Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакодинамика даптомицина и ванкомицина в системах in vitro, моделирующих фармакокинетику антибиотиков: прогнозирование антистафилококкового эффекта и развития резистентности

¡х.О

На правах рукописи

Смирнова Мария Владимировна

ФАРМАКОДИНАМИКА ДАПТОМИЦИНА И ВАНКОМИЦИНА В СИСТЕМАХ IN VITRO, МОДЕЛИРУЮЩИХ ФАРМАКОКИНЕТИКУ АНТИБИОТИКОВ- ПРОГНОЗИРОВАНИЕ АНТИСТАФИЛОКОККОВОГО ЭФФЕКТА И РАЗВИТИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степе1

кандидата биологических наук ООЗ 170969

Москва 2008

003170969

Работа выполнена в ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Фирсов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Жердев Владимир Павлович

доктор биочогических наук Сингин Александр Стефанович

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университе1

Защита диссертации состоится «_»_2008 I в_час на заседании

диссертационного совета Д 001 024 01 в ГУ НИИ фармакологии имени В В Закусова РАМН по адресу 125315, Москва, ул Балтийская, д 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН по адресу 125315, г Москва, ул Балтийская, д 8

Автореферат разослан «_»_2008г

Ученый секретарь диссертациониого совета, доктор медицинских наук

Е А Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы Широкое распространение антибиотико-устойчивых возбудителей инфекционных заболеваний диктует необходимость создания новых антибиотиков, способных воздействовать не только на чувствительные, но и на резистентные бактерии Это обстоятельство потребовало внести серьезные коррективы в методологию фармакодинамических исследований, в частности предусмотреть возможность прогнозирования и предотвращения процессов селекции резистентных мутантов при различных режимах введения антибиотика Для достижения указанных целей все чаще применяются динамические системы, которые позволяют изучать фармакодинамику антибиотиков m vitro и оценивать их эффективность при фармакокинетически обусловленных изменениях концентрации препаратов [Фирсов А А и соавт , 1989, Bergan Т, 1986, Blaser J , 1985, Firsov A A et al, 2007, Zinner S H , 1987] Благодаря использованию таких систем оказалось возможным успешно прогнозировать эквиэффективные уровни и дозы новых фторхинолонов [Firsov A A et al, 1998 и 2000, Vostrov SN et al, 2000], а также установить зависимость селекции резистентных стафилококков [Фирсов А А и соавт, 2003, Firsov A A et al, 2003], пневмококков [Zinner et al, 2003] и псевдомонад [Tarn V H , et al, 2005] от отношения площади под фармакокинетической кривой в пределах 24 ч (ПФК24) фторхинолона к его минимальной подавляющей концентрации для данного штамма бактерии (МПК) - ПФК24/МПК Кривые зависимости резистентности к фторхинолонам от ПФК24/МПК имели куполообразную форму, что согласуется с недавно выдвинутой гипотезой об «окне селекции мутантов» (ОСМ - «mutant selection window») [Zhao X, Drlica К, 2001] Согласно этой гипотезе селекция устойчивых мутантов наиболее вероятна, когда концентрации антибиотика попадают в ОСМ, ограниченный снизу уровнем МПК, а сверху - минимальной концентрацией, предотвращающей рост устойчивых мутантов (МПКм - MPC)

В связи с этим проверка гипотезы ОСМ для антибиотиков других групп, в частности новых липо- и гликопептидов, а также оценка их фармакодинамических свойств в динамических системах in vitro весьма актуальны

Цель работы. Прогнозирование антистафилококкового эффекта нового липопептидного антибиотика даптомицина при моделировании его терапевтических концентраций, а также прогнозирование способности даптомицина предотвращать селекцию резистентных мутантов при моно- и комбинированной терапии

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи

1 Выбрать оптимальный метод количественной оценки антимикробного эффекта на примере анализа кинетики гибели и вторичного роста стафилококков под действием липо- и гликопептида (даптомицин и ванкомицин) в динамической системе in vitro

2 Установить зависимость антистафилококкового эффекта даптомицина и ванкомицина от моделируемого значения ПФК24/МПК на основе сравнительного изучения их фармакодинамики

3 Оптимизировать условия выявления резистентных стафилококков in vitro и установить зависимость их селекции от ПФК24/МПК даптомицина (при его введении отдельно и в сочетании с рифампицином) и ванкомицина

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований

1 Теоретически обоснован интегральный метод количественной оценки антимикробного эффекта даптомицина и ванкомицина в динамической системе, моделирующей их фармакокинетику у человека, по площади между кривыми гибели/вторичного роста бактерий в присутствии антибиотика и их роста в его отсутствие (интенсивность эффекта - параметр /Е)

2 Впервые установлена инвариантная относительно бактериального штамма и антибиотика зависимость антистафилококкового эффекта даптомицина и ванкомицина, выраженного параметром /Е, от отношения ПФК24/МПК

3 Разработаны новые методические подходы к выявлению in vitro даптомицино- и ванкомицинорезистентных мутантов Staphylococcus aureus и установлена зависимость их селекции от моделируемого значения ПФК24/МПК

4 На основе зависимости от ПФК24/МПК численности колоний S aureus, резистентных к антибиотику, или изменений в МГЖ после многократного введения даптомицина и ванкомицина установлено, что наибольшие потери в чувствительности к ним стафилококков, а также максимальная селекция резистентных мутантов происходят при значениях ПФК24/МПК, равных 32-64 ч, которые ниже терапевтических

5 Доказана принципиальная возможность подавления селекции даптомицино-резистентных мутантов S aureus при сочетанием применении даптомицина с рифампицином

Научно-практическая значимость работы

1 Интегральный метод количественной оценки антимикробного эффекта, апробированный для даптомицина и ванкомицина, может быть использован при фармакодипамичееком изучении других липо- и гликопептидов

2 Благодаря инвариантности зависимости между /Е и ПФК24/МПК относительно бактериального штамма, она может быть использована для прогнозирования действия липо- и гликопептидов на репрезентативные штаммы S aureus, в частности на те, для которых МПК равна МПК50 или МПК90 По результатам такого прогноза, эффективность даптомицина в терапевтических дозах примерно равна эффективности ванкомицина

