Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Оценка метаболизма в лимфоцитах крови у здоровых и больных с иммунодефицитными состояниями

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НОВОСИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

РГБ ОД

КОЗЫРЬ 2 О СЕН

Наталья Леонидовна

ОЦЕНКА МЕТАБОЛИЗМА В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ У ЗДОРОВЫХ И БОЛЬНЫХ С ИММУНОДЕФИЦИТНЫМИ СОСТОЯНИЯМИ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 1999

Работа выполнена в Институте клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

д.м.н., проф., академик РАМН, В.А. Труфакин.

доктор медицинских наук, профессор В.Д. Новиков, доктор медицинских наук, А.Ю. Летягин

Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера СО РАМН, г. Красноярск

Защита состоится'

1999 года в.

часов на за-

седании диссертационного совета Д 084.52.02 в Новосибирском медицинском институте (630091, Новосибирск, Красный проспект, 52.)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Новосибирского медицинского института.

Автореферат разослан

1999 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.

Машак А.Н.

р&гя.гя* л,о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время для анализа морфоцито-химических особенностей субклеточных, клеточных, тканевых и органных структур неоспоримую ценность приобрели автоматизированные методы обработки изображения, позволяющие получить важную информацию, практически недоступную непосредственному наблюдению (Автандилов Г.Г., 1980, 1990, Мантейфель В.М., 1980, Юрина H.A., 1984, Жукоцкий A.B., 1984, Агаджанян Ж.М., 1985, Исаков В.Л., 1988, Bartels Р.Н., 1975, 1981, Belmont А., 1984). Количественное описание клеток с помощью оптических, геометрических, текстурных параметров и последующей их статистической обработкой на ЭВМ позволяет выявить объективные особенности, связанные с функциональным состоянием клеток.

Известно, что морфология и метаболизм лимфоцитов определяют суть функционирования иммунной системы (Соколов В.В., 1975, Яновская A.C., 1978, Комиссарова И.А., 1983, Нарциссов Р.П., 1984, Гольдберг Е.Д., 1986, Нагоев B.C., 1988, Робинсон М.В., 1994, Труфакин В.А., 1997), которая в тесной связи с другими системами обеспечивает течение физиологических и патологических процессов в организме, причем каждый последующий этап развития этих процессов проявляется в виде клинико-функциональных изменений со значительным отставанием во времени по отношению к изменениям на уровне мембран, органелл клеток, на уровне изменения клеточного метаболизма. Высокая чувствительность ферментов к минимальным нарушениям гомеостаза и способность лимфоцитов отражать состояние организма в целом (Нарциссов Р.П, 1968-1999) породило большое направление в области использования цитохимических исследований.

Функция ядра в целом направляет и осуществляет кардинальные процессы жизнедеятельности - рост и размножение, старение и гибель клеток, дифференцировку и функциональные особенности органов и тканей. И все эти процессы связаны с переходом определенных генов в активное или неактивное состояние и зависят от структурных изменений в ядерных нуклеопро-теидах или хроматине (Збарский И.Б., 1988, Георгиев Г.П., 1989, Эренпрейса Е.А., 1990, Weintraub Н. et. al„ 1976).

Анализ особенностей структуры хроматина лимфоцитов и цитохимических параметров лимфоцитов исследованы в различных субпопуляциях лимфоцитов, при различных иммунных реакциях, при различных физиологических процессах: онтогенез и старение, при физических нагрузках, при экологическом влиянии, - и некоторых патологических процессах и заболеваниях (Катосова Л.К., 1975, Торбек В.Э., 1986, Матвейков Г.П., 1981, Слуцкий В.Б., 1984, Булыгин Г.В., 1992, Olson G.B., 1974, Durie В., 1978, Plum J., 1980, 1984). Это дало возможность применить анализ особенностей структуры хроматина и метаболического спектра лимфоцитов в целях изучения механизмов заболеваний, диагностики и дифференциальной диагностики заболеваний, выявления стадий болезни, при назначении лечения, в прогнозе развития, течения заболевания (Качергене Н.Б., 1982, Козинец Г.И., 1986, Бутусова H.H., 1986, По-горелов В.М., 1992, Новиков В.Д., 1992, Серебрянская М.В., 1992, .Куликова И.К., 1994, Preston К., 1990, Lesty С., 1994).

