Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Состояние свободнорадикального окисления как критерий гигиенической оценки опасности атмосферных загрязнений

< ■ •

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

¿Яд г &

ЕГОРОВА Наталья Николаевна

СОСТОЯНИЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ КАК КРИТЕРИЙ ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ОПАСНОСТИ АТМОСФЕРНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ.

14. 00.07 - Гигиена

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1999

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском университете

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор М.А. Пшшгин

доктор медицинских наук, профессор P.P. Фархутдинов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор P.C. Гильденскиольд

доктор медицинских наук, профессор Г.Н. Засва

доктор медицинских наук, профессор Т.Ш. Миннибаев

Ведущее учреждение: Всероссийский научный центр биологически активных веществ - ВНЦ БАВ

Защита диссертации состоится « /¿6 »___/ С С Л с^иХ_1999 г

в /У часов на заседании диссертационног о совета Д 074.05.07 при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова министерства здравоохранения Российской Федерации (119881, г. Москва, Большая Пироговская ул., 2/6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан « 1999 г.

х, £ ) * / Чо о

Ученый секретарь / / /х / , /С;

диссертаци0ШЮ10 совета,

доктор медицинских наук, профессор А.А.Королев

Актуальность работы

Проблема химического загрязнения окружающей среды, в частности,

1

атмосферного воздуха продолжает оставаться весьма актуальной во всем мире как вследствие огромных масштабов выбросов, поступающих в атмосферу от промышленности и транспорта, так и чрезвычайного разнообразия загрязняющих веществ, в том числе вновь синтезируемых. Среди многочисленных загрязнений в воздушной среде городов распространены метготзамещенные бензола (орто-ксилол, пара-ксилол, мета-ксилол, псев-докумол, дурол), в связи с широким использованием в различных производствах (нефтехимическом, нефтеперерабатывающем, лакокрасочном, фармацевтическом, целлюлозном) и для повышения октанового числа бензинов. Последнее в определенной степени обуславливает их присутствие в выбросах автотранспорта, которые в настоящее время вносят наибольший вклад в загрязнение атмосферного воздуха (Я.М.Грушко, 1986, А.Г. Малышева с соавт., 1997). В производственных условиях указанные вещества угнетают функциональное состояние ЦНС работающих, нарушают кроветворение, оказывают раздражающее действие, вызывают морфологические изменения во внутренних органах (Н.Ф. Измеров с соавт., 1977, Э.Р.Уждавини, 1984, Е.Г.Фельдт, 1985, В.Н.Чекаль с соавт., 1986 и др.). Между тем они не получили гигиенической оценки как загрязнители атмосферного воздуха населенных мест, для них не установлены соответствующие регламенты.

Известно, что гигиеническая регламентация (нормирование) допустимого содержания вредных веществ в атмосферном воздухе как научная основа предупреждения и снижения неблагоприятного влияния атмосферных загрязнений на здоровье населения начата в России (В.А.Рязанов, 1949, 1954). Это обеспечило не только создание современной медотологии гигиенической регламентации и оценки атмосферных за-

грязнснпй (Г.И.Сидоренко, 1975; 1985; М.А.Пшшгип, 1972; 1976; 1993), ио и уникальной нормативной базы (К.А.Буштуева, Р.С.Гильденскиольд, 1996, 1997 и др.), включающей в том числе 468 ПДК и 2000 ОБУВ загрязняющих веществ.

Важным аспектом совершенствования методологии гигиенической регламетадии и оценки атмосферных загрязнений явилась разработка их токсикометрии, классификации, методов ускоренного обоснования ПДК на основе установления фундаментальных количественных закономерностей "концентрация-время-эффект" (М.А.Пинигин, 1978, Г.И.Сидоренко, 1986), а также методов оценки специфических и неспецифических эффектов (Н.Я.Янышева, 1971, В.А. Гофмеклер,1971; Н.Г.Андреещева, М.А.Пинигин, 1979, Г.И.Сидоренко, Р.В.Меркурьева, 1986, Т.И. Бонашев-ская, 1986, H.H. Беляева, 1997). Наряду с этим, особенно в последние годы при оценке опасности атмосферных загрязнений большое внимание уделяется изучению донозологических состояний, лежащих на грани нормы и патологии (Г.И.Сидоренко, 1990, 1993; Е.Н.Кутепов, 1990, Г.Ф.Семснова с соавт., 1994, Л.Х.Мухамбетова, 1997, Т.В.Жукова, 1997, Г.П.Червоненко с соавт., 1998 и др.). Особенностью разрабатываемых методов является не только их высокая информативность и чувствительность, но и возможность широкого применения при изучении влияния атмосферных загрязнений на здоровье населения и, прежде всего, детского населения. Разработанные биохимические методы (Л.Х.Мухамбетова, 1997) позволяют определять различные метаболиты в легко доступных биоматериалах (слюна, моча), что обеспечивает возможность неинвазивной диагностики воздействия химических веществ как в условиях эксперимента с животными, так и при изучении влияния этих веществ на состояние здоровья людей. При этом дается оценка биохимического статуса организма каждого обследуемого. И.В.Петровой и соавторами (1997) разработаны неиивазивные методы определения иммунологического статуса, что по-

зволяет устанавливать различные труппы риска по состоянию этого статуса. Следовательно, теперь уже в условиях эксперимента с животными можно учитывать токсические эффекты не только в градированной, но и альтернативной форме. Последнее можно осуществлять и на основе установления различных состояний адаптации (С.Л.Авалиани, 1995).

Для оценки биологического действия химических веществ стали применяться биофизические методы, в частности, хемютоминисцентные (XJI), позволяющие исследовать свободнорадикалыюе окисление (СРО) в организме. Так, Г.Н. Красовский и соавт.(1989) применили указанные методы при гигиепическом нормировании допустимого содержания персульфата калия и аммония в воде , а И.М. Трахтенберг с соавт. (1991)- при обосновании безвредных уровней воздействия цикло- и дициклогексила-мида в условиях производства. Между тем указанные методы не использовались при гигиеттческой оценке и нормировании атмосферных загрязнений, хотя как свидетельствуют многие авторы (Ю.А. Владимиров с соавт., 1988, P.P. Фархутдинов с соавт.,19В9, Н.М. Митрохин с соавт., 1991, Л.А. Тиунов, 1991, Marietta М. et all., 1988, Palmer R. et all.,1987., Miyazawa T. et all.,1993, Yasuda II. et all., 1996), реакции СРО универсальны и являются показателем метаболических процессов в организме. Действие внешних прооксидантов (радиация, ультрафиолет, химические вещества и др.) и активация эндогенных механизмов генерации активных кислородных метаболитов приводит к напряжению механизмов антиоксидантной защиты и развитию "окислительного стресса", который может проявляться на клеточном, тканевом, организменном уровнях. Оценку активности СРО, инициируемого ксенобиотиками, и степень смещения равновесия в системе иерекисное окисление липидов - антиоксиданты следует рассматривать как объективный и весьма существенный показатель общего состояния организма (Е.Б. Меньшикова с соавт., 1991, B.Halliwell et all.,1987.

При известной биологической значимости состояния свободнора- -дикального окисления, оно остается неизученным в отношении критериальной значимости для оценки опасности атмосферных загрязнений. В известной мере определение критериальной значимости состояния свобод-норадикального окисления затрудняется из-за отсутствия сформулированных общих требований к методам оценки.опасности химических веществ, загрязняющих атмосферный воздух. Действительно, широкое развитие методов донозологической диагностики, примение альтернативных биологических моделей ( Г.И.Клебанов, 1995, Г.П.Червонская с соавт., 1998) как в связи с требованиями этики медико-биологических экспериментов, так и в связи с экономическими требованиями, делают выбор тех или иных критериев оценки опасности атмосферных загрязнений непростой задачей. Критериальная значимость свободнорадикалыюго окисления для оценки опасности атмосферных загрязнений остается недостаточно ясной и вследствие того, что количественные закономерности связи между степенью изменения свободнорадикального окисления, интенсивностю и длительностью воздействия атмосферных загрязнений остаются неизученными. Это, безусловно сдерживает развитие методических схем постановки эксперимента по оценке опасности веществ и обоснованию их ПДК в атмосферном воздухе.

В связи с изложенным целью настоящих исследований явилось обоснование возможности оценки свободнорадикалыюго окисления как критерия опасности атмосферных загрязнений, с разработкой гигиенических регламентов метилзамещенных бензола в атмосферном воздухе.

Для достижения цели в работе необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Сформулировать общие требования к методам донозологической

диагностики опасности веществ, загрязняющих атмосферный воздух и определить степень соответствия этим требованиям метода изучения свободнорадикального окисления с использованием хемилюмшшеценциа.

2. Изучить количественное выражение зависимости "концентрация-время-эффект" по изменению свободнорадикального окисления с обоснованием метода гигиенической регламентации и оценки опасности атмосферных загрязнений.

3. Оценить опасность метилзамещенных бензола (орто-, мета-, пара-ксилола, псевдокумола, дурола), обосновать их предельно допустимые концентрации с учетом состояния свободнорадикального окисления.

4. Исследовать связь показателей опасности общетоксического действия метилзамещенных бензола, установленных по изменению СРО, с их физико-химическими свойствами и электронно-ядерной структурой, изучить непосредственное действие веществ на процессы СРО в модельных системах.

Научная новизна:

- обоснованы требования к выбору методов оценки опасности и токсичности атмосферных загрязнений на уровне предпатологии, с учетом патогенетической значимости, возможности выявления изменений в альтернативной форме, высокой чувствительности, воспроизводимости, сходимости, информативности, соответствия принципам гуманности и экономической целесообразности;

- впервые показано, что при воздействии атмосферных загрязнений на . организм оценка состояния свободнорадикального окисления по хеми-

люминисценции, соответствуя указанным выше требованиям, позволяет дифференцировать состояние адаптационных процессов в системе сво-боднорадикальное окисление-антаоксиданты: компенсация (усиление окисления и антиокисления), напряжение (противоположная направленность изменений окисления и антиокисления), перенапряжение, заканчивающееся срывом (ослабление окисления и антиокисления вплоть до прекращения), которые зависят от длительности и уровня непрерывного воздействия метилзамещенных бензола;

- впервые установлена возможность количественного выражения изменений свободнорадикальное окисление - аптиоксиданты в градированной и альтернативной ( на основе градированных показателей и по стадиям компенсации, напряжения, перенапряжения) формах с получением зависимости "концентрация-время-эффект";

- по изменению процессов СРО определен лимитирующий показатель резорбтивного действия для всех метилзамещенных бензола;

- показано, что параметры токсичности соединений (порог хронического действия, недействующие концентрации), установленные по изменению СРО в ряду мелилзамещенных бензола, тесно коррелируют с характе- . ристиками их электронно-ядерной структуры;

- выявлено непосредственное влияние исследуемых соединений на процессы свободнорадикального окисления в модельных системах - с увеличением количества метальных групп в производных бензола усиливается интенсивность подавления окислительных процессов;

- с учетом стадий изменения процессов свободнорадикального окисления дана токсиколого-гигиеническая оценка 5-ти метилпроизводных бензола при непрерывном ингаляционном поступлении в организм и обоснованы их экологически надежные нормативы для атмосферного воздуха населенных мест.

