисфункции / соавт. М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. -№ 2005113243/14, заявл. 10.1.2006; опубл. 20.06.07, Бюл. № 17. - 7 е.: ил.

4. Пат. 2301670 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/401. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией эналаприла и резвератрола при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский,

Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140966/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 27.06.07, Бюл. № 18. - 5 с.

5. Пат. 2302239, МПК7 А61К 31/198, Способ фармакологической коррекции ишемии конечности / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. - № 2006125313/14, заявл. 14.07.2006; опубл. 10.07.07, Бюл. № 19. - 3 с.

6. Пат. 2302241 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/4045. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией индапамида и резвератрола при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г.Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140969/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 10.07.07, Бюл. № 19.-4 с.

7. Пат. 2306924 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/05. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией лозартана и резвератрола при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота/ М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140967/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 27.09.07; Бюл. №27.-4 с.

8. Паг. 2306929 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/4045. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией индапамида и Ь-аргинина при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140970/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 27.09.07, Бюл. № 27. - 4 с.

9. Пат. 2306930 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/4178. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией лозартана и Ь-аргинина при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140968/14, заявл. 28.12.2005; опубл. 27.09.07, Бюл. № 27. - 4 с.

10. Пат. 2306953, МПК7 А61К 39/395. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота человека - С12, СЗО, С200 / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова, А.С. Белоус. - № 2006125314/14, заявл.14.07.2006; опубл. 27.09.07, Бюл. №27.-4 с.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 27.02.2009 г. Подписано в печать 02.03.2009 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 62А. Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Изучение роли эндотелия в патогенезе различных заболеваний сердечно-сосудистой системы и возможности фармакологического и немедикаментозного воздействия на его функциональное состояние являются предметом многих исследований и представляют значительный теоретический и практический интерес.

Барьерная роль эндотелия сосудов как активного органа определяет его главную роль в организме человека: поддержание гомеостаза путем регуляции равновесного состояния противоположных процессов - тонуса сосудов (вазодилатация/вазоконстрикция), анатомического строения сосудов (синтез/ингибирование факторов пролиферации), гемостаза (синтез и инги-бирование факторов фибринолиза и агрегации тромбоцитов), местного воспаления (выработка про- и противовоспалительных факторов) [69, 13, 32].

При длительном воздействии повреждающих факторов, -таких как атеросклеротическое повреждение эндотелия, гипоксия, воспаление, гемо-динамическая перегрузка, происходит изменение эндотелиального ответа с тенденцией к доминированию и хронической гиперактивации вазоконст-рикции и гемокоагуляции, факторов роста и пролиферации, что в конечном итоге ведет к развитию эндотелиальной дисфункции [96, 10,'84, 85].

Как известно, эндотелиальная дисфункция рассматривается как предиктор целого ряда заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, а также патогенетическим компонентом органных повреждений при сахарном диабете, гипоэстрогенных и ряда других патологических состояний [72, 32, 66, 40]. При этом изучение роли эндотелия в патогенезе сердечнососудистых заболеваний привело к пониманию, что эндотелий регулирует не только переферический кровоток, но и другие важные функции.

Именно поэтому объединяющей стала концепция об эндотелии как о мишени для профилактики и лечения патологических процессов, приводящих или реализующих сердечно-сосудистые заболевания.

Данные ряда- исследований показывают, что состояние, характеризующееся нарушенной функцией эндотелия, обратимо. Так устранение причины, вызывающей нарушение функциональной активности эндоте-лиоцитов (отказ от курения, нормализация артериального давления) приводит к нормализации показателей эндотелий-зависимой вазодилатации плечевой артерии - одной из основных характеристик, отражающих состояние вазорегулирующей; функции эндотелия [96]. На сегодняшний день известно о положительном влиянии на функциональное состояние эндотелия: препаратов различных фармакологических групп. Так нитраты восстанавливают дефицит эндогенного N0, ингибиторы АПФ помимо снижения синтеза AT II препятствуют разрушению кининов, антагонисты кальция тормозят активность, AT II и эндотелина в гладких мышцах сосудов, усиливая вазодилататорный эффект NO, ингибиторы эндотелин-превращающего фермента и* антагонистыфецепторов>эндотелина-1 тормозят активность пептида. Однако до настоящего времени г четких методик лечения-нарушений функцииэндотелия не выработано, поэтому большую, ценность представляют данные о влиянии различных лекарственных средств на функциональные характеристики эндотелия.

Будущее за препаратами, обладающими не только гипотензивным эффектом, но и органопротективным действием, опосредованным позитивным влиянием на эндотелиальную функцию. Большой практический интерес может представлять комплексное лечение эндотелиальной дисфункции при артериальной гипертензии, когда антигипертензивная терапия будет сочетаться с применением других препаратов-корректоров нарушений функций эндотелия и немедикаментозными методами улучшения эндотелиальной функции.