Представленные литературные данные очень противоречивы и не содержат работ по комплексному оптико-структурному анализу ДНК и дегидроге-наз, а также изучению клеточного цикла лимфоцитов, что привлекло наше внимание и позволило использовать характеристики комплексного анализа в качестве критерия оценки состояния иммунной системы здоровых людей и больных ревматоидным артритом, а также использовать эти характеристики для прогноза лечения ревматоидного артрита иммунотропными препаратами: тактивином и левамизолом,- в связи с актуальностью проблемы разработки интегральной оценки иммунного статуса (Петров Р.В., 1984, Гельфгат E.JI., 1989, Ковальчук JI.B., Чередеев А.Н., 1990) и изучением роли лимфоцитов в патогенезе аутоиммунных заболеваний (Труфакин В.А., 1980, Лозовой В.П., 1981, Сперанский A.M., 1984, Ширинский B.C., 1986, Бененсон Е.В., 1991, Schwarte R.S., 1977, Fowell, 1992, Goognow, 1992, Tan, 1994). Применение в лечении аутоиммунных заболеваний иммунокорректоров довольно детально описано в последних работах. Но в данном аспекте это практически не исследовано.

Цель работы. Учитывая вышесказанное, мы поставили цель работы -провести оптико-структурный автоматизированный анализ ДНК и дегидроге-наз в лимфоцитах крови у здоровых людей и больных ревматоидным артритом в динамике иммунокоррекции тактивином и левамизолом.

Для решения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методическое и программное обеспечение для определения оптико-структурных параметров ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах крови.

2. Изучить оптико-структурные параметры ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах крови у здоровых мужчин и женщин.

3. Исследовать оптико-структурные параметры ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ревматоидным артритом.

4. Провести анализ оптико-структурных параметров ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ревматоидным артритом в динамике иммунокоррекции тактивином и левамизолом.

5. Оценить возможность прогнозирования по оптико-структурным параметрам ДНК и активности дегидрогеназ в лимфоцитах крови эффективности лечения больных РА левамизолом.

Научная новизна. Впервые разработан и проведен комплексный анализ оптико-структурных параметров ДНК, фаз клеточного цикла и энергетического метаболизма (СДГ, а-ГФДГ, ЛДГ, НАДН-Д) в лимфоцитах крови у здоровых мужчин и женщин.

Впервые по оптико-структурным параметрам ДНК и дегидрогеназ из всей популяции клинически здоровых людей выявлены группы с различным типом функционирования иммунной системы: "активированный", "неактивированный", "дефицитный", - которые характеризуются определенными взаимосвязями процессов биосинтеза ДНК и энергопродукции в лимфоцитах крови. При "активированном" типе иммунной системы показаны более высокая активность биосинтеза ДНК, высокий уровень митохондриальной энерго-

продукции в лимфоцитах. При "неактивированном" типе - большинство лимфоцитов находится в состоянии покоя (¿0 фазе), а некоторое угнетение основного пути энергопродукции (цикла Кребса) влечет компенсаторное усиление роли челночных систем. В группе с "дефицитным" типом обнаружены нарушения распределения клеток по фазам клеточного цикла и отсутствие процессов генерации энергии, как на уровне реакций биологического окисления, так и на уровне гликолиза.

Впервые комплексно исследованы оптико-структурные параметры конденсированного и диффузного хроматина, фазы клеточного цикла и энергетический метаболизм лимфоцитов у больных ревматоидным артритом, и детально описаны их динамические изменения на протяжении полугода и года при лечении больных РА тактивином и левамизолом.

Научная и практическая ценность работы. Полученные результаты свидетельствуют, что оптико-структурный автоматизированный анализ ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах может применяться в оценке иммунного статуса здорового человека и больных ревматоидным артритом. Показана его высокая информативность по сравнению с иммунологическими и эндокринными показателями.

Возможен прогноз эффективности лечения больных РА левамизолом по оптико-структурным параметрам ДНК и метаболическому спектру дегидрогеназ на каждом сроке лечения больных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Группы здоровых мужчин и женщин отличаются по оптико-структурным параметрам ДНК и дегидрогеназ.

2. Популяция клинически здоровых людей не однородна по метаболической характеристике лимфоцитов, что связано с различным типом функционирования иммунной системы.

3. Группы здоровых и больных ревматоидным артритом отличаются по оптико-структурным параметрам ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах крови.

