Автореферат и диссертация по медицине (14.00.52) на тему:ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ЛИМФОМАМИ КОЖИ СТАРШИХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП

На правах рукописи

КАРДАШОВА Зивер Заиддин кызы

ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ЛИМФОМАМИ КОЖИ СТАРШИХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП

14.00.53 - геронтология и гериатрия 14.00.11. - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 ДЕ.'[ 2008

Москва - 2008

003457864

Работа выполнена в ФГУ «Российский геронтологический научно-клинический центр Росздрава»

Научный руководитель:

академик РАМН,

профессор Шабалин Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Свиридкина Людмила Петровна Баткаев Эдгем Абдулахатович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится %АлУ> 2008 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д'208.104.01 по геронтологии и гериатрии в Российском геронтологический научно-клиническом центре Росздрава по адресу: 129226, г.Москва, ул. Леонова, 16 (конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского геронтологического научно-клинического центра Росздрава по адресу: 129226, г.Москва, ул. Леонова, 16.

Автореферат разослан 2008

года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Н.М.Соколова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Лимфомы кожи (ЛК) в настоящее время по сравнению с предыдущими годами встречаются сравнительно чаще и составляют 1-2% от всех кожных дерматозов. Обычно они возникают после 40 лет, причем более высокий уровень заболеваемости и распространённости ЛК отмечается у лиц старше 60 лет. Пятилетняя выживаемость больных прогностически благоприятными вариантами лимфом превышает 80%, а неблагоприятными не достигает и 30% (В.В. Ястребов, И.М. Рознатовский, 2000).

Лимфомы кожи являются гетерогенной группой неопластических заболеваний, обусловленных пролиферацией клона лимфоцитов в коже. Они цитоморфологически сопоставимы с лимфомами других локализаций. В зависимости от особенностей поражений кожи, проявляющихся клинически и гистологически, выделяют Т-клеточные и В-клеточные лимфомы. 'Г-клеточные лимфомы по клинике и прогнозу отличаются более тяжелым течением и встречаются значительно чаще (Д.В .Казаков,2002; С.Ви^,2000).

Этиология ЛК остаётся неясной. Выдвигаются вирусная, химическая и радиационная теории; активно обсуждается роль инфекционных и экологических факторов. Многие специалисты предполагают, что возникновение лимфом может быть обусловлено наследственными болезнями, сопровождающимися дефектами иммунитета. Однако иммунологический аспект патогенеза данной патологии остается недостаточно изученным.

Известно, что изменения иммунной системы, обусловленные возрастом, приводят к формированию физиологического иммунодефицита, преимущественно по Т- клеточному звену и ослаблению противовирусной и антибактериальной иммунной защиты организма с повышением частоты и тяжести инфекционных и онкологических заболеваний, а также аутоиммунной патологии у лиц старшего возраста (В.Н.Шабалин, 2005; В.Ф.Семенков с соавт., 2005).

Центральное место в реализации иммунопатологических реакций у больных ЛК принадлежит лимфоидной ткани кожи, которая представлена не как фиксированная ткань, а как рециркулирующая через кожу популяция лимфоцитов (J.D. Bos, et al., 1987).

В последние годы представление о патогенезе ЛК дополнилось новыми данными, полученными с помощью методов молекулярной биологии, которые показали тонкие механизмы изменений мембран пролиферирующих лимфоцитов, их кооперации с другими клетками и иммуногенетический контроль этих процессов (D.W.Bahler, et al., 1992; V.Bakels et al., 1993; G.S.Wood, 1991).

Критериями опухолевой природы лимфоидной пролиферации могут быть, кроме специфической цитологической и гистологической картины, результаты иммуноморфологического (иммунофенотипического) исследования срезов, а также изучение морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови методом компьютерной лазерной морфометрии (Е.М. Лезвинская с соавт., 2005; В.Б.Метелин, 2005).

Цель исследования

Выявить диагностические критерии Т-клеточных злокачественных лимфом кожи на основе витальных оптико-геометрических показателей морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови с учетом возрастных особенностей иммунного статуса больных.

Задачи исследований.

1. Изучить особенности морфофункционального состояния Т- и В-лимфоцитов периферической крови практически здоровых лиц различных возрастных групп (молодого, среднего и пожилого возраста) методом витальной компьютерной морфометрии.

2. Оценить методом витальной компьютерной морфометрии показатели морфофункционального состояния Т- и В-лимфоцитов больных эритродермическими вариантами Т-клеточных злокачественных лимфом кожи среднего, пожилого и старческого возраста.

3. Выявить особенности морфофункционального статуса Т- и В-лимфоцитов периферической крови больных эритродермическими формами псориаза различных возрастных групп для дифференциальной диагностики с эритродермическими вариантами Т-клеточных злокачественных лимфом кожи.

4. Сопоставить результаты витальной компьютерной морфометрии лимфоцитов с данными традиционной иммунограммы.

5. Определить диагностическое и прогностическое значение витальных морфометрических показателей лимфоцитов периферической крови больных Т-клеточными злокачественными лимфомами кожи.

Научная новизна

Впервые с использованием морфометрических параметров охарактеризованы и количественно оценены возрастные изменения Т- и В-лимфоцитов практически здоровых людей молодого, среднего, пожилого и старческого возрастов. Установлены морфометрические признаки формирования возрастных физиологических изменений иммунной системы.

Выявлены характерные для больных эритродермическими вариантами Т-клеточных злокачественных лимфом кожи (ТЗЛК) особенности морфофункционального состояния отдельных лимфоцитов и структуры всей циркулирующей популяции с учетом цитотоксического, активационного и пролиферативного потенциалов клеток.

Впервые установлена возможность идентификации в режиме реального времени атипичных форм лимфоцитов (клеток Сезари) по особенностям строения церебриформного ядра живых нативных клеток на основе анализа их оптико-геометрических параметров.

Установлена диагностическая и прогностическая значимость морфометрических показателей лимфоцитов в оценке особенностей течения эритродермических вариантов Т-клеточных злокачественных лимфом кожи у больных различных возрастных групп.

Практическая значимость

Установлена и подтверждена в исследованиях in vitro возможность оперативной оценки пролиферативного потенциала живых лимфоидных клеток по снижению анизотропии их ядер, отражающей структурную упорядоченность хроматина.

Для диагностики и прогноза течения эритродермических вариантов Т-клеточных злокачественных лимфом кожи предложен комплекс витальных морфометрических критериев, позволяющий оценивать

морфофункциональное состояние Т- и В-лимфоцитов, а также цитотоксический и пролиферативный потенциал всей лимфоцитарной популяции.