3 Разработанные методические подходы к выявлению и прогнозированию селекции мутантов S aureus, резистентных к даптомицину и ванкомицину, по величине ПФК24/МПК могут быть использованы и для других антибиотиков

4 Продемонстрированное подавление селекции даптомицинорезистентных мутантов при сочетанном применении даптомицина с рифампицином является предпосылкой для испытаний указанной комбинации в клинике

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 7-й Международной конференции MAKMAX/ESCMID «Антимикробная терапия» (Москва, 2005), 7-м Европейском конгрессе по химиотерапии и инфекциям (7th ECCI, Флоренция, 2005), 15-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (15th ECCMID, Копенгаген, 2005)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 статьи в центральных журналах и 3 тезисов

Объем и структура диссертации Диссертационная работа содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы и список литературы, включающий 16 отечественных и 215 зарубежных источников Работа иллюстрирована 5 таблицами и 53 рисунками Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Антибиотики и бактериальные штаммы Даптомицин был предоставлен компанией Cubist Pharmaceuticals, Inc (Лексингтон, США), а ванкомицин и рифам-

пицин были приобретены у компании MP Biomedicals, Inc (Солон, США)

В работе использовали штаммы Staphylococcus aureus, поддержание бактериальных культур обеспечивали путем их периодического посева на плотную питательную среду - агар Мюллера-Хинтон II (МХА II) Для изучения фармакодинамики даптомицина и ванкомицина были выбраны клинические штаммы - метициллиноустойчивый S aureus 866 и метициллиночувствительный S aureus 10 В экспериментах с даптомицином и рифампицином использовали метициллиноустойчивые штаммы S aureus АТСС 43300 и S aureus 866 Значения МПК антибиотиков устанавливали методом серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтон (МХБ, в случае с даптомицином обогащен С а*'), содержащем 24-часовую культуру стафилококка с исходной численностью клеток, равной 5x105 колониеобразующих единиц (КОЕ) в мл (КОЕ/мл) Для более точной оценки МПК антибиотиков использовали серийные разведения с различными значениями исходной концентрации Значения МПК антибиотиков для изученных штаммов приведены в таблице 1

Табл 1 Значения МПК (в мкг/мл)/МПКм (в мкг/мл) антибиотиков

антибиотик S aureus 866 S aureus 10 S aureus АТСС 43300

даптомицин 0,35/1,1 1,1/5,5 0,39/12,5

ванкомицин 0,70/2,4 1,3/11 _*

рифампицин 0,012/>800 _* 0,012/>800

*3начения МПК и МПКм антибиотика для данного штамма не определяли

Оценку МПКм осуществляли методом X Zhao и К Drlica (2001) (рис 1) После инкубирования при 37°С в течение суток, суспензию клеток стафилококка в МХБ концентрировали для достижения численности клеток, равной 10|о-10" КОЕ/мл, путем центрифугирования (4000xg в течение 10 мин) Полученную суспензию высевали на чашки Петри, содержащие антибиотик Точное значение МПКм Для каждой пары антибиотик - микроорганизм рассчитывали по результатам регрессионного анализа зависимости числа колониеобразующих единиц стафилококка от концентрации антибиотика, содержавшегося в МХА II - см рис 1 Значения МПКм антибиотиков для изученных штаммов приведены в таблице 1

о 2 4 6 8 10 12

Концентрация антибиотика, мкг/мл

Рис 1 Оценка МПКм даптомицина (темные символы) и ванкомицина (светлые символы) в отношении S aureus 866 (треугольники) и S aureus 10 (кружки) Цифрами на графике обозначены значения МПКм антибиотиков

Моделируемые фармакокииетические профили Во всех случаях моделировали моноэкспоненциальные фармакокииетические профили антибиотиков со значениями периода полувыведения (Г1/2), соответствующими установленным при клиническом изучении фармакокинетики даптомицина (9 ч), ванкомицина (6 ч) и рифампицина (3 ч)

В экспериментах с однократным введением даптомицина и двукратным введением ванкомицина с интервалом в 12 ч моделируемые значения отношения ПФК в пределах от 0 ч до бесконечности (ПФК0.„) к МПК (ПФК0,/МПК) составляли соответственно 67-540 и 33-540 ч (S aureus 866) и 43-970 и 73-1150 ч (S aureus 10) При 5-дневном введении даптомицина и ванкомицина значения ПФК24/МПК составляли 16-256 (S aureus 866) и соответственно 16-256 и 14-432 ч (S aureus 10) При моделировании сочетанного применения даптомицина с рифампицином (опыты с 5-дневным введением антибиотиков) значение ПФК24/МПК даптомицина составляло 64 ч, а рифампицина - 100 и 500 ч Большинство экспериментов были проведены в двух и более повторностях

Динамическая система in vitro Для моделирования фармакокинетических профилей и изучения фармакодинамики антибиотиков использовали динамическую систему, описанную ранее [Фирсов А А и соавт, 1989] Такая система состоит из соединенных между собой сосудов - вспомогательного, содержащего свежий МХБ («растворитель»), и основного (№1), содержащего МХБ с бактериальной культурой без (контроль) или с антибиотиком (опыт) (рис 2 (а))

Рис 2 Принцип воспроизведения моноэкспоненциального снижения концентрации антибиотика (а) и одновременного воспроизведения моноэкспоненциальных профилей двух антибиотиков (б) в динамической системе

С помощью перистальтического насоса МХБ из вспомогательного сосуда подается в основной сосуд, из которого с той же объемной скоростью (F) удаляется МХБ с бактериальной культурой (контроль) или с культурой и антибиотиком (опыт) При этом объем МХБ в сосуде №1 (V{) остается постоянным Таким образом, соотношение объемной скорости и объема жидкости в основном сосуде моделируют соотношение общего клиренса и кажущегося объема распределения антибиотика у человека

Расчет величины F, необходимой для обеспечения заданной скорости элиминации антибиотика при выбранном значении V\, осуществляется по формуле [1]

F=Vxx\.rQJTm [1]

Согласно формуле [1] для 60-мл объема среды в сосуде №1 расчетные значения F составляли 4,6 мл/ч для даптомицина (/"дан) и 6,9 мл/ч для ванкомицина (^ван)

