Автореферат и диссертация по медицине (14.03.07) на тему:Прогноз антибиотикорезистентности стафилококков в динамических системах IN VITRO, моделирующих фармакокинетику ципрофлоксацина и линезолида

004609624

Струкова Елена Николаевна

ПРОГНОЗ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ СТАФИЛОКОККОВ В ДИНАМИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ IN VITRO, МОДЕЛИРУЮЩИХ ФАРМАКОКИНЕТИКУ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА И ЛИНЕЗОЛИДА

14.03.07 - химиотерапия и антибиотики

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

3 О СЕН 2010

004609624

Работа выполнена в НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Фирсов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Сидоренко Сергей Владимирович

доктор медицинских наук, профессор

Жердев Владимир Павлович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия Росздрава

Защита диссертации состоится « 21 » октября 2010 г. в 14.00 ч на заседании диссертационного совета Д. 001.024.01 в НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук по адресу: 119021, Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук по адресу: 119021, Москва, ул. Б. Пироговская, д.11.

Автореферат разослан «_\)4_» сентября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук В.И. Пономаренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Развитие устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам является основным фактором снижения эффективности препаратов, поэтому оптимальными считаются такие схемы антибиотикотерапии, которые обеспечивают не только подавление чувствительной популяции патогенных микроорганизмов, но и предотвращение селекции их резистентных мутантов. В последние годы были предприняты попытки моделирования процессов развития устойчивости в динамических системах in vitro с использованием инокулумов высокой плотности, в которых могут содержаться спонтанные мутанты, резистентные к антибиотикам [Campion JJ. et al., 2004, 2005 a), b); Firsov A.A. et al., 2003; MacGowan A.P. et al., 2003; Smirnova M.V. et al., 2007; Tarn V.H., et al., 2005; Zinner et al., 2003, 2008]. Применительно к фторхинолонам и гликопептидным антибиотикам удалось установить определенные взаимосвязи между процессом селекции резистентных мутантов и интегральной характеристикой фармакокинетического профиля антибиотика - площадью под фармакокинетической кривой (ПФК), отнесенной к его минимальной подавляющей концентрации (ПФК/МПК). Характер таких взаимосвязей согласуется с гипотезой существования «окна селекции мутантов» (ОСМ), согласно которой пролиферация мутантов наиболее вероятна, когда концентрация антибиотика превышает МПК - нижняя граница ОСМ, - но не достигает минимальной концентрации, предотвращающей рост мутантов (МПКм - верхняя граница ОСМ) [Zhao X., Drlica К., 2001]. Вместе с тем, вопрос о выборе оптимального параметра для прогноза селекции устойчивых клеток - периода времени, на протяжении которого концентрация антибиотика находится в пределах ОСМ (7осм), отношений ПФК/МПК или ПФК/МПКм - остался нерешенным. Неизвестно также, возможно ли использовать методические подходы, позволившие моделировать селекцию фторхинолоноустойчивых мутантов, в тех случаях, когда устойчивость к антибиотикам возникает в результате спонтанных мутаций в консервативных участках ДНК, ввиду чего частота возникновения таких мутаций очень низка.

В связи с этим разработка методов изучения in vitro и прогнозирования антибиотикорезистентности является весьма актуальной.

Цель работы:

Совершенствование методов моделирования и прогнозирования процессов селекции антибиотикорезистентных мутантов в динамических системах in vitro.

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить селекцию резистентных стафилококков при моделировании режимов многократного струйного и непрерывного капельного введения ципрофлоксацина в широком диапазоне значений ПФК/МПК.

2. Обосновать выбор оптимального параметра для прогнозирования селекции мутантов, резистентных к ципрофлоксацину.

3. Изучить фармакодинамику линезолида в отношении чувствительных к нему штаммов S. aureus и установить зависимость антимикробного эффекта от отношения ПФК/МПК.

4. Разработать методические подходы к моделированию процессов развития резистентности к линезолиду с использованием смешанного инокулума чувствительных к нему клеток и полученных путем искусственной селекции резистентных мутантов.

5. Проверить применимость гипотезы существования ОСМ к линезолиду и прогнозировать антимутантное значение ПФК/МПК.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований:

1. Установлено, что воздействие ципрофлоксацина на устойчивую популяцию S. aureus надежнее прогнозировать с помощью параметра ПФК/МПКм, а на чувствительную - с помощью ПФК/МПК.

2. Доказано, что параметр 7осм> не отражающий положения фармакокинетического профиля антибиотика внутри ОСМ, менее надежен для прогнозирования селекции резистентных мутантов, чем ПФК/МПКм.

3. Установлено, что антистафилококковый эффект линезолида зависит от отношения ПФК/МПК антибиотика, причем эта зависимость инвариантна относительно штамма 5. aureus.

4. Разработан новый методический подход к изучению процессов развития устойчивости к линезолиду, предусматривающий использование смешанного инокулума чувствительных и резистентных к антибиотику клеток S. aureus.

5. Доказано, что селекция резистентных к линезолиду мутантов S. aureus происходит согласно гипотезе существования ОСМ и установлено антимутантное значение ПФК/МПК.

Научно-практическая значимость работы.

1. Параметр ПФК/МПКм, оптимальный для прогноза селекции ципрофлоксацинорезистентных стафилококков, может быть использован для прогнозирования устойчивости бактерий к другим антибиотикам.

2. Спрогнозированный in vitro эффект терапевтической дозы линезолида оказался в 4 раза выше эффекта ципрофлоксацина, что позволяет рассчитывать на высокую эффективность линезолида при стафилококковой инфекции.