Интегральная оценка инволютивных изменений

морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови по их витальным морфометрическим параметрам имеет диагностическое и прогностическое значение, способствуя своевременному выявлению иммунодефицитных и аутоиммунных состояний.

Положения, выносимые на защиту

1. Экспресс метод витальной компьютерной морфометрии может служить важным диагностическим и прогностическим тестом при оценке иммунореактивности пациентов.

2. Цитоморфологическими показателями возрастных изменений лимфоцитарного звена иммунной системы являются: увеличение гетерогенности циркулирующей популяции лимфоцитов, уменьшение средне-популяционных значений основных оптико-геометрических параметров клеток (диаметра, периметра, площади и объема), снижение их цитотоксического и пролиферативного потенциалов.

3. Цитоморфологическими диагностическими признаками Т-клеточных злокачественных лимфом кожи являются: увеличение средних значений диаметра, периметра, площади и объема Т-лимфоцитов при достоверном снижении их фазовой высоты; высокая степень гетерогенности

циркулирующей популяции Т-клеток; повышение их цитотоксической и пролифсративной активности; обнаружение атипичных форм лимфоцитов (клетки Сезари) в количестве более 5-10% в общем пуле циркулирующих Т-лимфоцитов.

Апробация работы

Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на 23 Российской конференции "Морфометрия в диагностике болезней", Москва, 14 октября, 2005; 24-ой научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 20 октября 2006; 5-ой научно-практической конференции «Новое в эстетической дерматологии: Наука и практика» Москва, 22 декабря 2006; 8-ом конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 27-29 июня 2007; Научно-практической конференции дерматовенерологов Центрального Федерального Округа РФ, Москва, 26-27 апреля 2007; 21st World Congress of Dermatology, 2007, Buenos Aires, Argentina; 2-ом Всероссийском конгрессе дермато-венерологов, Санкт-Петербург, 25-27 сентября 2007; 25-ой научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 19 октября, 2007; 7-ой научно-практической конференции «Новое в эстетической дерматологии: Наука и практика» Москва, 20 ноября 2007; I научно-практической конференции «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 15 мая 2008.

Публикации

По результатам выполненных исследований опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем и диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 57

отечественных и 63 зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 9 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект, материалы и методы исследования

Обследовано 25 больных с Т-ЗЛК: 15 больных имели верифицированный диагноз грибовидного микоза (эритродермические варианты), 7 - неуточненные диагнозы эритродермий неясного генеза, у 3 больных клинически был диагностирован синдром Сезари. Группу сравнения составили 30 пациентов с эритродермической формой псориаза и сходной с Т-ЗЛК клинической картиной заболевания. Для определения показателей нормы были обследованы 35 практически здоровых лиц.

Среди больных эритродермическими вариантами ТЗЛК 9 пациентов в возрасте от 51 до 63 лет составили группу пациентов среднего возраста (средний возраст 58,1±3,4), 16 - в возрасте от 65 до 80 лет - группу пожилого и старческого возраста (средний возраст 72,9±5,8).

19 больных с эритродермической формой псориаза в возрасте от 45 до 62 лет были включены в группу пациентов среднего возраста (средний возраст 50,5±5,1), 11 - в возрасте от 65 до 79 лет - в группу пожилого и старческого возраста (средний возраст 72,6±3,4).

Среди практически здоровых лиц 10 обследованных в возрасте от 25 до 44 лет составили контрольную группу молодого возраста (средний возраст 35,5±5,2), 10 - в возрасте от 50 до 63 лет - группу среднего возраста (средний возраст 56,2±4,7), 10 - в возрасте от 65 до 80 - группу пожилых (средний возраст - 73,8±4,7), 5 - в возрасте от 84 до 90 - группу старческого возраста (средний возраст 87,2±2,8).

Клиническое обследование включало анализ жалоб больного, данных анамнеза, клинического осмотра, результатов общего анализа крови и мочи печеночных тестов, уровня сахара в крови, белковых фракций сыворотки крови и др. Все пациенты были обследованы для исключения у них

системного лимфопролиферативного заболевания или злокачественных новообразований внутренних органов.

Гистологическое исследование включало биопсию кожи, фиксацию материала и приготовление ступенчатых срезов общепринятыми методами

Цитологический метод использовали для установления пораженности лимфатических узлов и костного мозга.

Иммунологический метод включал исследование фенотипа лимфоцитов на проточном лазерном цитометре БАКО с использованием моноклональных антител (МАТ) производства БАКО, меченных ФИТЦ и фикоэритрином.

Электронно-микроскопический метод применялся для выявления клеток Сезари при ТЗЛК.

Функциональные методы (УЗИ, рентгенологическое исследование, компьютерная томография, остеосцинтиграфия) проводились по показаниям для выявления лимфопролиферативных поражений внутренних органов, костей и возможных метастазов.

Материалом исследований служили Т- и В-лимфоциты периферической крови, выделенные стандартными методами на градиенте плотности.

Витальную компьютерную фазовую морфометрию лимфоцитов проводили с использованием отечественного фазово-интерференционного комплекса «Цитоскан», представляющий модифицированный интерферометр Линника с модуляцией фазы опорной волны. Источник света - гелий-неоновый лазер (к=633 нм). Объектив ЗОХ, общее увеличение системы 5000Х, точность измерения по высоте 0.5 нм, по полю - 20 нм; дискретность изображения 128X128, при минимальном размере пиксела-3 нм. Микроскоп обладает разрешением, незначительно уступающим растровому электронному микроскопу, и позволяет регистрировать параметры биологических объектов, не подвергавшихся предварительной фиксации или окрашиванию. Комплексный алгоритм морфометрии клеток включал

автоматическое определение заданных морфометрических показателей отдельных лимфоцитов (диаметр - D, периметр - Р, высота - Н, площадь - А, объем - V), интегральный морфометрическай анализ клеточной популяции, построение цитограмм.

Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью алгоритмов среды MatLab и математического пакета "Statistica 6". Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, среднего квадратичного отклонения и анализа асимметричности распределения. Различия между сравниваемыми группами рассчитывали по критериям Вилкоксона-Манна-Уитни, Колмагорова-Смирнова или Стьюдента. Уровень значимости устанавливался равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение В исследованиях in vitro были получены доказательства, что компьютерная фазовая морфометрия (КФМ) позволяет выявить детальные изменения фазовых параметров лимфоцитов, непосредственно связанные с их активацией. Исследования образцов с интактными (интерфазными) лимфоцитами показали, что на их топограммах четко визуализируются цитоплазма, ядро и слабоконтрастное ядрышко, которое имеет сложную несимметричную форму со средним диаметром 2 мкм (Рис.1).