Для одновременного моделирования моноэкспоненциальных профилей двух антибиотиков (даптомицин и рифампицин), характеризующихся разными значениями Тю, был использован принцип суперпозиции потоков, поскольку каждому из антибиотиков соответствует свое собственное значение F (/*ддп и FPm) При этом использовалась более сложная динамическая система [Blaser J, 1985], состоящая из 3 сосудов (рис 2 (б))

В этом случае вспомогательный сосуд параллельно соединен с двумя сосудами - основным (№1) и дополнительным (№2), который в свою очередь соединен с сосудом №1 В начальный момент времени в сосуд №1, содержащий МХБ с бактериальной культурой, добавляются оба антибиотика, а в сосуд №2 -только один антибиотик, характеризующийся более высоким значением Тц2 (даптомицин), в количестве, необходимом для достижения заданных значений их начальной концентрации Для воспроизведения неодинаковой скорости элиминации

даптомицина и рифампицина МХБ из вспомогательного сосуда подастся в сосуд №1 с объемной скоростью РДАП, а в сосуд №2 - с объемной скоростью РРИф - /-дли С той же объемной скоростью />Нф - /7дЛП МХБ с даптомицином подается из сосуда №2 в сосуд №1 При этом результирующая объемная скорость подачи МХБ из вспомогательною сосуда и МХБ с даптомицином из сосуда №2 в сосуд №1 складывается из £~дап и (Рриф - ^дап), т е равна />иф Таким образом, удается предотвратить слишком быстрое выведение даптомицина из основного сосуда, определяемое величиной /-"риф, и сохранить постоянство его объема Поскольку с той же объемной скоростью удаляется содержимое сосуда №1, его объем сохраняется постоянным При этом значения /'ддп и />иф рассчитываются по формуле [1] Для 85-мл объема среды в сосуде №1 (У\) значения /'"дли и составляли 6,5 и 19,6 мл/ч, соответственно, а объем сосуда №2 (У2), рассчитанный по формуле У2 = [(^риф - /гдап)//гдап]х^ь составлял 170 мл

Перед началом каждого эксперимента систему стерилизовали, заполняли свежим МХБ и термостатировали при 37°С В сосуд №1 вносили 18-часовую бактериальную культуру (106 КОЕ/мл в опытах с однократным или двукратным введением антибиотика или 108 КОЕ/мл в опытах с многократным введением), а затем, после получасовой инкубации, вводили антибиотик В течение эксперимента из сосуда №1 отбирали пробы, которые после разведения стерильной дистиллированной водой высевали на чашки Петри с МХА II без антибиотика (оценка численности бактериальной популяции) и с антибиотиком (оценка численности устойчивой субпопуляции) Нижний предел определения численности клеток бактерии составлял 1х102 и 1 х 101 КОЕ/мл, соответственно

Оценка антимикробного эффекта в отношении чувствительной и устойчивой субпопуляций и его зависимость от ПФКо-»/МПК пли ПФКм/МПК

Антимикробный эффект характеризовали временем снижения численности жизнеспособных бактерий в 10 (Тда>/,) и 100 раз (Т9д%), минимальной численностью жизнеспособных клеток (¿Умш), числом клеток в момент времени г, кратный интервалу дозирования, например, через 48 ч от начала эксперимента (Лу, площадью между кривыми изменения численности клеток в контроле и опыте в пределах г, например, от 0 до 48 ч (АВВС) и от 0 ч до того момента, когда указанные кривые совмещаются (/Е) (рис 3)

При однократном введении даптомицина и двукратном введении ванкомицина зависимость эффекта от ПФКо-«/МПК описывали уравнением [2]

¥=ах\в(х) + Ь, [2]

где х - ПФК0.И/МПК, Y Л'мин, Л« АВВС или 1Е, а а и Ь -параметры, при многократном введении - уравнением [3]

Е = £мин+(£шкс - £мин)/[1+(*/х5о,) Ч, [3]

где х - ПФК24/МПК, Е - /Е,

Емакс Ц ^мин

- максимальное и минимальное значения антимикробного эффекта, х50 -значение д:, определяемое выражением (Еыш+Еткс)/2, as- параметр

Селекцию резистентных мутантов S aureus характеризовали разностью логарифмов максимального (iVMai<c) и исходного (Д'исх) числа колоний на среде с антибиотиком, отношением величины МПК в конце эксперимента (МПКкон) к исходному значению МПК (МПКИСХ), а также площадью под кривой «логарифм числа мутантов - время» (AUBCu) Зависимость lg (NmJN„m) или МПКкон/МПК„сх от ПФК24/МПК описывали уравнением [4]

Y= Уо + а ехр [-0,5 (х - xcf/b2], [4]

где Y - lg (NmJNKCK) или МПКкон/МПКисх, У0 - минимальное значение Y, х - lg (ПФК24/МПК), хс - значение lg (ПФК24/МПК), соответствующее максимальному значению lg (Л'макс/Д'исх) или МПКкон/МПКисх, а а и b - параметры

Методические подходы к оценке антистафилококкового эффекта даптомицина и ванкомицина

В связи с тем, что вид зависимости антистафилококкового эффекта даптомицина и ванкомицина от концентрации неизвестен, на первом этапе фармакодинамических исследований была оптимизирована методология оценки этого эффекта, обеспечивающая установление количественных соотношений «ПФК/МПК - эффект» С этой целью изучена кинетика гибели/вторичного роста клеток S aureus 866 и S aureus 10 при моделировании в динамической системе однократного введения даптомицина и двукратного введения ванкомицина с интервалом в 12 ч

Во всех случаях кинетические кривые изменения численности жизнеспособных клеток 5 aureus характеризовались сокращением численности кле-

о ь

Ф

л

I-

о

0

X

1 ю о о

с о S X

|д«т

Рис 3 Параметры антимикробного эффекта

ток стафилококка под влиянием антибиотиков с последующим возобновлением их роста (рис 4)

S aureus 866 . 67

S aureus 10

/

540

S'

j 135 ' S f 270

/ S

s

85

y //

f 170 *

340

970 t

Рис 4 Кинетические кривые изменения численности клеток S aureus 866 и .S' aureus 10 под действием даптомицина и ванкомицина Цифрами у кривых обозначены моделируемые значения ПФКо-^/МПК (в часах) Остачьные обозначения те же, что на рис 1