В связи с вышеизложенным явилось актуальным изучение эндотели-опротективных. свойств препаратов с различными патогенетическими механизмами действия, улучшающими метаболизм (кардионат, милдронат), обладающими антиоксидантными свойствами (мексикор, аскорбиновая кислота), являющимися природными донорами оксида азота (L-аргинин) и активаторами фермента NO-синтазы (резвератрол), содержащими в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды (фосфоглив), а также афинно очищенные антитела к эндотелиальной NO-синтазе (импаза) при экспериментальном дефиците оксида азота.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программы «Изучение патологических состояний сердечно-сосудистой системы. Разработка современных медицинских'технологий профилактики, диагностики и лечения болезней системы кровообращения» на 2006-2010 гг. (номер государственной регистрации темы - 01.2.006-04734) и «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью увеличения продолжительности и качества жизни» на 2008-2010-гг. (номер государственной регистрации темы-01.2.007-10379).

Цель исследования: оценка возможности фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными патогенетическими механизмами действия при L-NAME индуцированном дефиците оксида азота.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Оценить развитие эндотелиальной дисфункции при L-NAME индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, являющегося природным донором оксида азота, L-аргинина SR при L-NAME индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

Исследовать влияние L-аргинина на уровень микроциркуляции и ан-гиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

3. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, являющегося активатором фермента NO-синтазы, резвератрола и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц при L-NAME индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

4. Изучить эндотелиопротективную активность антиоксиданта ок-сипиридинового ряда препарата мексикор при L-NAME индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

5. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды - фосфоглив при L-NAME индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

6. Изучить эндотелиопротективную активность цитопротектора метаболического действия препарата милдронат при L-NAME индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

7. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, содержащего в своем составе афинно очищенные антитела к эндотелиальной NO-синтазе, импаза при L-NAME индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических и маркеров и результатов морфологических исследований.

8. Провести интегральный векторный анализ для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, нитро-ксидергической системы, показателей сократимости и морфометрии миокарда с последующим расчетом вероятностного процента эндотелиопро-текции на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0.

Научная новизна исследования. В работе сформировано новое направление в доклинической оценке эндотелиотропной активности фармакологических препаратов с использованием коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведения функциональных проб, определения биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

Впервые предложен способ оценки эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота с помощью расчета КЭД. Продемонстрировано, что эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависи-мая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, резким снижением показателей биохимических маркеров (NOx, экспрессия NO-синтазы), а также отрицательной динами-* кой морфологических показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов).

По совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей подтверждено эндотелиопротективное действие природного донора оксида азота L-аргинина SR. L-аргинин SR 30 мг/кг способствует преобладанию эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, предупреждает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота NOx и предотвращает увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов у животных с L-NAME индуцированной патологией.

Исследование влияния L-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез в сравнении с рекомбинантными генами, кодирующими синтез эндотелиальных факторов роста (VEGF) показало, что полученные данные позволяют объективно говорить о том, что L-аргинин 200 мг/кг при системном введении способен активировать неоангиогенез и улучшать перфузию ишемизированных мышц.

В качестве потенциального эндотелиопротектора экспериментально обосновано использование перспективного препарата резвератрол (природный 3,5,4-тригидрокси-транс-стильбен), являющегося активатором фермента NO-синтазы. Впервые получены данные об эндотелио- и карди-опротективном эффекте резвератрола в составе фосфолипидных наноча-стиц при L-NAME индуцированной модели дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предупреждении снижения содержания NOx. При этом, нагрузочные пробы и морфометрия выявили уменьшение исчерпания миокардиального резерва, одновременно с ограничением увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов.

В ходе проведенного исследования, на модели L-NAME индуцированного дефицита N0, выявлена эндотелиопротективная активность анти-оксиданта оксипиридинового ряда мексикора. Мексикор 30 мг/кг снижает КЭД до значения 1,9±0,2 у.е. по сравнению с группой нелеченных животных, где данный показатель равен 5,4±0,6 у.е., а также предупреждает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота NOx.

Оригинальными являются результаты функциональных проб на фоне лечения препаратом фосфоглив, содержащем в своем составе «эссенциаль-ные» фосфолипиды при L-NAME индуцированной модели дефицита NO в эксперименте. При исследовании эндотелио- и кардиопротективного действия препаратов фосфоглив (капсулы) 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) 0,515 г/кг, фосфоглив (лиофилизат) 5,0 мл/кг в дозах, сопоставимых по

13 • фосфотидилхолину, выявлено снижение КЭД по сравнению-с группой не-леченных животных, предотвращение увеличения адренореактйвности и снижения сократительного резерва миокарда.