х,ит

Рис.1. Компьютерная фазово-интерференционная микроскопия живого Т-лимфоцита периферической крови здорового донора: а - топограмма; Ь -фазовый профиль, И - фазовая высота.

Для изучения динамики морфометрических показателей в процессе активации лимфоцитов к взвеси клеток in vitro в качестве индуктора активации добавляли 2 мкг/мл ФГА с экспозицией в течение 1 часа при 37°С. После инкубации проводили компьютерную морфометрию активированных лимфоцитов, оценивали динамику фазовой высоты клеток. В течение одного часа после добавления ФГА фазовая высота клетки и ее ядра достоверно снижались практически в 1,5 и более раза (с 220,0±39,0 нм до 95,0±24,0 нм).

Из рисунка 2 видно, что снижение фазовой высоты сопровождалось существенными изменениями морфологии лимфоцита: уменьшалась фазовая высота цитоплазмы, на фоне ядра, в котором неравномерно по площади клетки перераспределялся хроматин, выделялось контрастное ядрышко и появлялись множественные фибриллярные центры.

Рис.2. Компьютерная фазово-интерференционная микроскопия живого Т-лимфоцита периферической крови здорового донора, активированного фитогемагглютинином: а - топограмма; Ь - фазовый профиль, И - фазовая высота.

Известно, что ядерный хроматин способен к сложным информационным превращениям, изменяющим его физико-химические свойства. При этом хроматин дает эффект двулучевого преломления -анизотропию, величина которой отражает его структурную упорядоченность.

Снижение уровня анизотропии может интерпретироваться как показатель, свидетельствующий о явлениях деспирализации хроматина, сопровождающихся ослаблением химических связей комплекса ДНК -

гистон в ядрах клеток (В.П.Тычинский с соавт., 2005). Данный факт указывает на биологическую активацию хроматина - предпосылку матричной активности ДНК. Полученные нами результаты показывают, что при активации клетки в ядре происходит перераспределение гетерохроматина к периферии, заметное снижение его электронной плотности, а в ядрышке идентифицируются множественные фибриллярные центры, окруженные плотным фибриллярным и гранулярным компонентом. Таким образом, фазовая высота - объективный количественный параметр, отражающий процесс активации лимфоцитов и позволяющий регистрировать его в самой ранней фазе.

Популяция лимфоцитов периферической крови отличается выраженным морфологическим многообразием. При этом размерные показатели лимфоцита являются отражением его функционального состояния и принадлежности к определенной субпопуляции иммунокомпетентных клеток. В таблице 1 суммированы средние в циркулирующей популяции размерные параметры Т-лимфоцитов здоровых людей.

Таблица 1.

Размерные параметры Т- лимфоцитов периферической крови практически

здоровых лиц различных возрастных групп (М±а)

Группы Диаметр (О), мкм Периметр (Р), мкм Высота (Н), мкм Площадь (8), мкм2 Объем (V), мкм3

Молодой возраст 7,05±1,33 20,81±3,73 2,20±0,48 31,83±11,82 36,24±16,46

Средний возраст 6,32±1,42* 18,20±4,01* 2,05±0,44* 24,36±11,35* 25,16±13,94*

Пожилой возраст 7,07±1,12 20,23±3,01 2,21±0,42 29,49±9,03 33,13±12,71

Старческий возраст 6,66±1,18* 19,03±3,15 2,16±0,44 26,58±10,20* 28,86±11,98*

* - достоверно относительно группы молодого возраста, при р < 0,05

Данные таблицы 1 показывают, что особенности возрастных изменений Т-клсток проявляются в достоверном снижении всех морфометрических показателей. У здоровых добровольцев среднего возраста диаметр, периметр, высоты, площадь и объем клеток снижены по отношению к группе молодого возраста на 10,4, 12,6, 6,8, 24,5 и 30,6%, соответственно. В старческом возрасте средние в популяции диаметр, площадь и объем Т-лимфоцитов уменьшены на 6,5,16,5 и 20,4%, соответственно.

В отношении возрастных изменений В-лимфоцитов наблюдалась иная картина (Табл. 2). Достоверное уменьшение диаметра, периметра, площади и объема В-лимфоцитов наблюдалось только у лиц пожилого и старческого возраста.

Таблица 2

Размерные параметры В-лимфоцитов периферической крови практически здоровых лиц различных возрастных групп (М±а)

Группы Диаметр (D), мкм Периметр (Р), мкм Высота (Н), мкм Площадь (S), мкм2 Объем (V), мкм3

Молодой возраст 8,97±2,33 26,86±6,89 1,90±0,52 51,28±24,57 47,64±22,93

Средний возраст 8,75±2,05 25,75±5,95 2,03±0,54 46,29±21,52 45,10±25,37

Пожилой возраст 7,62±1,70* 21,87±4,94* 2,02±0,46 35,58±16,08* 35,83±17,74*

Старческий возраст 7,97±1,87* 23,09±5,47* 1,92±0,45 39,45±18,17* 36,22±18,27*

* - достоверно относительно группы молодого возраста, при р < 0,05

Известно, что в норме группу малых (диаметр < 6,5 мкм) и средних (6,5-8,5мкм) лимфоцитов составляют 95% от всего количества циркулирующих Т-хелперов и около 50% от общего числа цитотоксических Т-лимфоцитов. Большие Т-лимфоциты (>8мкм) представлены второй половиной цитотоксических Т-клеток и натуральными киллерами.

Популяция малых В-лимфоцитов представлена клетками с диаметром <8,5мкм, средних - 8,5-10,5мкм, а больших - >10,5мкм.

По данным КФМ в Т-звене иммунитета у доноров среднего возраста по отношению к группе доноров молодого возраста зарегистрировано более высокое содержание малых (63,6%), уменьшение средних и больших Т-лимфоцитов (30,0% и 6,2%). В пожилом возрасте соотношение клеток в популяции становится сопоставимым с группой молодого возраста, а в старческом - вновь увеличивается процент малых лимфоцитов (52,5%), уменьшается количество средних и больших (40,6% и 6,9%, соответственно).

В популяции В-клеток достаточно однородный состав сохраняется в молодом и среднем возрасте. В пожилом и старческом, напротив, отмечается достоверное увеличение числа малых В-лимфоцитов (76,2% и 63,3%, соответственно), уменьшение средних и больших клеток (17,9% и 6,0%, 24,5% и 12,2%, соответственно). Такое резкое (в 2 и более раза) уменьшение субпопуляции больших В-лимфоцитов, являющихся основными продуцентами иммуноглобулинов, демонстрирует снижение активности В-лимфоцитов, причем более выраженное у представителей пожилого возраста.

