Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Профилактика реакции трансплантат против хозяина у больных гемобластозами после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с помощью мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток д

005051756

На правах рукописи

Петинати Наталия Арнольдовна

Профилактика реакции трансплантат против хозяина у больных гемобластозами после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с помощью мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток донора

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 АПР 2013

Москва 2013

005051756

Работа выполнена в отделении высокодозной химиотерапии и трансплантации костного мозга Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор Савченко Валерий Григорьевич

доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Борис Владимирович (Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И. П. Павлова)

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Румянцев Сергей Александрович (Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачёва)

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П. А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 13 марта 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан « 23_у> 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Е. Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ал-ло-ТГСК) является единственным методом излечения многих гемобластозов. Однако ее проведение связано с развитием тяжелых осложнений. Одним из основных осложнений алло-ТГСК является реакция трансплантат против хозяина (РТПХ), влияющая на качество жизни и продолжительность жизни больных после алло-ТГСК.

С 1980 года за счет уменьшения смертности от инфекционных осложнений увеличилась выживаемость пациентов после алло-ТГСК, однако частота рецидивов и частота развития РТПХ не изменились. Смертность, связанная с трансплантацией, напрямую зависит от степени тяжести развившейся РТПХ. Следует учитывать также, что РТПХ тесно связана с реакцией трансплантат против опухоли, и ее развитие значительно снижает риск рецидива заболевания.

С целью профилактики РТПХ применяют различные препараты, включая ингибиторы кальциневрина (циклоспорин А, такролимус), антиметаболиты (метотрексат, микофенолата мофетил), глюкокортикостероиды (пред-низолон, метилпреднизолон), сиролимус, антитимоцитарный глобулин (АТГ), моноклональные антитела (алемтузумаб, даклизумаб), циклофосфа-мид. Действие иммуносупрессивных препаратов только на одно звено развития РТПХ приводит к недостаточной эффективности профилактики одним препаратом. Следствием же сочетанного применения препаратов является увеличение токсичности. Несмотря на проводимую профилактику, у 19-74% пациентов после алло-ТГСК развивается острая РТПХ II—IV степени и у 3076% - хроническая РТПХ.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) обладают уникальными иммуномодулирующими свойствами, которые были подтверждены in vitro и in vivo. Эти клетки могут быть культивированы, их источником могут служить костный мозг, жировая ткань, эмбриональная печень и др. При введении в организм ММСК не вызывают иммунного ответа. Эти характеристики сделали возможным применение ММСК в клинике. В настоящее время проводятся исследования по применению ММСК при таких заболеваниях, как боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, язвенный колит, болезнь Крона, системная красная волчанка, полимиозит и дерматомиозит, сахарный диабет 2 типа. Множество исследований посвящено лечению РТПХ с помощью ММСК. В данной работе представлены результаты проспективного рандомизированного исследования по профилактике РТПХ с помощью ММСК в сравнении с классическими режимами.

Цель работы

Изучить эффективность профилактики реакции трансплантат против хозяина у больных гемобластозами после трансплантации аллогенных ство-

ловых гемопоэтических клеток с помощью мультипотентных мезенхималь-ных стромальных клеток донора.

Задачи исследования

1. Оценить эффективность введения мультипотентных мезенхималь-ных стромальных клеток больным гемобластозами после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток в дозе 1х106/кг массы тела в период восстановления количества лейкоцитов до 1х109/л для профилактики острой реакции трансплантат против хозяина.

2. Изучить побочные эффекты введения мультипотентных мезенхи-мальных стромальных клеток после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с целью профилактики реакции трансплантат против хозяина.

3. Оценить влияние введения мультипотентных мезенхимапьных стромальных клеток в период восстановления числа лейкоцитов на частоту развития хронической реакции трансплантат против хозяина.

4. Определить влияние введения донорских мультипотентных мезен-химальных стромальных клеток на частоту развития посттрансплантационных рецидивов, инфекционных осложнений и отторжения трансплантата.

5. Проанализировать экспрессию генов интерлейкина 6, интерлейки-на 10, фактора комплемента Н, индолеамин-2,3-диоксигеназы, простаглан-дин Е синтетазы, макрофагального колониестимулирующего фактора в мультипотентных мезенхимапьных стромальных клетках, полученных от разных доноров.

Научная новизна

В данной работе впервые представлены результаты проспективного рандомизированного исследования, в котором показана эффективность профилактики острой РТПХ у реципиентов алло-ТГСК от НЬА-идентичных родственных доноров с помощью ММСК, полученных от донора гемопоэтических клеток. Подтверждена безопасность (отсутствие долгосрочных и угрожающих жизни осложнений) введения ММСК. Показано, что введение ММСК с целью профилактики РТПХ не увеличивает частоту рецидивов, инфекционных осложнений и отторжения трансплантата. Установлено, что введение ММСК в период восстановления числа лейкоцитов не влияет на частоту развития хронической РТПХ. Доказано, что ММСК, полученные от разных доноров, существенно различаются по экспрессии генов ИЛ-6, ИЛ-10, фактора комплемента Н, ГО01, КСФ1, РТСЕБ. Повышенный уровень экспрессии ИЛ-б в сочетании с повышением уровня экспрессии пероксисо-много активированного пролифератором рецептора т (РРАЛт) и возрастом донора старше 40 лет могут являться факторами, снижающими уровень им-муномодулирующей активности ММСК.

Практическая ценность работы

Предложен новый метод профилактики реакции трансплантат против хозяина. Эффективность этого метода значительно выше, чем у ранее применявшихся. Эффективная профилактика реакции трансплантат против хо-

зяина позволит снизить затраты на лечение больных с данным осложнением, сократить длительность госпитализации после алло-ТГСК.