В целом, повышение моделируемого значения ПФКо-*/МПК приводило к снижению минимальной численности жизнеспособных клеток S1 aureus 10 и вызывало задержку возобновления их роста Менее определенной оказалась взаимосвязь между моделируемым значением ПФК0.И/МПК и параметрами кинетических кривых, отражающих процессы гибели/вторичного роста клеток S aw eus 866 Так, повышение величины ПФК0-«/МПК даптомицина и ванкомицина от 135 до 540 ч практически не оказывало влияния на динамику гибели/роста стафилококка в динамической системе

Кроме того, визуальное сравнение кинетических кривых при одинаковых или сопоставимых значениях ПФКо-*/МПК не позволяло объективно сравнивать эффекты антибиотиков, что указывает на необходимость их параметризации

Описанные кинетические кривые были охарактеризованы 6 параметрами (рис 5)

10 8 6 4 2 0

R 2 = 0,69

20 т

15

10

r 2 = 0,09

R2~ 0,46

ют

R 2 = 0,88

r2= 0,87 ж

g 61 i: D>

7- 4

R2= 0,31

r 2 = 0,44

300r

£ 20(H S

n

О 100 $

m ч

10

r 2 = 0,84 *

400

100

1000

10000 10 ПФК^/МПК, ч

100

1000

10000

Рис 5 Зависимость параметров антистафилококкового эффекта даптомицина (непрерывная линия) и ванкомицина (пунктирная линия) от ПФКо^УМПК, описанная уравнением [2], для S aureus 866 и S aureus 10 Обозначения те же, что на рис 1

Как видно на рисунке, параметры Т90% и Т<><>%, отражающие скорость гибели клеток под действием антибиотика в начальной фазе кинетической кривой, не коррелируют с логарифмом моделируемого отношения ПФК0-»/МПК ванкомицина (Я2 0,03-0,09) и слабо коррелируют с логарифмом ПФКо®/МПК даптомицина (R 0,46-0,69) Более того, по крайней мере, для ванкомицина полученные зависимости Тдо% и 7д9% от ПФКо-оо/МГЖ парадоксальны вопреки логике эффект, выраженный этими параметрами, слабее при высоких значениях ПФК0 „/МПК, чем при низких

В отличие от 7'90% и Гд9о/о, параметр /VM„„, характеризующий центральную фазу

кривой, коррелирует с логарифмом ПФК0.оо/МПК (Л2 0,87 и 0,88 для даптомицина и ванкомицина, соответственно), а параметр Л:'т, характеризующий конечную фазу кривой, - нет Как видно на рисунке, величина /V, практически не изменяется при увеличении моделируемого значения ПФК0.оо/МПК даптомицина и ванкомицина (R2 0,44 и 0,31, соответственно) Оба интегральных параметра — АВВС и /Е - одинаково четко коррелируют с ПФКо-ю/МПК даптомицина (R2 0,84 и 0,81, соответственно) и ванкомицина (Л2 0,92 и 0,90, соответственно)

Проведенный анализ свидетельствует о меньшей информативности параметров Г90%, Г99% и Nx, традиционно используемых при анализе кинетических кривых гибели/роста бактерий под действием антибиотиков, по сравнению с таковой параметров Л^„„, АВВС и Поскольку точечные параметры, к числу которых относится и AU„, характеризуются меньшей точностью, чем интегральные (АВВС и /Е), которые отражают особенности кинетической кривой в целом, АВВС и /Е обладают преимуществами перед Л'мин Вместе с тем, параметр /Е предпочтительнее параметра АВВС, поскольку отражает всю совокупность наблюдаемых процессов - от гибели клеток до завершения периода их вторичного роста, - а АВВС может отражать лишь фрагмент кинетической кривой

Полученные результаты сопоставления применимости различных параметров для установления зависимости «ПФК/МПК - антимикробный эффект» согласуются с описанными ранее в фармакодинамических исследованиях со фторхинолонами [Firsov A A at al, 1997] В связи с этим, именно параметр /Е был использован в дальнейшей работе

Фармакодинамика даптомицина и ванкомицина при моделировании фармакокинетических профилей, наблюдаемых после многократного введения

антибиотиков

С целью приближения к реальным условиям клинического применения антибиотиков (7-10-дневные курсы) фармакодинамику даптомицина и ванкомицина исследовали при их ежедневном введении в динамическую систему на протяжении 5 дней, варьируя значения ПФК24/МПК даптомицина и ванкомицина, вводимых соответственно 1 и 2 раза в сутки в 16-кратном диапазоне

Как видно на рис 6, кинетические кривые изменения численности клеток S aureus 866 под воздействием даптомицина и ванкомицина имели сходный характер По мере повышения ПФК24/МПК от 16 до 256 ч, величина ZVM„„ систематически уменьшалась, а время возобновления роста бактерий возрастало Особенно отчетливо это прослеживалось применительно к воздействию на клетки S aureus 866 ванкоми-

с s

а

S

ш о

Ьй Л I-о о

X X 0) С о S 3"

256

2-

24

48

120

144

72 96

Время, ч

Рис 6 Кинетика изменения численности клеток S aureus 866 под действием даптомицина и ванкомицина Стрелками указаны моменты введения антибиотиков, цифрами у кривых -моделируемые значения ПФК24/МПК (в часах) Остальные обозначения те же, что на рис 1

цина Аналогичная закономерность отмечена и в опытах с S aureus 10, хотя кинетические кривые носили менее регулярный характер

Для количественной оценки антимикробного эффекта использовали параметр /е, который в этом случае отражает кумулятивный эффект, достигающийся к концу

курсового введения антибиотика Для каждой пары антибиотик - микроорганизм установлена зависимость /Е от ПФК24/МПК, которая отражает систематическое увеличение антистафилококкового эффекта по мере повышения ПФК24/МПК