Поскольку в исследованиях in vitro было установлено, что фазовая высота лимфоцита отражает состояние хроматина в ядре, является очевидным, что увеличение этого показателя свидетельствует о снижении, а уменьшение, напротив, указывает на повышение способности к пролиферации. Сравнительный анализ распределения лимфоцитов крови доноров различных возрастных групп по величине их фазовой высоте (до 1,5 мкм, от 1,5 до 3,0 мкм и выше 3,0 мкм) выявил снижение пролиферативного статуса Т-лимфоцитов у практически здоровых лиц старших возрастных групп. Так, процент клеток с высотой менее 1,5 мкм, представляющих наиболее активный пул клеток в популяции, уменьшается в пожилом и старческом возрасте до 4,4% и 5,9%, соответственно (против 6,9% в группе молодого возраста).

В В-звеие возрастные изменения характеризуются количественным перераспределением лимфоцитов с низкими и средними значениями фазовых высот. Число клеток с низкими значениями высоты уменьшается (до 11,3% и 14,3% в пожилом и старческом возрасте), а с высотой 1,5 — 3,0 мкм -увеличивается (до 86,8% и 83,7%, соответственно). Количество В-лимфоцитов с фазовой высотой более 3,0 мкм остается практически неизменным.

На основании полученных результатов можно утверждать, что цитоморфологическими показателями уровня возрастных изменений иммунной системы по сравнению с состоянием молодого организма являются:

для среднего возраста - выраженная гетерогенность циркулирующей популяции Т-лимфоцитов, признаки незначительного ТЫ/ТЬ2 дисбаланса (изменение соотношения малых и средних лимфоцитов), некоторое снижение цитотоксического потенциала (уменьшение числа больших лимфоцитов);

для пожилого возраста - снижение внутрипопуляционной гетерогенности Т-лимфоцитов, восстановление ТЫ/ТИ2 соотношения и цитотоксического потенциала, незначительное снижение пролиферативной способности Т-клеток, тенденция к уменьшению активности В-звена иммунитета;

для старческого возраста - гетерогенность циркулирующей популяции Т-лимфоцитов, признаки ТЬ1/ТЬ2 дисбаланса (изменение соотношения малых и средних лимфоцитов), снижение цитотоксического потенциала (уменьшение числа больших лимфоцитов) и пролиферативной способности (уменьшение числа клеток с низкой фазовой высотой), уменьшение активности В-звена иммунитета (снижение количества средних и больших В-лимфоцитов, уменьшение числа клеток с низкой фазовой высотой).

Проанализированы морфометрические параметры Т- и В-лимфоцитов периферической крови 25 больных с Т-клеточными злокачественными

лимфомами кожи. Группу сравнения составили 30 пациентов с эритродермической формой псориаза (Табл.3 и 4).

Таблица 3

Размерные параметры Т-лимфоцитов периферической крови больных ТЗЛК и ЭФП различных возрастных групп (М±с)

Группы Диаметр (D), мкм Периметр (Р), мкм Высота (Н), мкм Площадь (S), мкм2 Объем (V), мкм3

« ь а 5 X га et о. ТЗЛК 7,69±1,60* 22,10±4,75* 2,05±0,59 35,46±14,9* 39,27±19,5*

n S и ю ЭФП 7,11±1,46 20,26±4,14 2,20±0,43 30,47±12,7 31,77±15,1

К 32 « § S ° u g. ТЗЛК 7,61±1,47* 23,43±4,14* 2,03±0,42* 33,67±14,4* 37,57±16,3*

К Т г> й & О ЭФП 7,03±1,33 19,97±3,77 2,11±0,40 30,10±13,5 28,83±13,4

* - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

Таблица 4

Размерные параметры В-лимфоцитов периферической крови больных ТЗЛК _ и ЭФП различных возрастных групп (М±о) _

Группы Диаметр (D), мкм Периметр (Р), мкм Высота (Н), мкм Площадь (S), мкм2 Объем (V), мкм3

я Б X в ТЗЛК 8,86±1,96 25,54±5,66 1,91±0,38 48,08±20,93 46,36*22,39

V со а S о и ЭФП 9,03±1,97 25,94±5,81 2,00±0,44 48,36±20,34 48,33±22,80

я в 11Ü ТЗЛК 8,50±2,15* 23,59±6,28 1,99±0,48 41,04±21,15 41,89±22,33

1 1-5 S g * ЭФП 8,31±1,75 24,33±5,11 2,01±0,57 42,34±17,12 40,13±20,34

* - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

Установлено, что у больных ТЗЛК всех возрастных групп морфометрические параметры Т-лимфоцитов достоверно превышают значения соответствующей возрастной нормы. В группе ЭФП значимых изменений морфометрических показателей Т-лимфоцитов не обнаружено. В отношении В-лимфоцитов характерных и достоверных изменений не выявлено.

При гистограммном анализе отмечена высокая степень гетерогенности Т-популяции у пациентов с ТЗЛК во всех возрастных группах. Структура В-лимфоцитарного звена у больных в обеих группах сравнения оставалась практически без изменений по отношению к донорским группам соответствующего возраста.

Следует отметить, что у больных ТЗЛК всех возрастных категорий наблюдались признаки выраженного дисбаланса в Т-хелперной субпопуляции и увеличение цитотоксической активности: у пациентов среднего возраста содержание малых и средних лимфоцитов составило 22,8% и 50,5%, соответственно (против нормативных 63,8% и 30,0%), в пожилом и старческом возрасте - 40,6% и 45,3%, соответственно (против 34,1 и 54,4%). Количество больших лимфоцитов, ответственных за цитотоксический потенциал, у больных ТЗЛК среднего возраста превысило нормативные показатели более чем в 4 раза (26,7% против 6,2%, р<0,05), в группе больных пожилого возраста эта разница была недостоверной (14,1% против 11,5%, р>0,05), а в группе старческого возраста число больших лимфоцитов превысило нормативные величины практически в 4 раза: (25,0% против 6,9%, р<0,05).

В В-звене иммунитета больных ТЗЛК соотношение малых, средних и больших В-лимфоцитов находилось в диапазоне нормативных значений.

В Т-клеточной популяции больных ЭФП выявлены незначительные изменения ТЫ ЛЬ2 соотношения: у пациентов среднего возраста содержание малых и средних Т-лимфоцитов составило 49,9% и 43,4% (против нормативных 63,8% и 30,0%), в пожилом возрасте - 36,9% и 50,4% (против 34,1% и 54,4%), в старческом - 42,6% и 47,5%, соответственно (против 52,5% и 40,6%). Обращает внимание, что при ЭФП практически отсутствовали изменения цитотоксической активности клеточной популяции: содержание больших Т-лимфоцитов у больных среднего возраста составило 6,7%, у пожилого - 12,8%, а у пациентов старческого возраста 9,9% (против 6,2%, 11,5% и 6,9% у практически здоровых лиц, соответственно). В В-звене

иммунитета у больных ЭФП значимых изменений морфометрических показателей не обнаружено.