4. Оптико-структурные параметры ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах крови изменяются в динамике лечения больных РА тактивином и левамизолом.

5. По оптико-структурным характеристикам ДНК и цитохимической активности дегидрогеназ в лимфоцитах крови возможен прогноз эффективности лечения больных ревматоидным артритом иммунотропными препаратами.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на XI съезде анатомов, гистологов, эмбриологов, Полтава, 1992; школе - конференции молодых ученых "Механизм повреждения и регуляции восстановительных процессов", Москва, 1993, научной конференции молодых ученых России "Здоровье и болезни человека на рубеже XXI века", 1994.

Апробация диссертации состоялась на расширенном семинаре кафедры гистологии Новосибирского медицинского института 22 февраля 1999 г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, резуль-

таты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, указатель литературы.

Диссертация содержит 173 страницы машинописного текста (без списка литературы), иллюстрирована 30 графиками, 12 схемами, 20 таблицами, 4 рисунками. Список литературы включает 263 литературных источников, из которых 155 отечественных и 98 иностранных авторов.

Весь материал получен и обработан лично автором.

Автор выражает благодарность д.м.н., проф. Ширинскому B.C., к.м.н. Старостиной Н.М., д.м.н. Кожевникову B.C. за оказанную методическую помощь в процессе выполнения работы. За помощь, консультирование и обсуждение результатов диссертации автор искренне благодарен д.б.н. Робинсон М.В., ст. инженеру Белану И.Б.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследовали оптико-структурные параметры ДНК и окислительно-восстановительных ферментов в лимфоцитах крови у 112 здоровых людей, жителей г. Новосибирска: 79 здоровых мужчин, 33 здоровых женщин в возрасте от 18 до 42 лет, - по комплексной программе "Разработка принципов типологической оценки иммунного статуса здорового человека" Института Клинической Иммунологии СО РАМН.

Оптико-структурные параметры ДНК и окислительно-восстановительных ферментов в лимфоцитах крови определяли у женщин, больных классической суставной формой ревматоидного артрита (РА), в возрасте от 18 до 65 лет, с активностью ревматоидного процесса 1 и 2 степени: 1 группа - 20 человек, получавшие нестероидную противовоспалительную терапию, 2 группа -15 человек, проходивших дополнительно курс лечения тактивином в динамике в течение полугода: первичные, 1 мес., 2 мес., 4 мес., 6 мес. В 3 группе, состоящей из 35 человек, проходивших дополнительно курс лечения левами-золом (в дозе 150 мг в неделю) в динамике в течение 1 года каждые 2 месяца изучали оптико-структурные параметры ДНК и цитохимическую активность этих же дегидрогеназ.

Наблюдение больных ревматоидным артритом, подбор схем лечения осуществляли специалисты Института Клинической Иммунологии СО РАМН: д.м.н., проф. Ширинский B.C. и к.м.н. Старостина Н.М.

Для определения оптико-структурных параметров ДНК лимфоциты окрашивали в мазках венозной крови ДНК по Фельгену в модификации Olson (1974).

Изучали оптико-структурные параметры окислительно-восстановител ь-ных ферментов в лимфоцитах в мазках венозной крови, взятой в утренние часы из локтевой вены: лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (L-лактат: НАД-оксидо-редуктаза (I.I.I.27)):, НАДН-диафоразы (НАДН-Д) (НАДН-диафораза (КФ 1.6.99.1)):, сукцинатдегидрогеназы (СДГ) (сукцинат: (акцептор) оксидоредук-таза (1.3.99.1)):, альфа-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) (L-глицерол-З фосфат: НАД-оксидоредуктаза (I.I.I.8)),- с применением нитросинего тетразо-лия в качестве акцептора электронов методом Кваглино и Хейхоу (1974).

Цитохимическую активность этих же дегидрогеназ в лимфоцитах в маз-

ках венозной крови определяли количественным методом Р.П. Нарциссова (1969), основанным на применении п- нитротетразолия фиолетового (Кеапа1, Венгрия), образующего в клетке темно-фиолетовые гранулы формазана. Цитохимическая активность ферментов оценивалась по среднему количеству гранул формазана, подсчитанному в 50 лимфоцитах (гранул/лимфоцит).

Измерения оптико-структурных параметров ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах проводились на сканирующем микроскопе-фотометре "Люмам ПМ-11" (ЛОМО), соединенного с микро-ЭВМ "Электроника-бОМ".