3. Разработанный подход к изучению селекции мутантов, резистентных к линезолиду, может быть применим и к другим антибиотикам, устойчивость к которым развивается в результате спонтанных мутаций, возникающих с низкой частотой.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Новый подход к моделированию процессов развития антибиотикорезистентности в динамических системах in vitro с использованием смешанного инокулума чувствительных и резистентных к антибиотику клеток.

2. Прогнозирование селекции резистентных стафилококков с помощью параметра ПФК/МПКм-

3. Прогноз пороговых значений ПФК/МПК, обеспечивающих приемлемый эффект линезолида в отношении чувствительных и устойчивых к нему стафилококков.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 46-м Международном конгрессе «Антимикробные препараты и химиотерапия» (ICAAC, Вашингтон, 2006), на 47-м Международном конгрессе «Антимикробные препараты и химиотерапия» (ICAAC, Чикаго, 2007), на 48-м Международном конгрессе «Антимикробные препараты и химиотерапия» (ICAAC, Вашингтон, 2008), на 20-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (20th ECCMID, Вена, 2010), на 12-й Международной конференции MAKMAX/ESCMID «Антимикробная терапия» (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 статьи в журналах рекомендованных ВАК, 2 статьи в центральных зарубежных журналах и 7 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы и список литературы, включающий 13 отечественных и 122 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 39 рисунками. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Антибиотики и бактериальные штаммы. Ципрофлоксацин был предоставлен компанией Bayer Corporation (West Haven, США), a линезолид - Pfizer Corporation (Groton, США).

В работе были использованы мстициллиноустойчивые и метициллиночувствительные штаммы S. aureus. С целью селекции резистентных к линезолиду мутантов клинические штаммы S. aureus 479 и 10, а также коллекционный штамм S. aureus АТСС 43300 пересевали в бульон Мюллера-Хинтон (Becton-Dickinson & Со., США), содержащий линезолид в возрастающей концентрации (от 1 до 512 мкг/мл).

Значения МПК антибиотиков устанавливали методом серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтон, содержащем 24-часовую культуру стафилококка с исходной численностью клеток, равной 5><105 КОЕ/мл. Значения МПК ципрофлоксацина в отношении S. aureus АТСС 43300 и S. aureus АТСС 6538 составили 0,5 и 0,25 мкг/мл, соответственно. Значения МПК линезолида были одинаковыми в отношении всех четырех штаммов стафилококка - S. aureus АТСС 43300 и АТСС 700699 (GISA Ми-50), 5. aureus 479 и S. aureus 10 - 2 мкг/мл.

Для оценки минимальной концентрации, предотвращающей рост устойчивых мутантов (МПКм), использовали методику, разработанную X. Zhao и К. Drlica (2001). Для каждой пары антибиотик-микроорганизм строили графики зависимости численности колоний стафилококка от концентрации антибиотика в агаризованной среде. По мере увеличения содержания антибиотика в среде происходило систематическое снижение численности клеток. Значения МПКм определяли в точке пересечения линейным фрагментом графиков теоретического предела определения численности клеток (lg (КОЕ/мл) = 1). Расчетные значения МПКм ципрофлоксацина для S. aureus АТСС 43300 и АТСС 6538 составили 2 и 4 мкг/мл, соответственно, а

МПКм линезолида для S. aureus АТСС 700699, S. aureus 10 и S. aureus 479 - 16 мкг/мл, a S. aureus АТСС 43300 - 8 мкг/мл.

Моделируемые фармакокинетические профили. Во всех случаях моделировали моноэкспоненциальные фармакокинетические профили ципрофлоксацина и линезолида со значениями периодов полувыведения, установленными при клиническом изучении фармакокинетики антибиотиков - 4 и 6 ч, соответственно. Воспроизведенные фармакокинетические профили соответствовали профилям, реализуемым у человека при 3-дневном интермиттирующем дозировании ципрофлоксацина с интервалом з 12 ч или непрерывной инфузии, а также при 5-дневном введении линезолида с интервалом в 12 ч. Отношения площади под фармакокинетической кривой в течение 24 ч (ПФК24) к МПК (ПФК24/МПК) ципрофлоксацина варьировали в диапазоне от 30 до 100 ч для S. aureus АТСС 43300 и от 48 до 260 ч для S. aureus АТСС 6538, а значения ПФК24/МПК линезолида - от 30 до 1200 ч (S. aureus АТСС 43300), от 30 до 600 ч (S. aureus 479) и от 50 до 400 ч (5. aureus АТСС 700699).

В экспериментах со смешанным инокулумом чувствительных и устойчивых клеток S. aureus 10 значения ПФК^/МПК линезолида (по отношению к чувствительному штамму) составили 60, 120, 240 и 480 ч.

Динамическая система in vitro. Для моделирования фармакокинетических профилей и изучения фармакодинамики антибиотиков использовали модифицированный вариант динамической системы, описанной ранее [Фирсов A.A. и соавт., 1989]. Процессы введения антибиотиков и отбора проб были автоматизированы и контролировались с помощью микропроцессора. В опытах с ципрофлоксацином объемная скорость потока составляла 13 мл/ч при объеме центральной камеры, равном 75 мл, а в опытах с линезолидом - 11,6 мл/ч при объеме центральной камеры, равном 100 мл. Эти условия обеспечивали моноэкспоненциальную элиминацию антибиотиков из системы с константами скорости, равными 0,173 и 0,156 ч"1, соответственно.

