Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Прижизненная морфофункциональная оценка лимфоцитов человека при различных иммунодефицитных состояниях

Актуальность проблемы.

Высококвалифицированная медицинская помощь имеет важнейшее государственное значение, поскольку оказывает непосредственное влияние на качество жизни граждан. Это заставляет постоянно повышать требования к диагностике и лечению, искать возможности разработки и внедрения современных методов в лечебный процесс. Опыт развития медицины убедительно свидетельствует, что ее эффективность может быть поднята на качественно новый уровень только при условии интеграции в практику * здравоохранения научных достижений, внедрения новых способов диагностики и терапии [Хаитов P.M., 2002; Lawlor G.J. et al., 2000].

Успехи, достигнутые за последние годы в решении многих научных и практических проблем иммунологии, позволили выявить и охарактеризовать определенные нарушения функционирования иммунной системы при различных патологических состояниях. Показано, что проявления иммунологической недостаточности имеют важное значение при анализе течения и исхода многих заболеваний [Ковальчук J1.B. с соавт., 2003; Хаитов P.M. с соавт., 2002; Шабалин В.Н., 2000]. В клиническую практику прочно вошло понятие иммунодефицитов, что связывают со снижением функциональной активности основных компонентов иммунитета [Латышева Т.В., Сетдикова Н.Х., 2002].

Известно, что иммунная система, как одна из гомеостатических структур, участвует во всех адаптационных реакциях организма [Альбрант А.И. с соавт., 2000; Новиков B.C., 1996]. При этом лимфоциты, являясь центральной клеткой иммунной системы, не только осуществляют иммунологическую реактивность, но и выделяют биологически активные вещества, влияющие как на эффекторы иммунитета, так и на другие органы и системы. Принимая сигналы о дестабилизации внутренней среды организма, они модулируют свои функции, направленные на восстановление общего гомеостаза. Данный универсальный принцип лежит в основе всех реакций иммунокомпетентных клеток, делая их универсальными индикаторами нормы и патологии. В связи с этим остаются актуальными вопросы создания новых и совершенствования существующих способов разносторонней оценки морфофункционального состояния клеточного звена иммунной системы организма.

Анализ современных тенденций показывает, что в подавляющем большинстве случаев на первое место сегодня выходят методы, минимизирующие инвазивность, обеспечивающие оперативность, информативность и объективность исследований. Этим требованиям в полной мере отвечают новейшие оптические компьютерные лазерные системы [Автандилов Г.Г., 1998; Александров М.Т. с соавт., 1996; Cherny V.V. et al., 1995]. В последние годы были разработаны оригинальные подходы к изучению структуры и функции клеток, основанные на использовании достижений когерентной оптики, спектроскопии и компьютерной техники [Тычинский В.П., 2001; Farkas D.L. et al., 1998; Schrader M., Hell S.W., 1998].

Одним из них является компьютерная фазовая микроскопия (КФМ). Используемый в КФМ способ наблюдения и регистрации изображений дает возможность прижизненного измерения традиционного комплекса морфометрических параметров анализируемых клеточных объектов а, а также высокоточного определения локальных значений таких характеристик биологических структур как плотность, количество белка, пространственное распределение концентрации ферментов, лекарственных препаратов и т.п. Все это позволяет считать КФМ эффективным диагностическим инструментом и рассматривать вопросы его практического использования.

Цель настоящего исследования - выявить и охарактеризовать особенности прижизненного морфофункционального статуса лимфоцитов с помощью оптико-геометрических показателей, установить их диагностическую информативность в оценке степени тяжести различных иммунодефицитных состояний и эффективности проводимой иммунотерапии.