При каждом из смоделированных значений ПФК24/МПК эффекты дапто-мицина и ванкомицина, выраженные параметром /Е, практически не отличались (для S aureus 866) или отличались незначительно (для S aureus 10) Это позволило объединить данные по обоим штаммам S aureus и антибиотикам и аппроксимировать их уравнением сигмоиды (рис 7)

ПФК24/МПК, ч

Рис 7 Зависимость антистафилококковых эффектов даптомицина и ванкомицина от моделируемого значения ПФК24/МПК, описанная уравнением [3] Обозначения те же, что на рис 1

Ввиду штаммо-независимого характера зависимости «/е - ПФК24/МПК», она может быть использована для прогнозирования антимикробных эффектов даптомицина и ванкомицина при терапевтических значениях ПФК24/МПК (создаются при клинических дозах антибиотиков) в отношении гипотетического штамма S aureus с МПК, равной МПК90

С учетом приведенных в литературе значений МПК90 (1 мкг/мл для даптомицина и 2 мкг/мл для ванкомицина [Snydman D.R et al, 2000]) терапевтические значения ПФК24/МПК для даптомицина составляют 380 ч (доза 4 мг/кг) и 570 ч (6 мг/кг), а для ванкомицина (2x1 г) - 200 ч Как видно на рис 7, прогнози-

руемая эффективность антибиотиков практически одинакова при столь разных значениях ПФК24/МПК, поскольку все они попадают в диапазон, соответствующий фазе насыщения эффекта

Устойчивость S aureus к даптомицину и ванкомицину при моделировании их фармакокннетических профилей in vitro

С целью оценки влияния ПФК24/МПК на селекцию стафилококков, устойчивых к даптомицину и ванкомицину, моделируемые значения ПФК24/МПК были выбраны так, чтобы соответствующие максимальные концентрации антибиотиков были близки к МПК, находились в пределах между МПК и МПКм, т е внутри ОСМ, или превышали МПКм Три фармакокинетические кривые, отвечающие этому критерию в наибольшей степени, показаны на рис 8 (а) - на примере штамма 5 aureus 866 при 5-дневном введении даптомицина На том же рисунке представлены результаты популяционного анализа (рис 8 (б), (в)) и динамика изменения чувствительности S aureus 866 к даптомицину (рис 8 (г))

Как видно на левой панели рисунка, при минимальном значении ПФК24/МПК, когда уровни антибиотика едва достигали МПК и на протяжении большей части интервала дозирования были вне ОСМ, ни селекции резистентных мутантов, ни потерь в чувствительности S aureus 866 не было Подобные результаты были получены и при максимальном значении ПФК24/МПК, когда уровни даптомицина превышали МПКм и также были за пределами ОСМ (правая панель рисунка) В то же время, при концентрациях даптомицина, находящихся внутри ОСМ на протяжении большей части интервала дозирования (ПФК24/МПК = 32 ч) происходила селекция даптомицино-устойчивых клеток и снижение их чувствительности, выраженное отношением МПК, (значение МПК в момент времени t) к МПКИСХ - центральная панель рис 8

Аналогичная взаимосвязь наблюдалась между селекцией антибиотико-устойчивых клеток S aureus 866 и моделируемым значением ПФК24/МПК ванкомицина

Подобным образом, наиболее выраженная селекция резистентных клеток S aureus 10 с сопутствующим снижением их чувствительности к даптомицину или ванкомицину происходила только тогда, когда их концентрации были внутри ОСМ, но не вне его

Для установления зависимости между селекцией резистентных мутантов S aureus от ПФК24/МПК, результаты популяционного анализа были выражены лога-

О 24 48 72 36 1 20

0 24 48 72 96 120 Время, ч

0 24 48 72 96 120

Рис 8 Фармакокинетические профили даптомицина (а), а также кривые роста клеток S aureus 866 на чашках, содержащих даптомицин в концентрациях 2хМПК (б) и 4хМПК (в) и динамика изменения чувствительности S aureus 866, выраженная отношением МПК/МПК„СХ (г) Цифрами на графиках обозначены моделируемые значения ПФК24/МПК (в часах)

рифмом отношения максимальной численности клеток стафилококка {Nuакс) в агари-зованной среде, содержащей даптомицин или ванкомицин, к исходной численности жизнеспособных клеток (Nmx) Динамика изменений чувствительности стафилококков под воздействием антибиотиков была выражена отношением МПКк0„ к МПКИСХ

Как видно на рис 9, применительно к селекции клеток S aureus 866 и 10, устойчивых к 2хМПК даптомицина или ванкомицина, зависимость логарифма отношения Л'макс/Л'исх от моделируемого значения ПФК24/МПК оказалась сходной (рис 9 (а))

По мере повышения ПФК24/МПК значения lg (/VMaKC//V„C)<) вначале увеличивались, достигая максимума в интервале от 32 до 64 ч, а затем уменьшались

Это обстоятельство позволило сгруппировать данные и аппроксимировать их равнением [4]

Подобно описанному для фторхинолонов [Фирсов А А и соавт, 2004, Firsov A A et al, 2003], график зависимости lg (iVMAx) ОТ ПФК24/МПК для липо- и гликопептида имеет куполообразную форму Та же форма была характерна и для зависимости «lg (NmJNmx) -ПФК24/МПК» применительно к клеткам, устойчивым к 4хМПК даптомицина или ванкомицина (рис 9 (б)), с максимумом в интервале значений ПФК24/МПК от 32 ч до 64 ч Подобная зависимость от ПФК24/МПК была установлена и для отношения МПКко„/МПК„сх (рис 9 (в))

Как видно на рис 9, селекция устойчивых клеток S aureus происходит в интервале значений ПФК24/МПК, ограниченном 30 и 100-200 ч («диапазон резистентности») При меньших и более высоких значениях ПФК24/МПК резистентность стафилококков не выявляется

Рис 9 Зависимость селекции клеток S aureus,

устойчивых к 2хМПК (а) и 4*МПК (б) BW4H штаммо-независимы-

даптомицина и ванкомицина, а также ми, установленные соотношения

изменений чувствительности (в), от м резистентностью и ото-

моделируемого значения ПФК24/МПК,

описанная уравнением [4] Обозначения те же, шением ПФК24/МПК, могут быть что на рис 1 использованы для прогнозирования