Внедрение результатов исследования в практику

Предложенный метод профилактики применяется в отделении высоко-дозной химиотерапии и трансплантации костного мозга ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Получен Патент РФ №2454247 «Способ профилактики острой реакции трансплантат против хозяина после аллогенной трансплантации костного мозга».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Введение ММСК в дозе 1х10б/кг массы тела в период восстановления количества леикоцитов до 1х109/л является эффективным методом профилактики острой РТПХ.

2. Введение ММСК в дозе 1х106/кг массы тела в период восстановления количества лейкоцитов до 1х109/л не влияет на частоту развития хронической РТПХ, рецидивов, инфекционных осложнений и отторжения трансплантата.

3. ММСК, полученные от разных доноров, существенно различаются по экспрессии генов, участвующих в иммунном ответе.

Структура работы

Диссертация изложена на 90 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 5 рисунками. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, библиографического списка, включающего 165 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В проспективное рандомизированное исследование было включено 49 пациентов — 26 женщин и 23 мужчины, в возрасте от 17 до 63 лет (медиана возраста 34 года), которым была выполнена аллогенная трансплантация стволовых гемопоэтических клеток от НЬА-идентичных сиблингов в отделении высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга Гематологического научного центра МЗ РФ (генеральный директор - академик РАМН, профессор В. Г. Савченко, руководитель отделения -д.м.н. Е. Н. Паровичникова) в период с октября 2008 года по июнь 2012 года. Исследование было одобрено Этическим комитетом Гематологического научного центра МЗ РФ. Все пациенты, включенные в исследование, подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Всего в исследование было включено 25 пациентов с острым миелоб-ластным лейкозом (ОМЛ), 9 пациентов с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), 2 пациента с острым недифференцированным лейкозом (ОнедЛ), 7 -с хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ), 4 пациента с миелодиспласти-ческим синдромом (МДС), 1 пациент с анаплазированной Т-клеточной лим-фосаркомой и 1 - с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ). Из 25 пациентов с

ОМЛ у 16 был миелобластный вариант заболевания (М0/М1/М2 вариант по классификации FAB), у 7 был миеломонобластный вариант заболевания (М4 по классификации FAB), у 1 - острый промиелоцитарный лейкоз (МЗ по классификации FAB), у 1 - острый эритромиелоз (Мб по классификации FAB). Из 6 пациентов с ОЛЛ в двух случаях определялась филадельфийская хромосома, у двух пациентов был Т-клеточный вариант заболевания.

У трех пациентов с ОМЛ и одного пациента с ОЛЛ трансплантация была выполнена вне ремиссии заболевания, у остальных пациентов ремиссия была достигнута до трансплантации.

Пациенты были рандомизированы на 2 группы: группа стандартной профилактики - 24 человека, группа стандартной профилактики + ММСК -25 человек. Рандомизацию производили в день алло-ТГСК блочным методом. Больным в первой группе проводили стандартную профилактику РТПХ, а во второй группе, кроме стандартной профилактики РТПХ, вводили ММСК. Группы больных были сопоставимы по возрасту, полу, основному заболеванию, проведенному режиму кондиционирования, фазе заболевания в момент проведения алло-ТГСК.

Миелоаблативное кондиционирование проводили 35 пациентам. Оно включало бусульфан и циклофосфан. Немиелоаблативное кондиционирование 10 пациентам в ремиссии проводили флударабином, бусульфаном и АТГ. Трем пациентам с ОМЛ, у которых до алло-ТГСК не была достигнута ремиссия заболевания, проводилось немиелоаблативное кондиционирование флударабином, BCNU, мелфаланом и АТГ. У пациента с рецидивом ОЛЛ кондиционирование включало флударабин, идарубицин, цитозар и бусульфан.

Донорами костного мозга в 48 случаях были HLA-идентичные MLC-ареактивные сиблинги, и в одном случае донор отличался по двум HLA антигенам I класса.

Стандартная профилактика РТПХ включала метотрексат и циклоспорин у пациентов с острыми лейкозами, МДС и ХЛЛ, которым предтранс-плантационное кондиционирование проводили в миелоаблативном режиме; у пациентов с ХМЛ в схему профилактики дополнительно включали предни-золон. Пациентам, предтрансплантационное кондиционирование которым проводили в немиелоаблативном режиме, дополнительно назначали мофетил микофенолат. Трем пациентам с ОМЛ, у которых до алло-ТГСК не была достигнута ремиссия заболевания, профилактику РТПХ проводили мето-трексатом и циклоспорином. Пациенту с рецидивом ОЛЛ профилактику РТПХ проводили только циклофосфаном.

ММСК были культивированы в лаборатории физиологии кроветворения Гематологического научного центра МЗ РФ (заведующая -д.б.н. Н. И. Дризе) из костного мозга доноров гемопоэтических клеток в стандартной среде для культивирования, состоящей из среды альфаМЕМ с 4% лизата тромбоцитов, полученного из тромбоконцентрата от донора костного мозга, не более 3 пассажей.

ММСК были охарактеризованы морфологически, иммунофенотипиче-ски. Кроме того, была подтверждена способность полученных ММСК к остеогенной и адипогенной дифференцировке in vitro. Все образцы были проверены на отсутствие контаминации патогенами.

ММСК вводили внутривенно струйно после восстановления количества лейкоцитов до 1х109/л. В случае криоконсервирования клетки размораживали при температуре 38°С. Средняя доза клеток составила 1,2 (0,9-1,65)х10в/кг массы тела. В 11 случаях клетки вводили непосредственно после культивирования, 8 образцов криоконсервировали и вводили после размораживания. Остальным 6 пациентам вводили одновременно и свежие, и размороженные ММСК в связи с необходимостью введения большой дозы клеток.