Теоретическое значение работы заключается в том, что результаты исследований по оценке качественных и количественных изменений сво-боднорадикальных процессов, раскрывают особенности неспецифического действия, которое проявляется на ранних этапах взаимодействия токсиканта с организмом, способствуют пониманию закономерности взаимодействия организма и атмосферных загрязнений в динамике их непрерывного поступления, а также дальнейшему развитию теории гигиенического per-

ламентирования и оценке опасности атмосферных загрязнений на основе

концепции риска среди населения.

- Практическое значение работы. Использование разработанной методической схемы гигиенической оценки химических загрязнений окружающей среды при изменении свободнорадикального окисления в организме по стадиям компенсации, напряжения, перенапряжения позволяет оценить состояние каждого животного в альтернативной форме или по сравнению с градированной нормой показателя, обосновать гигиепичекие регламенты метилзамещенных бензола в •атмосферном воздухе с учетом оценки их токсичности в ранние сроки воздействия, что, в конечном итоге, будет способствовать оздоровлению окружающей среды; предложенные уравнения для прогнозирования порогов хронического действия и недействующих концентраций по электронно-ядерной структуре химических соединений дают возможность получить указанный показатель токсикометрии, с помощью его обосновать ОБУВ и оценить класс опасности уже при остром воздействии вещества без проведения субхронического эксперимента по изменению ХЛ; исследование свободнорадикального окисления в модельных системах позволяет проводить быстрый предварительный скрининг токсичности в ряду веществ.

- Внедрепие результатов работы. Результаты работы внедрены в практику в виде:

- изобретения "Способ прогнозирования ранних патологических изменений при действии загрязнителей атмосферы населенных мест" (положительное решение на изобретение от 28.01.98 г. по заявке № 95107203М4 - 012625 от 4.05.95) ;

- внесены в банк данных вузовских разработок по природоохранной тематике для реализации Государственной программы "Экологическая безопасность России" (ноябрь 1994 г.);

- применяются в системе эколого-гигиснического мониторинга в Республике Башкортостан при реализации природоохранных мероприятий;

- использованы при подготовке следующих документов:

- материалов по обоснованию предельно допустимых концентраций 1,2,4-триметилбензола в атмосферном воздухе населенных мест; утв. Проблемной комиссией «Научные основы гигиены окружающей среды»; информ. письмо № 10-13/45 от 14.01.92 г.;

- материалов по обоснованию предельно допустимых концентраций 1,2,4,5- тетраметилбензола в атмосферном воздухе населенных мест; утв. Проблемной комиссией «Научные основы гигиены окружающей среды»; информ. письмо № 10-13/100 от 16.11.92 г.;

- методики выполнения измерений концентраций дурола в атмосферном воздухе; утв. Проблемной комиссией «Научные основы гигиены окружающей среды»; информ. письмо № 17-5/210С от 28.10.92 г.;

- методики выполнения измерений концентраций псевдокумола в атмосферном воздухе; утв. Проблемной комиссией «Научные основы гигиены окружающей среды»; информ. письмо № 17-5/100С от 07.02.91 г.;

- материалов но обоснованию предельно допустимых концентраций орто-ксилола в атмосферном воздухе населенных мест; утв. Проблемной комиссией «Научные основы гигиены окружающей среды»; информ. письмо № ФК-13/1-149 от 19.07.94 г.:

- материалов по обоснованию предельно допустимых концентраций пара-ксилола в атмосферном воздухе населенных мест; утв. Проблемной комиссией «Научные основы гигиены окружающей среды»; информ. письмо № ФК-13/1-149 от 19.07.94 г.;

- материалов по обоснованию предельно допустимых концешраций мета-ксилола в атмосферном воздухе населенных, мест; утв. Проблемной

комиссией «Научные основы гигиены окружающей среды»; информ. письмо № 10-13 от 22.09.99 г.;

- «Итогов деятельности по приоритетным направлениям исследований» Отделения медицинских паук АН РБ - Башкирского научного центра РАМН за 1996, 1997, 1998 гг.;

- внедрены в учебный процесс на кафедрах Башкирского государственного медицинского университета {акты внедрения от 1998

г.).

- методических рекомендаций « Метод хемилюмшшсценции как способ оцепки токсичности атмосферных загрязнений», 1999. Уфа, 1999. - 16 с.

- Апробация работы. Основные материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях проблемных комиссий "Актуальные вопросы гигиены в регионах с развитой нефтеперерабатывающей, нефтехимической промышленностью", Уфа, 1996 г., 1997 г., 1998 г., "Научные основы охраны окружающей среды и здоровья населения РБ", Уфа, 1994 г.; заседаниях научного совета "Проблемы охраны окружающей среды и экологически обусловленной патологии человека" отделения медицинских наук Академии наук Республики Башкортостан - Башкирского научного центра РАМН , 1995, 1996, 1997, 1998 гг.; ; 4-ой всесоюзной конференции "Эндокринная система организма и

. вредные факторы окружающей среды", Ленинград, 1991; 2-ом съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосиб1грск, 1995; конференциях "Эколого-гигиенические проблемы Уральского региона", Уфа, 1995; "Уральский регион Башкортостана: человек, природа, общество", Уфа - Сибай, 1995 и др.; 3-м международном конгрессе по сравнительной физиологии , Japan, Tokyo, 1991; международных конференциях по научно-практическим аспектам управления качеством воздуха, St.-Petersburg, 1995; по фундаментальным и прикладным проблемам охраны окружающей среды, экологии, Tomsk, 1995; Уфа,

1995; Новосибирск, 1995; Berlin, 1996; St.-Petersburg, 1997; Moscow, 1998; Великий Новгород, 1999; научно-практической конференции кафедр общей гигиены, экологии человека и гигиены окружающей среды, гигиены труда Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, сентябрь 1999 г.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 38 работах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 265 печатных страницах, включает 46 таблиц, 45 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, 4 глав методов и собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 312 отечест-веиных и иностранных источников, 42 приложений.

На защиту выносятся следующие положения диссертации:

Оценка состояния свободнорадикальное окисление - антиоксиданты по изменению XJI позволяет проводить наиболее адекватную донозологи-ческую диагностику химических факторов окружающей среды.

По стадиям изменения свободнорадикального окисления при непрерывном действии химических веществ возможна оценка статуса организма и количественное выражение эффекта в градированной и альтернативной форме.

Параметры токсикометрии, установленные по изменению свободнорадикального окисления, наиболее точно характеризуют степень опасности и токсичности веществ и корреляционно тесно связаны с элекгронно-ядерной структурой метилзамещенных бензола.

Методы и объем исследований.

Обоснование общих требований к методам донозологической диагностики с оценкой соответствия этим требованиям метода свободнорадикального окисления осуществлялось на основе анализа и обобщения данных литературы, а также собственных экспериментальных данных по

изучению особенностей изменения окислительных и антиокислительных процессов в организме лабораторных животных при ингаляционном воздействии различных концентраций метилзамещенных бензола. В экспериментах сравнивалось время наступления изменений свободнорадикалыюго окисления с временем наступления достоверных изменений широко используемых интегральных показателей при обосновании атмосферных загрязнений (суммационно-пороговый показатель, норковый рефлекс, поведенческие реакции, активность холинэстеразы, морфологический состав периферической крови). Наряду с этим оценивались уровни действующих и недействующих концентраций, которые были установлены с использованием указанных тестов.

Состояние свободнорадикалыюго окисления белых крыс оценивалось по железозависимой хемилюминисценции путем регистрации свечения биосред организма (гомогенаты печени, почек, мочи, сыворотки крови) на хемилюминомере (Р.Р.Фархутдинов с соавт., 1990). Учитывая многочисленные исследования, убедительно доказавшие наличие корреляционной зависимости между интенсивностью хемилюминисценции и скоростью процессов свободнорадикального окисления (Ю.А.Владимиров с соавт., 1991, Р.Р.Фархутдинов с соавт., 1995 ), изменение свободнорадикального окисления оценено по следующим интегральным показателям хеми-лйминисценции: светосумме свечения , представлющей площадь под полученной кривой хемилюминисценции, которая позволяет судить о состоянии свободнорадикального окисления; периоду индукции (длительности латентного периода) - времени от окончания быстрой вспышки до начала медленного свечения, зависящему от антиокислителыюй активности.

Воспроизводимость указанного метода оценивалась путем сравнения данных хемилюминисценции, полученных при исследовании биосред организма у крыс-самцов в контрольных группах в разные периоды эксперимента.

Сходимость метода определялась при повторной записи ХЛ модельных систем желточных липопротеидов, а также при добавлении в среду инкубации одного того же количества антиоксиданта - ионола.

Возможность использования свободнорадикального окисления для целей псинвазивной диагностики исследовалась при сравнении результатов его определения в моче и в других биосредах (гомогепаты печени, почек, сыворотки крови) экспериментальных животных при ингаляционном воздействии метилзамещенных бензола.

Состояние свободнорадикального окисления в модельных системах изучено при непосредственном действии различных уровней орто-ксилола: 1 мкл; 2,5 мкл; 10 мкл; 20 мкл на желточные липопротеиды (по Г.И.Клебанову, 1989). Среду желточных липопротеидов, инициировали 2-х валентным железом в количестве 1 мл.