селекции устойчивых мутантов любого штамма S aureus, в том числе уже

ю

200 380570 100 1000

упомянутого выше гипотетического штамма, для которого значения МПК даптоми-цина и ванкомицина равны соответствующим значениям МПК90

Как видно на рис 9, терапевтические значения ПФК24/МПК даптомицина (380 и 570 ч) для такого штамма находятся за пределами «диапазона резистентности» Что касается терапевтического значения ПФК24/МПК ванкомицина (200 ч), оно практически совпадает с верхней границей указанного диапазона В связи с этим вероятность селекции резистентных стафилококков при ванкомицинотерапии выше, чем при использовании даптомицина

Анализ описанных выше результатов свидетельствует об относительно слабой выраженности процессов селекции устойчивых мутантов S aureus Так, к концу 5-дневного введения даптомицина численность клеток, резистентных к 2* и 4><МПК антибиотика, возрастала лишь на 2-3 порядка, а МПК- в 6-8 раз (2-3 шага при серийных разведениях)

Для того чтобы понять, чреваты ли эти изменения дальнейшим отбором резистентных мутантов и снижением их чувствительности при более длительном применении даптомицина, в динамической системе были смоделированы режимы 10-дневного введения антибиотика при значениях ПФК24/МПК, которые ассоциировались с максимальной селекцией мутантов в 5-дневных экспериментах (ПФК24/МПК = 32 или 64 ч)

Как видно на рис 10(a), на всем протяжении 10-дневного курса введения даптомицина (ПФК24/МПК = 64 ч) численность клеток S aureus АТСС 43300,

Время, сутки

Рис 10 Кинетические кривые изменения численности клеток 5 аигеи.ч ЛТСС 43300 (а), на чашках, не содержащих (ОхМПК) и содержащих даптомицин (2хМПК и 4хМПК), а также динамика изменений чувствительности клеток (б) при моделировании значения ПФК24/МПК, равного 64 ч

устойчивых к 2х и 4хМПК антибиотика, систематически возрастала, достигая к концу эксперимента ~107 КОЕ/мл Если на 5-й день наблюдения она превышала исходную на 4-5 порядков, то на 10-й - на 6 порядков Сопутствующие изменения чувствительности клеток S aureus АТСС 43300 к даптомицину также характеризовались постепенным повышением значений МПК - в 9 раз как на 5-й, так и на 10-й день (рис 10 (б)) При моделировании значения ПФК24/МПК даптомицина, равного 32 ч, изменения численности резистентных клеток стафилококка и их чувствительности к даптомицину были аналогичными

Таким образом, относительно небольшая продукция резистентных стафилококков, наблюдаемая при моделировании 5-дневного введения даптомицина, является предвестником значительного возрастания их численности при последующих введениях С другой стороны, удлинение продолжительности введения даптомицина с 5 до 10 дней сопровождалось лишь количественными (но не качественными) изменениями в популяции - чем продолжительнее воздействие антибиотика, тем больше устойчивых мутантов и тем ниже чувствительность Более того, различия в потерях чувствительности стафилококка на 5-й и 10-й дни оказались относительно незначительными

Анализ полученных данных позволяет предположить, что 5-дневные эксперименты достаточно объективно отражают динамику даптомицино-резистентности в бактериальной популяции

Фармакодинамика даптомицина и его способность к предотвращению селекции резистентных стафилококков при сочетанном применении с

рифампицином

Как было отмечено выше, селекция стафилококков, резистентных к даптомицину и ванкомицину, наблюдалась при значениях ПФК24/МПК, равных 32 - 64 ч, которые ниже соответствующих терапевтических значений ПФК24/МПК90, по крайней мере, для даптомицина Вместе с тем, в процессе клинического применения даптомицина терапевтические значения ПФК^/МПКзд могут постепенно снижаться (как это произошло в результате длительного использования ванкомицина) В таких случаях единственным выходом из положения является комбинированная антибиотикотерапия Для того чтобы оценить перспективы снижения риска развития устойчивости стафилококков к даптомицину при его сочетанном применении с другими противо-стафилококковыми антибиотиками, изучена селекция резистентных мутантов на примере комбинации даптомицина с рифампицином

Фармакодинамическое взаимодействие даптомицина (ПФК24/МПК = 64 ч) и рифампицина (ПФК24/МПК = 100 и 500 ч) выразилось в значительно более быстром и резком снижении численности чувствительных к ним клеток S aureus 866, чем при использовании антибиотиков по отдельности (рис 11 (а))

Время, ч

Рис 11 Кинетика изменения численности клеток S aureus 866 под действием даптомицина (ДАП) и рифампицина (РИФ), используемых по отдельности и в комбинации а) - чувствительных, б) - устойчивых к 4хМПК даптомицина, в) -устойчивых к 16хМПК рифампицина Цифры в скобках отражают моделируемое значение ПФК24/МПК (в часах)

В результате сочетанного применения даптомицина с рифампицином не только снижалась минимальная численность жизнеспособных клеток S aureus 866, но и увеличивалась длительность проявления антимикробного эффекта

Та же закономерность была отмечена и для S aureus АТСС 43300 При этом влияние рифампицина на наблюдаемый антимикробный эффект было тем большим, чем выше была доля рифампицина в комбинации Так, при сочетанном применении даптомицина с рифампицином в большей дозе (ПФК24/МПК = 500 ч) их антимикробный эффект (/Е) в отношении S aureus 866 возрастал в 15 раз, а в меньшей дозе (ПФК24/МПК = 100 ч) - в 10 раз по сравнению с величиной /Е при введении даптомицина без рифампицина Применительно к S aureus АТСС 43300, соответствующее увеличение /Е было 60- и 30- кратным

Сочетанное применение даптомицина с рифампицином приводило к замедлению (S aureus АТСС 43300) или к предотвращению (S aureus 866) селекции даптомицинорезистентных мутантов Если на фоне введения даптомицина численность устойчивых мутантов 5 aureus 866 неуклонно возрастала, то в присутствии рифампицина она снижалась относительно исходного уровня (рис 11 (б)) Соответственно, величина AUBCu, характеризующая интенсивность продукции мутантов, устойчивых к 4хМПК даптомицина, при моделировании комбинированного применения антибиотиков была меньше установленной при введении даптомицина отдельно на 5-34% (S aureus АТСС 43300) и 64-66% (S aureus 866)

