Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Прогнозирование токсичности и безопасных уровней воздействия производных бензола на основании квантовохимической модели их биоактивации

АКАДЕМИЯ мдвдщнских НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИСОВДОВАТЕЯЬСКШ ИНСТИТУТ ШШНЫ ТРУДА И ПРОБЕССИСНАДШЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ Алексей Валентинович

ПРОШШИРШАНИЕ ТСКСИЧНОСТИ И БЕЗОПАСНЫХ УРОВНЕЙ

ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗОЛА НА ОСНОВАНИИ КВАНТдаОШШКЖСЙ МОДЕЛИ их БИОАКТИВАЩИ

14.00.07 - Гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1991

Работа выполнена в 'отделе промышленной токсикологии НИИ гигиены труда и профессиональных заболеваний АМН- СССР.

Научные руководители:.

доктор медицинских наук профессор

доктор химических наук

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук »профессор Н.Г. ИВАНОВ

доктор медицинских наук З.И. ЩЩАКСВА

Ведущая организация - Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова.

«

Защита состоится . " "_1991 г. на заседании

специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук (Д.001.12.01) в ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте гагиены труда и профессиональных заболеваний АМН СССР.

V

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института' по адресу: 105275, Москва, проспект Буденного, 31.

Автореферат разослан " " _|_1991 г.

И.П. УЛАН СБА П.Н* ДЬЯЧКСВ .

УЧШЬИ СЕКРЕТАРЬ специализированного, совета доктор медицинских наук

А.И. ЭЙТИНГШ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. Для решения задач ускоренного нормирования химических веществ особое значение приобретают квантово-химические расчеты разнообразных (электронных, термодинамических, кинетических) характеристик соединений и их реакций. Разрабатываются метода квантовохимического моделирования ферментативных реакций метаболизма, биоактивации и детоксикации чужеродных веществ. Развитие этих методов дает основание для поиска ° адекватных квантовохиыических параметров, наиболее точно отражающих биологическую активность веществ.

Современная квантовая биохимия с ее большим вычислительным потенциале»! может рассматриваться как физико-химический подход близкий к экспериментальному (Лужков В.Б., Богданов Г.Н., 1986). Ее объектами являются молекулярные модели с небольшим числом атомов. Для таких моделей квантовохимические расчеты позволяют оценивать труднонаблюдаемые экспериментально свойства. Квантовая биохимия не может и не должна подменять эксперименталыше метода изучения живого, тем не менее многие события на уровне клетки и организма в целом определяются процессами на молекуляр-. ном уровне и, следовательно, мо1ут быть изучены и описаны с по-йощьгэ квантовохимических методов.

Квантовохимический подход для исследования зависимости "структура - активность" широко используется в токсикологии в последние годы. Однако исследования в этой области носят в значительной мере статистический характер. То есть параметры электронного строения молекул, используют в уравнениях прогноза токсичности, без какого-либо дополнительного обоснования, что в значительной степени сникает ценность и достоверность полученных результатов, дает мало информации о механизме действия химических веществ. Кроме того, не учитывается метаболизм

чужеродных соединений в 'организме, хотя известно, что токсические свойства многих ксенобиотиков связаны с метай одическими превращениями под действием ферментных систем организма.

В последнее время повысился интерес'к исследованию взаимодействия ксенобиотиков с активными центрами ферментов. Подобные процессы относятся к разряду труднонаблвдаемых экспериментально, поэтому, именно в этих случаях, использование квантово-химических расчетов дает преимущества в описании биологических эффектов химических соединений.

Вагным и широко используемым классом соединений являются производные бензола с различными заместителями в ароматическом кольце. Для ряда соединений этого класса установлены гигиенические нормативы. Однако многое производные бензола, применение которых в промышленности предполагается в ближайшем будущем, не нормированы, поэтому разработка ускоренных методов нормирования производных бензола актуальна в настоящее время.

При производстве красителей, пластмасс и других химических продуктов широко применяются 2~£МИНо-5-нитрофенал (2А5НФ), 2,4,6-триметилфенол (1МФ) и п-фторнитробензол (ШБ). Отсутствие сидений о токсичности, опасности и характере биологического действия этих соединений, необходимых для разработки про-• \

филактических'мероприятий, обеспечивающих безопасные условия • при их производстве и применении, послужило основанием для проведения экспериментальных исследований, выполненных в данной работе.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ явилась разработка квантовахиМической модели • прогнозирования токсичности и безопасных уровней воздействия производных бензола с учетом механизмов бйоактивации этих соединений.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить .следующие задачи:

- рассчитать электронное строение ^100 производных бензола и при сопоставлении с их биологической активностью выяснить возможность описания токсичности и метаболизма соединений этого класса с позиции "структура - биологическое действие";

- в ряду однократно замещенных производных бензола обосновать преимущества использования динамического индекса реакционной

способности для описания токсичности и метаболизма этих соединений по сравнению с наиболее часто используемыми статическими индексами реакционной способности;

- на основе построенной модели дать прогаоз параметров токсикометрии и безопасных уровней воздействия ряда экспериментально неизученных производных бензола;

- оценить токсичность, опасность и характер действия 3-х производных бензола в эксперименте на животных и сопоставить результаты прогноза с полученными экспериментальными данными.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На примере производных бензола вйервые.в рамках оксеноидной модели механизма ферментативной активности монооксигеваз разработан квантовохимический метод расчета параметров токсикометрии и безопасных уровней воздействия соединений этого класса.