Задачи исследования:

1. адаптировать и оптимизировать программное обеспечение отечественного компьютерного фазово-интерференционного комплекса Цитоскан для автоматизированной количественной оценки морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови человека;

2. изучить особенности морфофункционального статуса Т- и В-лимфоцитов периферической крови методом прижизненной компьютерной лазерной фазометрии у больных с различными иммунодефицитными состояниями (красный плоский лишай слизистой оболочки рта; угроза выкидыша при привычном невынашивании беременности; хроническая почечная недостаточность);

3. провести мониторинг в режиме реального времени изменений структурно-объемных характеристик лимфоцитов периферической крови больных хронической почечной недостаточностью после аллотрансплантации трупной почки;

4. определить диагностическую и прогностическую значимость данных прижизненной лазерной фазометрии лимфоцитов в сопоставлении с результатами общепринятых клинико-лабораторных иммунологических методов исследования;

5. предложить комплекс критериев оценки тяжести иммунодефицитных состояний и эффективности проводимой иммунотерапии на основе прижизненного анализа оптико-геометрических параметров фазово-интерференционных портретов лимфоцитов периферической крови.

Научная новизна

Разработан новый подход к изучению клеток иммунной системы человека, позволяющий одновременно давать количественную оценку прижизненных структурных и функциональных параметров, отражающих различную степень активности Т- и В-лимфоцитов.

Проведена оптимизация программного обеспечения отечественного фазово-интерференционного комплекса Цитоскан, повышающая эффективность автоматизированной количественной оценки морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток.

Установлены и охарактеризованы значительные витальные изменения структурно-объемных параметров иммунокомпетентных клеток в процессе реализации иммунных реакций организма.

Предложен комплекс критериев количественной оценки морфофункционального состояния лимфоцитов для диагностики, определения особенностей течения и эффективности терапии при различных иммунодефицитных состояниях.

Практическая значимость

Полученные сведения о витальных морфофункциональных особенностях иммунокомпетентных клеток представляются важными для теоретической и практической медицины, поскольку дают дополнительную ценную информацию о механизмах перестройки иммунной системы при различных иммунодефицитных состояниях.

Высокая информативность КФМ дает возможность в рамках одного метода оперативно и объективно оценивать особенности популяционного состава клеток, определять уровень их функциональной активности без использования дорогостоящего оборудования и реактивов. С помощью предложенного метода изучают живые клетки крови, не подвергающиеся фиксированию и окрашиванию, что позволяет избежать их возможной экзогенной деформации. Данный метод экономичен, проводится с использованием отечественного компьютерного фазового микроскопа Цитоскан.

Компьютерная фазометрия клеток крови может быть успешно применена в акушерской практике при обследовании женщин для уточняющей диагностики невынашивания беременности.

Посуточное мониторирование витального морфофункционального статуса иммунокомпетентных клеток у больных хронической почечной недостаточностью после АТТП в раннем послетрансплантационном периоде позволяет определить относительную значимость различных клеточных показателей в оценке жизнеспособности аллогенного трансплантата.

Предложены рекомендации по тактике постоперационного ведения больных ХПН в терминальной стадии после аллотрансплантации трупной почки.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что фазовые диаметр, периметр, высота, площадь и объем Т-клеток составляют 7,15 мкм, 20,86 мкм, 2,26 мкм, 32,06 мкм2, 37,61 мкм3. В-клетки отличаются большими диаметром, периметром, площадью и объемом (9,48 мкм, 28,34 мкм, 56,26 мкм , 50,84 мкм ), но меньшей фазовой высотой - 1,85 мкм.

2. База данных прижизненных оптико-геометрических параметров лимфоцитов позволяет оценить направление изменений морфофункционального состояния Т- и В-клеток в сторону их активации или угнетения. Это является важным при обследовании больных с различными иммунодефицитными состояниями.

3. Показано, что эффективность, информативность и объективность метода компьютерной фазово-интерференционной микроскопии повышается за счет оптимизации математической обработки (выбраковка артефактов, визуализация четкого оконтуривания) и введения новых количественных параметров (распределение клеток на субпопуляции по величине фазового диаметра и высоты, индекс асимметричности).

4. Установлено, что результаты компьютерной фазово-интерференционной микроскопии полностью коррелируют с данными традиционных иммунологических исследований (иммунофенотипирование, реакция бласттрансформации лимфоцитов, определение цитокин-содержащих клеток) и позволяют в рамках одного метода оценить морфологические особенности отдельных клеток, степень их активации, изменения популяционного состава лимфоцитов и др.

5. Мониторинг изменений прижизненных оптико-геометрических показателей лимфоцитов позволяет на доклинической стадии у больных ХПН после аллотрансплантации трупной почки выявить признаки острого криза отторжения трансплантата и оперативно решить вопрос о необходимости антикризовой терапии.