В целом, комбинация даптомицина с рифампицином сильнее снижала селекцию даптомицинорезистентных мутантов S aureus 866, чем мутантов S aureus АТСС 43300, причем эффективность этой комбинации не зависела от моделируемого значения ПФК24/МПК рифампицина

В свою очередь, даптомицин оказывал воздействие на процессы селекции рифампицинорезистентных стафилококков Как видно на рис 11 (в), в отличие от быстрого замещения чувствительных к рифампицину клеток S aureus 866 устойчивыми, отмеченного при его введении отдельно, численность рифампицинорезистентных мутантов при сочетанном применении рифампицина с даптомицином незначительно отличалась от исходной на протяжении всего периода наблюдения Аналогичный эффект комбинации отмечен в экспериментах с S aureus АТСС 43300 Под влиянием даптомицина величина AUBCu, характеризующая численность мутантов S aureus АТСС 43300 и S aureus 866, устойчивых к 16хМПК рифампицина, снижалась соответственно на 59-71% и 80-82%

выводы-

1 На примере изучения фармакодинамики даптомицина и ванкомицина в динамической системе in vitro доказано, что оптимальным параметром, отражающим степень и длительность антистафилококкового эффекта, является площадь между кривыми изменения численности колониеобразующих единиц в присутствии и в отсутствие антибиотика (¡¿)

2 При моделировании режимов многократного введения даптомицина и ванкомицина установлена зависимость h от отношения площади под фармакокинетической кривой в пределах 24 ч к минимальной подавляющей концентрации (ПФК24/МПК), которая оказалась нсспсцифичной как для штаммов Staphylococcus aw eus, так и для антибиотиков

3 Зависимость «/Е - ПФК24/МПК» позволяет осуществлять прогноз эффективности даптомицина и ванкомицина при стафилококковой инфекции, согласно которому их терапевтические значения ПФК24/МПК могут обеспечивать одинаковый антистафилококковый эффект

4 Оптимизированы условия выявления мутантов S aureus, резистентных к даптомицину и ванкомицину, - моделирование 5-дневного введения антибиотиков, популяционный анализ с ежедневной оценкой антибиотико-чувствительности

5 Доказано, что селекция резистентных стафилококков происходит только при концентрациях антибиотиков, попадающих в «окно селекции мутантов» (ОСМ)

6 Установлена зависимость резистентности от ПФК24/МПК, инвариантная относительно бактериального штамма и антибиотика

7 Прогнозированное с помощью указанной зависимости антимутантное значение ПФК24/МПК (200 ч) для даптомицина оказалось в 2-3 раза ниже терапевтических (380-570 ч), а для ванкомицина - соизмеримым с терапевтическим (200 ч)

8 Продемонстрирована принципиальная возможность предотвращения селекции даптомицинорезистентных стафилококков путем сочетанного применения даптомицина с рифампицином при субтерапевтических значениях ПФК24/МПК

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Востров С Н , Лубенко И Ю , Смирнова М.В , Фирсов А А Прогноз развития устойчивости стафилококков к 8 антибиотикам по концентрации, предотвращающей селекцию мутантов // Клин Микробиол Антимикроб Терапия, 2005, т 7 (Прилож 1), с 18

2 Firsov А А , Alferova I V , Smirnova М V , Lubenko I Yu , Vostrov S N , Mirchink E P , Portnoy Yu A , Zinner S H Relative abilities of daptomycin (DAP) and vancomycin (VAN) to prevent the enrichment of resistant Staphylococcus aureus mutants in an in vitro dynamic model // Clin Microbiol Infection, 2005, v 11, Suppl 2, p 518

3 Smirnova M.V., Alferova I V , Lubenko I Yu , Vostrov S N , Zinner S H , Firsov A A Daptomycin and vancomycin pharmacodynamics with differentially susceptible Staphylococcus aureus multiple-dose simulations using an in vitro dynamic model Hi Chemotherapy, 2005, v 17, Suppl 3,p 8

4 Смирнова M.B., Алферова И В , Востров С Н , Лубенко И Ю , Портной Ю А , Фирсов А А Сравнительная фармакодинамика антистафилококкового эффекта даптомицина и ванкомицина в динамической системе in vitro // Клин Микробиол Антимикроб Терапия, 2006, т 8, №2, с 186-192

5 Firsov А А , Smirnova M.V., Lubenko I Yu , Vostrov S N , Portnoy Yu A Testing the mutant selection window hypothesis with Staphylococcus aureus exposed to daptomycin and vancomycin in an in vitro dynamic model // J Antimicrob Chemotherapy, 2006, Vol 58 (6), p 1185-1190

6 Smirnova M.V., Lubenko 1 Yu, Portnoy Y A, Zinner S H , Firsov A A Concentration-response relationships as a basis for choice of the optimal endpoints of the antimicrobial effect daptomycin and vancomycin pharmacodynamics with staphylococci in an m vitro dynamic model // Int J Antimicrob Agents, 2007, Vol 29, p 165-169

Актуальность проблемы. Широкое распространение антибиотико-устойчивых возбудителей инфекционных заболеваний диктует необходимость создания новых антибиотиков, способных воздействовать не только на чувствительные, но и на резистентные бактерии. Это обстоятельство потребовало внести серьезные коррективы в методологию фармакодинамических исследований, в частности предусмотреть возможность прогнозирования и предотвращения процессов селекции резистентных мутантов при различных режимах введения антибиотика. Именно поэтому для достижения указанных целей все чаще применяются динамические системы, которые позволяют изучать фармакодинамику антибиотиков in vitro и оценивать их эффективность при фармакокинетически обусловленных изменениях концентрации препаратов [Фирсов A.A. и соавт., 1989; Bergan Т. 1986; Blaser J., Zinner S.H. 1987; Firsov A.A. et al., 2007]. Благодаря использованию таких систем оказалось возможным успешно прогнозировать эквиэффективные уровни и дозы новых фторхинолонов [Firsov A.A. et al., 1998 и 2000; Vostrov S.N. et al., 2000]; a также установить зависимость селекции резистентных стафилококков [Фирсов A.A. и соавт., 2003; Firsov A.A. et al., 2003], пневмококков [Zinner et al., 2003] и псевдомонад [Tam V.H. et al., 2005] от отношения площади под фармакокинетической кривой в пределах 24 ч (ПФК24) фторхинолона к его МПК (ПФК24/МПК). Кривые зависимости резистентности к фторхинолонам от ПФК24/МПК по своей форме напоминали гауссову кривую, что согласуется с недавно выдвинутой гипотезой об «окне селекции мутантов» (ОСМ - «mutant selection window») [Zhao X., Drlica К., 2001]. Согласно этой гипотезе селекция устойчивых мутантов наиболее вероятна, когда концентрации антибиотика попадают в ОСМ, ограниченный снизу уровнем МПК, а сверху - минимальной концентрацией, предотвращающей рост устойчивых мутантов (МГЖм - MPC).