С целью диагностики реакции трансплантат против хозяина оценивали окраску кожных покровов, наличие диареи, исследовали концентрацию общего билирубина и активность щелочной фосфатазы в крови, оценивали функцию внешнего дыхания и выполняли компьютерную томографию легких. При появлении признаков поражения кожи и кишечника выполняли гистологическое исследование для подтверждения диагноза. Степень тяжести РТПХ определяли согласно классификации предложенной Glucksberg Н., 1974 г.

При анализе частоты развития хронической РТПХ учитывали пациентов, проживших более 150 дней после алло-ТГСК, которым в течение этого времени не проводили курсы химиотерапии и трансфузии лимфоцитов донора. В группе стандартной профилактики были также исключены из анализа пациенты, которым вводили ММСК с целью лечения острой РТПХ. Таким образом, в анализ частоты развития хронической РТПХ было включено 13 пациентов группы стандартной профилактики и 19 пациентов, которым с целью профилактики РТПХ вводили ММСК.

Анализ экспрессии генов проводили, как правило, в клетках первого пассажа.

Уровень экспрессии генов оценивали с помощью количественной Taqman полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с предшествующей обратной транскрипцией. Для этого из исследуемых ММСК выделяли рибодезоксинуклеиновые кислоты (РНК). Лизис клеток проводили денатурирующим раствором, содержащим 25мМ цитрата натрия (Sigma), 0,5% N-лаурил саркозина (ICN), 4М гуанидина изотиоцианата (ICN) и 0,1М Р-меркаптоэтанола (Sigma). Денатурированные белки, липиды и большую часть ДНК осаждали смесью фенола и хлороформа. Из полученного водного раствора РНК осаждали изопропанолом, промывали 75% этанолом и растворяли в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре. На основании полученной РНК впоследствии строили комплементарные цепи дезоксиорибонуклеиновых кислот (кДНК) с помощью обратной ревертазы (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя.

Наличие интересующего гена определяли с помощью специфических праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол». Исследовали гены интерлейкина 6, интерлейкина 10, фактора комплемента Н, IDOl, PTGES, КСФ1, PPARy. Все ПЦР проводили на приборе ABI Prism 7000 Applied Biosystems.

Для анализа полученных данных использовали метод дельта Ct. Для нормирования количества кДНК в исходных пробах использовали гены «домашнего хозяйства», кодирующие GAPDH и ß-актин.

Статистический анализ выполнен совместно с сотрудниками лаборатории биостатистики Гематологического научного центра МЗ РФ (заведующий - к.т.н. С. М. Куликов). При статистическом анализе данных использовали анализ выживаемости (метод Каплана - Мейера); результаты представлены в виде оценок вероятности (со стандартной ошибкой) и относительного риска (ОР) (с доверительным интервалом). Результаты считались статистически значимыми при р < 0,05. Данные об относительном уровне экспрессии исследуемых генов были представлены в виде средних значений и величины стандартного отклонения. Тесноту и направление корреляционной связи при анализе относительного уровня экспрессии генов определяли методом ранговой корреляции Спирмена. Значение коэффициента более 0,7 считали показателем высокой тесноты связи, от 0,4 до 0,7 - показателем умеренной тесноты связи. Результаты были обработаны с помощью программы Statistica version 6 (Stat Soft Inc).

Результаты исследования

Профилактика острой РТПХ

Значительные отличия наблюдались в частоте развития острой РТПХ у пациентов, получавших с целью профилактики ММСК, по сравнению с группой стандартной профилактики. В группе пациентов, получивших ММСК, острая РТПХ II—IV степени развилась только у 2 из 25 пациентов (8%). Во второй группе у 8 из 24 (33%) пациентов развилась РТПХ II—IV степени (Хи-квадрат = 4,84, р=0,0278). Вероятность острой РТПХ (на 100-дневном временном интервале) при отсутствии профилактики ММСК достигает 30%±10%, с профилактикой ММСК - 10%±5%; различие статистически значимо (р=0,05). Риск РТПХ без профилактики ММСК в 3,5 раза выше, чем с профилактикой ММСК (относительный риск 3,5; 95% доверительный интервал 2,4-5,0).

В двух случаях неэффективной профилактики с помощью ММСК не было выявлено общих клинических характеристик, которые можно было бы расценивать как факторы неблагоприятного прогноза. В первом случае пациент 40 лет страдал хроническим миелолейкозом, трансплантация была выполнена в первой хронической фазе. Донором был родной брат 56 лет. Число лейкоцитов возросло до 1х109/л на 17-й день после алло-ТГСК. ММСК были введены на 30-й день, а первые признаки РТПХ появились на 25-й день. Задержка введения ММСК была связана с медленным ростом клеток.

Во втором случае пациент 37 лет страдал острым лимфобластным лейкозом, трансплантация была выполнена во втором рецидиве заболевания. Донором был родной брат 41 года. Число лейкоцитов возросло до 1х109/л на 20-й день после алло-ТГСК. ММСК были введены на 20-й день, а первые признаки РТПХ появились на 46-й день. Вероятно, причины возникновения РТПХ в этих случаях различны.

Таким образом, введение ММСК в дозе 1 х106/кг массы тела в период восстановления количества лейкоцитов до 1х109/л является эффективным методом профилактики острой РТПХ.

Профилактика хронической РТПХ

Хроническая РТПХ развилась у 4 из 13 пациентов контрольной группы и у 5 из 19 пациентов, получавших для профилактики РТПХ ММСК. Таким образом, различий между двумя группами не выявлено.