6. Предложен комплекс информативных критериев оценки прижизненного морфофункционального состояния лимфоцитов на основе данных КФМ (размерные параметры, характер распределения клеток по их показателям, индекс асимметричности, соотношение отдельных субпопуляций), которые позволяют установить степень тяжести патологического процесса и количественно оценить эффективность проводимой иммунокорригирующей терапии.

Заключение

Опыт развития медицины убедительно свидетельствует, что эффективность лечения может быть поднята на качественно новый уровень только при условии внедрения в практику здравоохранения научных достижений, использования новых технологий в диагностике и терапии. При этом анализ современных тенденций показывает, что в подавляющем большинстве случаев на первое место выходят методы, минимизирующие инвазивность, обеспечивающие оперативность, информативность и объективность исследований. Этим требованиям в полной мере отвечают новейшие оптические компьютерные лазерные системы [Автандилов Г.Г., 1998; Александров М.Т. с соавт., 1996; Cherny V.V. et al., 1995]. В последние годы были разработаны разнообразные методы микроскопии, основанные на использовании современных достижений когерентной оптики, спектроскопии и компьютерной техники [Тычинский В.П., 2001; Farkas D.L. et al., 1998; Schrader M., Hell S.W., 1998]. Анализ опубликованных работ указывает на значительные успехи в становлении нового направления в прикладной оптики -компьютерной микроскопии, способствующей превращению традиционной морфологии из описательной в динамическую математическую науку. Однако основными объектами исследования, по прежнему, остаются фиксированные и окрашенные цитологические материалы. Более прогрессивным в этом отношении можно считать метод фазового и интерференционного контраста, позволяющий оперативно проводить прижизненный многопараметрический анализ нативых медико-биологических препаратов, что во многом расширяет возможности исследования [В.Н. Шабалин и соавт., 2000].

Данная работа посвящена поиску и обоснованию системы критериев оценки прижизненного морфофункционального статуса лимфоцитов крови человека, выяснению их диагностической значимости, а также выявлению возможностей практического использования КФМ при анализе особенностей течения и эффективности терапии различных иммунопатологических состояний.

В живой клетке на различных уровнях ее организации одновременно происходит много биохимических реакций и биофизических процессов, которые сопровождаются изменением локальных макроскопических параметров и в принципе могут быть зарегистрированы оптическими методами. Однако существует ряд моментов, ограничивающих их широкое использование. Одна из основных проблем фазово-интерференционной микроскопии состоит в сложности интерпретации полученного изображения. Принципиальное значение имеет характер первичной информации, которая закодирована в изображении и подвергается последующей обработке. Вполне естественно, что функциональные образы живых клеток, полученные с использованием когерентных фазово-интерференционных микроскопов, имеют ряд необычных свойств и содержат дополнительную по сравнению с классическими клеточными изображениями информацию. Учитывая это, основное внимание было уделено адаптации методики фазометрического исследования для анализа морфофункционального статуса живых лимфоцитов периферической крови человека, а также оптимизации алгоритма и программного обеспечения количественной оценки структурно-функциональных характеристик Т- и В-клеток в норме и при иммунопатологических состояниях.

За основу был принят алгоритм компьютерной фазометрии клеток, предложенный авторами метода, который предполагал автоматическое определение комплекса заданных параметров и статистическую обработку данных [Василенко И. А. с соавт., 1996]. Однако решение поставленных научных задач потребовало разработки качественно новых подходов к подготовке анализируемых образцов, выбору специальных критериев оценки клеток и интерпретации полученных данных.

Поскольку объектом исследования служили живые функционирующие лимфоциты, немаловажным условием успешного проведения экспериментов было обеспечение оптимальной среды для получения достаточно качественных фазовых изображений. Нами разработан раствор, представляющий собой смесь питательной среды (среда 199) и глицерина в соотношении 1:1. Такое техническое решение вопроса позволило практически исключить появление артефактов в фазово-интерференционном портрете клетки.