В связи с этим проверка гипотезы ОСМ для антибиотиков других групп, в частности новых липо- и гликопептидов, а также оценка их фармакодинамических свойств в динамических системах in vitro весьма актуальны.

Цель работы. Прогнозирование антистафилококкового эффекта нового липопептидного антибиотика даптомицина при моделировании его терапевтических концентраций, а также прогнозирование способности даптомицина предотвращать селекцию резистентных мутантов при моно- и комбинированной терапии.

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:

1. Выбрать оптимальный метод количественной оценки антимикробного эффекта на примере анализа кинетики гибели и вторичного роста стафилококков под действием липопептидного антибиотика даптомицина и гликопептидного антибиотика ванкомицина в динамической системе in vitro.

2. Установить зависимость антистафилококкового эффекта даптомицина и ванкомицина от моделируемого значения ПФК24/МПК на основе сравнительного изучения их фармакодинамики.

3. Оптимизировать условия выявления резистентных стафилококков in vitro и установить зависимость их селекции от ПФК24/МПК даптомицина (при его введении отдельно и в сочетании с рифампицином) и ванкомицина.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований:

1. Теоретически обоснован интегральный метод количественной оценки антимикробного эффекта даптомицина и ванкомицина в динамической системе, моделирующей их фармакокинетику у человека, по площади между кривыми гибели/вторичного роста бактерий в присутствии антибиотика и их роста в его отсутствие (интенсивность эффекта - параметр /е).

2. Впервые установлена инвариантная относительно бактериального штамма и антибиотика зависимость антистафилококкового эффекта даптомицина и ванкомицина, выраженного параметром Те, от отношения ПФК24/МПК.

3. Разработаны новые методические подходы к выявлению in vitro даптомицино- и ванкомицинорезистентных мутантов Staphylococcus aureus и установлена зависимость их селекции от моделируемого значения ПФК24/МПК.

4. На основе зависимости от ПФК24/МПК численности колоний S. aureus, резистентных к антибиотику, или изменений в МПК после многократного введения даптомицина и ванкомицина установлено, что наибольшие потери в чувствительности к ним стафилококков, а также максимальная селекция резистентных мутантов происходят при значениях ПФК24/МПК, равных 32-64 ч, которые ниже терапевтических.

5. Доказана принципиальная возможность подавления селекции дапто-мицинорезистентных мутантов S. aureus при сочетанном применении даптомицина с рифампицином.

Научно-практическая значимость работы.

1. Интегральный метод количественной оценки антимикробного эффекта, апробированный для даптомицина и ванкомицина, может быть использован при фармакодинамическом изучении других гликопептидов.

2. Благодаря инвариантности зависимости между /Е и ПФК24/МПК относительно- бактериального- штамма она может быть использована- для-прогнозирования действия гликопептидов на репрезентативные штаммы S. aureus, в частности на те, для которых МПК равна МПК50 или МПК90. По результатам такого прогноза, эффективность даптомицина в терапевтических дозах примерно равна эффективности ванкомицина.

3. Разработанные методические подходы к выявлению и прогнозированию селекции мутантов S. aureus, резистентных к даптомицину и ванкомицину, по величине ПФК24/МПК могут быть использованы и для других гликопептидов.

4. Продемонстрированное подавление селекции даптомицинорезистентных мутантов при сочетанном применении даптомицина с рифампицином является предпосылкой для испытаний указанной комбинации в клинике.

Выводы:

1. На примере изучения фармакодинамики даптомицина и ванкомицина в динамической системе in vitro доказано, что оптимальным параметром, отражающим степень и длительность антистафилококкового эффекта, является площадь между кривыми изменения численности колониеобразующих единиц в присутствии и в, отсутствие антибиотика

4).

2. При моделировании режимов многократного введения даптомицина и ванкомицина установлена зависимость 1Е от отношения площади под фармакокинетической кривой в пределах 24 ч к минимальной подавляющей концентрации (ПФК24/МПК), которая оказалась неспецифичной как для штаммов Staphylococcus aureus, так и антибиотиков.

3. Зависимость «/Е - ПФК24/МПК» позволяет осуществлять прогноз эффективности даптомицина и ванкомицина при стафилококковой инфекции, согласно которому! их терапевтические значения ПФК24/МПК могут обеспечивать одинаковый антистафилококковый эффект.

4. Оптимизированы условия выявления мутантов S. aureus, резистентных к

- даптомицину " и" ванкомицину, —- моделирование-5-дневного -введения-антибиотиков, популяционный анализ с ежедневной оценкой антибиотико-чувствительности.

5. Доказано, что селекция резистентных стафилококков происходит только при концентрациях антибиотиков, попадающих в «окно селекции мутантов» (ОСМ).

6. Установлена зависимость резистентности от ПФК24/МПК, инвариантная относительно бактериального штамма и антибиотика.

7. Прогнозированное с помощью указанной зависимости антимутантное значение ПФК24/МПК (200 ч) для даптомицина оказалось в 2-3 раза ниже терапевтических (380-570 ч), а для ванкомицина - соизмеримым с терапевтическим (200 ч).

8. Продемонстрирована принципиальная возможность предотвращения селекции даптомицинорезистентных стафилококков путем сочетанного применения даптомицина с рифампицином при субтерапевтических значениях ПФК24/МПК.