Хроническая РТПХ - клинико-патологический синдром, проявляющийся спустя более чем 100 дней после алло-ТГСК. ММСК не обладают способностью к хомингу и быстро выводятся из организма. Профилактика хронической РТПХ с помощью ММСК может быть неэффективной в связи с ранним сроком введения, так как к моменту возникновения хронической РТПХ введенные клетки в организме пациента уже отсутствуют. Другой причиной может быть предполагаемый механизм развития хронической РТПХ, то есть, возможно, ММСК не способны влиять на образование ауто-реактивных Т-клеток или на участие В-клеток с продукцией антинуклеарных аутоантител. Таким образом, введение ММСК в дозе 1х106/кг массы тела в момент восстановления числа лейкоцитов до 1х109/л не влияет на частоту развития хронической РТПХ.

Оценка безопасности введения ММСК

ММСК культивировали в среде, содержащей лизированные тромбоциты, чтобы избежать образования антител к ЭТС и возможного переноса патогенов. Все образцы плазмы, обогащенной лизированными тромбоцитами, использовавшиеся при культивировании ММСК, были взяты от доноров ге-мопоэтических клеток. Показано, что допустимо введение ММСК, несовместимых по HLA-антигенам с реципиентом. Однако, учитывая данные некоторых исследователей о наличии слабой иммуногенности у ММСК ¡n vivo, в данном исследовании ММСК получали только из костного мозга доноров гемопоэтических клеток.

С целью профилактики РТПХ ММСК вводили 25 пациентам.

ММСК вводили в момент восстановления показателей крови после алло-ТГСК (лейкоциты более 1х109/л). Срок введения был выбран в связи с тем, что восстановление гемопоэза часто совпадает с манифестацией РТПХ.

ММСК вводили через 19-54 дня (медиана +28 день) после алло-ТГСК. Клетки вводили без предварительного введения антигистаминных препаратов и глюкокортикоидов. Температура тела пациента в момент введения ММСК не превышала 37,5°С.

У 9 (36%) пациентов в течение суток после введения ММСК отмечен кратковременный подъем температуры выше 38°С, у 6 (24%) - озноб. В некоторых случаях, возможно, повышение температуры не было связано с введением ММСК, поскольку максимальная температура после введения ММСК не превышала максимальную температуру за предыдущие сутки. Нельзя исключить, что в части случаев реакции были вызваны диметилсуль-фоксидом, присутствующим в размороженных клетках, а не самими ММСК.

Вероятно, предварительное введение антигистаминных средств позволит предотвратить повышение температуры. Во всех случаях повышение температуры было кратковременным и купировалось антигистаминными препаратами. Других осложнений выявлено не было.

Таким образом, введение ММСК, полученных от доноров гемопоэти-ческих клеток, безопасно и не вызывает серьезных осложнений.

Влияние введения ММСК на частоту рецидивов, отторжения трансплантата и инфекционных осложнений

Общая выживаемость в группе больных, которым вводили ММСК, составила 80% (20 пациентов), в контрольной группе - 62,5% (15 пациентов).

Летальность в первые 100 дней после трансплантации составила 4,2% (1 пациент) в контрольной группе, в группе с профилактикой ММСК все пациенты пережили ранний посттрансплантационный период. Рецидив в группе ММСК развился у 7 пациентов (28%), в контрольной группе - у 8 пациентов (33,3%). Различий в частоте отторжения трансплантата и инфекционных осложнений выявлено не было. Таким образом, введение ММСК не влияет на развитие рецидива, частоту отторжения трансплантата и инфекционных осложнений. Выживаемость в группе профилактики РТПХ с помощью ММСК выше, чем в контрольной группе.

Экспрессия генов некоторых факторов, модулирующих иммунный ответ, в неактивированных ММСК доноров

В данной работе была проанализирована экспрессия генов ИЛ-6, ИЛ-10, фактора комплемента Н, Ш01, РТОЕБ, КСФ1, участвующих в механизмах взаимодействия ММСК с клетками иммунной системы. Экспрессия была проанализирована в неактивированных ММСК, т. е. не контактировавших с лимфоцитами или дендритными клетками. Всего было исследовано 35 образцов РНК, выделенных из ММСК 35 доноров.

• Показано, что неактивированные ММСК экспрессируют гены, участвующие в модификации иммунного ответа, при этом уровень экспрессии существенно различается между ММСК разных доноров.

В ММСК всех 35 доноров была экспрессирована РНК гена ИЛ-6. Среднее значение относительного уровня экспрессии составило 2,58 (0,0630,09), стандартное отклонение 5,82. Уровень относительной экспрессии ИЛ-10 был выше порога чувствительности метода в 26 случаях из 35, среднее значение 2,03 (0—12,58), стандартное отклонение 3,30. Уровень относительной экспрессии гена Ш01 был значимым (выше порога чувствительности метода) у 23, среднее значение 2,30 (0-67,13), стандартное отклонение

11,31. Уровень относительной экспрессии гена простагландин Е синтетазы был значимым у 27, среднее значение 10,07 (0-88,94), стандартное отклонение 18,69. Уровень относительной экспрессии гена КСФ1 был значимым у 35, среднее значение 2,04 (0,03-10,70), стандартное отклонение 2,32. Уровень относительной экспрессии гена фактора комплемента H был значимым у 35, среднее значение 1,98 (0,15-8,49), стандартное отклонение 2,14. Известно, что иммуносупрессивное действие ММСК связано с растворимыми молекулами. Наиболее вероятными эффекторами иммуномодулирующего действия ММСК являются ИЛ-10 и ID01. Анализ относительного уровня экспрессии ИЛ-10 и IDOl показал существование обратной зависимости относительного уровня экспрессии данных генов, то есть чем выше экспрессия ИЛ-10, тем ниже экспрессия IDOl, и наоборот (коэффициент Спирмана 0,768531).

Выполнен анализ относительного уровня экспрессии исследуемых генов в зависимости от возраста, пола, роста, ИМТ доноров.