Кроме того, в пакет программ были внесены существенные коррективы. Совместно с математиками института биохимической физики РАН проведена оптимизация алгоритма КФМ с учетом современных требований анализа данных:

• исключена процедура вычитания фона;

• введена визуализация четкого оконтуривания границ лимфоцита;

• предоставлена возможность ручной выбраковки файлов с дефектами фазовых изображений.

Для повышения объективности анализа лимфоцитов в протокол исследования дополнительно введен индекс асимметричности (НА), характеризующий особенности распределения клеток по их размерным параметрам. Кроме того, на уровне популяционного анализа мы реализовали возможность количественной оценки клеточных групп, различных по величине их максимального диаметра и высоты.

Ретроспективный анализ литературы показал, что сведения о результатах исследований в области морфометрии живых лимфоцитов крови человека автоматизированными методами носят единичный характер (Левин ГГ., Козинец ГИ. и др., 1997).

В связи с этим, значительная часть работы была посвящена накоплению оптимального объема выборок клеточных образцов и количественного описания морфофункциональных особенностей живых лимфоцитов периферической крови практически здоровых людей. Полученная база данных позволила идентифицировать характерные черты лимфоцитов крови человека.

Мононуклеары крови разделяли по адгезивной способности к полистиролу (Методические рекомендации «Стандартизация HLA сывороток для иммунологического типирования», Москва, НИИ геронтологии, 1995). Установлено, что популяции клеток с низкой (КНА) и высокой (КВА) адгезивной способностью различаются по своим фазово-интерференционным характеристикам. Так у КВА диаметр, периметр, площадь и объем превышают аналогичные показатели КНА на 24, 26, 43 и 25%, соответственно. Высота у этих клеток, напротив, на 25.5% меньше. Методом проточной лазерной цитометрии с использованием моноклональных антител CD3 и CD 19 показано, что популяция КНА достаточно однородна и содержит более 80% Т-лимфоцитов. КВА представлены преимущественно В-лимфоцитами (более 70%) с примесью Т-клеток и неидентифицированных элементов.

Помимо разницы в величине средних размерных параметров, наши исследования выявили и различный характер распределения клеток в этих популяциях. Так, у Т-клеток ИА диаметра, периметра, площади и объема ниже, чем у В-лимфоцитов. По высоте Т- и В-клетки распределяются практически одинаково, ИА при этом самый низкий среди всех показателей и равен 0,30 и 0,35, соответственно.

Таким образом, с помощью КФМ впервые количественно охарактеризованы особенности морфофункционального состояния отдельных Т- и В-лимфоцитов, а также их популяций в крови практически здоровых доноров.

В качестве примеров различных иммунопатологических состояний были выбраны группы больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта (КПЛ) и беременных женщин с угрозой прерывания беременности, имеющих в анамнезе привычное невынашивание.

Анализ размерных параметров популяции Т-клеток у больных КПЛ показал, что в стадии обострения у пациентов наблюдается тенденция к увеличению среднего диаметра, периметра, площади и объема при снижении фазовой высоты лимфоцитов.

После проведения курса иммунокорригирующей терапии отечественными иммуномодуляторами последнего поколения - ликопидом и полиоксидонием, отмечена нормализация клеточных показателей: величины диаметра, периметра, площади и объема клеток снижаются, хотя фазовая высота лимфоцитов по-прежнему остается ниже контрольных значений.

На гистограммах распределения цитообъектов по величине их морфометрических показателей отмечается некоторый сдвиг вправо, демонстрирующий изменение популяционного состава циркулирующих Т-лимфоцитов за счет появления группы клеток с большими размерными параметрами. Выраженная бимодальность, как свидетельство неоднородности популяции, наиболее явно прослеживается при анализе фазовой высоты Т-лимфоцитов. Не исключено, что зарегистрированные изменения отражают наличие некоторого дисбаланса в клеточном звене иммунной системы пациентов. После проведенного лечения является очевидной внутрипопуляционная перестройка Т-клеток, сопровождающая состояние клинического улучшения больных КПЛ.

Следует отметить, что значения ИА у пациентов в стадии обострения ниже, чем в группе больных после иммунотерапии. По-видимому, развитие патологического процесса вызывает выраженные однонаправленные изменения в популяции иммунокомпетентных клеток, в то время как эффект лечебной коррекции морфофункционального состояния лимфоцитов проявляется неодновременно и неоднозначно.