Количественное выражение зависимости "концентрация- время-эффект"по изменению свободнорадикального окисления у белых крыс при ингаляционном воздействии метилзамещенных бензола определялось на основе первоначального построения по данным эксперимента кривых "время- эффект", а затем кривых " концентрация- эффект" при заданном времени воздействия и "концетрация-время" при определенной степени выраженности эффекта.

При разработке метода оценки опасности атмосферных загрязнений на основе изучения СРО было использовано количественной выражение зависимости "концентрация-время", так как именно эта зависимость дает возможность не только определять, но и прогнозировать все необходимые токсикометрические параметры для обоснования ПДК атмосферных загрязнений по результатам краткосрочного эксперимента (М.А.Шпшгин, 1972; Г.И.Сидоренко, 1986). Изменение показателей СРО учитывалось в градированной и альтернативной форме. В случае учета эффекта в гради-

рованной форме в качестве времени наступления определенного эффекта принималось время наступления максимума угнетения светосуммы свечения хемилюминисценции, а в случае учета в альтернативной форме - время наступления одной из адаптационных стадий - компенсации, напряжения, перенапряжения установленное по состоянию СРО-антиокисление у преимущественного числа животных.

Для обоснования максимально разовой ПДК веществ оценено их рефлекторное действие в соответствии с "Временными методическими указаниями по обоснованию ПДК загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест", 1989 г. С этой целью было изучено 22 концентрации метилзамещенных бензола с привлечением 122 волонтеров.

Оценка токсичности и опасносш 5-ти метилзамещенных бензола с обоснованием их среднесуточной ПДК в атмосферном воздухе с учетом изменения хемилюминисцешрш осуществлялась на основе ускоренного экспериментального метода (М.А.Пинигин, 1978; Г.И.Сидоренко, 1986) с нашими дополнениями.

При изучении резорбтивного действия метилзамещенных бензола животные подвергались непрерывному ингаляционному воздействию 21 концентрации. Длительность воздействия колебалась от 0,5 часов до 2880 часов в зависимости от уровня концентраций веществ в воздухе (табл. 1), которые контролировались с помощью метода газожидкостной хроматографии (Г.Г. Халитов с соавт., 1997). В эксперименте использовано 1200 белых крыс с исходной массой 120-140 г.

При выборе показателей для оценки биологического действия указанных веществ па организм животных руководствовались убедительно доказанными данными результатов обоснования их регламентов в рабочей зоне о способности этих соединений поражать преимущественно ЦНС, оказывать выраженное действие на печень, кроветворную систему(Э.Р.Уждавини

с соавт., 1970, 1984, Н.Е.Дышиневич, 1975, В.Г.Фельдт, 1985, И.Е.Шафранский, 1998).

Таблица 1.

Концентрации метилзамещенных бензола и длительность воздействия при изучении их резорбтивного действия.

Название вещества Концентрация, мг/м3 Длительность ингаляции, в час

Пара-ксилол 44, 56, 560, 1550 0,5 - 576

Орто-ксилол 6, 54, 500, 1530 0,5 -576

Мета-ксилол 9, 26, 120, 700 1-240

Псевдокумол 0,01, 1, 9, 390, 2880 3 -2880

Дурол 40, 80, 200, 450 3-600

В связи с этим действие веществ оценивалось по следующим показателям:

СПП, норковый рефлекс, число вставаний, активность холинэстеразы цельной крови, содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарная формула с применением общепринятых токсикологических методов. По окончании ингаляции проведены патоморфологические исследования легких, печени, почек, головного мозга крыс.

Для выяснения зависимости активности СРО в организме экспериментальных животных от структуры метилзамещенных бензола исследована связь пороговых и недействующих концентраций соединений, обоснованных по изменению СРО, с их физико-химическими и электронно-квантовыми свойствами с помощью анализа "структура-эффект". Для чего осуществлен квантово-химический расчет структуры молекул анализируемых веществ, отличающихся друг от друга лишь количеством метальных групп в бензольном кольце или их ориентацией. Методом AMI оптимиза-зии Полукарибьера получены следующие квантово-химические характеристики веществ: энергия высшей заполненной молекулярной орбитали -ВЗМО, низшей свободной молекулярной орбитали-НСМО, разность энергии орбигалей, суммарный заряд на атомах углерода, не связанный с за-местателями на бензольном кольце, дипольный момент, потенциал иони-

^ зации, сродство к электрону, электроотрицательность, определены геометрические размеры молекул по моделям Бриглеба-Споарта ( длина, шири-I на, соотношение дошлы к ширине). Также использованы и расчитаны фи-1 - зико-химические константы: молекулярная масса, плотность вещества (при 20 С, отнесенная к плотности воды при 4 С), температура плавления, кипения, показатель преломления, парахор (но Мак-Гоуану), липофилыюсть. Вычислены коэффициенты корреляции с их ошибками, средние квадратичные отклонения, в пределах которых находятся 2/3 всех расчитанных величин, Р-уровень достоверности для малой выборки.

. Оценка токсичности веществ в ряду метилзамещенных бензола в зависимости от их структуры на процессы свободнорадикальное окисление-антиоксиданты проведена в модельных системах желточных липопротеи-дов (по Г.И.Клебанову, 1989). Среду желточных линопротеидов, инициировали 2-х валентным железом в количестве 1 мл.

Объем выполненных исследований приведен в таблице 2.

Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием методов вариационной статистгаси, корреляции, регрессии по компьютерным программам Microsoft Office, Excel, Statistica на ПЭВМ ЮМ 486 DX4.

Обоснование общих требований к методам донозологнческой диагностики опасности атмосферных загрязнений и определение соответствия этим требованиям метода опенки свободнорадикального окисления по хемнлюминисценцин.

Как уже отмечалось, нарушения свободнорадикального окисления являются молекулярной основой развития различных патологических реакций. Генерация активных кислородных метаболитов вследствие воздействия внешних и эндогенных факторов приводит к напряжению механизмов антиоксидантной защиты и развитию "окислительного стресса", который может проявляться на клеточном, тканевом, организменном уров-

Таблица 2. i

Методы и объем выполненных исследований <

Методы исследования Источник Объекты и количество исследований

Биохимические, клинические, физиологические КостЕ.А., 1968, Неменова Ю.М, 1972 Экспериментальные кры-сы-1200, цельная кровь -4500, физиологические параметры -4500

Хемилюминисцентные Владимиров Ю.А. и др., 1972, Клебанов Г.И. и др., 1989 Гомогенаты печени, почек, Сыворотка крови, моча экспериментальных крыс -800 модельные системы желточных липопротеидов -30

Физико-химические Биосреды крыс - 700

Хромато графические Халитов Г.Г. и др., 1997 Газовоздушные смеси -1300

Гистологические Волкова О.В. и др., 1982 внутренние органы крыс -600

Морфологические Ольфакторные Меркулов Г. А., 1966 АндресщеваН.Г., 1971 внутренние органы крыс -600 добровольцы-волонтеры, 122 человека, 1974 исследования

Расчетные: оптимизации Полукарибьера, Мак-Гоуаиа, Маллике-на.Бриглеба-Стюарта Бреишайдер С., 1996 киантово-химические, физико-химические параметры - 80

Статистический Плохинский H.A., 1970, Боровиков В.П., Боровиков И.П., 1997 вариационные ряды - 700

Наименьших квадратов Лишние Ю.В., 1962 зависимости "концентрация-время-эффект" -50

Корреляционный Гублер Е.В., 1978 параметры токсичности метилзамехцешшх бензола, квантово-хммические, физико-химические характеристики - 220

Регрессионный Гублер ЕВ., 1978 Уравнения регрессии - 20

нях. Поэтому оценка состояния СРО рассматривается во взаимосвязи процессов окисления-антиокисления. Эта сущность СРО весьма информативно раскрывается при определении его состояния хемилюминисцентным методом - ХЛ.

Как показали результаты исследований, изменения состояния СРО

- под воздействием метилзамещенных бензола в действующих по интегральным показателям концентрациях имеют определенную закономер-

1

" ностъ. Первоначально наблюдается усиление как окислительных, так и антиокислительных процессов (светосумма свечения и период индукции ХЛ возрастают). Затем изменения приобретают разную направленность -окисление ослабевает, антиокисление продолжает усиливаться и, напротив, окисление усиливается, антиокисление ослабевает (светосумма свечения

- снижается до минимума, период индукции увеличивается до максимального уровня). Наконец, окисление вновь ослабевает, при дальнейшем ослаблении антиокисления (светосумма свечения и период индукции уменьшаются).

Типичный ход изменения процессов окисление-антиокснданты при воздействии химических агентов может свидетельствовать об изменении адаптационного статуса организма: компенсации (усиление процессов),

напряжения (разная направленность процессов), перенапряжения (ослабление процессов), заканчивающихся срывом (рис. 1). Необходимо отметить, что в стадии напряжения, когда светосумма свечения снижается до минимума, а период индукции возрастает до максимума, между этими величинами ХЛ выявляется высокая корреляционная связь - р <0,05-0,001. Возможность определили различных стадий на уровне окислнтелыю-антиокислительных процессов по ХЛ позволяет переходить от учета эффекта в градированной форме к их учету в альтернативной форме (по статусу организма). Учет биологических эффектов у лабораторных животных в альтернативной форме позволяет получшъ зависимость "концен-трация-(доза) - ответ". Так как эта зависимость лежит в основе оценки риска неблагоприятных эффектов среди населения, можно считать, что установление данной зависимости в эксперименте с животными будет способ

А

Длительность ингаляции, час

В

Длительность ингаляции, час

5

6

С

О 120 192 216 240

Длительность ингаляции, час

3 $

Рис. 1 Изменение СПП (1), норкового рефлекса (2), числа вставаний (3), активности холинэсте-разы (4), числа пересечений (5), количества гемоглобина (6), светосуммы ХЛ гомогената печени (7), периода индукции ПИ (8) гомогената печени .при непрерывной ингаляции дурола. (40 мг/м3) - А. псевдокумола (2880 мг/м3) - В, мета-ксилола (9 мг/м3) - С. :

ствовать оценке риска аналогичных эффектов среди населения. В связи с этим возможность перехода от градированных показателей к альтернативным является одним из важных требований, предъявляемых к методам

А

донозологической диагностики опасности атмосферных загрязнений.

К числу общих требований к указанным методам оценки биологического действия веществ следует отнести и требование высокой чувствительности - возможности выявления изменений показателей при наименьших уровнях воздействия веществ, а также при наиболее ранних сроках воздействия данной концентрации.