Воспроизводимость заданных фармакокинетических профилей. Надежность воспроизведения фармакокинетических профилей ципрофлоксацина в динамической системе была подтверждена ранее [Firsov A.A. et al., 1998 а)]. Проверку воспроизводимости заданных фармакокинетических профилей линезолида проводили путем определения его концентрации в содержимом центральной камеры динамической системы с помощью ВЭЖХ при моделировании моноэкспоненциального снижения концентрации антибиотика при однократном

введении (начальная концентрация - 20 мкг/мл).

7

Хроматографическая система состояла из колонки Нуклеосил 100 С]8 (40x4,6 мм, зернение - 3 мкм), перистальтического насоса (Gilson 305, Франция), УФ-детектора (Waters 481, США) и термостата (Du Pont Instruments, США). Подвижная фаза состояла из смеси 50 мМ раствора фосфата калия монозамещенного и ацетонитрила в соотношении 79:21, скорость потока - 1,0 мл/мин. Детектирование производили при длине волны, равной 254 нм. Объем пробы составлял 20 мкл, температура колонки - 40°С. Калибровочная кривая была линейной в диапазоне изменения концентрации линезолида от 0,15 до 10 мкг/мл (г2 > 0,99). Предел количественного определения линезолида - 0,05 мкг/мл. Стандартное отклонение (п=5) при концентрациях 10, 1,5 и 0,15 мкг/мл составило 1,7%, 3,1% и 5,9%, соответственно. Методика ВЭЖХ-анализа была разработана С.А. Довженко и М.Б. Кобриным.

Как видно на рисунке 1, значения концентрации линезолида, установленные путем его хроматографического определения, были близки заданным.

Время, ч

Рис. 1. Оценка воспроизводимости заданного фармакокинетического профиля линезолида. Сплошная линия - заданные значения концентрации, круги - средние значения измеренной концентрации (п = 5).

Таким образом, динамическая система обеспечивала надежное воспроизведение желаемого фармакокинетического профиля антибиотиков.

Регламент эксперимента, оценка антимикробного эффекта и проявлений резистентности. На протяжении каждого эксперимента из центральной камеры динамической системы отбирали пробы, которые последовательно разводили стерильной дистиллированной водой, а затем высевали на чашки Петри, содержащие агар Мюллера-Хинтон II (ВесЮп-ГНсктзоп & Со., США). В результате разбавления

проб концентрация препарата не превышала МПК, что позволяло предотвратить действие оставшегося в пробе антибиотика ("antibiotic carry-over"). Нижний предел определения составлял 20x102 КОЕ/мл.

Длительность экспериментов в каждом случае определялась временем, в течение которого численность бактерий, подвергнутых воздействию антибиотика, вновь достигала исходного значения. Все эксперименты проводились не менее чем в двух повторностях.

Антимикробные эффекты характеризовали временем, за которое численность клеток уменьшается в 10 раз (Т90%) и в 100 раз (799%) относительно исходной, минимальной численностью жизнеспособных клеток (N„„,0, а также логарифмом отношения jVkон к где NKtx исходная численность клеток, a NK0H - их численность в конце эксперимента (рис. 2). Для интегральной оценки процессов изменения численности чувствительных бактериальных клеток под воздействием антибиотика использовали параметр AUBC (площадь под кинетической кривой гибели/роста бактерий, ограниченная временем г, кратным интервалу дозирования, рис. 2). Кроме того, характеризовали эффект антибиотика площадью между кривыми изменения численности клеток в контроле и опыте в пределах г (АВВС) и площадью между указанными кривыми, определяемой вплоть до того момента, когда численность бактерий в фазе вторичного роста равна таковой на контрольной кривой (/Е) [Фирсов А.А.и соавт., 1985].

Кривая роста клеток бактерии, год действием антибиотика

время

Рисунок 2. Точечные и интегральные параметры антимикробного эффекта (по Firsov A.A. et al., 1997).

Зависимость Т9о%, Г99%, А^ин и А иВС от ПФК24/МПК описывали уравнением У=ах + Ь (1),

где у - Т9оо/о, Тщ%, №„,„ или А11ВС, х - ^ (ПФК24/МПК), а и Ь- параметры.

Зависимость АВВС или 1Е от ПФК24/МПК описывали уравнением Хилла Г=Гтахх"/[(х50)"+Л (2)

где У - АВВС или /Е, х - ^ (ПФК24/МПК), Утах - максимальное значение АВВС или /Е, л:50 - ПФК24/МПК, при котором антимикробный эффект равен Утах/2, и « -параметр.

Для выявления ципрофлоксацино- или линезолидоустойчивых мутантов проводили популяционный анализ путем высева проб каждые 24 ч на чашки с агаром Мюллера-Хинтон II, содержащим ципрофлоксацин или линезолид в концентрации 2х, 4х и 8><МПК. Предел определения - 10 КОЕ/мл. Для интегральной оценки интенсивности селекции резистентных мутантов использовали интегральный параметр АиВСи - площадь под кривой изменения численности клеток, резистентных к 2х, 4х или 8><МПК ципрофлоксацина. Зависимость А11ВСМ от ПФК24/МПК описывали уравнением 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фармакодинамика ципрофлоксацина: развитие резистентности клеток S. aureus в динамической системе, моделирующей in vitro фармакокинетику

антибиотика

С целью выбора оптимального параметра для прогноза селекции резистентных мутантов исследовали динамику изменения численности клеток S. aureus при моделировании различных режимов введения ципрофлоксацина. При интермиттирующем введении значения ПФК24/МПК были выбраны таким образом, чтобы уровни антибиотика находились внутри ОСМ на протяжении большей части

10

интервала дозирования - 56-63% (S. aureus АТСС 43300) и 75-100% (S. aureus АТСС 6538). Для каждого штамма, по крайней мере, два значения ПФК24/МПК обеспечивали одинаковую продолжительность периода времени, на протяжении которого концентрация находится в пределах «окна селекции мутантов» (7осм)- При непрерывном введении ципрофлоксацина его уровни поддерживались в пределах ОСМ на протяжении всего интервала дозирования (Т0см ~ 100%). Моделируемые фармакокинетические профили и соответствующие кинетические кривые изменения численности чувствительных и устойчивых к нему клеток S. aureus показаны на рис. 3.