Разделение клеток по величине их диаметра на малые (<6,5 мкм), средние (6,5 — 8,5 мкм) и большие (>8 мкм) в определенной мере помог понять механизм выявленных изменений клеточного состава Т-лимфоцитов. Известно, что малые и средние лимфоциты включают 95% Т-хелперов и около 50% цитотоксических Т-лимфоцитов.

Для больных КПЛ процент малых и средних Т-лимфоцитов составляет 21 и 68, соответственно (в сумме 89% против 86% контрольной группы), кроме того, наблюдается незначительное снижение числа больших Т-клеток до 11%. После иммунокоррекции соотношение малых, средних и больших лимфоцитов нормализуется, практически возвращаясь к уровню донорской группы.

Результаты КФМ в определенной степени коррелируют с данными параллельного определения субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у больных КПЛ с помощью МАТ. Так, при КПЛ до лечения не обнаружено изменений общего содержания Т-клеток (CD3). Выявленный нами дисбаланс между подгруппами Т-лимфоцитов подтверждается достоверным увеличением количества цитотоксических (CD8) Т-лимфоцитов и натуральных киллеров (CD3+CD16+CD56+), в то время как число хелперов (CD4+) остается практически без изменений.

Достоверное увеличение CD8+ клеток, выполняющих элиминацию из организма чужеродных клеток: опухолевых, вирус-инфицированных, измененных ксенобиотиками и т.д., - свидетельствует о важной роли этих Т-лимфоцитов в развитии иммунопатологических процессов при КПЛ. Несомненно, высокий уровень их содержания является важным звеном в этиологии и патогенезе КПЛ и отражает общую стимуляцию данной клеточной популяции при этом заболевании.

Поскольку фракция малых и средних Т-лимфоцитов включает в себя практически все Т-хелперы, мы провели более подробный анализ распределения клеток по величине их диаметра в диапазоне 4,0 - 8,5 мкм.

Наглядно продемонстрированы изменения, происходящие в субпопуляции Т-хелперов при КПЛ: сдвиг лимфограммы вправо в острой фазе патологического процесса, сопровождающийся перераспределением клеточного состава внутри данной субпопуляции. После лечения иммуномодуляторами структура лимфограмм нормализуется. Соответственно изменяются и величины индекса асимметричности в каждой из анализируемых клеточных групп. Поскольку по данным иммунофенотипирования у больных КПЛ не было выявлено изменений общего уровня Т-хелперов, определяли количество лимфоцитов, содержащих внутриклеточные у-интерферон и интерлейкин-4 - маркеры Thl и ТЬ2-клеток. Оказалось, что процент Т-лимфоцитов, в цитоплазме которых определялся ИЛ-4, статистически значимо повышен у пациентов с КПЛ.

После проведения лечения ликопидом и полиоксидонием процент у-интерферон содержащих Т-лимфоцитов существенно понижался, достигая практически нормальных значений.

Полученные результаты показывают, что КПЛ можно отнести к заболеваниям, в этиологии и патогенезе которых ведущая роль принадлежит ТН1-лимфоцитам. При их активации происходит повышение синтеза цитокинов, вызывающих в коже воспалительный процесс гиперчувствительности замедленного типа. Ингибиторами Thl -клеток являются интерлейкины, продуцируемые Th2- клетками: ИЛ-4 и ИЛ-10, относящиеся к разряду противовоспалительных цитокинов. Положительный клинический эффект иммуномодуляторов ликопида и полиоксидония, вероятно, связан с их способностью повышать продукцию ИЛ-4 ТЬ2-клетками и снижать число лимфоцитов, синтезирующих у-интерферон.

Следовательно, лимфограмма может косвенно отражать даже такие тонкие изменения иммунореактивности пациента как соотношение Т-хелперов I и II порядка.