Анализ пролиферативного потенциала показал, что у пациентов с ТЗЛК среднего возраста содержание Т-лимфоцитов с высотой менее 1,5 мкм составил - 7,9% (против возрастной нормы - 6,9%), у больных пожилого возраста - 8,8% (против 4,4%), а старческого - 8,9% (против 5,9%). Полученные результаты показывают, что у больных ТЗЛК имеется четкая тенденция к увеличению пролиферативного потенциала Т-клеток: содержание лимфоцитов с высоким пролиферативным потенциалом в циркулирующей популяции при ТЗЛК увеличивается, в среднем, в 1,5 раза.

У больных ЭФП среднего, пожилого и старческого возраста не обнаружено значимых изменений пролиферативного потенциала Т-популяции: содержание активированных клеток с фазовой высотой менее 1,5 мкм составило всего 6,2%, 6,1% и 6,9%, соответственно.

Корреляционный анализ позволил выявить достоверные связи между морфометрическими параметрами лимфоцитов и содержанием клеток с определенным фенотипом (Рис.3). Величины среднего диаметра и периметра Т-клеток положительно коррелируют с числом лимфоцитов, экспрессирующих активационные молекулы НЬА-ВК. (г=0,39, р=0,09 и г=0,42, р<0,05) и количеством ЦТЛ (СБ8+) (г=0,33, р>0,05), а отрицательно -с содержанием незрелых клеток (СБ38+) (г=-0,41, р<0,05 и г=-0,49, р<0,05).

Количество малых Т-лимфоцитов положительно коррелирует с СБ38+клетками (г=0,36, р>0,05), а больших - с СБ25+ (г=0,39, р>0,05). При этом для больших Т-лимфоцитов выявлены корреляции с уровнем зрелых Т-клеток и ЦТЛ (г=0,42, р<0,05 и г=0,40, р<0,05).

Для фазовой высоты Т-лимфоцитов характерно наличие отрицательных корреляций с клетками, несущими маркеры ранней и поздней активации (г=-0,36, р>0,05 и г=-0,36, р>0,05, соответственно), а для фазового объема - с незрелыми или активированными клетками (СБ38+) (г=-0,45, р<0,05).

СО 38

С011Ь СБ5

Н1шп (1

Рис. 3 - Диаграмма структуры корреляционных связей между морфометрическими параметрами Т-лимфоцитов (1) и В-лимфоцитов (2) периферической крови и данными иммунограммы. Б - диаметр, Р - периметр, Н - высота, Б - площадь, V - объем.

_____ - положительная недостоверная связь; = - отрицательная недостоверная связь; _____ - положительная достоверная связь;

— - отрицательная достоверная связь

Величина площади Т-лимфоцитов положительно коррелирует с содержанием НЬА-ВЯ+ клеток (г =0,41, р<0,05).

В В-звене иммунитета выявлены положительные корреляции между величинами среднего диаметра и площади с содержанием СБ20+ клеток (г=0,41, р<0,05, г=0,52, р<0,05), а отрицательные - содержанием (г = -0,55, р<0,05 и г = -0,55, р<0,05, соответственно). Установлена положительная взаимосвязь между процентом малых В лимфоцитов и уровнем ^М и ^А (г = 0,55, р<0,05 и г = 0,48, р<0,05, соответственно).

Представленные результаты позволяют сделать вывод, что КФМ позволяет в рамках одного метода не только оперативно оценить индивидуальные изменения каждого отдельного лимфоцита, проанализировать структуру популяционного состава и функциональную полноценность циркулирующих лимфоцитов, но и косвенно охарактеризовать возможные изменения фенотипического профиля иммунокомпетентных клеток без использования дополнительной аппаратуры и реактивов.

Важным аспектом настоящей работы можно считать, то, что в процессе анализа морфофункционального состояния лимфоцитов обследованных больных нами была установлена возможность в режиме реального времени при исследовании морфометрических параметров нативных, не подвергавшихся предварительной обработке (фиксирование и окрашивание) клеток, получать информацию о наличии в популяции атипичных лимфоцитов - клеток Сезари.

Известно, что определение клеток Сезари в периферической крови в количестве более 5- 10% - важный патогномоничный лабораторный признак, подтверждающий диагноз синдрома Сезари и являющийся важным дифференциальным критерием в сложных случаях диагностики эритродермических состояний.

КФМ лимфоцитов периферической крови позволяет получить новую информацию о пространственно-временном статусе (микрогеометрии

поверхности, толщине слоев, показателе преломления и др.) атипичных клеток. Так, в фазово-интерференционном портрете клетки Сезари отчетливо определяется церебриформное ядро, характеризующееся складчатостью, глыбчатостью и неравномерным распределением хроматина. В центральной части ядра определяется расщелина (инцизия), что придает ядру бобовидный характер (Рис.4). Такую подробную информацию возможно получить только при исследовании клеток с помощью электронной микроскопии.

А В

Рис.4. Атипичные лимфоциты - клетки Сезари (мелкоклеточный вариант). А - электроннограмма, увеличение 3500; В- топограмма, полученная методом витальной компьютерной фазовой морфометрии, увеличение 5000.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что диагностическими морфометрическими признаками ТЗЛК могут служить более высокие значения диаметра, периметра, площади и объема Т-лимфоцитов по сравнению с нормативными показателями при достоверном снижении фазовой высоты; высокая степень гетерогенности циркулирующей популяции Т-клеток; достоверное увеличение цитотоксической и пролиферативной активности Т-лимфоцитов; обнаружение атипичных форм лимфоцитов (клеток Сезари) в количестве более 5-10% от циркулирующей популяции.

ВЫВОДЫ

1. Цитоморфологическими показателями возрастных

физиологических изменений иммунной системы являются: - увеличение индексов асимметричности гистограмм распределения клеток,

(гетерогенность циркулирующей популяции Т-лимфоцитов); - изменение соотношения малых и средних лимфоцитов (ТЫ/ТЬ2 дисбаланс); -уменьшение числа больших лимфоцитов (снижение цитотоксического потенциала) и лимфоцитов с фазовой высотой менее 1,5 мкм (уменьшение пролиферативной активности); - снижение активности В-клеточного звена иммунитета (уменьшение доли средних и больших В-лимфоцитов, клеток с низкой фазовой высотой).