Так, при воздействии псевдокумола в концентрации 2880 мг/м3 достоверное (р< 0,001) усиление окислительных процессов в печени крыс ( свето-сумма железозависимой ХЛ возрастала в 2,3 раза) наступило через 3 часа, между тем достоверное изменение интегральных показателей (р< 0,010,001) отмечалось только через 6 часов ( угнетение норкового рефлекса, увеличение суммациопно-порогового показателя, снижение активности хо-линэстеразы цельной крови).

Через 336 часов непрерывного воздействия псевдокумола в концентрации 1 мг/м3 светосумма железозависимой ХЛ увеличивалась в 3,4 раза (р<0,001), тогда как интегральные показатели (число вставашш) достоверно изменялись (р<0,001) только к 480 часам.

При ингаляционном воздействии, псевдокумола на уровне 0,01 мг/м3 достоверные изменения свободнорадикального окисления (р<0,001) наступали через 1 месяц - светосумма ХЛ гомогената печени увеличивалась в 2 раза и на протяжении 4-х месяцев превышала исходный уровень в 2-2,9 раз. В то же время при действии данной концентрации не выявлено изменений ни по-одному функциональному биохимическому, физиологическому показателю на протяжении 4-х месяцев эксперимента.

Таким образом, с помощью ХЛ метода удалось выявить изменения СРО в наиболее ранние сроки и при низких уровнях воздействия вещества, что подчеркивает его высокую чувствительность.

Согласно литературным данным одним из важных требований к методу является его воспроизводимость, под которой следует понимать близость друг к другу результатов измерения ХЛ, выполняемых в различных . условиях, в частности, в различное время эксперимента у интакгных животных. Как показали исследования у разных групп интакгных крыс сам- -цов, масса которых была в пределах 120-140г, показатели ХЛ в гомогенате печени у животных в разные сроки эксперимента удовлетворительно со-, ответствовали друг другу, имели незначительный разброс значений в пре- -делах 21-37 относительных единиц, при этом в исследуемых группах средние значения показателя составили 22; 24,6 и только у одного из 10 животных в группах значение светосуммы свечения отличалось от показателей других животных, что во всех случаях исследования не превышало 10%. В то же время показатели ХЛ разных биосред одних и тех же животных отличались между собой. Наибольшие значения светосуммы свечения и периода индукции ХЛ были в гомогенате печени (24,б±0,93; 0,64+0,16), а наименьшие - в гомогенате почек, сыворотке крови и моче (18,1+0,5 ).

Вместе с тем, показатели ХЛ мочи позволяли вполне удовлетворительно выявлять состояние свободнорадикального окисления у лабораторных животных.

Это свидетельствует о том, что оценка опасности химических соединений по изменению свободнорадикального окисления может осуществляться на основе требований неинвазивной диагностики. Например при ин-галяциошюм воздействии псевдокумола в концентрации 9 мг/м3 в пробах мочи животных наблюдалось достоверное (р< 0,001) увеличение светосуммы свечения в 1,4 раза через 48 часов воздействия, причем, оно возникло

значительно раньше, чем произошло достоверное (р< 0,001) увеличение

- суммационно-порогового показателя (через 192 часа). Полученные результаты подтверждают возможность оценки действия химических соедине-

- юга по изменению состоя!гая свободнорадикального окисления в организме с помощью биосред, полученных неинвазивным путем.

При многократном воспроизведении записи свечения модельных систем желточных липопротеидов (20мкг) установлена светосумма ХЛ на уровне 110 ±0,16 (максимальные отклонения вариант от средней величины составили относительно единиц +8, -6). Добавление универсального синтетического антиоксиданта ионола в количестве 2% по отоошешно к желточным липопротеидам (2.10"7 л) неизменно полностью подавляло процессы свободнорадикального окисления в модельных системах. Соответствие друг другу результатов измерения ХЛ, выполненных в данном случае при соблюдении одинаковых условий, показывало удовлетворительную сходимость измерений. Таким образом, хорошая воспроизводимость и сходимость измерений методом ХЛ обеспечивает максимальную объективность получения результатов изменения СРО в биосредах организма и модельных системах.

Как показали исследования, изменения свободнорадикального окисления в разных биосредах организма (печень, почки, сыворотка крови, моча) при оценке опасности атмосферных загрязнений являются достаточно информативными, так как хорошо отражают дозозависимую интенсификацию ингаляционного воздействия веществ. Так, в динамике непрерывной ингаляции псевдокумола (2880, 1 мг/м3) максимальные отклонения ХЛ наблюдались в печени (более 5 раз при действии большей концентрации, в 2 раза при действии меньшей концентрации псевдокумола).

Следует подчеркнуть также, что при непрерывной ингаляции псевдокумола (концентрации 2880 и 1 мг/м3) максимальное угнетение светосуммы свече-

ния и увеличение времени между окончанием быстрой и началом медленной вспышки в гомогенате печени происходило в более ранние сроки, чем в других биосрсдах.

Наибольшая лабильность параметров ХЛ отмеченная в печени, свидетельствует о развитии в ней более интенсивных окислительных процессов и согласовывается с данными других исследователей о высокой выраженности в органе свободнорадикальных реакций при повреждающем действии ксенобиотиков (Ю.А.Владимиров с соавт., 1992, Е.Б.Меньшикова с соавт., 1994, Н.М.Митрохип с соавт., 1991).

Однако, достоверное (р<0,001) изменение светосуммы свечения других биосред (гомогенат почек, сыворотка крови) в начальные сроки воздействия веществ (5 часов ингаляции псевдокумола и 1,5 часа ингаляции орто-ксилола), свидетельствует о высокой информативности окислительных процессов в организме лабораторных животных.

Как было известно из литературы, из множества методов донозоло-гической диагностики предпочтительнее методы, не требующие специальной подготовки исследуемого материала, наличия большого количества реактивов, дорогостоящего оборудования, имеющие короткое время проведения анализа, отличающиеся простотой выполнения.

Собственные результата показали, что перечисленным требованиям вполне соответствует ХЛ метод: не требует длительной подготовки исследуемых проб, большего количества реактивов, т.к. является биофизическим методом, прост в выполнении - за короткое время проведения анализа (до 10 минут) обеспечивает объективность и надежность получения результатов изменения СРО в организме, что подтверждает его экономическую целесообразность.

Таким образом, проведенные исследования показали, что хемишо-минисцентный метод определения свободнорадикального окисления вполне соответствует общим требованиям к методам донозологической ди-

агностики химических факторов окружающей среды, которые можно сформулировать следующим образом: определение патогенетического значения; возможность учета изменений не только в градированной, но и в альтернативной форме; высокая чувствительность и информативность; хорошая воспроизводимость, сходимость; соответствие принципам этики и гуманности; экономическая целесообразность.'

Количественное выражение зависимости "концептрация-время-эффект" по изменению свободнорадикального окисления с обоснованием метода гигиенической опенки опасности атмосферных загрязнений.

Анализ динамики изменения свободнорадикального окисления при ингаляции псевдокумола показал, что по мере увеличения длительности воздействия одной и той же концентрации наблюдаются, как уже отмечалось, фазовые отклонения светосуммы свечения и периода индукции ХЛ. Ввиду фазовосга развития эффекта во времени в случае его учета в градированной форме построить кривые зависимости "время-эффект" и выразить их математически представляется непростой задачей.

Вместе с тем, исходя из динамики эффекта для получения зависимостей "время-эффект" можно устанавливать время, в течение которого происходит наступление определенных достоверных изменений показателей. Так, 1-ое достоверное изменения светосуммы свечения и периода индукции гомогената печени крыс иа 180% ( между которыми в данный момент исследования установлена достоверная корреляционная связь г<0,95-0,98), характерное для стадии напряжения, при воздействии псевдокумола в концентрации 2880 мг/м3 наступало через 1 час ингаляции при групповой оценке изменения показателей у животных, с уменьшением уровня концентрации вещества время наступления данного эффекта возрастало (табл. 3). Более того, при недействующих по интегральным показателям уровнях вещества (0,01 мг/м3) указанного увеличения периода индукции

на фоне уменьшения светосуммы свечения ХЛ вообще не наблюдалось на протяжении 4-х месяцев ингаляции.

Таблица 3

Время наступления максимума уменьшения светосуммы свечения гомогената печени крыс при непрерывной ингаляции псевдокумола в раз_личных концентрациях_

Концентрация, мг/м3 Время воздействия ве-.щества в часах Степень выраженности эффекта по отношению к контролю, % Р

2880 1.5 >180 <0,001

390 18 180 <0,001

9 72 >180 <0,001

1 480 >180 <0,001

В соответствии с кривыми "время-эффект" установлена зависимость -"концентрация-время" с выражением изменения параметров ХЛ на 200 и более процентов при воздействии различных концентраций вещества, которая описывалась уравнением общего вида 1§Т = 1дТо - ^ос^С и в координатах двойного логарифмического масштаба имела вид прямых.

Графическое выражение указанной зависимости, степенную функцию которой установил М.Д.Пинигин (1972), полученное нами по изменению свободнорадикального окисления, подтверждает общебиологический характер зависимости "концентрация-время", установленной исследователями при действии более 100 химических веществ , относящихся к 14 химическим классам (ароматические углеводороды, металлы, соединения азота, бактерийные лекарственные препараты, фенол и т.д.) по изменению 52 различных функциональных показателей оценки токсического действия веществ (М.А. Пинигин, 1972, Ю.Я.Якушевич, 1973, В.В.Косяков, Е.В. Пе-ченникова, 1978; А.В.Сачков, 1983, В.М.Пазынич, 1984, Л.НДветкова, 1981, Г.И.Нскрасова, 1984, К.А.Рапопорт,1986, А.Х.Камильджанов, 1987, С.М.Соколов, 1990, НЛЕгорова, 1994,1999, Л.А.Тепикина,1997 и др.).

Следует подчеркнуть особую значимость возможности количественного выражения зависимости "концентрация-время", т.к. это позволяет устанавливать токсикометрические параметры, полученные с учетом изменения СРО в организме на ранних этапах токсического воздействия веществ:

При количественной оценке изменений СРО в альтернативной форме, учитывающей процент животных с отклонением показателя в группе от градированной нормы (М ±т1) интактной группы, установлено, что при действии различных концентраций псевдокумола изменения показателя у одного н того же числа животных развивалось в разное время. Так, при снижении концентрации псевдокумола с 2880 до 0,01 мг/м3 время наступления эффекта у 84% животных в группах увеличивалось с 2-х до 1400 часов.