Впервые установлено выраженное эндотелиопротективное действие цитопротектора метаболического действия препарата милдронат, ингиби-рующего активность гамма-бутиробетаингидроксилазы и вызывающего индукцию оксида азота в эксперименте. Милдронат 80 мг/кг способствует преобладанию эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных и оказывает положительное- влияние на NO-продуцирующую функцию эндотелия.

Впервые показано выраженное эндотелиопротективное действие гомеопатически потенциированных антител, к eNOS (G12, G30, С200) -препарата импаза на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO; что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания NOx*. Одновременно результаты нагрузочных' проб свидетельствовали о предотвращении повышения адренореактивности, уменьшении исчерпания миокарди-ального резерва.

Научная новизна подтверждается получением 10 патентов.РФ.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными патогенетическими механизмами действия: природным донатором оксида азота L-аргинином SR, активатором фермента NO-синтазы резвератролом, антиоксидантом оксипиридинового ряда мексикором, препаратом, содержащим в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, фосфогливом, цитопротектором; метаболического действия милдронатом и гомеопатически потенцированными антителами к eNOS (С 12, С30, С200) препаратом импаза, для коррекции L-NAME-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что их использование позволяет нормализовать, изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзави-симая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилата-ция), что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД.

Одновременно результаты нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований свидетельствовали о положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (снижение адренореактивности, предотвращение исчерпания миокарди-ального резерва, уменьшение диаметра кардиомиоцитов) и о восстановлении активности NO-продуцирующей функции эндотелия (повышение продукции нитрит-ионов NOx).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные доклинические и клинические испытания исследуемых препаратов в качестве эндотелиотропных аддитивов при лечении патологических состояний, связанных с развитием:эндотелиальной дисфункции.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив форте производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008120/08), фосфоглив производства ОАО «Фар-мстандарт-Лексредства» (РУ Р N002528/01), препаратов мексиприм производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛС-001668) и-мельдоний производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛСР-006481/08) включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности биологически-активной добавки L-аргинин (свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.2795.3.05 от 18.03.05), включены в состав документов, поданных на регистрацию в ГУ НИИ питания РАМН. Результаты работы используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской по-, мощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 гг., XIII-XV Национальном конгрессе "Человек и лекарство", I—II Национальном конгрессе терапевтов, VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ, XII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева (2006). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 1, внутренних болезней„№ 2, гистологии, цитологии и эмбриологии, патофизиологии, НИИ Экологической медицины КГМУ (2008).

По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту

1. Комплекс методических подходов, включающий расчет коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведение функциональных проб, определение биохимических маркеров и оценку результатов морфологических исследований, является адекватным способом исследования эффективности фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции при L-NAME индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.

2. На основании проведенного комплексного изучения L-аргинина SR, резвератрола, мексикора, фосфоглива, милдроната, импазы на модели L-NAME индуцированного дефицита NO, можно в качестве потенциальных эндотелиопротекторов предложить следующие фармако-терапевтические группы:

- донаторы оксида азота

- активаторы эндотелиальной NO-синтазы

- антиоксиданты

- мембранопротекторы, содержащие «эссенциальные фосфолипиды»

- цитопротекторы метаболического действия

- гомеопатически потенциированные антитела к eNOS

3. Эпдотелио- и кардиопрогективные эффекты исследованных препаратов на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота: природного донора оксида азота L-аргинипа SR, активатора фермента NO-синтазы резвератрола, аптиоксиданта оксипиридинового ряда мексикора, препарата фосфоглив, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, цитопротектора метаболического действия милдроната, гомеопатически потенциированных антител к eNOS (С 12, СЗО, С200) импазы, свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического и клинического изучения данных препаратов в качестве потенциальных эндотелио-протекторов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 532 источника, из них 132 отечественных и 400 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 348 страницах машинописи, содержит таблиц - 32, рисунков -103, формул - 6.

285 ВЫВОДЫ

1. Введение в течение 7 суток N -нитро-Ь-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг/сутки вызывает у лабораторных животных развитие эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся закономерной динами1 кой функциональных, биохимических и морфометрических маркеров. Наиболее информативным оказался коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), представляющий собой соотношение площади над кривой сосудистой реакции на эндотелийнезависимую вазодилатацию (нитропрус-сид натрия) к площади сосудистой эндотелийзависимой вазодилатации (ацетилхолин). КЭД при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита N0 оказался в 5 раз выше, чем у интактных животных. Параллельно наблюдалось развитие выраженной артериальной гипертензии (190/145 мм рт. ст.), повышение адренореактивности, снижение резервов сократимости миокарда, уменьшение в 3,5 раза уровня стабильных* метаболитов оксида, азота NOx и снижение в 2 раза экспрессии eNOS, а также развитие гипертрофии миокарда. ■

2. Донатор оксида азота Е-аргинин SR 30 мг/кг проявляет выраженное эндотелиопротективное' действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражается в преобладании эндоте-лийзависимого расслабления сосудов, снижении КЭД до значения 2,6±0,2, и предупреждении снижения содержания уровня стабильных метаболитов оксида азота NOx. Одновременно нагрузочные пробы и морфомет-рия показали предотвращение повышения адренореактивности, уменьшение исчерпания миокардиального резерва и ограничение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов. Цифры АД не достигали целевых значений.