Таким образом, метод КФМ позволил выявить следующие особенности морфофункционального состояния Т-лимфоцитов периферической крови больных КПЛ:

- изменение размерных оптико-геометрических показателей Т-клеток (увеличение среднего диаметра, периметра, площади и объема, снижение фазовой высоты), свидетельствующие о нарушении внутриклеточного метаболизма;

- изменение характера распределения клеток по анализируемым параметрам и индекса асимметричности, отражающих внутрипопуляционную перестройку Т-лимфоцитов и проявление дисбаланса в Т-звене иммунитета;

- изменение состава малых и средних Т-лимфоцитов, демонстрирующих нарушение соотношения субпопуляций Т-хелперов I и II порядка;

- изменение (увеличение) содержания Т-клеток с высокими значениями фазовой высоты, свидетельствующее о подавлении функциональной активности лимфоцитов;

- нормализация морфофункционального состояния Т-лимфоцитов после курса терапии иммуномодуляторами ликопидом и полиоксидонием.

На следующем этапе методом прижизненной компьютерной лазерной фазометрии было изучено морфофункциональное состояние лимфоцитов периферической крови у здоровых женщин-доноров во II фазе менструального цикла, женщин с физиологической беременностью и угрозой самопроизвольного выкидыша в I триместре.

Проведённые исследования показали, что в Т-популяции при нормальном течении беременности в первом триместре наблюдается достоверное снижение высоты и объема клеток на 8% по отношению к контрольной группе. В то же время отмечается некоторая тенденция к увеличению таких показателей, как диаметр, периметр и площадь.

При угрозе самопроизвольного выкидыша достоверно относительно контроля снижается только высота (на 4%), усиливается тенденция к увеличению среднего по популяции диаметра и периметра клеток. Достоверных различий между показателями Т-лимфоцитов при патологическом и физиологическом течении беременности на этих сроках выявить не удалось.

В В-популяции при физиологической беременности происходит незначительное, по сравнению с показателями практически здоровых женщин, достоверное уменьшение таких параметров В-клеток, как диаметр, периметр и площадь. Одновременно наблюдается достоверный рост высоты и объема на 7 и 9%, соответственно.

В состоянии угрозы самопроизвольного выкидыша такие морфологические показатели, как диаметр, периметр и площадь уменьшаются уже на 7, 8 и 13%, соответственно.

Представленные данные компьютерной морфометрии лимфоцитов позволяют сделать вывод, что в развитии гестационного процесса активно участвуют как Т-, так и В-звено иммунитета. Причем наблюдается активация Т-лимфоцитов и подавление функциональной активности В-клеток. Выявленные изменения наиболее ярко выражены при угрозе самопроизвольного выкидыша.

Наши результаты подтверждены исследованиями иммунофенотипирования популяции лимфоцитов и согласуются с данными литературы, свидетельствующими о снижении иммунологической реактивности матери при беременности [Драник Г.П., 1999; Теодореску-Эксарку М., 1999; Ledee-Bataile et al., 2002]. Развитие угрозы выкидыша сопровождаются одновременным и синергическим действием механизмов клеточного и гуморального иммунитета, причем ведущая роль принадлежит клеточному иммунитету.

Таким образом, приведенные результаты параллельного исследования лимфоцитов при различных иммунопатологических состояниях с применением КФМ и традиционных иммунологических тестов, позволяют сделать вывод, что компьютерная фазометрия живых клеток обладает высокой точностью, информативностью и объективностью. Наряду с этим, следует отметить оперативность получения данных, минимум финансовых затрат на реактивы и дополнительное оборудование. Важно, что в рамках одного метода можно прямо или косвенно оценить целый комплекс различных параметров, характеризующих не только морфологию, но и функциональную полноценность клеток. Эти качества делают КФМ незаменимым экспресс-методом для проведения многофакторной диагностики состояния различных популяций клеток, что дает возможность непосредственно в процессе лечения объективно отслеживать положительную или отрицательную динамику и вносить соответствующие изменения в лечебный процесс.

Метод прошел апробацию в отделении хронического гемодиализа и пересадки почки МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского при мониторинге морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови больных ХПН в терминальной стадии после аллотрансплантации трупной почки.

При обследовании больных терминальной ХПН, находящихся на регулярном гемодиализе, значимых изменений клеточных параметров у Т-лимфоцитов не выявлено. В то время как для В-лимфоцитов характерно достоверное уменьшение диаметра, периметра и площади. Фазовая высота, напротив, увеличивается. Т.е. в В-звене иммунитета имеются признаки функциональной недостаточности, связанной, очевидно, с подавлением В-клеточной активации.