Как видно на рис. 3, по мере повышения ПФК24/МПК минимальная численность чувствительных к ципрофлоксацину клеток систематически уменьшалась, а время возобновления их роста, сопровождавшегося обогащением популяции резистентными мутантами, возрастало. Селекция мутантов - в большей степени для менее резистентных, чем для более резистентных клеток, - наблюдалась при всех режимах дозирования и сопровождалась 8-64-кратным повышением МПК. При низких значениях ПФК24/МПК рост мутантов начинался раньше, чем при высоких, независимо от 7осм-

Так, несмотря на одинаковые значения 7осм - 56% (S. aureus АТСС 43300) или 75% (S. aureus АТСС 6538), селекция резистентных мутантов была более интенсивной при низких значениях ПФК24/МПК (30 ч для S. aureus АТСС 43300 и 48 ч для S. aureus АТСС 6538), чем при высоких (100 ч для S. aureus АТСС 43300 и 260 ч для S. aureus АТСС 6538)). Обнаруженная закономерность более интенсивной селекции устойчивых мутантов при низких ПФК24/МПК подтвердилась при анализе данных с помощью интегрального параметра A UBCm, т.е. при вычислении площади под кривой изменения численности мутантов, резистентных к 2*, 4х и 8хМПК ципрофлоксацина. Как видно на рисунке 4, при минимальных значениях ПФК24/МПК величина AUBCm была выше, чем при максимальных.

Таким образом, прогнозирование селекции резистентных мутантов по величине ПФК24/МПК надежнее, чем по параметру 7ocmj который не отражает положения фармакокинетического профиля антибиотика внутри ОСМ.

Как было отмечено выше, повышение моделируемых значений ПФК24/МПК приводило к снижению интенсивности селекции резистентных мутантов, которое выразилось в систематическом снижении величины AUBCM для обоих штаммов S. aureus, как при непрерывном, так и при интермиттирующем введении ципрофлоксацина. Это обстоятельство позволило объединить данные по обоим штаммам и способам введения антибиотика (рис. 5).

И

ь

5. эигеш» АТСС 43300

№

пни или [иш 1111 л

зон их № >.>,».» К И* 1 [- ^ г- МГКм «н • • • > и»

. К К К к К

\\ мгк

5. аигеиз АТСС 653В

Н1П

Щ

ИШ

. К К К

МГКм

мгк

О 24 48 т?

О 72 о 24 ДЭ 72

Время, ч

Рис. 3. Фармакокинетические профили ципрофлоксацина и изменения численности клеток З.аипеш, устойчивых к Ох, 2х, 4х, 8хМПК ципрофлоксацина, при интермиттируюьцем (пунктирные линии, текные символы) и непрерывном (сплошные линии, светлые символы) введении. Значения ПФКм/МПК (ч) и Госм (%, только для интермиттирующего введения) показаны у каждого профиля. Стрелками показаны моменты интермиттирующего введения антибиотика.

2хМПК 4хМПК

ЗхМПК

2хМПК 4хМПК 8хМПК

ПФК24/МПК, ч

О Минимальные ПФК../МПК ■ Максимальные ПФК,,/МПК

Рис. 4. Значения А11ВСМ для мутантов, резистентных к 2х, 4х и 8ХМПК ципрофлоксацина, при минимальном и максимальном отношениях ПФК24/МПК (значениях 7осм одинаковы).

Как видно на рисунке 5, зависимость А ШСм от ПФК24/МПК и ПФК24/МПКм была лог-линейной и инвариантной относительно бактериального штамма, причем интенсивность селекции резистентных мутантов стафилококка, выраженная параметром А11ВСи, лучше коррелировала с ПФК24/МПКм (г2 = 0,61 - 0,72), чем с ПФК24/МПК (г2 = 0,35 - 0,59). Характерно, что в отличие от АиВСм, величина АиВС, отражающая действие антибиотика на чувствительную субпопуляцию, лучше коррелировала с ПФК24/МПК (г2 = 0,76), чем с ПФК24/МПКм (г2 = 0,45).

Таким образом, независимо от формы моделируемого фармакокинетического профиля, эффект воздействия ципрофлоксацина на чувствительные клетки надежнее прогнозировать с помощью параметра ПФК24/МПК, а на резистентные клетки - с помощью ПФК24/МПКм.

У 800 т X

I

а

о ¡й О)

О" §

г2 = 0.76

ОхМПК

А

□ "ч. ^ч! й Г2 = 0.45 □ • ^ о

ОхМПК

Г* = 0.59

2*МПК

2*МПК

г2 = 0.61

с I

иЗ §

о>

о£ §

ч

• Г2 = 0.43

4*МПК

г2 = 0.35

8*МГЖ

ПФК24/МПК, ч

4*МПК

лг = 0.70

■

8*МПК л г2 = 0.72 л F-x

ПФК24/МПКН, Ч

Рис. 5. Взаимосвязь между AUBC или AUBCM и ПФК24/МПК или ПФКгУМПКм для S. aureus АТСС 43300 (темные треугольники - интермиттирующее введение, светлые - инфузия) и S. aureus АТСС 6538 (темные квадраты - интермиттирующее введение, светлые - инфузия) -объединенные данные по обоим режимам введения ципрофлоксацина.