Исследование влияния L-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте показало, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг активизирует неоангиогенез и улучшает перфузию ишемизированных мышц.

3; Активатора eNOS резвератрол (2 мг/кг) и резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) проявляют выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня 1,2±0,1 и; 1,9±0,2 соответственно, а также в1 полном предупреждении снижения содержания NOx. П]ри этом . нагрузочные пробы и морфометрия выявили, уменьшение исчерпания миокардиального-резерва- одновременно с ограничением увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов; [Значения- АД не достигали заданных величин: Резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц проявлял сопоставимую эндотелиопротекторную' активность в. дозе 0,15 мг/кг, что-почти в 10 раз меньше; чем дозировка традиционной субстанции. Это позволяет предположить его большую биодоступность и активность;

4. Антиоксидант оксипиридинового ряда мексикор 30 мг/кг проявляет эндотелиопротективное 'действие на. модели 1 ,^АМЕ-иидуцированиого дефицита NO, что выражается в: преобладании эндотелийзависимого' расслабления сосудов, снижении КЭД до значений 1,9±0,2 и предупреждении снижения содержания-уровня: стабильных метаболитов оксида азота NOx. Одновременно обнаружено предотвращение повышения адренореактивно-сти и уменьшение исчерпания; миокардиального резерва. Морфологические исследования показали ограничение увеличения поперечного диамет-. ра кардиомиоцитов. Цифры АД не достигали целевых значений.

5. Препараты, содержащие эссенциальные фосфолипиды, фосфоглив (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) в дозе 0,515 г/кг, фосфоглив (лиофилизат)* в ! дозе 5^0 мл/кг (сопоставимые: по фосфотидил-холину), а также 0,5 мл/кг, проявляют эндотелиопротективное действие.на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что i выражается в иреобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД соответственно до 2,2±0,3, 2,2±0,2, 3,1±0,4 и 2,9±0,5 по сравнению с контрольной группой животных (5,4±1,1). Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение увеличения адренореактивности и снижения сократительного резерва. При исследовании эндотелиопротективного эффекта компонентов в сопоставимых по фосфотидилхолину величинах обнаружено, что основной вклад вносят фосфотидилхолин и глицират при их положительном фармакодинамическом взаимодействии.

6. Кардиоцитопротектор' (ингибитор гамма-бутиробетаингидрокси-лазы) милдронат 80 мг/кг проявляет выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижении КЭД до значений 1,7±0;2 и полном предупреждении снижения уровня стабильных метаболитов оксида азота NOx. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение развития гиперадренореактивности и уменьшение исчерпания, миокардиального резерва. Морфометрические исследова1 ния кардиомиоцитов обнаружили ограничение под влиянием милдроната увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов. Значения АД не достигали целевого-уровня.

7. Гомеопатически потенцированные антитела к eNOS (С 12, СЗО, С200) -препарат импаза (1 таблетка/кг, на 100 мл воды при свободном доступе), проявляют выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижении КЭД до уровня 2,1±0,2 и предотвращении снижения содержания NOx. Значения АД не достигали заданных величин. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности, уменьшение исчерпания миокардиального резерва при отсутствии достоверной динамики морфометрических показателей кардиомиоцитов.

8. Расчет площадей векторных диаграмм, учитывающих комплекс функциональных, биохимических и морфометрических показателей, обнаружил, что значения интегральных площадей интактных животных (5,5±0,3) и животных с L-NAME-индуцированным дефицитом NO (10,1 ±1,2) отличаются друг от друга почти в 2 раза. Анализ эффективности изученных путей фармакологических воздействий на патогенетические механизмы развития ЭД показал, что все фармакологические группы проявляют выраженную эндотелиопротективную активность и при интегральной оценке эндотелиопротекции располагаются в следующем порядке: активатор eNOS резвератрол > кардиоцитопротектор (ингибитор гамма-бутиробетаингидроксилазы) милдронат > антиоксидант окси пиридинового ряда мексикор > гомеопатически потенцированные антитела к eNOS (С 12, СЗО, С200) - препарат импаза > резвератрол в составе фосфоли-пидных наночастиц >фосфоглив форте >донатор оксида азота L-аргинин SR > фосфоглив > фосфоглив (лиофилизат).

289