. Установлено, что в рамках разработанной модели удается описать данные по токсичности и метаболизму производных бензола. Показано, что динамические индексы реакционной способности бо- ■ лее адекватно описывают как токсичность, так и метаболизм замещенных бензола, по сравнению с наиболее часто используемыми статическими индексами реакционной способности. Впервые получены данные о степени токсичностч опасности и характере действия "

• - 4 -

3-х производных бензола.•

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На основании проведенных экспериментальных и теоретических исследований с использованием разработанной квантовохимической модели о'боснованы гигиенические регламенты дая воздуха рабочей зоны для 3-х соединений (ЛДК 2-амино-5-нитрофенола утверядена в законодательном порядке. Величины ПДК для 2,4,6-триметилфенола и п-фторнитробензола одобрены секцией промышленной токсикологии проблемной комиссии "Научные основы гигиены труда и профзаболеваний" и переданы на утверждение в МЗ СССР).

Используя предложенную модель дан прогаоз параметров токсикометрии и безопасных уровней воздействия для 20 экспериментально неизученных соединений, относящихся к производным бензола.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации 'далсжены и обсуждены на научной конференции молодых ученых "Актуальные вопросы гигиены труда и профпатодогии в современном производств" (Москва, 1989) ; на заседании сессии АМН СССР (Москва, 1989); на заселении. Московского общества токсикологов (Москва, 1990); на международной конференции по медицинской и экологической токсикологии (Москва, 1991); на 10-м Всесоюзном совещании по перок-си комплексам (Черноголовка, 1991); на научных конференциях отдела промышленной токсикологии НИИ ТТ и ПЗ АМН СССР (Москва, ^ 1988-1991).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из 4 глав, выводов, списка использованной литературы. Список использованной литературы • содержит 145 источников, в том числе 68 иностранных авторов. . Работа содержит 25 таблиц и 5 рисунков.

ШЬШ И МЕТОПЫ ИССЛБЩСВАНИЙ. Для выполнения задач, поставке hisîx в диссертационной работе, был использован комплекс кван-товохдаических, токсикологических, биохимических и статистических катодов исследования»

Изучение токсичности и опасности 2А5НФ, ТМФ и ФНБ проводс-¿и.оь в соответствии с "Методачоскша указаниями к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ -в воздухе" (1980) в условиях острого и подострого эксперимента при различных путях поступления в организм (введение в келудок, ингаляция, нанесение на кожу а слизистые оболочки глаз).

В эксперименте всего использовано: 1000 крыс (весом 150200 г), 300 белых мышей (весом 18-22 г), 18 кроликов.

Выбор показателей для оценки состояния организма гивотных определялся с учетом сведений литературы о характере действия соединений, близких я изучаемым по химической структуре.

Для оценки функционального состояния нервной системы использовались следующие метода: ориентировочная реакция (двигательная активность в ограниченном пространстве-и на "открытом поле"), . способность к суьелаща подаороговых ш,шульсов, "норковый рефлекс". Суммацаонную способность Нераной системы (СШ) оценивала по методу C.B. Сперанского (1865). Исследование двигательной аомпоненты ориентировочной реакции проводилось методом "открытого поля".

Раздражающее действие на дыхательные пути оценивалось в опытах сразу после окончания затравка. Регистрировалась частота дыхания и клеточная реакция в смывах с бронхо-альвеолярных путей и легких.

Анализ состава периферической крови включал в себя подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева, лейкоци-

тарной формулы и дериватов гемоглобина (мет-, сульф-, окси- и общий гемоглобин). Определение дериватов гемоглобина проводилось по методу и.С. Кушаковското.

функциональное состояние печени оценивали по содержанию общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции, активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыворотке крови определяли с помощью набора химических' реактивов "био-тест".

Изучение функционального состояния почек проводилось с использованием комплекса методов, рекомендованных Н.И. ¡Думской и Н.К. Карамзиной (1966) (диурез, содержание белка и хлоридов).

Расчеты электронною строения <*>100 иолвкул ароматических соединений, 300 переходных комплексов этих молекул были выполнены на ЗШ ЕС-1060 в вычислительном центре Института общей и неорганической химии АН СССР с использованием про1раммы 1ШЮ/С. Параметры.в методе расчета 1ШЮ выбраны так, чтобы воспроизвести экспериментальные межатомные - расстояния и теплоты образования молекул. Также можно рассчитать такие параметры строения молекулы как: заряда на атомах, порядки связей, %здо* %ЗМ0' 2НД0К~ сы свободной валентности, суперделокализуемости атомов и связей и др. Этот метод широко применяется доя расчета электронного строения сложных органических молекул, подобно тем, которые рассматриваются в данной работе.

Оценку достоверности различий данных в опытной и контрольной группах проводили с помощью критерия Стыодента-Фишера. Различия между величинами в опытной и контрольной 1руппах считались ■значимыми при Р/ 0,05. .