В соответствии с прямыми"время-эффект" определен процент животных, у которых к заданному времени произошло изменение свободноради-кального окисления, выходящее за пределы градированной нормы.

Например к 23 часам при ингаляции псевдокумола в концентрации 2880 мг/м3 отмечены изменения у 90% животных при ингаляции в концентрации 390 мг/м3 у 80% животных, при действии концентрации 9 мг/м3 - у 70% животных. Полученная с использованием выявленной зависимости "время-эффект" зависимость "концентрация-эффект" (табл.4) позволяет оценивать опасность вещества при действии разных концентраций на основе концепции риска.

Таблица 4.

Зависимость изменения светосуммы свечения гомогената печени животных (в процентах) от уровня концентрации псевдокумола при разной длительности ингаляции_

Эффект, % При воздействии 23 час. концентрация, мг/м3 При воздействии 360 час. концентрация, мг/м3

84 230 0,05

50 14 0,04

16 1,18 0,005

Однако, учитывая, что параметры ХЛ весьма лабильны и в динамике воздействия значительно отличаются от величины показателей интакпшх животных, оценивались изменения показателей у каждого животного в соответствии со стадиями адаптации: компенсацией, напряжением, перенапряжением, устанавливаемыми в динамике непрерывного воздействия вещества по изменению параметров ХЛ. Была определена структура адаптации животных в разные сроки непрерывной ингаляции в зависимости от уровня воздействия вещества.

В группу со стадией компенсации эффекта относили животных, по альтернативному признаку у которых и светосумма свечения и период индукции увеличивались по сравнению с предыдущим исследованием.

Группу со стадией напряжения эффекта составили животные, светосумма и период индукции ХЛ которых имел разную направленность изменений - при продолжающемся увеличении или уменьшении одного параметра другой параметр наоборот уменьшался или увеличивался.

В группу со стадией перенапряжения эффекта вошли животные с наступающими одновременно уменьшением светосуммы свечения и периода индукции.

Так, в табл.5 представлены данные, характеризующие структуру адаптационного состояния у животных в зависимости от длительности ингаляционного воздействия псевдокумола в концентрации 9 мг/м3.

Таблица 5.

Изменение структуры статуса лабораторных животных при непрерывном ингаляционном воздействии псевдокумола

Концентрация, мг/м3 Длительность ингаляционного воздействия, час Стадии адаптации

компенсац. эффект % напряжение эффект % Перенапряж. Эффект %

9 32 80 20 -

48 50 30 20

72 10 60 30

162 - 70 30

По мере увеличения длительности воздействия процент животных, находившихся в стадии компенсации уменьшался за счет перехода в стадии напряжения и перенапряжения. Например, к 32 часам 80% животных находились в стадии компенсации, а к 162 часам - 70% животных относилось к стадии напряжения и 30% -к стадии перенапряжения.

Аналогичные данные были получены и при воздействии меньших и больших концентраций псевдокумола. Отличие состояло лишь в том, что изменения структуры стадий адаптации по состоянию свободнорадикаль-ного окисления у животных в первом случае происходило медленнее, а во втором - быстрее.

Альтернативный учет изменения свободнорадикального окисления дает возможность проследить и как развитие того или иного эффекта у животных (компенсации, напряжения, перенапряжения) зависит от уровня воздействующих концентращш (табл. 6).

Таблица 6.

Изменение структуры статуса лабораторных животных от уровня концентраций псевдокумола при 48 часовом воздействии.

Концентрация, мг/м3 Стадии адаптации

Компенсация, эффект % Напряжение, эффект % Перенапряжение, эффект %

2880 - 60 40

390 10 50 40

9 50 30 20

1 90 10 -

Анализ зависимости процента животных с различными стадиями адаптации от уровня концентраций псевдокумола при 48 часовом воздей-

ствии показывает, что при увеличении уровня воздействия вещества с 1 мг/м3 до 2880 мг/м3 относительное число животных с компенсацией эффекта уменьшается (с 90% до 0%), а с напряжением и перенапряжением увеличивается (с 10% до 60% и с 0% до 40%). Графическое выражение зависимости "концентрация-эффект" на логарифмически-пробитной сетке имеет вид прямой, указашгая зависимость может быть установлена для каждой стадии адаптации к любому заданному времени воздействия.

Несмотря на то, что мере воздействия одной и той же концентрации вещества животные все больше переходят из группы с компенсацией в группу с напряжением и перенапряжением эфффекга существует возможность выражения зависимости "время-эффект" по наступлению определенного изменения адаптации животных: компенсации, напряжения, перенапряжения. Так, с увеличением времени воздействия псевдокумола в концентрации 9 мг/м3 процент животных с компенсацией эффекта уменьшался (от 80% до 0%), а процент животных в стадии напряжения и перенапряжения возрастал (от 20% до 70% и от 0% до 30%), что при графическом выражении на логарифмически -пробитной сетке имело вид прямых. На основе анализа установленных зависимостей "время-эффект" в альтернативной форме по стадиям компенсации, напряжения, перенапряжения для каждой концентрации вещества можно определять время наступления любого заданного эффекта В качестве примера было установлено время наступления эффекта в стадии напряжения у 50% животных при исследовании различных концентраций псевдокумола (табл. 7).

Как следует из таблицы, с уменьшением величины воздействующей концентрации ( с 2880 до 1 мг/м3) возрастает время указанного эффекта у животных (с 5 до 130 час.), на основании представленных данных можно построить зависимость " концентрация-время". Указанная зависимость, полученная по альтернативным показателям, в масштабе двойного логарифма имеет вид прямой, математически описывается уравнением общего ви

да: Т= 1§а 1дС и является основанием для получения параметров токсичности и опасности веществ: недействующих и пороговых концентраций, коэффициентов запаса, класса опасности, дифференцированных по времени ПДК.

Таблица 7 .

Время наступления эффекта у 50% лабораторных животных в стадии напряжения при непрерывной ингаляции псевдокумола в различных

концентрациях

Концентрация, мг/м3 2880 390 9 1

Время наступления эффекта у 50% животных, час 5 50 80 130

Таким образом, установленная количественная зависимость "концентрация-время-эффект" по изменению СРО в организме позволяет определять относительное число животных в процентах, соответствующих стадиям компенсации, напряжения, перенапряжения в зависимости от уровня непрерывного химического воздействия и выявлять уровень данного загрязнения для любого заданного числа случаев эффекта (84, 50, 16 процентов и т.д.), характерного для различных стадий адаптации животных.

Использование предложенной количественной зависимости не требует сравнения с нормативными величинами, позволяет оценить изменения показателя у каждого животного, устанавливать показатели токсичности и опасности соединений по кривым «концентрация-время», полученным в альтернативной форме и является основой для перехода к оценке риска патологии среди населения.

Количественное выражение зависимости "концентрация-время-эффект" по изменению состояния СРО в градированной и альтернативной

форме было положено в основу экспериментальных методов ускоренного и хронического обоснования ПДК атмосферных загрязнений населенных мест по общетоксическому действию, которые выполняются по следующей схеме.

В качестве объектов исследования используются белые крысы массой 120-140 г. Число животных в опытных и контрольной группах . должно быть не менее б, увеличение их количества повышает достоверность получаемых результатов исследования. Параллельно с изучением состояния СРО исследуются и другие 4-6 интегральных показателей, выбранных с учетом токсикодинамики веществ, что позволяет оценить взаимосвязь изменений показателей в динамике воздействия соединений для -более точного выявления пороговых и недействующих уровней.

При проведении традиционного хронического эксперимента исследуется 4-5 концентраций, одна из которых может быть неэффективной, при проведении ускоренного эксперимента изучается 3-4 концентрации - -в данном случае все концентрации должны быть действующими. В качестве самой высокой концентрации используется концентрация, установленная в остром или подостром опыте, самая низкая - соответствует рас- . четной недействующей величине. Длительность непрерывной хронической ингаляции составляет 3-4 месяца, непрерывное воздействие в краткосрочном эксперименте соответствует 3-4 неделям.

В динамике воздействия каждой концентрации исследование показателей биологического действия проводят 4-5 раз, при действии высоких концентраций в хроническом эксперименте интервалы между повторными исследованиями должны быть короткими (1-2 недели), при уменьшении концентраций повторные исследования проводят через 1 месяц, в зависимости от уровня концентраций, используемых в краткосрочном

методе, время между повторными исследованиями определяется часами, сутками, неделями.

Определение функционального состояния организма по изменению СРО учитываются в градированной или альтернативной форме.

При учете эффекта в альтернативной форме определяется структура процента животных по стадиям компенсации, напряжения, перенапряжения в соответствии со стадиями состояния адаптационных процессов по изменению свободнорадикального окисления (светосуммы свечения и периода индукции ХЛ) к одному и тому же времени воздействия по каждой исследуемой концентрации. Это является основой для получения зависимости "время-эффект"на логарифмически - пробитной сетке, для выравнивания которой используется метод "наименьших квадратов". Если - фактическое время воздействия при разных концентрациях различно, то необходимая величина времени может быть получена при экстраполяции " зависимости "время-эффект" по экспериментальным значениям.

По зависимости "время-эффект" устанавливается зависимость "концентрация-эффект" к различным заданным срокам ингаляционного воздействия вещества. Для определения вероятностной пороговой величины в хроническом эксперименте зависимость "концентрация-эффект" получают к-2880 часам или другому сроку окончания хронического воздействия. Указанный параметр устанавливается по преобладающему эффекту у животных в стадии напряжения или перенапряжения, т.к. к данному сроку воздействия изменения СРО у максимального числа животных соответствуют данным стадиям.

Для определения параметров токсичности и опасности по зависимости «время-эффект», полученной в альтернативной форме для каждой концентрации в стадии напряжения определяют время наступления изменения эффекта у 50 % животных, что является основанием для построения зави-

симости «концентрация-время». Использование последней позволяет установить: недействующие и пороговые концентрации, коэффициенты запаса, класс опасности, дифференцированные по времени ПДК.