Выявлена прямая зависимость относительного уровня экспрессии ИЛ-10 и роста у доноров-мужчин, то есть чем выше донор, тем выше у него экспрессия ИЛ-10 (связь умеренной тесноты, коэффициент Спирмана 0,651404).

Кроме того, у мужчин была выявлена обратная зависимость относительного уровня экспрессии ИЛ-10 и фактора комплемента H (связь умеренной тесноты, коэффициент Спирмана -0,690909).

Других корреляций уровня экспрессии проанализированных генов друг относительно друга, а также относительно характеристик доноров выявлено не было.

Таким образом, ММСК, полученные от разных доноров, значимо отличаются по экспрессии иммуномодулирующих цитокинов.

Экспрессия генов И.П-6, ИЛ-10, фактора комплемента H, IDOl, простагландин Е синтетазы, КСФ1, а также PPARr в случаях неэффективной профилактики

Как отмечалось ранее, из 25 пациентов, получивших ММСК, острая РТПХ II—IV степени развилась только у 2 (8%). В обоих случаях неэффективной профилактики была проанализирована экспрессия генов ИЛ-6, КСФ1, ИЛ-10, IDOl и фактора комплемента Н. Дополнительно была исследована экспрессия маркера поздней стадии жировой дифференцировки клеток - пероксисомного активированного пролифератором рецептора гамма.

Для определения среднего относительного уровня экспрессия PPARy была исследована в ММСК 20 доноров гемопоэтических клеток. Среднее значение относительного уровня экспрессии составило 0,4 (0,05-2,2), стандартное отклонение 0,5.

В обоих случаях неэффективной профилактики присутствовали три отличительных фактора: во-первых, донорами были мужчины старше 40 лет; во-вторых, относительный уровень экспрессии ИЛ-6 в ММСК был значительно выше среднего (в среднем в 2,6 раза), и в-третьих, относительный

уровень экспрессии РРАЯт в ММСК был значительно выше среднего (в среднем в 6,8 раза).

Возможно, что повышенный уровень экспрессии ИЛ-6 не позволил ММСК предотвратить активацию Т- и В-клеток донора. Известно, что ИЛ-6 активирует Т- и В-клетки. Повышение относительного уровня экспрессии РРАЯу может свидетельствовать о преобладании более зрелых клеток в образцах вводимых для профилактики ММСК.

В некоторых случаях эффективной профилактики присутствовали два фактора из трех, например повышение относительного уровня экспрессии ИЛ-6 и возраст донора старше 40 лет. Таким образом, можно предположить, что повышенный уровень экспрессии ИЛ-6 в сочетании с повышением уровня экспрессии РРАЯу и возрастом донора старше 40 лет могут являться факторами, указывающими на низкий уровень иммуномодулирующей активности ММСК, и могут быть причиной неэффективности профилактики острой РТПХ. Ограниченное число случаев неэффективной профилактики развития острой РТПХ не позволяет сделать окончательные выводы, однако дальнейшее изучение экспрессии этих генов в ММСК доноров может позволить отбирать наиболее пригодные образцы ММСК.

Связь экспрессии генов ИЛ-6, ИЛ-10, фактора комплемента Н, Ю01, простагландин Е синтетазы, КСФ1 с эффективностью лечения РТПХ с помощью ММСК

Пяти больным контрольной группы, у которых развилась острая РТПХ II—IV степени, резистентная к глюкокортикоидам, проводили терапию ММСК. Эффективность лечения острой РТПХ с помощью ММСК была оценена по четырехбалльной шкале: 0 - нет ответа (сохранение прежних проявлений оРТПХ) (1 пациент), 1 - клиническое улучшение (уменьшение симптомов РТПХ менее чем на 50%) (1 пациент), 2 - частичный ответ (уменьшение симптомов РТПХ не менее чем на 50% по пораженным органам: площадь кожных поражений, показатель билирубина, объем диареи в сутки) (1 пациент), 3 - полный ответ (регрессия симптомов РТПХ) (2 пациента).

При анализе экспрессии генов ИЛ-6, ИЛ-10, Ш01 связи с эффективностью лечения РТПХ обнаружено не было. Тесноту и направление корреляционной связи определяли методом ранговой корреляции Спирмена. Значение коэффициента более 0,7 считали показателем высокой тесноты связи, от 0,4 до 0,7 - показателем умеренной тесноты связи.

Выявлена прямая связь умеренной тесноты между относительным уровнем экспрессии простагландин Е синтетазы и эффективностью лечения (коэффициент Спирмана 0,567227) и обратная связь умеренной тесноты между относительным уровнем экспрессии КСФ1 и эффективностью лечения (коэффициент Спирмана -0,507519).

Недостаточное количество данных не позволяет делать выводы, однако можно предположить, что одновременное снижение относительного уровня экспрессии простагландин Е синтетазы и КСФ1 в ММСК может свидетельствовать о неэффективности терапии.

Поскольку известно, что иммуносупрессивное действие ММСК связано с растворимыми молекулами, необходимы дальнейшие исследования для определения эффекторных путей действия ММСК. Большинство исследователей используют ММСК не от доноров гемопоэтических клеток, а от «третьих лиц». Это позволяет заранее провести исследование экспрессии генов иммуномодулирующих факторов, что может способствовать определению наиболее эффективных образцов.