Для разработки математических моделей щютозщюващя параметров токсикометрии й беэопасшх уровней воздействия использова-

- 7 -_______________________________________________________

лась корреляционный и регрессионный метода статистической обработки данных,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Обоснование и разработка квантовохимической модели биоактивации однократно замещенных производных бензола с участием активного кислорода оксиганаз смешанной функции.

МЕТАБОЛИЗМ. Основные положения, лежащие в основе предлагаемой квантовохимической модели, основываются на современных знаниях о метаболизме, молекулярных механизмах окисления ксенобиотиков, связи токсичности с метаболизмом.

Известно, что большинство производных бензола, являясь липо-тропными веществами, метабализируются с участием микросомальных ферментов типа цитохрома Р450. Этот процесс протекает через ряд промежуточных стадий, причем обязательным этапом является активация молекулярного кислорода и разрыв связи кислород - кислород. При этом один из атомов кислорода восстанавливается до воды, а другой связывается с субстратом (Ляхович Б»Б., цырлов И.Б., 1981; Метелица Д.И., 1982; АКУ. 1986 и др.).

Несмотря на чрезвычайную сложность всего процесса взаимодейзг-вия монооксигеназ с ксенобиотиком, ваквде для понимания механизма токсического действия результаты удается понять в рамках так называемой оксеноидной модели активации соединений, согласно нотой роль фермента состоит в образовании из молекул С^ "активного" кислорода - в атомарном (или-близком к атомарному) состоянии, который и связывается с субстратом.

Лимитирующей стадией микросомального окисления (Метелица Д.И., 1982) является внедрение активированного кислорода в субстрат. При этом, в частности, для производных бензола считают,

что ключевой реакцией, запускающей процесс метаболизма и биоак-тиведии, является присоединение кислорода к одному из атомов углерода: х X

со: . ш

I й

с образованием тетраэдрического интермедиата II. Результатом этого взаимодействия является образование более полярных под»-' котированных соединений (фенолов) из исходного вещества.

Существуют убедительные доказательства того, что ареноксиды типа II являются интермедаатами биоактивации производных бензола, и что токсические эффекты этих соединении являются результатом взаимодействия образовавшегося аренаксида с клеточными макромолекулами.

■ С этих позиций, очевидно» что для описания токсичности производных бензола, адекватным динамическим индексом реакционной способности макет быть энергия ( дЕ> образования арен оксида тетраэдрического типа II из исходного соединения I. Величина ¿Е характеризует легкость образования и термодинамическую устойчивость ареноксидов.

Учитывая' вышеизложенное, логично предположить, что различные заместители X в бензольном кольце.могут влиять на скорость » реакции I, определяя зависимость метаболизма и токсичности производных бензола от природы заместителя.

В соответствии с этими представлениями окисление (гидроксшш-рование) различных позиций (орто-, мета- или Пара-) бензольного кольца однократно замещенных производных бензола должно осуществляться в том положении, для которой л Б минимальна.

Сопоставление величин дЕ (орто), ¿Е(мета) и ¿Е(пара) с

метаболизмом 20 однократно замещенных производных бензола показало, что модель удовлетворительно предсказывает преимущественное полокениэ гидроксилирования ароматического кольца в соединениях С6н5-х.

Все изученнне соедшення по величинам дЕ(орто), лЕ(кета) 2 д ЕС Пара) можно разделить на несколько групп. К первой группе относятся соединения 06Н5-Х о Х=/У(СН3)2, А/Н2, СН,//(СН3) (С^), 00^, /УВОНО, /УНСШ2, /1/НС0СН3, СНСН2 и Г. Для них мета-положение деактивировано по сравнении с бензолом, т.е. для этой группы маловероятно образование мета-фенолов. В согласии с теорией для этих веществ в эксперименте либо не наблюдается образование мета-фекслов, либо их концентрация гораздо меньше, чем концентрация орто- и дара-феналов. Орто- и пара-позиции в этой группе веществ активированы, поэтому бйотрансформации орто-я пара-феНолЫ образуются} пара-фенолы, как правило, образуются легче, что воэмс&йо связано со стерическиш препятствиями для внедрения кислорода в орто-позицшо, расположенную в непосредственном соседстве с заместителем X.

В алкил- и аллилбензолах активированы все положения бензольного кольца. Максимально активировано лара>-поло£ение и в эксперименте легче аее£о образуются пара-фейалы. Особенно показательны в этом отношений данные йо йзчгаЙйййШу Наиболее изученного соединения - толуола.

В группе соединений с > СО®, 0,1, С/У и Л/02 все

положения деакткпировакы (в меньшей степени цета-полокение), и-поэтому несколько легче должны образовываться мета-фенолы. Предсказываемое соотношение изомеров наблюдается для бензойной кислоты, бензамида и хлорбензола, но ко выполняется для двух соединений с самыми сильными деактивирующиыи заместителями и С/1/ .