2. Диагностическими морфометрическими признаками ТЗЛК могут служить: - увеличение средних значений диаметра, периметра, площади и объема Т-лимфоцитов по сравнению с нормативными показателями на 10% и более; - достоверное снижение фазовой высоты на 6% и более; - высокая степень гетерогенности циркулирующей популяции Т-клеток (правосторонняя асимметрия, правосторонний эксцесс, высокие значения ИА); - увеличение цитотоксической и пролиферативной активности Т-лимфоцитов; - выявление более 5-10% атипичных форм лимфоцитов (клетки Сезари).

3. Дифференциальная диагностика эритродермических форм псориаза с Т-клеточными злокачественными лимфомами кожи заключается в отсутствии у больных ЭФП достоверных изменений средних морфометрических параметров Т- и В-лимфоцитов, цитотоксического и пролиферативного потенциалов, однако при этом могут наблюдаться признаки внутрипопуляционной перестройки иммунокомпетентных клеток (увеличение индексов асимметричности) и ТЬ1/ТЬ2 дисбаланса, особенно в среднем и пожилом возрасте.

4. Установлена высокая степень корреляции морфометрических параметров лимфоцитов с показателями иммунограммы. В Т-клетках величины диаметра, периметра и площади положительно коррелируют с содержанием НЬА-ОШ- лимфоцитов (г = 0,39, р=0,09; г = 0,42, р<0,05; г = 0,41, р<0,05, соответственно), высота отрицательно коррелирует с СВ25+ и

НЬЛ-ОЯт (г = -0,36, р>0,05 и г = -0,36, р>0,05, соответственно). Процент больших Т-лимфоцитов - с уровнем СО 16+ и С138+ (г = 0,42, р<0,05 и г = 0,40, р<0,05). В В-клетках значения диаметра, периметра и площади положительно коррелируют с СБ20+ (г=0,41, р<0,05, г=0,52, р<0,05; г=0,52, р<0,05, соответственно). Это подтверждает, что данные компьютерной морфометрии позволяют оценить активационный, пролиферативный и цитотоксический потенциалы иммунной системы.

5. Установлен ряд витальных морфометрических показателей циркулирующих Т- и В-лимфоцитов, позволяющий одновременно оценивать особенности морфологии и функциональной активности отдельных клеток. Степень нарушения морфофункционального статуса лимфоцитов отражает тяжесть течения процесса, увеличение изменений морфометрических параметров Т-клеток имеет неблагоприятное прогностическое значение.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. КФМ целесообразно использовать для оценки состояния Т- и В-клеточного звена иммунитета, в том числе в качестве элемента программы определения биологического возраста человека.

2. КФМ лимфоцитов показано в качестве скринингового экспресс-теста для оперативной дифференциальной диагностики ТЗЛК, а также прогноза дальнейшего развития заболевания по морфометрическим показателям иммунокомпетентных клеток крови больного.

3. Преимуществом метода является минимальный объем крови (5-6 мл), отсутствие необходимости применения реактивов и дополнительного оборудования, оперативная оценка особенностей морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток.

4. Оценку морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток больных с подозрением на ТЗЛК рекомендуется проводить комплексно, с учетом активационного, пролиферативного и

цитотоксического потенциалов иммунной системы, а также с выявлением атипичных форм лимфоцитов (клеток с церебриформными ядрами).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Галлямова Ю.А., Кардашова 3.3. Лечебная косметика в наружной терапии псориаза. // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. //2006. -№1.-С.10-13.

2. Овсянникова Г.В., Василенко И.А., Метелин В.Б., Кардашова 3.3. Метод компьютерной лазерной морфометрии в диагностике эритродермических вариантов лимфом кожи //Альманах клинической медицины. - 2006. - Т.9. - С.94-96.

3. Кардашова 3.3., Василенко И.А., Бабакова C.B., Метелин В.Б., Овсянникова Г.В. Возможности витальной компьютерной морфометрии в диагностике злокачественных лимфом кожи. // Вестник последипломного медицинского образования. - 2006. - № 3-4. - С.49.

4. Кардашова 3.3., Шабалин В.И., Метелин В.Б., Василенко И.А., Бабакова C.B., Лезвинская Е.М. Морфофункциональное состояние лимфоцитов периферической крови больных пожилого возраста со злокачественными лимфомами кожи. // Материалы 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Общество государство и медицина для пожилых. М., 2006. - С.48-49.

5. Кардашова 3.3., Лезвинская Е.М., Василенко И.А. Опыт использования компьютерной морфометрии лимфоцитов крови в диагностике злокачественных лимфом кожи. //Труды 8-го конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», М., 2007. - Российский аллергологический журнал. -2007. - №3, прил. 1. - С.250.

6. Кардашова 3.3., Шабалин В.Н., Ламоткин И.А., Метелин В.Б., Василенко И.А., Бабакова C.B. Витальная морфометрия лимфоцитов периферической крови в диагностике злокачественных лимфом кожи. //4-ая научно-практическая конференция «Общество государство и медицина для пожилых», М., 2007. - С.47-48.

7. Кардашова 3.3., Шабалин В.Н., Василенко И.А., Бабакова C.B., Метелин В.Б. Роль современных компьютерных технологий в диагностике Т-клеточных злокачественных лимфом кожи //Материалы 2-го Всероссийского конгресса дерматовенерологов. Санкт-Петербург, 2007. - С.61.

8. Кардашова 3.3., Бабакова C.B., Лезвинская Е.М., Шабалин В.Н. Иммунологические аспекты Т-злокачественных лимфом кожи у больных пожилого и старческого возраста // Аллергология и иммунология. - 2007. - Т.8, №1. - С.82.

9. Кардашова 3.3., Шабалин В.Н., Василенко И.А., Бабакова C.B., Метелин В.Б. Современные подходы к диагностике Т-клеточных

злокачественных лимфом кожи. // Вестник последипломного медицинского образования. - 2007. - №1. - С.ЗЗ.

10. Kardashova Z., Shabalin V., Molochkov V., Lezvinskaya E., Vasilenko I., Babakova S. Use of computer morphometry of living blood lymphocytes for diagnosis of malignant cutaneous t-cell lymphoma. // 21st World Congress of Dermatology. Buenos Aires, Argentina, 2007. - 4415.

11. Кардашова 3.3., Лезвинская E.M., Василенко И.А. Современный взгляд на диагностику и лечение эритродермических вариантов злокачественных лимфом кожи. // Лечащий врач. - 2007. - №6. - С.27-31.

12. Кардашова 3.3., Лезвинская Е.М., Василенко И.А., Овсянникова Г.В. Дерматоонкология: компьютерная морфометрия в диагностике заболеваний. МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, г. Москва, РГНКЦ РОСЗДРАВА, 2007. - С.39-41.