При учете эффекта в градированной форме устанавливается зависимость " время-эффект" по градированным показателям. Для чего в динамике непрерывной ингаляции проводится сравнение средних значений изменения ХЛ при групповой оценке показателя животных опытной группы со средней величиной контроля с ее доверительным интервалом с учетом малой выборки (М±лЦ). Для каждой концентрации устанавливается время наступления 130 и более процентной степени выраженности эффекта, который наблюдается у животных в ранние сроки ингаляции и соответствует изменениям, характерным для стадии напряжения при групповой оценке состояния свободнорадикалыюго окисления. Полученные результаты используются для графического выражения зависимости "концентрация-время". На основании полученной кривой определяются параметры опасности и токсичности, функционально связанные между собой: класс

Ч :

опасности, пороговые и недействующие концентрации, коэффициент запаса, кумуляции, дифференцировшшые по времени ПДК.

Предложенный метод обоснования ПДК атмосферных загрязнений с учетом изменения состояния СРО на основе экспериментального ускоренного метода (М.А.Пинигин,1978, Е.И.Гончарук, Г.И.Сидоренко, 1986) использован для оценки токсичности и опасности метилзамещенных бензола.

Оценка опасности метилзамещенных бензола и обоснование их предельно допустимых концентраций с учетом состояния свободно-радикального окисления

В связи с тем, что при гигиенической оценке веществ, обладающих запахом, лимитирующим показателем вредности, зачастую, является о ль-

факторное действие, при его изучении для метилзамещенных бензола установлены параметры ольфактометрии ПДК м р и класс опасности: пара-ксилол -0,27 мг/м 3, 3; орто-ксилол - 0,3 мг/м 3,3; мета-ксилол - 0,24 мг/м3, 3; псевдокумол - 0,04 мг/м 3, 4 ; дурол - 0,025 мг/м3,4 .

Возможность количественного выражения изменений СРО явилась основанием для получения по ним параметров токсикометрии и определения их надежности прн оценке опасности и токсичности метилзамещенных бензола в сравнении с параметрами, установленными по изменению других общетоксических показателей при резорбтивном действии.

. Непрерывное воздействие метилзамещенных бензола в высоких, средних, низких концентрациях вызывало однонаправленные изменения состояния свободнорадикального окисления в стадии напряжения, физиологических, клинических, биохимических показателей у животных в разные сроки ингаляции. Так, действие дурола (450 мг/м3) через 4 часа приводило к уменьшению интенсивности светосуммы свечения и увеличению периода индукции (р < 0,001 ), через 5 часов угнетался норковый рефлекс (р < 0, 02); псевдокумол (390 мг/м3) изменял параметры ХЛ после 18 часов непрерывного воздействия (р< 0,001), через 19 часов снижался порог болевой чувствительности (р< 0,001); при ингаляции мета-ксилола (700 мг/м3), орто- и пара-кенлолои (505,560 мг/м3) изменение светосуммы свечения и периода индукции (р< 0,001) наблюдалось соответственно через 2, 16, 17 часов, тогда как уменьшение числа вставаний (р<0,05) отмечено только через 3, 17, 18 часов. Характер изменений исследуемых показателей и степень их выражешюсти зависели от уровня концентрации и времени воздействия веществ.

Например, при снижении концентрации дурола с 450 до 40 мг/м3 время уменьшения светосуммы и увеличения периода индукции (р< 0,001) возрастало с 4 до 25 часов, угнетения норкового рефлекса (р < 0,02) - с 5 до 28 часов; снижение концентрации мета-ксилола с 700 до 9 мг/м3 со-

провождалось изменением интенсивности ХЛ (р< 0,001) с 2 до 192 часов, увеличением времени изменения СПП (р< 0, 001) с 3 до 432 часов.

Увеличение времени наступления 130 и более процентной степени выраженности изменения свободнорадикального окисления, характерного для стадии напряжения, и токсического эффекта по интегральным показателям при снижении уровня концентраций наблюдалось при действии всех веществ (кроме псевдокумола в концентрации 0,01 мг/м3 - пороговой по интегральным показателям), что позволило построить прямые зависимости "концентрация-эффект" и "концентрация-время", которые описывались уравнением общего вида: IgT=lgTo - Iga Ige в соответствии с уравнением : у=ах+в; на их основе были установлены параметры токсичности и опасности мегалзамещенных бензола (табл. 8).

Различный наклон прямых, полученных по изменению одинаковых показателей (СПП, норковый рефлекс, число вставаний) для разных веществ - изомеры ксилола, дурол, псевдокумол, свидетельствовал о большей опасности последних. Минимальные величины недействующих концентраций при действии пара-ксилола, орто-ксилола, мета-ксилола, дурола были установлены по изменению СПП при действии псевдокумола - по изменению активности холинэстеразы и числа вставаний.

Примечательно, что среди других показателей биологического действия метилзамещенных бензола по изменению ХЛ определены наименьшие пороговые и недействующие уровни для всех веществ. XJ1 была лимитирующим показателем для всех соединений (табл. 9).

Еще больше убеждает в точности оценки степени опасности веществ по изменению ХЛ тог факт, что для всех соединений классы опасности, выявленные но лимитирующему показателю - интенсивности ХЛ, совпадали с таковыми, полученными в соответствии с максимальными значениями углов наклона прямых зависимостей "концентрация-время" по другим интегральным показателям (табл. 10).

Таблица 8

Параметры токсичности и опасности метилзамещенных бензола.

Показатели Параметры токсичности и опасности

биологического Угол Класс Zimch Коэф- Недей- пдк

действия нак- опас- фици- ству- ср.сут

лона ности ент ющая

запаса концен-

трация

1. Пара-ксилол:

- ХЛ гомогената печени 130° 3 2,4 10 0,24 0,96

-СПП 131° 3 3,0 9 0,30 1,2

- норковый рефлекс 130° 3 10 10 1 4

- число вставаний 130 3 5 10 0,5 2,0

- количество лейкоцитов 126° 3 11 12 0,91 3,64

2. Орто-ксилол

- ХЛ гомогената печени 136° 3 0,5 6 0,082 0,33

-СПП 134° 3 1 7 0,14 0,56

- норковый рефлекс 131й 3 3 9 0,33 1,32

- число вставаний 134° 3 2 7 0,3 1,2

- количество лейкоцитов 127° 3 3 11 0,27 1,08

3. Мета-ксилол:

- ХЛ гомогената печени 135° 3 0,30 7 0,04 0,16

-СПП 134° 3 0,35 7 0,05 0,20

- норковый рефлекс 129° 3 2,3 10 0,23 0,92

- число вставаний 130° 3 2,4 10 0,24 0,96

- количество лейкоцитов 126 й 3 2,3 12 0,19 0,76

4. Псевдокумол:

- ХЛ гомогената печени 152° 2 0,05 17 0,003 0,012

-СПП 151 0 2 0,11 15 0,006 0,024

- норковый рефлекс 148° 2 0,12 13 0,009 0,036

- число вставаний 151° 2 0,08 15 0,005 0,020

- активность холпгостеразы 150° 2 0,08 . 14 0,005 0,020

5. Дурол:

- ХЛ гомогената печени 147° 2 0,02 10 0,002 0,008

-СПП 147° 2 0,03 10 0,003 0,012

- норковый рефлекс 143° 2 0,07 8 0,009 0,036

- число вставаний 143° 2 0,08 8 0,01 0,04

- активность холинэстеразы 120° 4 23 18 ЬЗ 5,2

Среди всех исследуемых показателей максимальные углы наклона установлены по изменению ХЛ при действии псевдокумола, дурола, орто-

ксилола, мета-ксилола, что согласно существующему в токсикологии положению характеризует ее как наиболее чувствительный показатель. Между тем, как показано в табл.10, дурол, отнесенный по изменению СРО ко 2-му классу опасности по изменению активности холинэстеразы можно отнести к веществам 4 класса опасности. При действии пара-ксилола диапазон отклонений величины угла наклона, полученного по изменению ХЛ от максимального угла, установленного для вещества по СПП, составил соответственно 1 при этом вещества были отнесены к одному классу опасности по изменению ХЛ и СПП.

Таблица 9.

Основные токсикометрические параметры металзамещенных бензола, установленные по лимитирующим показателям биологического действия.

Вещество Лимитирующий показатель Угол наклона, в" Класс опасности Пороговая концентрация, мг/ы3 Недействующая концентрация, мг/м3

Псевдокумол ХЛ 152 2 0,05 0,003

Дурол ХЛ 147 2 0,02 0,002

орто-ксилол ХЛ 136 3 0,5 0,082

мета-ксилол ХЛ 135 3 0,3 0,04

пара-ксилол ХЛ 130 3 2,4 0,24

Таблица 10.

Характеристика опасности метилзамещенных бензола в соответствии с величиной углов наклона прямых «концентрация - время»

Классы опасности

Вещество по физиологии. по биохипческим по изменению по измене-

показателям показателям крови нию ХЛ

Псевдокумол 2 2 - 2*

Дурол 2* 4 - 2*

Орто-ксилол 3 - 3 3*

Мета-ксилол 3 - 3 3»

Пара-ксилол 3* - 3 3

Примечание: * отмечены показатели, имеющие максимальные значения величин углов наклона зависимостей "концентрация-время"

Таким образом, метилзамещеиные бензола при непрерывном ингаляционном поступлении в организм оказывают политропное действие -рефлекторное и резорбтивное (нейротоксическое, гепатотоксическое, гема-тотоксическое); при этом изменения свободнорадикального окисления предшествуют фунюцюнальным сдвигам со стороны ЦНС, ферментных систем, показателей периферической крови, поведенческих реакций, что характеризует его как наиболее чувствительный показатель.Наименьшие недействующие уровни и классы опасности, полученные при резорбтивном действии для всех метилзамещенных бензола по изменению свободнорадикального окисления свидетельствуют, что его использование при экспериментальном гигиеническом нормированиии повышает точность и надежность оценки токсичности и опасности атмосферных загрязнений.