- 10 -

Помимо качественных (преимущественное положение гадроксили-рования ароматического кольца) в рамках предложенной модели для рада соединений CgH^-X удается получить и количественные соотношения между величинами ¿Ей концентрациями образующихся фенолов. Для сопоставления использованы результаты работы (DatyJ., 1968), в которой получено наибольшее число экспериментальных данных по интенсивности гидроксияирования ароматического кольца в системе in vitro . Как видно из рисунка I, между логарифмом концентрации (С) продуктов гидроксшшрования производных бензола и ¿Б наблюдается линейная корреляция. С увеличением ¿Е от -0,6 до -»0,19 эВ количество образующихся фенолов снижается от 27,2 до 0,01$. Соответствующее уравнение регрессии имеет ввд: # С =-4,9 ¿Е - 0,985 ( Г = - 0,863; /7=17; 0,001). Таким образом, оксеноддная модель механизма окйсления субстратов цитохромом Р—450 позволяет описать основные черты биотрансформации соединений, содержащих бензольное кольцо.

ТОКСИЧНОСТЬ. Обсудим доя одвокрахнократно замещенных производных бензола результаты корреляционного анализа зависимости параметров токсикометрии и ПДКр 3 от динамического индекса ( лЮ, определяющего в явной форме леность биоактивации соединений с образованием ареноксидов.

Для каждого соединения было вычислено значение лЕ r»in =■ min £ лЕ(орто)¿Е(мета), дЕ(пара)^ - минимальная величина энергии, необходимая для образования тетраэдрического интермедиа-та.

Из рисунка 2 видно, что уменьшение лЕ пил , т.е. возрастанию легкости образования ареноксвда тетраэдрического типа сопро-. всвдается уменьшением величин средиесмертельных доз при введении в желудок (JUgg), средаесмертельных концентраций при иигаля-

i -

-l

-л •

\

N

\ 3n

v 6» V*

/47

4/7

\

. Sa

^ ÉI

* S

• 7n

Лг \

Рис. I.

-ду

—I— -й*

^ ов>

Однократно замещенные производные бензола. Зависимость концентрации (С) фенолов (вХ{, образующихся в системе in vitre от энерпш образования тетраэдрического интер-медиата а Е. Рядом с цифрами указано положение гидро-ксиларования (о-орто, м-мета, п-пара).

I - бензол, 2 - анилин, 3 - анизол, 4 - форманилид, 5 - фенилмочевина, 6 - ацетанилид, 7 - фторбензол, 8 -толуол, 9 - хлорбензол, 10 - бифенил, II - трифгорацет-аншшд.

ции (С^д) и величин ЦЦКр^3< для одшифатно замещенных цроизвод-, ных бензола (Таблица I).

Таблица I

Уравнения. длЯдрасчета параметров токсикометрии и ЦДК (мг/кг и мг/м ) однократно замещенных производных бензола

Рехрессионные уравнения

1 г \ n I ! Р£

= 1,18 л Е min + 3,61 ■ 0,78- 23 0,25 0,001

% С150м = 3,08 л Е /»/л + 4,62 - 0,93 12 0,28 0,001

= 1,24 л Е m in 3,70 0,77 Л 0,95 22 0,27 0,001

i С150к = 2,99 а Е »iin + 4,79 8 0,26 0,001

= 2;56 л Е fin + 1,478 '0,82 23 0,51 0,001

о

Ч •

3 1

^ 01. & Мг/кг) • — — $ О-я, а -

■3

а

».у.

>3

а

О ,о ■ ^

• •

а

а ?

, «

-о, г

-1-1-1-т~

-0.6 .

—г~

-49

л Еп"п(зв}

г-

•I -

^ ПА н (""я ')

• >9

■ е

и

г/ п

« п л» ' V -

-Г.?

1— -0.9

—I—

-е.6

—>— -с.ч

—г— -с.»

Рис. 2. Зависимость средне смертельных концентраций, средне смертельных доз для мышей и ПЖр.з. однократно замещенных ' производных бензола от л¿¡/»¿я

I - бензол, 2 - хлорбензол» 3' - бензотрифторид, 4 - то- -дуол, 5 - анилин, 6 - нитробензол, 7 - фенол, 8 - анизол, 9 - бензальдегад, Ю - фторбензол, II - ацетофенон, 12 - стирал, 13 - изопропилбензол, 14 - этилбензол, 15 -¿-метилмирол, 16 - диметалфенилкарбинол, 17 - изопропил-бензола гидроперекись, 18 - фенетол, 19 - тетрафторэтило-вый эфир тенола, 20 - изобугилбензол, 21 - ж-этил анилин, -"/У -метил-^'-феншшочевина, 23 - пропилбензол, 24 - феноксиуксусная кислота, 25 - бензойная кислота, 26 - л^-диметиланшшн, 27 - диметилмочевина, 28 - ди-. • метилбензвламин, 29 - бензиловый спирт, 30 - бензотри-хлорид, 31 - бензоил хлористый.