13. Кардашова 3.3., Власова Е.А., Кастрикина И.С., Лысенко М.А., Модина М.А. Витальная компьютерная морфометрия клеток крови в решении клинико-диагностических задач. // Вестник последипломного медицинского образования.- 2008.- № 3-4. - С.75-77.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ

ИА - индекс асимметричности

КФМ - компьютерная фазовая морфометрия

ЛК — лимфомы кожи

МАТ - моноклональные антитела

СС - синдром Сезари

ТЫ - Т-хелперы 1 типа

Th2 - Т-хелперы 2 типа

ТЗЛК - Т-клеточные злокачественные лимфомы кожи

ФГА - фитогемагглютинин

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

ЭФП - эритродермическая форма псориаза

CD - кластеры дифференцировки

HLA - главный комплекс гистосовместимости

IgA - иммуноглобулин А

IgG — иммуноглобулин G

IgM - иммуноглобулин М

Фазовая высота - оптико-геометрический показатель клетки (произведение показателя преломления и реальной высоты клетки)

Фазовый профиль - произвольное виртуальное сечение фазово-интерференционного изображения клетки

Подписано в печать;

26.11.2008

Заказ № 1328 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы. Лимфомы кожи (ЛК) в настоящее время по сравнению с предыдущими годами встречаются сравнительно чаще и составляют 1-2% от всех кожных дерматозов. Обычно они возникают после 40 лет, причем более высокий уровень заболеваемости и распространённости ЛК отмечается у лиц старше 60 лет. Во всех возрастных группах преобладают мужчины. Пятилетняя выживаемость больных прогностически благоприятными вариантами лимфом превышает 80%, а неблагоприятными не достигает и 30% [Ястребов В.В., Рознатовский И.М., 2000].

Лимфомы кожи являются гетерогенной группой неопластических заболеваний, обусловленных пролиферацией клона лимфоцитов в коже. Они цитоморфологически сопоставимы с лимфомами других локализаций. В зависимости от особенностей поражений кожи, проявляющихся клинически и гистологически, выделяют Т-клеточные и В-клеточные лимфомы. Т-клеточные лимфомы по клинике и прогнозу отличаются более тяжелым течением и встречаются значительно чаще [Казаков Д.В., 2002; Burg G., 2000].

Этиология ЛК остаётся неясной. Выдвигаются вирусная, химическая и радиационная теории; активно обсуждается роль инфекционных и экологических факторов. Многие специалисты предполагают, что возникновение лимфом может быть обусловлено наследственными болезнями, сопровождающимися дефектами иммунитета. Однако иммунологический аспект патогенеза данной патологии остается недостаточно изученным.

Известно, что изменения иммунной системы, обусловленные возрастом, приводят к формированию физиологического иммунодефицита, преимущественно по Т- клеточному звену и ослаблению противовирусной и антибактериальной иммунной защиты организма с повышением частоты и тяжести инфекционных и онкологических заболеваний, а также аутоиммунной патологии у лиц старшего возраста [Шабалин В.Н., 2005; Семенков В.Ф. с соавт., 2005].

Центральное место в реализации иммунопатологических реакций у больных JIK принадлежит лимфоидной ткани кожи, которая представлена в не как фиксированная ткань, а как рециркулирующая через кожу популяция лимфоцитов.

В последние годы представление о патогенезе ЛК дополнилось новыми данными, полученными с помощью методов молекулярной биологии, которые показали тонкие механизмы изменений мембран пролиферирующих лимфоцитов, их кооперации с другими клетками и иммуногенетический контроль этих процессов (Bahler D.W. et al., 1992; Bakels V. et al., 1993; Wood G.S., 1991).

Критериями опухолевой природы лимфоидной пролиферации могут быть, кроме специфической цитологической и гистологической картины, результаты иммуноморфологического (имунофенотипического) исследования срезов, а также изучение морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови методом компьютерной лазерной морфометрии [Лезвинская Е.М. с соавт., 2005; Метелин В.Б., 2004].

Цель исследования.

Выявить диагностические критерии Т-клеточных злокачественных лимфом кожи на основе витальных оптико-геометрических показателей морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови с учетом возрастных особенностей иммунного статуса больных.

Задачи исследований.

1. Изучить особенности морфофункционального состояния Т- и В-лимфоцитов периферической крови практически здоровых лиц различных возрастных групп (молодого, среднего и пожилого возраста) методом витальной компьютерной морфометрии.

2. Оценить методом витальной компьютерной морфометрии показатели морфофункционального состояния Т- и В-лимфоцитов больных эритродермическими вариантами Т-клеточных злокачественных лимфом кожи среднего, пожилого и старческого возраста.

3. Выявить особенности морфофункционального статуса Т- и В-лимфоцитов периферической крови больных эритродермическими формами псориаза различных возрастных групп для дифференциальной диагностики с эритродермическими вариантами Т-клеточных злокачественных лимфом кожи.

4. Сопоставить результаты витальной компьютерной морфометрии лимфоцитов с данными традиционной иммунограммы.

5. Определить диагностическое и прогностическое значение витальных морфометрических показателей лимфоцитов периферической крови больных Т-клеточными злокачественными лимфомами кожи.

Научная новизна.

Впервые с использованием морфометрических параметров охарактеризованы и количественно оценены возрастные изменения Т- и В-лимфоцитов практически здоровых людей молодого, среднего, пожилого и старческого возрастов. Установлены морфометрические признаки формирования возрастных физиологических изменений иммунной системы.

Выявлены характерные для больных эритродермическими вариантами Т-клеточных злокачественных лимфом кожи (ТЗЛК) особенности морфофункционального состояния отдельных лимфоцитов и структуры всей циркулирующей популяции с учетом цитотоксического, активациоиного и пролиферативного потенциалов клеток.

Впервые установлена возможность идентификации в режиме реального времени атипичных форм лимфоцитов (клеток Сезари) по особенностям строения церебриформного ядра живых нативных клеток на основе анализа их оптико-геометрических параметров.

Установлена диагностическая и прогностическая значимость морфометрических показателей лимфоцитов в оценке особенностей течения эритродермических вариантов Т-клеточных злокачественных лимфом кожи у больных различных возрастных групп.

Практическая значимость.

Установлена и подтверждена в исследованиях in vitro возможность оперативной оценки пролиферативного потенциала живых лимфоидных клеток по снижению анизотропии их ядер, отражающей структурную упорядоченность хроматина.