Фармакодинамика линезолида при моделировании его фармакокинетнкн в динамической системе in vitro

Те же принципы популяционного анализа, что и в случае изучения развития резистентности к ципрофлоксацину, были использованы применительно к линезолиду, однако на первом этапе исследования необходимо было оценить его эффект в отношении чувствительных клеток, поскольку вид зависимости антистафилококкового эффекта от концентрации линезолида был неизвестен. Кинетические кривые изменения численности клеток 5. aureus при моделировании различных режимов многократного введения линезолида показаны на рисунке 6. Как видно на рисунке, характер кривых во всех случаях был сходным: под воздействием антибиотика численность клеток S. aureus снижалась, а затем возвращалась к исходному уровню. Ни в одном эксперименте не происходило селекции устойчивых к линезолиду мутантов.

Сравнение графиков зависимости антистафилококкового эффекта, выраженного различными параметрами, показало, что 7W. и особенно Т.59% гораздо хуже коррелируют с ПФК24/МПК (г2 = 0,59 и 0,06, соответственно), чем Ммш {г2 = 0,94). Столь же четкой оказалась и сигмоидная зависимость интегрального параметра /Е от ПФК24/МПК (г2 = 0,95), которая была инвариантной относительного бактериального штамма. Поскольку интегральный параметр учитывает все точки кинетической кривой, что обеспечивает более полную и надежную оценку антимикробного эффекта, параметру /Е было отдано предпочтение перед параметром Num.

С целью прогнозирования значения ПФК24/МПК линезолида, эквиэффективного уже известному для широко применяемого в клинике антибиотика, антистафилококковые эффекты линезолида были сопоставлены с таковыми ципрофлоксацина. Для того чтобы это сопоставление было корректным, несмотря на неодинаковую длительность моделируемых курсов введения линезолида (5 суток) и ципрофлоксацина (3 суток), использовали 3-дневные фрагменты кинетических кривых, которые отражают антистафилококковый эффект линезолида, выраженный параметром АВВС. Зависимость АВВС от ПФК24/МПК линезолида (рис. 7) была сходна с упомянутой выше для /Е (приведена в диссертации), причем добавление точек, отражающих эффект ципрофлоксацина, не только не снижало соответствующее значение г2 (0,82), но даже повышало его {г1 = 0,90). Это обстоятельство позволило описать данные по двум антибиотикам одним уравнением (уравнение 2), что свидетельствует об эквиэффективности значений ПФК24/МПК линезолида и

iiiiiim

S.aureus 479 3<>р

/600

V\ 200/

2 3 4 5 6 7 8

Время, ДНИ

Рис. 6. Кинетические кривые изменения численности клеток S. aureus АТСС 43300 (треугольники), 5. aureus 479 (квадраты) и S. aureus АТСС 700699 (круги) под воздействием линезолида (значения ПФК24/МПК показаны цифрами у кривых). Стрелками показаны моменты введения антибиотика.

ципрофлоксацина, в том числе порогового значения (125 ч), обеспечивающего

приемлемый антимикробный эффект в клинике [Forrest А. et al., 1993]. Следует

отметить, что прогнозируемое пороговое значение Г1ФК24/МПК линезолида, равное

125 ч, сопоставимо с таковым, установленным в клинике при бактериемии, инфекции

16

кожи и мягких тканей и нижних дыхательных путей (80 - 120 ч [Rayner C.R. et al., 2003]).

То обстоятельство, что пороговые значения ПФК24/МПК ципрофлоксацина и линезолида одинаковы, не означает, однако, что при воздействии препаратов в ПФК24/МПК, соответствующих терапевтическим дозам, их эффективность также окажется одинаковой. Так, при воздействии линезолида или ципрофлоксацина в клинических дозах на гипотетический штамм S. aureus, для которого значение МПК каждого антибиотика равно МПК50, соответствующее значение ПФК24/МПК50 линезолида составляет 122 ч, а ПФК24/МПК50 ципрофлоксацина - лишь 35 ч. Как видно на рисунке 7, этим отношениям ПФК24/МПК соответствуют резко различающиеся эффекты: величина АВВС для линезолида почти в 4 раза выше, чем для ципрофлоксацина.

ПФК24/МПК, ч

Рис. 7. Зависимость АВВС от ПФК24/МПК, описанная уравнением 2: Значения АВВС, соответствующие отношениям ПФК24/МПК50 линезолида (122 ч) и ципрофлоксацина (35 ч) при воздействии на гипотетический штамм S. aureus, показаны цифрами.

Таким образом, можно предположить, что при стафилококковой инфекции эффективность линезолида в клинике будет значительно выше эффективности ципрофлоксацина.

Фармакодинамика линезолида при его воздействии на смешанный инокулум чувствительных и устойчивых клеток S. aureus в динамической

системе in vitro

Экспериментальный подход, который был использован при изучении селекции стафилококков, резистентных к ципрофлоксацину, оказался неприемлемым для линезолида, поскольку при той же плотности исходного инокулума (посевная доза 108 КОЕ/мл) в нем просто не было резистентных к препарату клеток, что обусловлено низкой частотой мутаций консервативного участка ДНК (10~9- 1(Г" [Zander J. et al., 2008; Allen G. P. a. Bierman В. C., 2009] или даже 10"" [Zurenko G. E., 1996]).