_________1______ __________"13---------------- --------------------------------

Следует. отметить, что при хорошем соответствии мезду токсичностью, величинами'ЦДК„ „ и значениями лБ^'л из общих зависи-

]/»о»

мостей выпадают соединения, содержащие хлор в боковой цепи, на ' токсичность которых влияют реакции дегалогенирования боковой группы. Не укладывается также бензонитрил и нитробензол. В случае бензонитрила это расхождение можно объяснить реакциями боковой группы, например, отщеплением высокотоксичного иона . Нитробензол в эксперименте оказывается более токсичным, чем это предсказывается величиной ¿Зтп\ высокую токсичность нитробензола модно понять, если учесть, что в организме млекопитающих нитробензол восстанавливается до анилина, который в свою очередь легко образует высокотоксичный ареноксид. В связи с этим, для предсказания токсичности нитропроизводных бензола следует использовать йЕ для аналогичного соединения с аминогруппой в позиции нитрогруппы.

Таким образом с позиции оксеновдной модели функционирования оксигеназ смешанной функции и с помощью квантовохимических расчетов дано объяснение изменения степени токсичности и величин 1Щ в ряду монозамещенных бензола от их строения.

Сравнение динамических и статических квантовохимических индексов реакционной способности для описания токсичности и метаболизма однократнократно замещенных производных бензола.

Душ анализа количественных соотнощений-структура-активность с использованием квантовохимического подхода более адекватны проблема описания биологической активности и реакционной способности молекул динамические индексы реакционной способности (ИРС), которые относятся к реакциям трансформации молекул.

Практическое применение динамических ИРС в исследованиях биологаческой активности затруднено тем, .что такой подход требу-

-I4-

ёт конкретизации рецептора, взаимодействием с которым определяется активность ксенобиотика, а также молекулярного механизма реакции ксенобиотик-рецептор.

Поэтому, в практике расчетов в настоящее время для анализа количествеинг'с соотношений структура-активность наиболее часто используют большое количество простых статических ИРС, которые относятся к изолированной исходной молекуле.

В работе на примере однократнократно замещенных производных бензола показано преимущество использования динамического ИРС ( лЕ) для количественного описания соотношений структура-токсичность, по сравнению с наиболее часто используемыми статическими ИРС (некоторые из них представлены на рисунке 3).

Для большинства статических ИРС корреляция с токсичностью вообще отсутствует. Несколько лучше корреляция с 2161, ,

0. орто,- tf пара, Fm*x = f орао, F"пара, (рис. 3). Однако

и здесь, наблюдаются более низкие, чем в случае с лЕт/и значения коэффициентов корреляции. Наилучшими из статических индексов оказались: максимальный индекс свободной валентности (/у*чг) и максимальная нукдеофнльная суперделокализуемость атомов упперо-да бензольного кольца (S^x ) . Однако оба эти параметра неудовлетворительно описывают как.положение, так и интенсивность гид-роксшшрования бензольного кольца. Так, параметр fr»*x всегда предсказывает гздроксилирование в орто позиции по отношению к заместителю, что противоречит многочисленным экспериментальным данным по их метаболизму. Предсказываемое но величине положение твдроксалирования хуже соотносится с данными по метаболизму однократно замещенных производных бензола, чем предсказания на основании величины дЕ. -

Использование значений t&min для предсказания токсичности

веществ, более предпочтительно, чем использование параметра гид-рофобности (рис. 3).

лЕтт X Ом 2/0/ <¡0 в" Fn

DL se лыш»

ту

e.iz 0.6 -o.w -г>.*з -CM -o.s8 -c.ss -¿>se

PL с» крыш \УЛ i—1 1—1 1—n 1—i 1—1 И И И 47r fi.st -qsb -c.s<r -ass -e.sf -a? -i? -0.6?

CLso яышн

CLsc крысы

ел p.63 -0.S2 -о,S3 -О,и -0.U -0.S3 -с>78

ajr CJS- -О.З r0.79 ~O.W -W--49J.

и гл

ПАК

Ld

□

□ а. И EZ2

Л и 0.74 -0.t3 -0,62 -O.S? -Q6* -¿¡6S -46 -473

Рис. 3. Значения коэффициентов корреляции медцу ¿Еwin , , некоторыми статическими индексами реакционной способности и параметрами токсикометрии 1Д1сп и CIkyO для мышей и крыс И- ПДК р.з. однократно ^замещен-

ных производных бензола.

Обозначения: Э^ - константа гвдрофобности. Для атомов • - углерода бензольного кольца: hat - сумма абсолютных --.., величин зарадов; Qt»«.* , Q орто и Япара - величины зарядов; гжч , /"орто л г пара - индексы свободной валентности; - Максимальная нухлеофильная суперделока-лизуемость. Примечание: штриховка при Р/ 0,001

Проведенный анализ соответствия разных индексов реакционной способности с биологической активнастю и метаболизмом (в частности, с образованием ареноксидов) в ряду однократно замещенных производных бензола убедительно свидетельствует о преимуществе динамического индекса дЕ.

Использование разработанной кванговохимаческой модема для описания метаболизма и токсичности многократно замещенных производных бензола.

На примере многократно замещенных производных бензола показано, что разработанная модель позволяет предсказывать положение преимущественного гидроксилирования дяя производных бензола, содержащих 2 и более заместителей в кольце. Как и в случае однократно замещенных производных бензола присоединение кислорода в непосредственном соседстве с эамэститашш затруднено, вследствие стерических влияний заместителей.