Для диагностики и прогноза течения эритродермических вариантов Т-клеточных злокачественных лимфом кожи предложен комплекс витальных морфометрических критериев, позволяющий оценивать морфофункциональное состояние Т- и В-лимфоцитов, а также цитотоксический и пролиферативный потенциал всей лимфоцитарной популяции.

Интегральная оценка инволютивных изменений морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови по их витальным морфометрическим параметрам имеет диагностическое и прогностическое значение, способствуя своевременному выявлению иммунодефицитных и аутоиммунных состояний.

Положения, выносимые на защиту

1. Экспресс метод витальной компьютерной морфометрии может служить важным диагностическим и прогностическим тестом при оценке иммунореактивности пациентов.

2. Цитоморфологическими показателями возрастных изменений лимфоцитарного звена иммунной системы являются: увеличение гетерогенности циркулирующей популяции лимфоцитов, уменьшение средне-популяционных значений основных оптико-геометрических параметров клеток (диаметра, периметра, площади и объема), снижение их цитотоксического и пролиферативного потенциалов.

3. Цитоморфологическими диагностическими признаками Т-клеточных злокачественных лимфом кожи являются: увеличение средних значений диаметра, периметра, площади и объема Т-лимфоцитов при достоверном снижении их фазовой высоты; высокая степень гетерогенности циркулирующей популяции Т-клеток; повышение их цитотоксической и пролиферативной активности; обнаружение атипичных форм лимфоцитов (клетки Сезари) в количестве более 5-10% в общем пуле циркулирующих Т-лимфоцитов.

Апробация работы

Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на 23 Российской конференции "Морфометрия в диагностике болезней", Москва, 14 октября, 2005; 24-ая научно-практическая конференция «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 20 октября 2006; 5-ая научно практическая конференция «Новое в эстетической дерматологии: Наука и практика» Москва, 22 декабря 2006; 8-ой конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 27-29 июня 2007; Научно практическая конференция дерматовенерологов центрального федерального округа РФ. Москва,26-27 апреля 2007; 21st World Congress of Dermatology, 2007. Buenos Aires, Argentina; 2-ой всероссийский конгресс дермато-венерологов, Санкт-Петербург, 25-27 сентября 2007; 25-ая научно практическая конференция «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 19 октября, 2007; 7-ая научно практическая конференция «Новое в эстетической дерматологии: Наука и практика» Москва, 20 ноября 2007; I научно-практическая конференция «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 15 мая 2008.

Личное участие автора в разработке проблемы

Автором лично были освоены методики витальной компьютерной фазово-интерференционной микроскопии клеток крови, проведено исследование морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови практически здоровых лиц и больных ТЗЛК разных возрастных групп, анализ результатов клинико-лабораторных исследований; математическая обработка полученных данных; подготовка иллюстративного материала; публикация основных результатов исследований.

Публикации

По результатам выполненных исследований опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем и диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 120 отечественных и зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 9 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. Цитоморфологическими показателями возрастных физиологических изменений иммунной системы являются: - увеличение индексов асимметричности гистограмм распределения клеток, (гетерогенность циркулирующей популяции Т-лимфоцитов); - изменение соотношения малых и средних лимфоцитов (Thl/Th2 дисбаланс); -уменьшение числа больших лимфоцитов (снижение цитотоксического потенциала) и лимфоцитов с фазовой высотой менее 1,5 мкм (уменьшение пролиферативной активности); - снижение активности В-клеточного звена иммунитета (уменьшение доли средних и больших В-лимфоцитов, клеток с низкой фазовой высотой).

2. Диагностическими морфометрическими признаками ТЗЛК могут служить: - увеличение средних значений диаметра, периметра, площади и объема Т-лимфоцитов по сравнению с нормативными показателями на 10% и более; - достоверное снижение фазовой высоты на 6% и более; - высокая степень гетерогенности циркулирующей популяции Т-клеток (правосторонняя асимметрия, правосторонний эксцесс, высокие значения ИА); - увеличение цитотоксической и пролиферативной активности Т-лимфоцитов; - выявление более 5-10% атипичных форм лимфоцитов (клетки Сезари).

3. Дифференциальная диагностика эритродермических форм псориаза с Т-клеточными злокачественными лимфомами кожи заключается в отсутствии у больных ЭФП достоверных изменений средних морфометрических параметров Т- и В-лимфоцитов, цитотоксического и пролиферативного потенциалов, однако при этом могут наблюдаться признаки внутрипопуляционной перестройки иммунокомпетентных клеток (увеличение индексов асимметричности) и Thl/Th2 дисбаланса, особенно в среднем и пожилом возрасте.

4. Установлена высокая степень корреляции морфометрических параметров лимфоцитов с показателями иммунограммы. В Т-клетках величины диаметра, периметра и площади положительно коррелируют с содержанием HLA-DR+ лимфоцитов (г = 0,39, р=0,09; г = 0,42, р<0,05; г = 0,41, р<0,05, соответственно), высота отрицательно коррелирует с CD25+ и HLA-DR+ (г = -0,36, р>0,05 и г = -0,36, р>0,05, соответственно). Процент больших Т-лимфоцитов - с уровнем CD 16+ и CD8+ (г = 0,42, р<0,05 и г = 0,40, р<0,05). В В-клетках значения диаметра, периметра и площади положительно коррелируют с CD20+ (г=0,41, р<0,05, г=0,52, р<0,05; г=0,52, р<0,05, соответственно). Это подтверждает, что данные компьютерной морфометрии позволяют оценить активационный, пролиферативный и цитотоксический потенциалы иммунной системы.

5. Установлен ряд витальных морфометрических показателей циркулирующих Т- и В-лимфоцитов, позволяющий одновременно оценивать особенности морфологии и функциональной активности отдельных клеток. Степень нарушения морфофункционального статуса лимфоцитов отражает тяжесть течения процесса, увеличение изменений морфометрических параметров Т-клеток имеет неблагоприятное прогностическое значение.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. КФМ целесообразно использовать для оценки состояния Т- и В-клеточного звена иммунитета, в том числе в качестве элемента программы определения биологического возраста человека.

2. КФМ лимфоцитов показано в качестве скринингового экспресс-теста для оперативной дифференциальной диагностики ТЗЛК, а также прогноза дальнейшего развития заболевания по морфометрическим показателям иммунокомпетентных клеток крови больного.

3. Преимуществом метода является минимальный объем крови (5-6 мл), отсутствие необходимости применения реактивов и дополнительного оборудования, оперативная оценка особенностей морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток.

4. Оценку морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток больных с подозрением на ТЗЛК рекомендуется проводить комплексно, с учетом активационного, пролиферативного и цитотоксического потенциалов иммунной системы, а также с выявлением атипичных форм лимфоцитов (клеток с церебриформными ядрами).