Определяли следующие оптико-структурные параметры ДНК и дегидрогеназ: количества ДНК, конденсированного и деконденсированного хроматинов и ферментов (Б1, Р1, Б1, ЯЧ), площади распределений ДНК, конденсированного и деконденсированного хроматинов и ферментов (БР, РР, БР, Я-Р), средние оптические плотности ДНК, конденсированного и деконденсированного хроматинов и ферментов (8М, РМ, БМ, №М) соответственно, - а также площадь лимфоцитов (СР).

В работе использовали статистические методы по программам, разработанным Беланом И.Б., Елисеевой Т.Н., Козырь Н.Л.: одномерный статистический анализ: расчет средней, ошибки средней, дисперсии, коэффициентов вариации, асимметрии, эксцесса, - достоверность различий групп оценивали по параметрическому критерию Стьюдента и непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни, корреляционные анализы: параметрический -Пирсона и непараметрический - Спирмена, кластерный анализ, информативность параметров рассчитывали по информационному критерию Кульбака.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Разработка методического и программного обеспечения для исследования объектов различной

структуры

Для управления подсистемой и анализа изображений клеток и тканей было разработано необходимое методическое и программное обеспечение, реализованное на диалоговом языке С>иА81С. Комплект программ состоит из двух частей. Первая - программа поиска, сканирования, предварительной обработки данных. Для исследования объектов различной структуры в интерактивном режиме разработан выбор программ: 1 - для изучения "однокомпо-нентной" структуры объекта: например, ядра, 2 - для изучения "двухкомпо-нентной" структуры объекта: например, ядра и цитоплазмы клетки, конденсированного и диффузного хроматина ядра, 3 - для измерения оптико-структурных параметров дегидрогеназ, 4 - общий случай.

Вторая часть - программа статистической обработки накопленных данных на машинном носителе по программе и дополнительных данных, вводимых с терминала. В программе реализованы: ввод, дополнение, корректировка, печать, одномерная статистическая обработка, построение графиков и двумерных диаграмм на экране дисплея, расчет коэффициента корреляции и уравнения регрессии.

2 Морфоцитохимические особенности лимфоцитов крови у здоровых людей

2.1 Сравнительная характеристика оптико-структурных параметров ДНК лимфоцитов крови здоровых мужчин и женщин

Исследования групп здоровых мужчин и женщин по оптико-структурным параметрам ДНК показали, что в группе здоровых женщин преобладают клетки с большим количеством ДНК, большей площадью распределения ДНК и меньшей средней оптической плотностью ДНК (График 1). А корреляционный анализ выявил, что в лимфоцитах с увеличением содержания ДНК в ядре увеличивается площадь распределения ДНК и уменьшается средняя оптическая плотность ДНК. Такая зависимость характерна для малодифференциро-ванной и/или пролиферирующей популяции клеток (Козинец Г.И., 1986, Тор-бек В.Э., 1986, Збарский И.Б., 1988).

У мужчин клетки с большим количеством ДНК имеют большую среднюю оптическую плотность ДНК и меньшую площадь распределения ДНК, т.е., отмечается более плотная упаковка хроматина в ядре лимфоцитов. По-видимому, популяция лимфоцитов в группе мужчин состоит из более дифференцированных клеток. Известно, что в дифференцированных клетках .хроматин представляется более конденсированным, что связано с суперспирализа-цией ДНК (Альберте Б., 1987, Збарский И.Б., 1988, Шгокаи/а К., 1978).

Подтверждением являются полученные нами данные анализа гистограмм распределений лимфоцитов -по оптико-структурным параметры ДНК и двумерных распределений ядер лимфоцитов по количеству и средней оптической плотности ДНК: .в группе женщин активно синтезирует ДНК (8 фаза) большая доля лимфоцитов, чем в группе мужчин (График 1, 2).

Наше участие в комплексной программе "Разработка

10 8 6 4 2 0 г I »д /Лд • я ' \ т Ча

25 3,25 4,25 5,25 625 7,25 825 9,25 1025 11,25

21 ■ 18' 15 12 9 6 3 0 1 С. •• ' \ ■О' \ н< \ о > X /\ 4

3 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69

1210' 8 64 2 0 0, к / < *» \ г . V/. \ о »/ \ «>/ . т У \'

39 0,13 0.17 021 025 0,29 0,33 0,37 0,41 0,45 0,49 0,53

График 1. Гистограммы распределений оптико-структурных параметров ДНК в лимфоцитах здоровых мужчин и женщин. - количество ДНК (у.е.), ЭР - площадь распределения ДНК (мкм2), ём - средняя оптическая плотность ДНК (у.е.). Обозначения: • -мужчины, -женщины.