Для дальнейшей проверки модели в работе рассчитаны величины л Е/ып для многократнократно замещенных производных бензола. Ио-пользуя полученные значения лЕ тм , вычислены величины Д150, С1^д ДЯЯ шшей и ЦДК р.з. для 33 веществ. Результаты свидетельствуют, что параметр л Е т'п с учетом известной погрешности токсикологического эксперимента удовлетворительно воспроизводит параметры токсикометрии и величины 1ЩК р,э.

Следует, однако, отметить ряд расхождений. Наиболее значительные отклонения наблюдаются для резорцина (в 19 раз для ЦЦК и 6,3 раза для Д1^д)4 Отмечаются также некоторые расхождения для м-хлораннлина, о-аминофенола, п-хлорфенола, о-дашорбенэола.

После включения в обработку всех изученных веществ как однократно, так и многократно замещенных производных бензола (всего 64 соединения), бШш получены следующие регрессионные уравнения

______________^______________________17 ------------

(Таблица 2) .

Таблица 2

Уравнения для расчета,паракетров токсикометрии и ПЖ (мг/кг и мг/м' ) замещенных бензола

Регрессионные уравнения ! Г i п ! ! Р/

47 0.34 0,001 21 0,5 0,001

48 0,29 0,001 21 0,62 0,001 48 0,54 0,001

Видно, что закономерности, полученные для однократно замещенных производных бензола, сохраняются. Отмечается лишь некоторое уменьшение коэффициентов" корреляции и возрастание среднеквад-ратического отклонения построенной линии регрессии ( ¿ух ). Однако увеличение объема исследованной выборки не снижает достоверности полученных уравнений.

Анализ величин Su свидетельствует, что отклонения 2/3 расчетных величин ÎÎ5Q, CI5q и 1Щ р.з. от экспериментально определенных составляет 1,95-2,«,; 3,1-4,1 и 3,47 соответственно.

Практическое использование разработанной модели проведено для 3-х производных бензола - ФНБ, 2А5НФ и 1МФ, которые в токсикологическом плане до настоящего времени изучены не были. Указанные вещества содержат различное число заместителей в бензольном кольце (2, 3 и 4 заместителя). Кроме того, соединения, со-дпржащие нитро-, а\шно-, гадрокси-, фтор- и метальные грушш в бензольном кольце, бьии использованы для разработки и построения модели.

Исследования по установлению параметров токсикометрии, изучению характера действия 2А5НФ, ТМФ и ШБ.

Физико-халические свойства этих соединений представлены в

? да5ом =I«15 jE/*">

Ç С15й. - 3,08 ДЕ т» А ¿Д5ОК = 1,04 ¿S тп # CI5ÛK = 2,77 дЕ min

4 Ш =2,08лЕ*»>

+ 3,56 0,75

+ 4,58 ' 0,896

+ 3,68 0,77

+ 4,44 0,84

+ 1,348 0,79

таблице 3.

Таблица 3

Физико-химические свойства 2А5Ш, ТИФ а ШБ

Вещества 1 он I

I лф

Физико-химиче С! ( Ц|®

т _' лаоащ....... !

А/Ох

г-П-4ЙБ

Агрегатное со- КристадаИввЫСЙ Кристаллический Твердое вещ-во в

.стояние порошок ж&еввро порошок белого веде застывшей

цвета цвета с резким кассы с резким

специфическим запахом горького

запахом виндаля

Температура-

плавления (С) 154 69-72 26,5

Температура»

кипения 1°С) - 220,6 95-97

Растворимость Трудно растворим Растворяется в Пало растворим в воде , хорошо горячей воле в воде .хорошо в органических ( > 60°С) ,раство- в органических ' растворителях ркм в большинст- растворителях / ве органических

__ШТВ9ШШХ_

Все соединения ври обычных температурах - твердые вещества, плохо растворимы в воде к хорошо в органических растворителях.

Данные о токсичности и опасности указанных соединений представлены в таблице 4.

Как видно из приведенных в таблице 3 данных, при введении в желудок 2А5НФ относится к 4 классу малотоксачных соединений, а ЯЮ и ШБ к 3 классу умеренно токсичных соединений. Кумулятивное действие наиболее выражено у ШБ; 2А5НФ не обладает способностью к кумуляции, 4НБ хорошо проникает через кожу. Цветное действие на кожу, и конъюнктиву таз наиболее выражено у ТИФ, наименее - у 2А5НФ, Бее изученные вещества оказывают действие на нервную систему и почки. Кроме того 2А5НФ нарушает энергетический обмен, а ШБ вызывает образование - а

Таблица 4

Некоторые параметры токсикометрии 2А5НФ, 1МФ и ФНБ

Вещества !

Параметры ! токсикометрии {

2А5НФ

!

ШФ

ФНБ

^50 (мг/кг)

С159

(мг/мЗ) %-сит .

>6000

не достщвута ( >180)

10

Кожно-резорбтив-

ное действие не обладает

Иестное действие: на кожу не обладает

на конъюнктиву

таз не обладает

• 2400 не достигнута

6.7

не обладает

выраженное

выраженное

760 1260

1,54

Характер дейст- оказывает дейст- действует на вия вие на печень, нервную систе-

почки»нервную му, почки систему.нарушает - энергетический обмен

.5,5 31,2

(С1Ш„£ Н-группы) (СПП,ориенти-. , ровочная реак-

ция, хлорида в моче)

Lim цс (мг/ы3)

ЦЦК (мг/м3)

0,5

(а) П кл.оп.