Заключение

Проведенное проспективное рандомизированное исследование показало эффективность профилактики острой РТПХ у реципиентов алло-ТГСК от НЬА-идентичных родственных доноров с помощью ММСК, полученных от донора гемопоэтических клеток. Предложенный метод профилактики предполагает внутривенное введение ММСК в момент восстановления числа лейкоцитов до 1х109/л в дозе 1х106/кг массы тела. Чтобы исключить контакт с продуктами животного происхождения и минимизировать риск развития иммунологических и инфекционных осложнений, культивирование ММСК проводилось с использованием плазмы, обогащенной тромбоцитами, полученной от донора гемопоэтических клеток. Острая РТПХ у пациентов, получавших с целью профилактики ММСК, развивалась значительно реже, чем в контрольной группе. В группе пациентов, получивших ММСК, острая РТПХ Н-1У степени развилась только у 2 из 25 пациентов (8%). В контрольной группе у 8 из 24 (33%) пациентов развилась РТПХ II—IV степени. Данные различия статистически достоверны. После введения ММСК не было отмечено серьезных осложнений. У пациентов, получавших ММСК с целью профилактики РТПХ, не было отмечено увеличения частоты рецидивов, инфекционных осложнений и отторжения трансплантата по сравнению с контрольной группой. Введение ММСК в момент восстановления числа лейкоцитов не влияет на частоту развития хронической РТПХ.

Предложенный метод профилактики острой РТПХ с помощью ММСК является оригинальным и не был описан ранее в литературе.

В данной работе также проанализирована экспрессия генов ИЛ-6, ИЛ-10, фактора комплемента Н, ГО01, простагландин Е синтетазы, КСФ1, участвующих в механизмах взаимодействия ММСК с клетками иммунной системы. Выявлена прямая зависимость относительного уровня экспрессии ИЛ-10 и роста у доноров-мужчин, то есть чем выше донор, тем выше у него экспрессия ИЛ-10 (связь умеренной тесноты, коэффициент Спирмана 0,651404). Кроме того, у мужчин была выявлена обратная зависимость относительного уровня экспрессии ИЛ-10 и фактора комплемента Н (связь умеренной тесноты, коэффициент Спирмана -0,690909).

Экспрессия была проанализирована в неактивированных ММСК, которые использовались для профилактики и лечения острой РТПХ, резистентной к терапии глюкокортикостероидами.В случаях неэффективной профилактики РТПХ с помощью ММСК анализ экспрессии генов ИЛ-6, КСФ1, ИЛ-10, Ш01 и фактора комплемента Н, а также РРАЯт позволил

предположить, что повышенный уровень экспрессии ИЛ-6 в сочетании с повышением уровня экспрессии РРАЛт и возрастом донора старше 40 лет могут являться факторами, снижающими уровень иммуномодулирующей активности ММСК.

При анализе экспрессии генов ИЛ-6, ИЛ-10, Ш01 связи с эффективностью лечения РТПХ обнаружено не было, однако выявлена прямая связь между относительным уровнем экспрессии РТвЕБ и эффективностью лечения (коэффициент Спирмана 0,567227) и обратная связь между относительным уровнем экспрессии КСФ1 и эффективностью лечения (коэффициент Спирмана-0,507519).

Полученные данные позволяют предположить, что эффективность введения ММСК с иммуномодулирующей целью зависит от уровня экспрессии исследованных генов.

Выводы

1. В результате проведения проспективного рандомизированного клинического исследования установлено, что введение мультипотентных мезен-химальных стромальных клеток больным гемобластозами после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток в дозе 0,9-1,65x10® на килограмм массы тела в момент восстановления числа лейкоцитов до 1x109 на литр снижает риск развития острой реакции трансплантат против хозяина И—IV степени в 3,5 раза (относительный риск=3,5; 95% доверительный интервал: 2,4-5,0).

2. Профилактическое применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток не изменяет частоту развития хронической реакции трансплантат против хозяина.

3. Введение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток не увеличивает вероятность развития рецидивов, инфекционных осложнений и отторжения трансплантата.

4. Введение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с целью профилактики реакции трансплантат против хозяина у 36% пациентов вызывает кратковременное повышение температуры тела и у 24% - озноб, но не сопровождается тяжелыми осложнениями.

5. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные от разных доноров, характеризуются высокой разнородностью по экспрессии генов интерлейкина 6, интерлейкина 10, фактора комплемента Н, индолеамин-2,3-диоксигеназы, простагландин Е синтетазы, макрофагального колониестимулирующего фактора.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Кузьмина, J1. А. Экстрамедуллярные рецидивы после трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток и трансфузий лимфоцитов донора / Л. А. Кузьмина, JT. С. Любимова, Л. П. Менделеева, Е. И. Желнова, Н. А. Петинати, Р. Ф. Богданов, В. А. Васильева, Т. В. Гапонова, И. Б. Кап-ланская, И. Э. Костина, В. С. Шавлохов, О. Е. Грибанова, Т. Н. Обухова, Е. Н. Паровичникова, В. Г. Савченко // Клиническая онкогематология. -2011.-№3.-С. 191-195.

2. Kuzmina, L. A. Multipotent Mesenchymal Stromal Cells for the Prophylaxis of Acute Graft-versus-Host Disease — A Phase II Study / L. A. Kuzmina, N. A. Petinati, E. N. Parovichnikova, L. S. Lubimova, E. O. Gribanova, T. V. Gaponova, I.N. Shipounova, O. A.Zhironkina, A. E. Bigildeev, D. A. Svinareva, N. J. Drize, and V. G. Savchenko // Stem Cell International. - Vol. 2012 (2012). - Article ID 968213

3. Петинати, H. А. Анализ экспрессии генов, участвующих в модуляции иммунного ответа, в неактивированных мультипотентных мезенхи-мальных стромальных клетках / Н. А. Петинати, И. Н. Шипунова,

A. Е. Бигильдеев, Л. А. Кузьмина, К. С. Момотюк, E. Н. Паровичникова, Н. И. Дризе, В. Г. Савченко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153. -№ 2. - С. 211-216.