Связь показателей опасности общетоксического действия мстил-замещештых бензола, установленных по измененшо СРО, с пх фгошсо-хнмпческпмп свойствами и электроппо-ядериои структурой, исследование непосредственного действия веществ на процессы СРО в .модельных системах

Диапазон отклонений параметров токсикометрии, установленных для

метилзамещенных бензола по изменению СРО в организме в динамике непрерывного поступления веществ, составил по величинам недействующих концентраций у пара-ксилола (0,24 мг/м3) и дурола (0,002 мг/м3) и порогам хронического действия у пара-ксилола (2,4 мг/м3) и дурола (0,02 мг/м3) 120 раз, что вероятно, отражает закономерности изменения биологической активности данных веществ по мере снижения их летучести и растворимости в воде. Исследуемые соединения отличаются друг от друга лишь количеством метальных групп (от диметилбензола до тетраметил-бензола) или их ориентацией (орто-, мета-, пара-), чем и может обосновываться их механизм действия. Как известно , с увеличением числа метальных групп в бензольном кольце возрастает токсичность гомологов бензола на ЦНС. Способность бензола и его метилпроизводных увеличивать актив-

ностъ микросомалышх ферментов коррелировала с числом метальных групп, при этом, параориентация метальных групп снижала способность ксилола индуцировать микросомальные энзимы, наибольшей активностью из числа ксилолов обладал метаизомер (И.С. Гусев, 1965, Л.А. Тиунов, 1991).

Наличие колебаний параметров токсикометрии, полученных по изменению СРО, для веществ одного ряда позволило нам провести корреляционный анализ "структура-эффект".

Корреляционный анализ зависимости порогов хронического действия и недействующих концентраций исследуемых соединений с их параметрами электронно-ядерной структуры и физико-химическими свойствами выявил наиболее высокие коэффициенты корреляции (-0,97; 0,9), соответствующие линейной зависимости вида у = а + Ьх, полученные для следующих пар переменных: порог хронического действия -ширина молекулы, -суммарный заряд ядра, -липофильность, -парахор, -температура кипения, -температура плавления, -молекулярная масса; недействующая концентрация - ширина молекулы, -суммарный заряд ядра, -липофильность, -парахор, -температура кипения, -молекулярная масса.

Выявленные данные позволяют заключить, что линейную взаимосвязь с параметрами токсичности в большей степени проявляет ширина молекул (г= -0,97), отражающая один из линейных размеров геометрического параметра молекул, в несколько меньшей - другие изученные электронно-ядерные показатели. Полученные результаты показывают, что с возрастанием ширины молекул метилзамещенных бензола вступает в действие сте-рический фактор (обуславливается только шириной молекул, так как их длина имеет коэффициенты корреляции -0,3; -0,5) , который является определяющим для проявления биологического действия, и хорошо согласуются с известными результатами, свидетельствующими о значимости

стерических свойств молекул других веществ при оценке взаимосвязи "структура - активность".

Анализом многомерной пошаговой регрессии определены показатели, имеюшис наибольший уровень значимости связи (0,987-0,999) логарифмов недействующих концентраций (In Нед. конц.) и логарифмов порогов хронического действия (In Lim. ch) с шириной молекул метилпроизводных бензола, суммарным зарядом ядра на атомах углерода, не связанным с заместителями на бензольном кольце, разности энергии высшей заполненной и низшей свободной молекулярных орбиталей (ВЗМО и НСМО). Это дало возможность получить уравнения регрессии, которые с максимальной степенью точности определяют экспериментально обоснованные параметры токсичности соединений, все члены которых были одинаково значимы: In Lim. ,h = 8,39 - 0,73xi2 + 0,03х3, (n=5; R-0,999; S=0,088; F-923,51); In Нед. конц. = -0,76 - 0,84x12 + 1 l,51x9, (ir=5; R=0,988;> S=0,455; F-41,32); In Нед. конц. =- 23,45 - 0,93 x12-3,62x6, (n-5; R=0,987;, S=0,471; F-38,49); ( где x i2 - Ш1фина молекулы, Х9 - суммарный заряд ядра, Хб - разность энергии высшей заполненной и нижней свободной молекулярных орбита-лей -ВЗМО и НСМО, х-, - температура плавления).

Прогнозируемые значения соответствующих параметров токсикометрии, рассчитанные на основе предложенных уравнений регрессии, имели наименьшее отклонение от экспериментальных величин. Максимальные ошибки оценивания при расчете недействующих концентраций 0,48-0,49 и при расчете порогов хронического действия 0,077 свидетельствовали о высоком соответствии экспериментальных и расчетных значений параметров токсичности.

Таким образом, по электронно-ядерной структуре и физико-химическим свойствам возможен прогноз недействующих концентраций и порогов хронического действия метилзамещенных бензола. Ширина молекул, суммарный заряд ядра и разность энергий высшей заполненной и низ-

шей свободной молекулярных орбиталей являются электронными параметрами, наиболее точно характеризующими общетоксическое действие метил- "» замещенных бензола. Токсичность данных соединений увеличивается по мере уменьшения разности энергии высшей и низшей молекулярных орбиталей и при снижении суммарного заряда ядра. Однако, для уточнения коэффициентов модели и увеличения ее прогнозирующей способности необходимо дальнейшее накопление экспериментальных данных.

Применение предлагаемого подхода позволяет с достаточной надежностью прогнозировать недействующие концентрации и пороги хронического действия, проводить ориентировочный прогноз ОБУВ а определять класс опасности метилпроизводных бензола с предварительным вычислением зон хронического и биологического действия на основе изучения только острой токсичности соединений при исследовании свободнорадикального окисления без проведения субхронического эксперимента.

Для подтверждения зависимости свободнорадикальных процессов, инициируемых в организме метилзамещенными бензола, от структуры их молекул, нами исследовано непосредственное действие соединений на СРО в модельных системах желточных липопротеидов. Светосумма модельных систем уменьшалась по мере увеличения концентрации ароматических соединений и была минимальной в присутствии наибольшей выбранной концентрации, содержащей 20 цкл; при этом пара- ксилол уменьшал интенсивность свечения в 5 раз, орто- ксилол - в 7 раз, мета- ксилол - в 10 раз, псевдокумол - в 14 раз, дурол - в 20 раз.

Одной из причин различной активности близких по стругауре гомологов бензола в модельной системе может быть количество метальных групп: 2 - по-разному ориентированные в изомерах ксилола, 3 - у псевдо-кумола, 4 - у дурола.

Исследованные вещества в указанных концентрациях максимально замедляли процессы окисления в системе ЖЛП и проявили антирадикальные свойства, в большей степени выраженные у псевдокумола и дурола.

Приведенные результаты показывают, что исследуемые соединения оказывают непосредственное влияние на процессы свсбоднорадикального окислеши в модельных системах - с увеличением количества метальных групп в производных бензола усиливается интенсивность подавления окислительных процессов. Рекомендуемый подход позволит использовать модельные системы для проведения быстрого предварительного скршшн-га .активности в пределах гомологических рядов и может быть особенно целесообразным для экспериментального подтверждения широко используемых в последнее время расчетных данных ускоренной оценки токсикологических свойств вновь синтезируемых химических веществ методами компьютерного прогноза.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что исследование свободнорадикальных процессов хемилюминисцентным методом имеет перспективное значите при оценке резорбтивного действия химических соединений и непосредствешюго действия в модельных системах.

Выводы

1. Характеристика состояний свободнорадикального окисления при воздействии химических веществ с помощью хемишоминисцентного метода свидетельствует о его патогенетическом значении, высокой чувствительности, информативности, воспроизводимости, сходимости, соответствии гуманным принципам этики медико-биологических исследований, экономической целесообразности, что позволяет считать последний наиболее адекватным при использовании для донозологической диагностики факторов окружающей среды.

2. Смещение равновесия процессов свободнорадикальное окисление-, антиоксиданты в динамике непрерывного воздействия химических веществ зависит от уровня и длительности непрерывной ингаляции и раскрывает биологическую значимость последних. При действии подпороговых по интегральным показателям концентраций (физиологических, биохимических, морфологических, гематологических) происходит усиление процессов; при действии пороговых уровней - одновременное усиление окислительной и антиокислителыюй активности сменяется разнонаправленными изменениями указанных процессов (уменьшением окислительной и увеличением антиокислительной активности, которые достигнув максимума изменений развиваются в обратном направлении), впоследствии наступает угнетение как окислительной, так и антиокислительной активности биосред организма.

3. Типичная последовательность динамики процессов окислительной и антиокислительной активности соответствует стадиям компенсации, напряжения, перенапряжения, заканчивающегося срывом, подтверждается изменением функциональных сдвигов со стороны ЦНС, поведенческих реакций, ферментных систем, показателей периферической крови, морфологических показателей и является основанием для оценки адаптационных реакций по свободнорадикальному окислению в биосредах организма при непрерывном действии химических зздрязнений.

4. Зависимость времени наступления сдвигов свободнорадикального окисления в стадии напряжения в градированной форме, имеющих высокую степень корреляции между процессами окисления и антиокисления (г=0,93-0,96), от величины воздействующих концентраций веществ описывается уравнением степенной функции вида у = ах® и аппроксимируется прямыми на сетке двойного логарифмирования; что подтверждает ее биологическую закономерность.

5. Количественное выражение зависимости "концентрация-время-эффект", полученное по изменению процессов свободнорадикального окисления в альтернативной форме по стадиям адаптации (компенсации, напряжения, перенапряжения), открывает путь к оценке опасности риска среди населения.

6. Метилзамещенные бензола при непрерывном ингаляционном поступлении в организм оказывают политропное действие - рефлекторное и ре-зорбтивное (нейротокснческос, гепатотоксическое, гематотоксическое); при этом изменения свободнорадикального окисления предшествуют функциональным сдвигам со стороны ЦНС, ферментных систем, показателей периферической крови, поведенческих реакций, что характеризует его как наиболее чувствительный показатель.

7. Наименьшие недействующие уровни и классы опасности, полученные при резорбтявном действии для всех метилзамесценных бензола по изменению свободнорадикального окисления свидетельствуют, что его использование при экспериментальном гигиеническом нормированиии повышает точность и надежность оценки токсичности и опасности атмосферных загрязнений.

8. Показатели хронической токсичности соедшштш (пороговые, недействующие концентрации), установленные по изменешпо СРО, выявляют объективную связь « электронно-ядерная структура - активность метил-замещенных бензола» (г=-0,9-0,97); использование математических моделей, отражающих полученную закономерность, возможно для прогноза опасности уже при остром воздействии веществ без проведения субхронического эксперимента.