2,0

(п+а)Ш кл.оп.

Т150=2ч.1СМ.

умеренное

слабое

действует на нервную систему.периферическую кровь,печень, почки

(белок в мочеДЦД» ¿«-группы)

1.0 (п) Ц кл.оп.

в периферической крови. После однократного внутрижелудочного воздействия ®Б на уровне 1/2 ДХ^ максимальный уровень J&tHf в крови крыс отмечался через 6-24 часов (опыт 16,8±2,5; контроль Q,48±0,I7$0. Содержание ¡¿«¿fof постепенно нарастало, достигая максимума ко 2-м суткам (опыт 5,6^0,54; контроль 0,33^0,15^).

При ингаляционном пути поступления для 2А5НФ и Ш смертельных уровней не достигнуто. CI5Q дяя ШБ составляет 850 и 1260 мг/м3 для мышей и крыс соответственно.

При ингаляционном воздействии аэрозолем дезинтеграции 2А5НФ

в концентрация 37 мг/м3 (действующий уровень) наблюдалось снижение величины сушационно^-порогового показателя (СИЛ), увеличение активности АПТ и ACT, нарушение функции почек (протеинурая к гипохлория), увеличение содержания неорганического фосфора в сыворотке крови, уменьшение содержания ^//-групп и ыалонового да-альдегада (МДА) в сыворотке крови (более чем в 2,5 раза)., что свидетельствует об интенсификации перекисного окисления липидов.

Экспозиция 2А5НФ на уровне 5,5 мг/м3, как и при воздействии более высокой концентрации, вызывала развитие процзссов возбуждения нервной системы (ошжение СПП), увеличение содержания -групп на фоне снижения ЩА в сыворотке крови, что является свидетельством включения компенсаторных механизмов, препятствующих развитию интоксикации. Концентрация 5,5 мг/м3 для 2А5НФ определена как пороговая, а 0,7 мг/м3 является недействующей.

Ингаляционное воздействие ТМФ на уровне 113 мг/м3 показало, что эта концентрация является действующей, так как вызывает изменения в нервной системе, выражающиеся в снижение СПП и ориентировочной реакции, нарушение функции почек (увеличение белка и хлоридов в моче), снижение частоты дыхания.

Порог острого действия установлен на уровне 31,2 мг/м3 (снижение СШ, увеличение содержания хлоридов в,моче).

Концентрация ЗМФ 5,9 мг/м3 определена как недействующая.

При воздействии ШБ в концентрации 700 мг/м3 (действующий уровень) наблюдалось изменение показателей нервной системы (увеличение СПП, снижение показателей ориентировочной реакции и "открытого поля"), нарушение функции почек (увеличение диуреза, содержания хлоридов в моче) и печени (увеличение активности АЛТ). Выявлено специфическое действие на периферическую кровь - стойкое увеличение метгемоглобина, сульфгемоглобина, а также сниже-

- 21 -

ние содержания общего гемоглобина в крови.

При воздействии концентрации 259 мг/м3 отмечены изменения в тех же системах, что и при воздействии большей концентрации, ' но менее выраженные. Действие на кровь характеризуется стойким увеличением содержания сульфгемоглобина. В крови отмечено увеличение содержания МДА и уменьшение общих -групп.

Снижение функционального состояния нервной системы отмечается и при воздействии концентрации 86,6 мг/м3.

На основании выполненных экспериментальных исследований, а также сопоставления характера действия и параметроз токсикометрии с соединениями, близкими по химической структуре, обоснованы величины ПДК для 2А5НФ на уровне 0,5 мг/м3 (а), П класс опасности; для 1МФ - 2 мг/м3 (п+а), Ш класс опасности; для ФНБ -I мг/м3 (п), П класс опасности, с пометкой - "требуется специальная защита кожи и глаз".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ .

Сравнение экспериментально полученных в данной работе параметров токсикометрии и величин ЦЦК для ФНБ, ТМФ и 2А5НФ с результатами прогноза на основании разработанной модели показало, что различия в величине составляют 1,05-2,24 раза, а ПДК -1,2-2,4 раза, что означает практически полное совпадение. Несколько больше различаются экспериментальные и теоретические величины С15д (3,9 и 4,6 раз) для п-фторнитробензола, но и они не выходят за рамки межл^ораторных различий, которые, по данным ряда авторов, составляют от 3 до 5 раз.

Модель не воспроизводит токсичность бензонитрила, а также ароматических соединений, содержала атом хлора в боковой цепи (например, бензотрихлорвд, хлористый бензоил и др.). Очевидна

невозможность применения модели для полностью замещенных бензолов (например: дентахлорфенол, пентафторфенол и др.). Диапазон полученных в данной работе значений л Емп составляет от -0,83 до -»0,14 эБ, поэтому, если расчетное значение л Евыходит за эти пределы, необходимо соблюдать осторожность в трактовке полученных результатов.