принципов типоло-

гической оценки иммунного статуса здорового человека" совместно с сотрудниками лабораторий Института Клинической Иммунологии показало четкое согласование данных по оптико-структурным параметрам ДНК с иммунологическими. В группе женщин преобладают активирующие процессы в Т- и В-системах иммунитета, что подтверждается высокой спонтанной пролиферативной активностью лимфоцитов (СПЛ) (в 1.25 раза) и высоким пролиферативным ответом на стимуляцию ми-тогенами (ПРЛ) (в 3 раза). Различается соотношение численности регулятор-ных субпопуляций Т-лим-фоцитов: количество

"высокоаффинных" Т-лимфоцитов (ШЕ-РОК) в группе женщин превосходит в 3 раза, выше хелперно/супрессорное отношение (РЕ/ВЕ-РОК) (преобладают Т-клетки с функцией хелперов/индукторов (РЕ-РОК), количество предшественников супрессорных Т-клеток ниже (ВЕ-РОК)), что также свидетельствует о преобладании процессов активации в Т-системе иммунитета. Выше количество активированных В-лимфоцитов (ОЯ+В-кл.).

2.2 Сравнительная характеристика оптико-структурных параметров дегидрогеназ в лимфоцитах крови здоровых мужчин и женщин

Изучение метаболического спектра показало, что в группе женщин преобладают лимфоциты с высоким уровнем митохондриальной энергопродукции (СДГ и НАДН-Д) (График 3). Увеличение активности дегидрогеназ в лимфоцитах крови - признак, постоянно сопутствующий состоянию повышенной активности самих клеток (Комиссарова И.А., 1968, 1970).

У мужчин в лимфоцитах отмечается угнетение ферментных систем цикла Кребса и НАД-зависимых дегидрогеназ, а поскольку СДГ отражает заинтересованность основного пути энергообеспечения клеток, то указанная энзимо-патия ведет к нарушению основных механизмов энергообмена и активизации

2.25 3.25 4.25 5.25 6.25 7.25 8.25 9.25 10.3 11.3 12.3

2.25 3.25 4.25 5.25 6.25 7.25 8.25 9.25 10.3 11.3 12.3

График 2. Двумерное распределение ядер лимфоцитов по количеству и средней оптической плотности ДНК у здоровых мужчин и женщин.

- количество ДНК в лимфоцитах (у.е.), ЭМ - средняя оптическая плотность ДНК (у.е ).

резервных: усилению роли челночных систем, координирующих взаимосвязь процессов дыхания и гликолиза, намечается тенденция к анаэробному типу обмена: активации гликолиза.

На напряженное состояние метаболических процессов в лимфоцитах мужчин указывают более многочисленные, чем у женщин, корреляционные связи между параметрами ферментов. По мнению ряда авторов, увеличение связей между ферментами свидетельствует о неблагоприятных условиях функционирования для клетки, при этом усиление соподчиненное™ различных ферментов позволяет ей наиболее экономно использовать белковые катализаторы (Катосова JI.K., 1971, Ефимова Е.А., 1972, Терновская В.А., 1976, Яновская A.C., 1978, Булыгин Г.В., 1984, Полонская М.Г., 1992). В связи с этим, нами была предпринята попытка разобраться, в чем кроется причина "напряженного" метаболизма в лимфоцитах у здоровых мужчин.

2.3 Характеристика оптико-структурных параметров ДНК в лимфоцитах крови здоровых мужчин

С целью выделения "однородных" групп среди здоровых женщин и мужчин за основу были взяты оптико-структурные параметры ДНК и дегидроге-наз, и по всей совокупности изученных параметров был проведен кластерный анализ. Группа здоровых женщин оказалась единым целым классом. А из всей изученной популяции здоровых мужчин (79 человек) выделилось 3 класса: 1 группа - 20 человек, 2 группа - 33 человека, 3 фуппа - 26 человек.