Анализ внутрипопуляционного распределения Т-лимфоцитов по величине их диаметра не выявил каких-либо изменений в составе клеток. В популяции В-лимфоцитов на 12% увеличилось содержание малых В-клеток и практически в 2 раза снизилось количество больших лимфоцитов.

Полученные нами данные свидетельствуют, по видимому, о том, что у больных ХПН в терминальной стадии наблюдаются признаки подавления функциональной активности гуморального иммунитета без значимых изменений Т-клеточного звена.

Представленные результаты не противоречат мнению других авторов. Некоторые исследователи отмечают повреждение при уремии клеточного иммунитета. Однако наиболее вероятной причиной дисфункции Т-клеток является снижение экспрессии молекул В7-2 на поверхности моноцитов, вследствие чего нарушаются процессы костимуляции и снижается продукция ИЛ-2. Отсюда следует, что угнетение активности Т-клеточного звена является не причиной, а следствием иммунодефицита, свойственного терминальной стадии ХПН. При сохраненной костимуляции функциональная активность Т-лимфоцитов не нарушается. Кроме того, показано, что регулярное применение гемодиализа при уремии также повышает активность лимфоцитов [Kaul Н. et al., 2000].

Что касается В-звена иммунитета, несмотря на то, что в количественном отношении уровень основных иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) в плазме при терминальной стадии ХПН обычно остается нормальным, специфический антительный ответ оказывается подавленным [Зубкин М.Л., 2003; Кожокарь Ю.В., 2001; Casciani C.U. et al., 1978; McAdam A.J. et al., 1998].

Резюмируя вышеизложенное, можно сказать, что разработанный нами метод позволил объективно оценить морфофункциональное состояние популяций Т- и В-лимфоцитов, выявив особенности, характерные для терминальной стадии хронической почечной недостаточности.

Было обследовано 15 пациентов отделения после аллотрансплантацией трупной почки. У 9 из них наблюдалась стабильная функция трансплантата. Эти реципиенты составили, так называемую, группу стандарта («немедленная функция трансплантата без криза отторжения»), по отношению к показателям которой можно судить о течении посттрансплантационного периода.

Проведенный мониторинг морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови больных в этой группе показал, что на 3 сутки послеоперационного периода как в Т-, так и в В-звене, происходят наиболее значимыми изменениями размерных параметров клеток. Причем у Т-лимфоцитов достоверно увеличиваются все оптико-геометрические показатели, а у В-клеток только высота и объем. Однако, по-видимому, эти изменения связаны не столько с нарушением иммунологических процессов у больных, сколько с острой реакцией организма на оперативное вмешательство и начало интенсивной иммуносупрессии. Последующий анализ продемонстрировал постепенную нормализацию результатов морфометрии. При выписке пациентов (22 - 28 сутки наблюдения) средние клеточные показатели становятся сопоставимыми с донорской группой. Стабилизация гистограмм распределения клеток по их размерным параметрам как в Т-, так и в В-звене при неосложненном течении регистрируется уже на 16 сутки после АТТП. Соответственным образом изменяются и НА анализируемых гистограмм, приближаясь к контрольным значениям в конце срока наблюдения.

Результаты морфометрии лимфоцитов пациентов в послеоперационном периоде были подтверждены данными общеклинических, биохимических, иммунологических и физикальных методов обследования. Особое внимание уделялось исследованию динамики содержания креатинина.

У 6 пациентов в различные сроки (5 - 20 сутки) после АТТП было зарегистрировано острое отторжение трансплантата, подтвержденное данными КФМ и клинико-лабораторными исследованиями.

При этом с помощью КФМ появление первых признаков иммунологического отторжения трансплантированного органа было зафиксировано на несколько суток раньше, чем по показателям традиционного клинико-диагностического обследования.

Таким образом, апробация метода КФМ в клинике показала несомненную перспективность дальнейших исследований в этом направлении.

На основании данных исследования можно сделать вывод о целесообразности включения компьютерной фазометрии лимфоцитов крови в комплексное клинико-диагностическое обследование больных с целью выявления признаков острых кризов отторжения трансплантата и оценки эффективности проводимой терапии.