С целью оптимизации условий эксперимента был разработан новый подход, предусматривающий гарантированное присутствие резистентных мутантов в посевной дозе, - использование смешанного исходного инокулума, содержащего как чувствительные клетки, так и их резистентные мутанты. Для этого путем искусственной селекции (пересевы клеток в среде, содержащий линезолид в возрастающей концентрации (от 1 до 512 мкг/мл)) были получены мутанты S. aureus, устойчивые к линезолиду. В процессе селекции происходило постепенное снижение чувствительности штаммов к антибиотику, так что к 15-му пассажу значения его МПК превышали исходные в 32-128 раз.

Критерием оптимальности состава смешанного инокулума было отсутствие влияния резистентных мутантов на величину МПКм, установленную для родительского штамма. Присутствие высокорезистентных мутантов (характеризующихся МПК линезолида, равной 128 мкг/мл) в концентрации 10 и даже 102 КОЕ/мл в суспензии клеток родительского штамма (Ю10 - 10" КОЕ/мл) приводило к резкому возрастанию значения МПКм смеси. Только умеренно устойчивый штамм S. aureus 10, полученный после 9-го пассажа - штамм М9 (МПК = 8 мкг/мл), в концентрации 102 КОЕ/мл не оказывал влияния на величину МПКм смеси. Поскольку штаммы с таким же уровнем устойчивости были выделены клинике [Mendez R. Е. et al., 2008; Shaw K.J. et al., 2008], именно штамм M9 оказался наиболее подходящим для создания смешанного инокулума в следующем соотношении (при расчете на 500 мл среды): клетки М9 в количестве 5х 102 КОЕ и клетки родительского штамма в количестве 5*1010 КОЕ.

С целью проверки применимости гипотезы существования ОСМ к линезолиду при его воздействии на смешанный инокулум чувствительных и устойчивых клеток S. aureus 10, параметры режимов введения антибиотика были рассчитаны таким образом, чтобы его концентрация находилась в пределах ОСМ на протяжении 100, 86, 37 или 0% интервала дозирования. Фармакокинетические профили и кривые изменения

18

численности жизнеспособных клеток, подвергнутых воздействию линезолида, показаны на рис. 8. При минимальном значении ПФК24/МПК (60 ч), когда концентрация постоянно находилась в пределах ОСМ - 7Ъсм = 100%, наблюдалась селекция резистентных стафилококков, причем рост численности субпопуляций, устойчивых к 2х и 4х, но не 8хМПК линезолида, носил экспоненциальный характер. При этом МПК линезолида для всей популяции к концу эксперимента возрастала в 4 раза. Подобная селекция устойчивых клеток с такими же потерями в их чувствительности наблюдалась и при отношении ПФК24/МПК, равном 120 ч (соответствующем терапевтической дозе), когда концентрация линезолида находилась в пределах ОСМ на протяжении большей части интервала дозирования (86%).

При дальнейшем повышении значений ПФК24/МПК до 240 и 480 ч, когда фармакокинетические профили концентрации линезолида располагались выше МПКм на протяжении большей части или всего интервала дозирования, а Тосм составляли 37 и 0%, соответственно, ни роста резистентных мутантов, ни потерь в чувствительности популяции стафилококков к линезолиду не наблюдалось.

ЖЖЖ

ПФК„/МПК60ч Госи 100%

LiiiiiiiL.

ПФК2</МПК120Ч

IHIHIIil IIHHtHi

ПФК24/МПК240ч ПФКг1/МПК480ч

Гос«37°/. Гос»0%

\NNNNNNMN\ мпк»

\ \мпн

.....................................\ V"

о Ш

в о

•

2хМПК

„«>" «»МПК 1

■с*

-о— с---

8хМПК

2хМПК

>> 4хМПК

J Время, дни

Рис. 8. Фармакокинетические профили линезолида в динамической системе и кинетика изменения численности клеток S. aureus 10 (смешанный инокулум), подвергнутых воздействию антибиотика. Заданные значения ПФК24/МПК показаны около каждого фармакокинетического профиля, стрелками обозначены моменты введения антибиотика.

Таким образом, величину ПФК24/МПК, равную 240 ч, можно рассматривать как антимутантную. Следует отметить, что она вдвое выше концентрации, достижимой при клинической схеме введения линезолида.

То обстоятельство, что селекция резистентных клеток происходила только при концентрациях антибиотика, остававшихся в пределах ОСМ на протяжении большей части интервала дозирования, доказывает применимость гипотезы существования ОСМ не только для фторхинолонов и гликопептидных антибиотиков, но и для линезолида.

ВЫВОДЫ:

1. По результатам фармакодинамического изучения ципрофлоксацина в системах in vitro установлено, что его воздействие на чувствительные клетки S. aureus надежнее прогнозировать с помощью отношения площади под фармакокинетической кривой в пределах 24 ч к МПК (ПФК24/МПК), а на резистентные клетки - с помощью отношения ПФК24 к минимальной концентрации, предотвращающей рост мутантов (ПФК24/МПКм).

2. Показано, что параметр Г0см - период времени, на протяжении которого концентрация антибиотика находится внутри «окна селекции мутантов» (ОСМ), не отражающий положения фармакокинетического профиля относительно границ ОСМ, менее надежен для прогнозирования селекции резистентных мутантов, чем отношение ПФК24/МПКм.

3. Сравнение динамики изменения численности клеток при моделировании интермиггирующего введения и непрерывной инфузии ципрофлоксацина показало, что взаимосвязи между AUBCm или AUBC и ПФК24/МПКм или ПФК24/МПК не зависят от способа введения антибиотика.

4. При моделировании режимов многократного введения линезолида установлена зависимость эффекта препарата, выраженного интегральным параметром 4, от отношения ПФК24/МПК, которая оказалась неспецифичной для штаммов S. aureus.