4. Петинати, Н. А. Лечение острой реакции «трансплантат против хозяина» у больных после трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками из костного мозга донора / Н. А. Петинати, Л. А. Кузьмина, E. Н. Паровичникова, Л. С. Любимова, Е. О. Грибанова, И. Н. Шипунова,

H. И. Дризе, В. Г. Савченко // Терапевтический архив. — 2012. — № 7. - С. 2630.

5. Kuzmina, L. A. Reduced-intensity allogeneic hematopoietic cell transplantation in patients older than 50 years / L. A. Kuzmina, E. N. Parovichnikova,

I. A. Demidova, L. S. Lubimova, N. A. Petinati, E. O. Gribanova, V. G. Savchenko // Cellular Therapy and Transplantation (CTT). - 2010- Vol. 3. — No. 9.-P. 76.

6. Петинати, H.A. Использование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток с целью профилактики реакции «трансплантат против хозяина» у пациентов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток / Н.А. Петинати, Л. А. Кузьмина, И. Н. Шипунова, Д. А. Свинарева, Е. О. Грибанова, E. Н. Паровичникова, Л. С. Любимова, Н. И. Дризе,

B. Г. Савченко // Вестник гематологии. - 2011. — Т. 7. -№ 1. - С. 37—38.

7. Kuzmina, L. A. Resistant pure red cell aplasia after allogeneic stem cell / L. A. Kuzmina, I. V. Tauson, L. S. Lubimova, M. N. Vasileva, N. A. Petinati, E. N. Parovichnikova, E. O. Gribanova, К. I. Ntanisian, N. Kalinin, V. G. Savchenko// Bone marrow transplantation. - 2011.- Vol.46. - Suppl. 1, April 2011. - P. 206. (abst. P751 ).

8. Kuzmina, L. The treatment of steroid-resistent graft-versus-host disease with multipotent mesenchymal stromal cells / L. Kuzmina, L. Lubimova, N. Petinati, I. Shipounova, E. Parovichnikova, E. Gribanova, N. Kalinin, N. Drize, V. Savchenko // Hematologica. - 2011. - Vol. 96 (S2). - P. 587-588 (abst. 1482).

9. Petinati, N. Graft-versus-host disease prophylaxis with multipotent mesenchymal stromal cells / N. Petinati, L. Kuzmina, I. Shipounova, L. Lubimova, O. Zhironkina, E. Gribanova, E. Parovichnikova, N. Kalinin, N. Drize, V. Savchenko // Controversies in stem cell transplantation and cellular therapies. -Berlin, 2011. - P. 49, abst. (Leukemia suppl.)

10. Бигильдеев, A. E. Возможности применения некоторых молеку-лярно-биологических методов для анализа мультипотентных мезенхимных стромальных клеток / А. Е. Бигильдеев, И. Н. Шипунова, О. А. Жиронкина, Н. В. Сац, В. Е. Мамонов, Н. А. Петинати, E. Н. Паровичникова, Н. И. Дризе, В. Г. Савченко // Стволовые клетки и регенеративная медицина : сб. тезисов IV Всероссийской научной школы-конференции. - М. : Макс-пресс, 2011. - С. 14-15.

11. Petinati, N. Alterations in bone marrow stromal precursor cells in patients before and after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation / N. Petinati, L. Kuzmina, L. Lubimova, I. Shipounova, N. Sats, A. Bigildeev, E. Parovichnikova, N. Drize, V. Savchenko // Haematologica. - 2012. - Vol. 97. -e-Supplement 1, June 14-17. - P. 287.

Список использованных сокращений

алло-ТГСК - трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток

АПК - антигенпрезентирующие клетки АТГ - антитимоцитарный глобулин ИЛ - интерлейкин

кДНК - комплиментарные цепи рибодезоксинуклеиновых кислот КСФ1 - макрофагальный колониестимулирующий фактор 1 МДС - миелодиспластический синдром

ММСК — мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

OJIJI - острый лимфобластный лейкоз

OMJI - острый миелобластный лейкоз

ОнедЛ - острый недифференцированный лейкоз

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибодезоксинуклеиновая кислота

РТПХ — реакция трансплантат против хозяина

СКК - стволовые кроветворные клетки

ХЛЛ - хронический лимфолейкоз

ХМЛ - хронический миелолейкоз

IDOl - индолеамин-2,3-диоксигеназа

PPARr — пероксисомный активированный пролифератором рецептор т PTGES — простагландин Е синтетаза

Подписано в печать. Формат А4 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № г0584 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39

1.1. Актуальность проблемы

Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) является единственным методом излечения многих гемобластозов. Однако ее проведение связано с развитием тяжелых осложнений. Одним из основных осложнений алло-ТГСК является реакция трансплантат против хозяина (РТПХ), влияющая на качество жизни и продолжительность жизни больных после алло-ТГСК.

С 1980 года за счет уменьшения смертности от инфекционных осложнений увеличилась выживаемость пациентов после алло-ТГСК, однако частота рецидивов и частота развития РТПХ не изменились. Смертность, связанная с трансплантацией, напрямую зависит от степени тяжести развившейся РТПХ. Следует учитывать также, что РТПХ тесно связана с реакцией трансплантат против опухоли, и ее развитие значительно снижает риск рецидива заболевания.