Анализ средних значений оптико-структурных параметров ДНК в группах здоровых мужчин показал, что в 1 группе преобладают лимфоциты с наибольшим содержанием ДНК и площадью распределения ДНК. Анализ корреляционных связей выявил, что в 1 группе: клетки с большим количеством ДНК имеют большую площадь распределения ДНК и меньшую среднюю оптическую плотность ДНК. Описанные характеристики лимфоцитов мужчин 1 группы соответствуют параметрам активно синтезирующей ДНК популяции клеток, что и было подтверждено сравнительным анализом двумерных распределений ядер- лимфоцитов по количеству ДНК и средней оптической плотности (График 4): в 1 группе мужчин наибольшая доля клеток по сравнению с другими группами активно синтезирует ДНК (S фаза), а наименьшая находится в состоянии покоя (G0 фаза).

Результаты иммунологического обследования в 1 группе мужчин показали максимальный пролиферативный ответ на митогены (ПРЛ), снижение количества предшественников супрессорных Т-клеток (ВЕ-РОК), за счет чего

НйДН-Д ЛДГ СДГ а-ГФДГ

График 3. Активность дегидрогеназ в лимфоцитах у здоровых мужчин и женщин. Обозначения: I I - группа мужчин, ИЯ - группа женщин.

0.59 т 0.49 0.39 0.29 0.19 ! 0.09 2.25

ем

1 группа мужчин Б

62

3.25 4.25 5.25 6.25 7.25 8.25 9.25 10.25 11.25 12.25

2 группа мужчин

0.09

2.25 325 4.25 5.25 6.25 7.25 8.25 9.25 10.25 11.25 12.25

максимально хел-перно/супрессорное отношение (РЕ/ВЕ-РОК), максимальное количество активированных В-лимфоцитов (БЯ+В-кл.). Это подтверждает данные об активации процессов Т- и В-сис-тем иммунитета, что и позволило нам условно обозначить эту группу, как группу с "активированным" типом иммунной системы.

Анализ средних значений оптико-

структурных параметров ДНК показал, что во 2 группе - лимфоциты с наименьшим количеством ДНК и средней оптической плотностью ДНК. Анализ корреляционных связей между параметрами ДНК выявил более плотную упаковку ДНК в ядре лимфоцитов. Полученные характеристики лимфоцитов мужчин 2 группы соответствуют параметрам более дифференцированной популяции клеток, что и нашло подтверждение в анализе двумерных распределений ядер лимфоцитов по количеству ДНК и средней оптической плотности: во 2 группе мужчин большая часть клеток находится в состоянии покоя (СО), а меньшая (по отношению к этой группе) - в предсинтетическом периоде (01), и совсем малая доля клеток в фазе синтеза ДНК (Б) (График 4).

Результаты иммунологического обследования во 2 группе мужчин показали минимальную спонтанную пролиферацию лимфоцитов (СПЛ), низкий пролиферативный ответ на митогены (ПРЛ), минимальное количество активированных В-лимфоцитов (ВЯ+В-кл.). Максимальны количества Т-лимфо-цитов (КЕ-РОК), зрелых Т-лимфоцитов (ТЕ-РОК), максимально количество предшественников супрессорных Т-клеток (ВЕ-РОК), за счет чего хел-перно/супрессорное отношение (РЕ/ВЕ-РОК) - низкое. Это свидетельствует о минимальной активации процессов В- и особенно Т-системы иммунитета, что

2.25 3.25 4.25 5.25 6.25 7.25 8.25 9.25 10.25 11.25 12.25

График 4 . Двумерное распределение ядер лимфоцитов по количеству и средней оптической плотности ДНК у здоровых мужчин по группам.

- количество ДНК в лимфоцитах (у.е.), БМ - средняя оптическая плотность ДНК (у.е.).

позволило условно обозначить эту группу, как группу с "неактивированным" типом иммунной системы.

Анализ средних значений оптико-структурных параметров ДНК показал, что в 3 группе - лимфоциты со средним количеством ДНК, минимальной площадью распределения ДНК и максимальной средней оптической плотностью ДНК. Анализ корреляционных связей показал, что большее количество ДНК имеют лимфоциты с большими средней оптической плотностью и площадью распределения ДНК. В полученных характеристиках содержится некое противоречие: с одной стороны, это соответствует параметрам дифференцированной популяции клеток (минимальная площадь распределения ДНК и максимальная средняя оптическая плотность ДНК), с другой стороны, количество ДНК - среднее, а не минимальное, и прямо пропорциональная зависимость между количеством ДНК и площадью распределения ДНК говорит об обратном: об активации клеток.