9. Исследуемые соединения оказывают непосредственное влияние на процессы свободнорадикального окисления в модельных системах ( с увеличением количества метилышх групп в производных бензола усиливается

интенсивность подавления окислительных процессов); использование модельных систем позволит проводить быстрый предварительный скрининг активности в ряду веществ на основе неинвазивной диагностики, например, для экспериментального подтверждения широко используемых в последнее время расчетных данных ускоренной оценки токсикологических свойств вновь синтезируемых химических веществ методами компьютерного прогноза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации :

1. Гигиеническая оценка атмосферного воздуха и состояния здоровья детского населения в городах с развитой нефтеперерабатывающей и химической промышленностью // В кн. "Охрана окружающей среды и здоровье населения в районах размещения крупных нефтехимических комплексов". - Уфа,1986. - С.51-52. ( в соавт. с Овсянниковой Л.Б., Андаржановым Ф.К., Шаймордановой Р.Б., Габдиновой И.Л.).

2. Действие псевдокумола на активность холинэстеразы крови крыс // В кн. "Актуальные проблемы охраны и рационального использования природных и растительных ресурсов". - Уфа, 1987. - С.15-16. (в соавт. с Кулагиной И.Г.).

3. Сравнительные экспериментальные данные изучения состояния ЦНС методом суммационного порогового показателя и ориентировочной реакции // В кн. "Оздоровление окружающей среды и адаптация организма". - Уфа, 1987. - С.47-48. (в соавт. с Овсянниковой Л.Б., Кулагиной И.Г.).

4. К патологии острого отравления псевдокумолом // В кн. "Оздоровление окружающей среды и адаптация организма". - Уфа, 1987. - С.58-59. (в соавт. с Гилевым В.Г., Валиахметовым А.Х. Гайсинской С.Е.).

5. Зависимость "концентрация-время" при гигиеническом регламентировании загрязнителей окружающей среды // В кн. "Оздоровление окружающей среды и адаптация организма". - Уфа, 1987. - С. 107. (в соавт. с Овсянниковой Л.Б., Кулагиной И.Г., Азаровой М.В.).

6. К вопросу действия атмосферных загрязнителей на иммунную систему // В кн. "Вопросы гигиены в условиях ускорения научно-технического прогресса". - Уфа, 1988. - С.91-92. (в соавт. с Овсянниковой Л.Б., Кулагиной И.Г.).

7. Влияние выбросов нефтехимических производств на состояние ЦНС в эксперименте у животных // В кн. "Вопросы гигиены и охраны здоровья населения в регионах с развитой нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленностью". - Уфа, 1990. - С.79-80. (в соавт. с

Овсянниковой Л.Б., Гилевым В.Г., Губайдуллиным P.M., Гайсинской С.Е.).

8. Оценка гепатотоксического действия 1,2,4-триметилбензола при гигиеническом нормировании // В кн. "Вопросы гигиены и охраны здоровья населения в регионах с развитой нефтеперерабатывающей л нефтехимической промышленностью". - Уфа, 1990. - С.80-82.

9. Заболеваемость детского населения индустриального города и ее зависимость от загрязнителей атмосферного воздуха // В ют "Город, среда, человек". - Уфа, 1990 - С.88-89. ( в соавт. с Эткиной Э.И, Эткиным А.Е., Покшубиной Е.И.).

10. Изменение секреции кортюола у крыс при действии 1,2,4-триметилбензола // Тез. IV Всесоюзной конференции "Эндокринная система организма и вредные факторы окружающей среды". -Ленинград, 1991. - С.83.

11 .Biochemical change of white rat under the benzol derivatives influence // 3rd intenational congress of comparative phy в соавт., с siology and biochemistry. - Tokyo, August 25-30, 1991. (в соавт. Kulagina I.G.).

12.К токсикологии 1,2,4-триметилбепзола // В кн. "Изучение и рациональное использование природных ресурсов". - Уфа, 1991. - С.45-46. (в соавт. с Кулагиной И.Г.).

13.Современное состояние гигиенического регламентирование вредных веществ в атмосферном воздухе // "Здравоохранение Башкортостана". -1994, №4,- С. 57-63.

М.Токсиколого- гигиеническая характеристика 1,2,4-триметилбензола как загрязнителя атмосферного воздуха // "Здравоохранение Башкортостана". - 1994, № 4. - С. 15-18. (в соавт. с Кулагиной И.Г., Гилевым В.Г., Губайдуллиным P.M., Гайсинской С.Е.).

15.Роль факторов внешней среды в развитии токсического отравления организма // В сб. "Актуальные проблемы современной психиатрии и наркологии". - Уфа, 1994. - С.81-84. ( в соавт. с Кулагиной И.Г., Исянгильдиной А.Х.).

16.Free biological effect of durol as an atmospheric air pollutant in urban areas // International conference Fundamental and applied problems of environmental protection - Tomsk, September 12-16, 1995. ( Kulagina I.G., Gaysinskaja S.E.).

17.The prediction of the toxicity level of substances on the basis of "concentration- time" // International conference Fundamental and applied problems of environmental protection. - Tomsk, September 12-16, 1995. -P.219.

18.The study of non- septic effect of the environmental pollutants according to Hygienic norms // International conference Fundamental and applied problems of environmental protection - Tomsk, September 12-16, 1995. - P.220. ( Far-khutdinov R.R.)

19.Death rate peculiarities of a city with developed oil- refinery and petrochemical indusrty causes by malignant growth // International conference Fundamental and applied problems of environmental protection. - Tomsk, September 12-16,1995. - P.185. (Sharafutdinova N.Kh., Karamova L.M.).

20. К оценке резорбтивного действия бисамина по зависимости "концентрация- время" // International conference Fundamental and applied problems of environmental protection. - Tomsk, September 12-16, 1995. -P.229. (в соавт. с Зулькарнаевым Т.Р., Аскаровой Я.Н., Шакировым Д.Ф., Мустафиным Р.З.).

21.Free radical oxidation state under terogenic effect of o-, n- xilenes // Indoor air international. - St. Peterburg, 1995. - P.62- 63. (Farkhutdinov R.R., Kulagina I.G.).

22.The application of chemilumescence for prognosis of atmosphere pollutants effect //2rd International Conference on Clinical chemilumescence. - Berlin, April 27-30, 1996. - P.2M. (Farkhutdinov R.R.).

23.Влияние ароматических загрязнителей атмосферного воздуха на обонятельный анализатор // Тез. Докл. Научно- практической конференции "Современные аспекты профилактической и клинической медицины". -Уфа, 1995. -С.114-115. (в соавт. с Исянгильдиной А.Х.).

24.К вопросу о метаболических изменениях в эритроцитах при аэрогенном воздействии ароматические - соединений // В кн. "Эколого-гигиенические проблемы Уральского региона ". - Уфа, 1995, - С.96-102. (в соавт. с Шакировым Д.Ф., Фархутдиновым P.P., Власюк В.А., Зулькарнаевым Т.Р.).

25.0 прогнозировании состояний на грани нормы и патологии // Мат. конференции "Уральский регион Башкортостана: человек, природа, общество". - Уфа- Сибай, 1995. - С.158. (в соавт. с Фархутдиновым P.P., ИГарафутдиновой Н.Х.).

26.Эпидемиологический анализ смертности работающих на предприятиях нефтепереработки и нефтехимии // Международный симпозиум "Проблемы экологии в нефтепереработке и нефтехимии". - Уфа, 1995. -С.А-29. (в соавт. с Шарафутдшювой Н.Х., Шарафутдиновым А.Я.).

27.Прогностическая значимость изменения свободнорадикальных процессов при интоксикации загрязнителями атмосферного воздуха // Тез. научно- технич. конференции "Диагностика, информатика, метрология, экология, безопасность". - Санкт-Петербург, 1996. - С.311. (в соавт, с Фархутдиновым P.P.).

28. Гистопатология ингаляционной интоксикации 1,2,4-триметилбензолом // Деп. в ВИНИТИ 15.04.96, № 1221-В96. - 12 с. (в соавт. с Гилёвым В.Г., Губайдуллиным P.M., Гайсинской С.Е., Гизатуллиной А.А., Власюк В.А.).

29.Оценка последствий аэрогенного действия ароматических соединений на состояние органов дыхания //6th National Congress of Lung Diseasea. -Novosibirsk, July 1-4, 1996. - P.307. (в соавт. с Гайсинской С.Е.).

30.Biologikal samples*ultra wearkloght emission registration appplikation for earlydiagnosis air pollutants tosis effect. //1 International Congress- Wearand Hyperweak Fields and Radiations in Biology and Medicine. - St.Petersburg 16-19,06. 1997. -P.228. (Farkhutdinov R., Kopaneva Л.).

31 Г'азохромато графический способ определения содержания орто-, мета, пара-ксилолов в воздухе населенных мест // "Гигиена и санитария. 1997, № 4. - С.59-60. (в соавт. с Хапитовым Г.Г., Мавродиевой H.H.).

32.Способ прогнозирования ранних патологических изменений при действии загрязнений атмосферы населенных мест //Авторское свидетельство на изобретение от 28.01.98 г. по заявке № 95107203V14 -012625 от 4.05.95 (в соавт. с Фархутдиповым P.P., Лиховских В.А).

33.The tvalution of the atmospheric air toxici with the aromatik pollutants at the stage of donosological changes in the organism // International Confcrense on Environmental Pollution ICEP 98, Abstracts. - Moscow, Russia.- September, •1998,- P. Ill A, 235 ( Sharafutdinova N., Sharafutdinov A., Speranski V., Farkhutdinov R.).

34.Гигиеническая оценка 1,2,4,5-тетраметнлбензола при ингаляционном поступлении в организм // "Гигиена и санитария."- 1999, № 2. - С. 5 - 7.

35.хс.\1илюминнсцентная оценка химических загрязнений атмосферного воздуха. - Уфа, 1999. - 120 с.

36.Гигиеническая оценка загрязнения атмосферного воздуха изомерами ксилола // "Гигиена и санитария."- 1999, № 5. - С.5 - 7 .

37.Оценка токсичности и опасности атмосферных загрязнений с помощью метода хсмилюмннисценщш // "Токсикологический вестник."- 1999, № 6 (в печати).

38.Взаимосвязь биологической активное™ метилзамещенных бензола с их физико-химическими свойствами и электронно-ядерной структурой // "Токсикологический вестник."- 1999_№ 6 ( в печати).