Несмотря на некоторые 'Ограничения разработанной модели, которые сужают круг соединений для расчетов, тем не менее количество веществ для прогноза остается .весьма значительным. Так, только для 2-кратно замещенных производных бензола 30 различных заместителей образуют (с учетом изомерии) 30 х 30 х 3 = 2700 веществ.

Необходимо отметить, что предложенная модель позволяет описывать не только данные по токсичности, но и по метаболизму (с образованием ареноксвдов) производных бензола. Такой подход на выявление и изучение ключевых стадий биотрансформации производных бензола, ответственных за проявление их токсического действия, представляется наиболее обоснованным.

Перспектива дальнейшей работы в намеченном нами направлении состоит в применении разработанной модели для прогаоза биологической активности соединений других классов, содержащих ненасыщенные двойные связи. . .

В широком плане, как свидетельствует анализ данных литературы, применение методов квантовой химии позволяет описывать не только .общетоксическое, но и их специфическое действие химических соединений (в той числе и отдаленные последствия), что может быть одним из перспективных путей дальнейшего развития проблемы ускоренного нормирования в аспекте "структура - биологическое действие".

ВЫВ оды

I. На примере производных бензола впервые в рамках оксеноидной модели механизма ферментативной, активности монооксигеназ разработан квантовохшический метод расчета параметров токсикометрии и безопасных уровней воздействия химических соединений.

2. В рамках разработанной модели с помощью квантовохимических расчетов удается одновременно интерпретировать данные по метаг-бсишзму и токсичности производных бензола.

3. На примере однократно замещенных производных бензола установлено, что динамические индексы реакционной способности более адекватно описывают как токсичность, так и метаболизм замещенных бензола по-сравнению с наиболее часто используемыми статическими индексами реакционной способности.

4. На основании проведенных исследований дан прогноз параметров токсикометрии и величин безопасных уровней воздействия для 20 экспериментальных неизученных производных бензола. С использованием разработанной квантовохимической модели обоснованы гагиенические регламенты для воздуха рабочей зоны для 3-х соединений: 2,4,6-триметилфенола, п-фторнитробензола и 2-амино-5-нитрофенола. .

5. 2-амино-5-нитрофенол при введении в желудок крыс относится к 4 классу малоопасных соединений. на достигнута. При ингаляции поражаются преимущественно почки, печень, нарушаются биоэнергетические процессы. 2,4,6-триметилфенсл (ТМФ) при введении в желудок мышей относится к 3 классу умеренно опасных соединений. 01^ не достигнута. При ингаляции преимущественно поражаются нервная система и почки. С1-50 для ФЕБ составляет 650 и 1260 мг/м3 для мышей и крыс соответственно. ФНБ обладает способности) образовывать мет- и сульфгемогло-бин и относится ко Ц классу соединений с сильной ( ) и к Ш классу с умеренной ) _ степенью специфического поражения крови. Ингаляция ФНБ вызывает поражение нервной системы, дочек, печени и периферической 1фови. ЦЦК 2-амино-5-ни-трофенола - 0,5 мг/м (П класс опасности) утверждена в законодательном порядке (дополнение Л 4 списку ПДК от 26.05.88

4617-88). Величины ЩК дая 2,4,6-триметилфенола - 2,0 мг/м3 (Ш класс опасности) и п-фторнитробензсяа - 1,0 мг/м3 (Д класс опасности) одобрены секцией промышленной, токсикологии проблемной комиссии "Научные основы гигиены труда и профзаболеваний" и переданы на утверждение в МЗ СССР.

СПИССК РАБОТ, (ПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Прогаозщювание токсичности производных бензола на основании квантовохимической модели оксеноидного механизма из биоактивации // Актуальные вопросы токсикологаи. - Пермь, 1989. -С. 77-78.

2. Связь между энергией образования ареноксидов и токсичностью однократно замещенных производных бензола: Сб. докл. кснф. молодых ученых и специалистов НИИ ГЕиПЗ АМН СССР. - Депон. во ШИИМИ № Д-18896, 1989.

3. К оксеноидной модели механизма активации нолекулярного кислорода цитохромом Р-450: роль структуры субстрата // Молекулярная биология. - 1990. - Т. 24, J* 5. - С. 1373-1380.

4. Квантовохимическое исследование зависимости токсичности и гидроксилирования производных фенола от энергии образования ареноксидов // Современные аспекты гигиены и профпатологии. - Н. Новгород, 1991. - С. 30.

5. Протезирование токсичности и бйотрансформации производных бензола с помощью квантовохшических расчетов продуктов окисления ароматического кольца // Проблемы токсикологии и прикладной экологии. - Л., 1991. - С. 143. - (в соавт.).

6. Моделирование механизма окисления и биоактивации производных бензола под действием кислорода цатохрома Р-450 // 10-е Всес. совещ. по квантовой химии. - Казань, 1991. - С.166* - (в соавт.).

. 7. Использование динамических и статических квантовохимпческих индексов реакционной способности дая описания токсичности * производных бензола // Гигиена и санитария. - (в соавт., в печати). ... . _____________________________

Зак. № 485 поап. к почата 17.10.01 г.» тар. 100 виз. Ротапринт НИИ ГТиПЗ АМН СССР