Анализ двумерных распределений ядер лимфоцитов по количеству ДНК и средней оптической плотности показал (График 4), что в 3 группе наибольшая часть клеток находится в состоянии покоя (СО), а наименьшая - в пред-синтетическом периоде (в 1), но обнаруживается значительная доля клеток, активно синтезирующих ДНК (Б).

Результаты иммунологического обследования в 3 группе мужчин показали, что минимальны количества Т-лимфоцитов (КЕ-РОК), зрелых Т-лимфо-цитов (ТЕ-РОК) и незрелых (ауто-РОК), минимально количество "высокоаффинных" Т-лимфоцитов (ШЕ-РОК), снижено количество Т-клеток с функцией хелперов/индукторов (РЕ-РОК) и предшественников супрессорных Т-клеток (ВЕ-РОК), за счет чего минимально хелперно/супрессорное отношение (РЕ/ВЕ-РОК), что свидетельствует об иммунодефиците Т-сисгемы иммунитета. В то же время, обнаружена максимальная спонтанная пролиферация лимфоцитов (СПЛ), но минимальный (близкий ко 2 группе) пролиферативный ответ на митогены (ПРЛ), найдено среднее (близкое к 1 группе) количество активированных В-лимфоцитов (ВЯ+В-кл.), что проявляется максимальным количеством 1§А в сыворотке крови, максимальным количеством В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране поверхностные иммуноглобулины - это свидетельствует об умеренной активации процессов В-системы иммунитета. По-видимому, в 3 группе мужчин Т-иммунодефицит ведет к усилению спонтанной пролиферации лимфоцитов и умеренной активации процессов В-системы иммунитета, а это и объясняет наличие значительной доли активированных клеток. Все это позволило лам условно обозначить эту группу, как группу с "дефицитным" типом иммунной системы, причем в данном случае - "Т-иммунодефицит".

2.4 Характеристика оптико-структурных параметров дегидрогеназ в лимфоцитах крови здоровых мужчин Исследование метаболического статуса лимфоцитов выявило (График 5), что в 1 группе мужчин - с "активированным" типом иммунной системы преобладают лимфоциты с высоким уровнем митохондриальной энергопродукции.

Во 2 группе мужчин - с "неактивированным" типом иммунной системы, -

некоторое угнетение ферментных систем цикла Кребса влечет компенсаторное усиление роли челночных систем (а-ГФДГ).

В 3 группе - с "дефицитным" типом иммунной системы,-наблюдается отсутствие процессов генерации энергии как на уровне гликолиза, так и на уровне реакций биологического окисления. Такое состояние вызывает развитие декомпенсированного биоэнергетического дефицита и способствует необратимым изменениям структуры аэробноактивных клеток и их гибели. В результате подобного статуса энергопродуции в иммунной системе возможно развитие гипоксии ткани, которая является одним из важнейших патогенетических факторов многих заболеваний и реализуется в функции самого клеточного дыхания. В практическом отношении важно, что депрессия ферментов лимфоцитов выступает при этом как предвестник нарушений внутренних органов (Березов Т.Т., 1972, Суслова Г.Ф., 1975, Духова З.Н., 1976, Степаньковская Г.К. и др., 1978, Маргарина Н.Е., 1981, Чирков В.А., 1981 - 1983, Васильева О.Б.,1981 - 1985, Баранец H.A. и др., 1985, Дауранов И.Г., 1985, Нарциссов Р.П., Степанова Е.И., 1987, Шищенко В.М., 1988, Ва-люлис А.Р., 1993, Куликова И.К., 1994).

Итак, за основу разделения на группы популяции здоровых людей были взяты оптико-структурные параметры ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах, и выявлены группы с различным типом функционирования иммунной системы.