5. Доказана эквиэффективность линезолида и ципрофлоксацина при одинаковых значениях ПФК24/МПК и осуществлен прогноз эффективности антибиотиков при стафилококковой инфекции, согласно которому при воздействии в терапевтических дозах линезолид в 4 раза эффективнее ципрофлоксацина.

6. Предложен новый подход к изучению развития устойчивости к линезолиду -применение смешанного инокулума, содержащего как чувствительные к линезолиду клетки S. aureus, так и их резистентные мутанты, полученные путем искусственной селекции.

7. При моделировании 5-дневного введения линезолида в случае смешанного инокулума выявлен рост мутантов S. aureus, резистентных к антибиотику, и доказано, что селекция резистентных стафилококков происходит согласно гипотезе существования «окна селекции мутантов» (ОСМ).

8. Прогнозированное антимутантное значение ПФК24/МПК (240 ч) для линезолида в 2 раза превысило его терапевтическое значение (120 ч).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lubenko I. Y., Smirnova М., Strukova Е., Zinner S., Firsov A. Bacterial strain-independent pharmacodynamics of linezolid with Staphylococcus aureus: five-day treatments simulated in an in vitro dynamic model. 46th 1CAAC, Abstracts, Washington, 2006, Abstr. A-640, P. 15.

2. Smirnova M., Lubenko I., Strukova E., Vostrov S., Firsov A., Zinner S. Comparative pharmacodynamics of linezolid, vancomycin and doxycycline with susceptible and resistant subpopulations of Staphylococcus aureus. Там же, Abstr. A-641, P. 15.

3. Firsov A., Lubenko I., Smirnova M., Strukova E., Vostrov V., Zinner S. Concentration-dependent enrichment of fluoroquinolone-resistant Staphylococcus aureus: the role of position of simulated concentrations inside the mutant selection window. 47th ICAAC, Abstracts, Chicago, 2007, Abstr. A-24, P. 6.

4. Firsov A., Lubenko I., Smirnova M., Strukova E., Zinner S. Heterogeneity of the mutant selection window (MSW): Selection of resistant Staphylococcus aureus at ciprofloxacin constant concentrations simulated close to the MIC or the mutant prevention concentration (MPC). Clin. Microbiol. Infection 2008, vol. 14 (Suppl. 7), S674, Abstr. R2267.

5. Firsov A., Lubenko I., Smirnova M., Strukova E., Zinner S. Enrichment of fluoroquinolone-resistant Staphylococcus aureus: oscillating ciprofloxacin concentrations simulated at the upper and lower portions of the mutant selection window. Antimicrob. Agents Chemother. 2008, Vol. 52, p. 1924-1928.

6. Firsov A., Smirnova M., Strukova E., Lubenko I., Portnoy Y., Zinner S. Relative strengths of area under the curve (AUC)/MIC or AUC/MPC as predictors of Staphylococcus aureus resistance during exposure to fluctuating and constant fluoroquinolone concentrations within the mutant selection window. 48th ICAAC and 46th Annual IDSA joint Meeting, Washigton, DC, 2008, Abstr. A-984.

7. Firsov A., Smirnova M., Strukova E., Vostrov S., Portnoy Y., Zinner S. Enrichment of resistant Staphylococcus aureus at ciprofloxacin concentrations simulated within the mutant selection window: bolus versus continuous infusion. Int. J. Antimicrob. Agents, 2008, Vol. 32, p. 488-493.

8. Струкова E.H., Смирнова M.B., Востров C.H., Портной Ю.А., Довженко С.А., Кобрин М.Б., Фирсов А.А. Прогнозирование развития антибиотикоустойчивости при моделировании клинических режимов дозирования в динамической системе in vitro. Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер., 2009, Т. 11, № 2, С. 152-160.

9. Strukova Е., Smirnova М., Vostrov S., Firsov A., Lubenko I., Zinner S., Portnoy Y. Linezolid pharmacodynamics with Staphylococcus aureus in an in vitro dynamic model. Int. J. Antimicrob. Agents, 2009, Vol. 33, p. 251-254.

10. Firsov A., Smirnova M., Strukova E., Portnoy Y., Zinner S. Bacterial resistance studies in an in vitro dynamic model: use of antibiotic-susceptible organisms supplemented with their resistant mutants. Clin. Microbiol. Infection, 2010, Vol. 16, Issue 2, P 1601.

11. Струкова E.H., Смирнова M.B., Портной Ю.А., Фирсов А.А. Методические подходы к моделированию процессов развития антибиотикорезистентности in vitro. MAKMAX/ESCMID «Антимикробная терапия» 2010, 12(2), Прилож. 1, ст. 49.

Заказ № 38-а/09/10 Подписано в печать 07.09.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Актуальность темы. Развитие устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам является основным фактором снижёния эффективности препаратов^ поэтому оптимальными считаются такие схемы антибиотикотерапии; которые обеспечивают не только ингибирование чувствительной популяции патогенных микроорганизмов; но и предотвращение селекции; их резистентных мутантов; В последние годы: были? предприняты; попытки: моделирования процессов развития антибиотикоустойчивости в динамических системах in vitro с использованием: инокулумов! высокой: плотности, в?:которыхмогут содержаться^спонтанныешутанты® [Campiom J{J1 et; al., 2004, 2005 a), b); Firsov A.A. et al., 2003: MacGowan A.P: et aL 2003; Smirnova\ к фторхинолонам и гликопептидным антибиотикам удалось установить »четкие; взаимосвязи* между селекцией резистентных мутантов- и интегральной: характеристикой фармакокинетического* профиля: антибиотикам - площадью; под фармакокинетической кривой (ПФК), отнесенной к его МПК (ПФК/МПК). Характер- таких взаимосвязей согласуется, с гипотезой? существования . «окна1, селекции мутантов» (ОСМ), согласнр которой пролиферация*мутантов наиболее вероятна, когда- концентрация; антибиотика превышает МПК - нижняя; граница ОСМ, - но не .достигает минимальной концентрации; предотвращающей рост мутантов (МПКм - верхняя граница ОСМ) [Zhao X., Drlica.K., 2001]. Вместе с тем, вопрос о выборе, оптимального параметра для прогноза' селекции: устойчивых клеток - периода врсмени, на протяжении которого концентрация антибиотика находится в пределах ОСМ (Тосм), отношений ПФК/МПК или ПФК/МГЖм - остался нерешенным. Неизвестно также, возможно ли использовать методические подходы, позволившие моделировать селекцию фторхинолоноустойчивых мутантов, в тех случаях, когда: устойчивость; к антибиотикам возникает в результате спонтанных мутаций в консервативных участках ДНК, ввиду чего частота возникновения таких мутаций очень низка:

В связи с этим разработка методов изучения in vitro и прогнозирования антибиотикорезистентности является весьма актуальной.

Цель работы:

Совершенствование методов моделирования и прогнозирования процессов селекции антибиотикорезистентных мутантов в динамических системах in vitro.

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить селекцию резистентных стафилококков при моделировании режимов многократного струйного и непрерывного» капельного введения ципрофлоксацина в широком! диапазоне значений ПФК/МПК.

2. Обосновать выбор оптимального параметра для прогнозирования селекции мутантов, резистентных к ципрофлоксацину.

3. Изучить фармакодинамику линезолида в отношении чувствительных к нему штаммов S. aureus и установить зависимость антимикробного эффекта от отношения ПФК/МПК.

4. Разработать методические подходы к моделированию процессов развития резистентности к линезолиду с использованием' смешанного инокулума чувствительных к нему клеток и полученных путем искусственной селекции резистентных мутантов.

5. Проверить применимость гипотезы существования ОСМ к линезолиду и прогнозировать антимутантное значение ПФК/МПК.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований:

1. Установлено; что воздействие ципрофлоксацина на устойчивую популяцию S. aureus надежнее прогнозировать с помощью параметра ПФК/МПКм, а на чувствительную - с помощью ПФК/МПК.

2. Доказано, что параметр Тоем, не отражающий положения фармакокинетического профиля антибиотика внутри ОСМ, менее надежен для прогнозирования селекции резистентных мутантов, чем ПФК/МПКм.

3. Установлено, что антистафилококковый эффект линезолида зависит от отношения ПФК/МПК антибиотика, причем эта зависимость инвариантна относительно штамма S. aureus.

4. Разработан новый методический подход к изучению процессов развития устойчивости к линезолиду, предусматривающий использование смешанного инокулума чувствительных и резистентных к антибиотику клеток S. aureus.

5. Доказано, что селекция резистентных к линезолиду мутантов S. aureus происходит согласно гипотезе существования ОСМ и установлено антимутантное значение ПФК/МПК.

Научно-практическая значимость работы.

1. Параметр ПФК/МПКм, оптимальный для прогноза селекции ципрофлоксацинорезистентных стафилококков, может быть использован для прогнозирования устойчивости бактерий к другим антибиотикам.

2. Спрогнозированный in vitro эффект терапевтической дозы линезолида оказался в 4 раза выше эффекта ципрофлоксацина, что позволяет рассчитывать на высокую эффективность линезолида при стафилококковой инфекции.

3. Разработанный подход к изучению селекции мутантов, резистентных к линезолиду, может быть применим и к другим антибиотикам, устойчивость к которым развивается в результате спонтанных мутаций, возникающих с низкой частотой.

Выводы:

1. По результатам фармакодинамичеекого изучения ципрофлоксацина в-системах in vitro установлено, что его воздействие на чувствительные клетки S. aureus надежнее прогнозировать с помощью параметра ПФК24/МПК, а на резистентные клетки - с помощью ПФК^/МПКм

2. Показано, что параметр Тос м, не учитывающий положения фармакокинетического профиля антибиотика относительно границ( ОСМ, менее надежен для прогнозирования селекции резистентных мутантов, чем отношение ПФК24/МПКм.

3. Сравнение динамики изменения численности клеток при моделировании' пилообразных* колебаний концентрации ципрофлоксацина.и его постоянной, концентрации показало, что форма фармакокинетического профиля не влияет на взаимосвязь между AUBCM и ПФК24/МПКм.

4. При моделировании режимов многократного введения линезолида установлена зависимость его эффекта от отношения ПФК24/МПК, которая оказалась неспецифичной »для штаммов S. aureus.

5. Доказана эквиэффективность линезолида, и ципрофлоксацина при одинаковых значениях ПФК^/МПК и осуществлен прогноз эффективности антибиотиков при стафилококковой инфекции, согласно которому при воздействии в терапевтических дозах линезолид может быть в 4 раза эффективнее ципрофлоксацина.

6. Предложен новый подход к изучению процессов^ развития, устойчивости к линезолиду — применение смешанного инокулума, содержащего как чувствительные к линезолиду клетки родительского штамма S. aureus, так и их резистентные мутанты, полученные путем искусственной селекции.

7. С помощью этого подхода при моделировании 5-дневного введения линезолида выявлен зависимый от его концентрации рост резистентных мутантов S. aureus и доказано, что их селекция происходит согласно гипотезе существования «окна селекции мутантов». 8. Прогнозированное антимутантное значение ПФК24/МПК (240 ч) для линезолида в 2 раза превысило его терапевтическое значение ПФК24/МПК (120 ч).