С целью профилактики РТПХ применяют различные препараты, включая ингибиторы кальциневрина (циклоспорин А, такролимус), антиметаболиты (метотрексат, микофенолата мофетил), глюкокортикостероиды (преднизолон, метилпреднизолон), сиролимус, антитимоцитарный глобулин (АТГ), моноклональные антитела (алемтузумаб, даклизумаб), циклофосфамид. Действие иммуносупрессивных препаратов только на одно звено развития РТПХ приводит к недостаточной эффективности профилактики одним препаратом. Следствием же сочетанного применения препаратов является увеличение токсичности. Несмотря на проводимую профилактику, у 19-74% пациентов после алло-ТГСК развивается острая РТПХ II—IV степени и у 30-76% -хроническая РТПХ.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) обладают уникальными иммуномодулирующими свойствами, которые были подтверждены in vitro и in vivo. Эти клетки могут быть культивированы, их источником могут служить костный мозг, жировая ткань, эмбриональная печень и др. При введении в организм ММСК не вызывают иммунного ответа. Эти характеристики сделали возможным применение ММСК в клинике. В настоящее время проводятся исследования по применению ММСК при таких заболеваниях, как боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, язвенный колит, болезнь Крона, системная красная волчанка, полимиозит и дерматомиозит, сахарный диабет II типа. Множество исследований посвящено лечению РТПХ с помощью ММСК. В данной работе представлены результаты проспективного рандомизированного исследования по профилактике РТПХ с помощью ММСК в сравнении с классическими режимами.

1.2. Цель работы

Изучить эффективность профилактики реакции трансплантат против хозяина у больных гемобластозами после трансплантации аллогенных стволовых гемопоэтических клеток с помощью мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток донора.

6. Выводы

1. В результате проведения проспективного рандомизированного клинического исследования установлено, что введение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток больным гемобластозами после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток в дозе 0,9-1,65х106 на килограмм массы тела в момент восстановления числа лейкоцитов до 1x109 на литр снижает риск развития острой реакции трансплантат против хозяина II—IV степени в 3,5 раза (относительный риск=3,5; 95% доверительный интервал: 2,4-5,0).

2. Профилактическое применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток не изменяет частоту развития хронической реакции трансплантат против хозяина.

3. Введение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток не увеличивает вероятность развития рецидивов, инфекционных осложнений и отторжения трансплантата.

4. Введение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с целью профилактики реакции трансплантат против хозяина у 36%» пациентов вызывает кратковременное повышение температуры тела и у 24% - озноб, но не сопровождается тяжелыми осложнениями.

5. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные от разных доноров, характеризуются высокой разнородностью по экспрессии генов интерлейкина 6, интерлейкина 10, фактора комплемента Н, индолеамин-2,3-диоксигеназы, простагландин Е синтетазы, макрофагального колониестимулирующего фактора.

5. Заключение

Проведенное исследование показало эффективность профилактики острой РТПХ у реципиентов алло-ТГСК от НЬА-идентичных родственных доноров с помощью ММСК, полученных от донора гемопоэтических клеток. Предложенный метод профилактики предполагает внутривенное введение ММСК в момент восстановления числа лейкоцитов до 1х109/л в дозе 1х106/кг массы тела. Чтобы исключить контакт с продуктами животного происхождения и минимизировать риск развития иммунологических и инфекционных осложнений, культивирование ММСК проводилось с использованием плазмы, обогащенной тромбоцитами, полученной от донора гемопоэтических клеток. Острая РТПХ у пациентов, получавших с целью профилактики ММСК, развивалась значительно реже, чем в контрольной группе. В группе пациентов, получивших ММСК, острая РТПХ П-1У степени развилась только у 2 из 25 пациентов (8%). В контрольной группе у 8 из 24 (33%) пациентов развилась РТПХ П-1У степени. Данные различия статистически достоверны. После введения ММСК не было отмечено серьезных осложнений. У пациентов, получавших ММСК с целью профилактики РТПХ, не было отмечено увеличения частоты рецидивов, инфекционных осложнений и отторжения трансплантата по сравнению с контрольной группой. Введение ММСК в момент восстановления числа лейкоцитов не влияет на частоту развития хронической РТПХ.

Предложенная методика профилактики острой РТПХ с помощью ММСК является оригинальной и ранее не была описана в литературе.

В данной работе также была проанализирована экспрессия генов ИЛ-6, ИЛ-10, фактора комплемента Н, ГО01, простагландин Е синтетазы, КСФ1, участвующих в механизмах взаимодействия ММСК с клетками иммунной системы. Выявлена прямая зависимость относительного уровня экспрессии ИЛ-10 и роста у доноров-мужчин, то есть чем выше донор, тем выше у него экспрессия ИЛ-10 (связь умеренной тесноты, коэффициент Спирмена 0,651404). Кроме того, у мужчин была выявлена обратная зависимость относительного уровня экспрессии ИЛ-10 и фактора комплемента Н (связь умеренной тесноты, коэффициент Спирмена -0,690909).

Экспрессия была проанализирована в неактивированных ММСК, которые были использованы для профилактики и лечения острой РТПХ, резистентной к терапии глюкокортикостероидами.В случаях неэффективной профилактики РТПХ с помощью ММСК анализ экспрессии генов ИЛ-6, КСФ1, ИЛ-10, ГО01 и фактора комплемента Н, а также РРАЯу позволил предположить, что повышенный уровень экспрессии ИЛ-6 в сочетании с повышением уровня экспрессии РРАЯу и возрастом донора старше 40 лет могут являться факторами, снижающими уровень иммуномодулирующей активности ММСК.

При анализе экспрессии генов ИЛ-6, ИЛ-10, ГО01 связи с эффективностью лечения РТПХ обнаружено не было, однако выявлена прямая связь между относительным уровнем экспрессии РТвЕБ и эффективностью лечения (коэффициент Спирмена 0,567227) и обратная связь между относительным уровнем экспрессии КСФ1 и эффективностью лечения (коэффициент Спирмена -0,507519).

Полученные данные позволяют предположить, что эффективность введения ММСК с иммуномодулирующей целью зависит от уровня экспрессии исследованных генов.