Кроме того, по информативности оптико-структурные параметры ДНК и дегидрогеназ оказались более значимыми по сравнению с иммунологическими показателями в группах здоровых мужчин и женщин (Таблица). 3 Морфоцитохимические особенности лимфоцитов крови у больных ревматоидным артритом

3.1 Сравнительная характеристика оптико-структурных параметров ДНК в лимфоцитах крови групп больных РА и здоровых женщин

По сравнению с больными РА у здоровых женщин большее количество диффузного хроматина вносит наибольший вклад в максимальный уровень всего хроматина, в свою очередь, количество диффузного хроматина больше за счет большей его площади распределения. Низкая средняя оптическая плотность ДНК обусловлена более низким уровнем конденсированного хроматина. Это свидетельствует о том, что у здоровых женщин в лимфоцитах

График 5. Активность дегидрогеназ в лимфоцитах у здоровых мужчин по группам._

Обозначения:! 1 -1 группа,ЕШ - 2 группа, . I » - 3 группа.

мужчины- 1 мужчины I мужчины 1 мужчины женщины | 1-2 группы | 1-3 группы | 2-3 группы

Параметры Инф. ¡Параметры Инф. ¡Параметры Инф. ¡Параметры Инф.

nFP 4.19 [aFM 3.107 IFP 4.323 рР 5.483

SI 3.93 SI 2.119 fcFP 3.375 №Р 4.992

aFM 3.25 СПЛ 1.805 [aFM 3.153 №1 4.760

IFM 3.06 pR+B-кл. 1.470 bFP 2.959 Ы=Р 4.021

cFP 2.63 nFP 1.253 pFM 2.955 ¡пРР 3.584

nFM . 2.42 McFI ' 1.090 teFI 2.798 ВМ 3.568

aFP 2.24 k.JgG 1.072 ISP 2.266 №М 3.011

IFP 2.21 ТЕ-РОК 0.981 SM 2.202 СР 2.845

CP 2.21 IFI 0.938 piFI 2.127 № 2.700

cFI 1.83 L:FP 0.917 (CP 1.974 ®Р 2.449

c.IgG 1.342 aFP 0.731 '¡aFI 1.906 [ТЕ-РОК 1.931

SP 1.28 ПРЛ 0.729 IEFI 1.789 В1 1.745

ПРЛ 1.165 c.IgM 0.725 pFM 1.640 пР1 1.545

ШЕ-РОК 1.141 M.IgG 0.700 pFP 1.504 рт 1.538

M-POK 1.09 piFM 0.681 M-POK 1.142 |DR+B-кл. 1.383

СПЛ 1.038 BE-POK 0.661 M.lgE 1.069 ВРМ 1.331

aFI 1.02 CP 0.621 ШЕ-РОК 0.834 СПЛ 1.212

c.lgA 0.837 kFI 0.596 ПРЛ 0.789 ¡ВЕ-РОК 1.086

M.IgG 0.744 DR+T-кл. 0.594 IFM 0.748 В-лимф. 1.038

Ауто-РОК 0.659 BP 0.493 BE-POK 0.722 |Т-лимф. 0.953

c.IgM 0.619 ГГ-лимф. 0.459 TE-POK 0.684 КЕ-РОК 0.848

KE-POK 0.539 В-клетки 0.459 (Г-лимф. 0.668 ЬРМ 0.777

DR+B-кл. 0.531 jc.lgA 0.441 KE-POK 0.622 р.1дС 0.744

nFI 0.52 KE-POK 0.430 C.IgG 0.622 крМ 0.734

SM 0.45 M.lgE 0.413 ¡DR+T-кл. 0.613 м.1дЕ 0.495

Лимф-ты 0.409 ШЕ-РОК 0.403 В-клетки 0.607 р1имф-ты 0.468

(PE/BE)-POK 0.339 cFM 0.377 t.IgM 0.469 РЕ-РОК 0.439

cFM 0.29 SM 0.319 СПЛ 0.426 м.1дв 0.353

IFI 0.26 №E/BE)-POK 0.271 SI 0.380 куто-РОК 0.261

PE-POK 0.245 «FP 0.271 p.lgA 0.368 Ь.1дМ 0.251

BE-POK 0.216 ¡Ауто-РОК 0.269 KPE/BE)-pOK 0.350 pR+T-кл. 0.245

Ni.IgM 0.188 ¡Лимф-ты 0.234 Лимф-ты 0.338 м.1дМ 0.197

TE-POK 0.148 IFM 0.195 M.IgG 0.309 |ПРЛ 0.196

DR+T-кл. 0.134 UFI 0.194 PE-POK 0.257 р.!дА 0.160

В-лимф. 0.121 PE-POK 0.156 DR+B-кл. 0.235 <РЕ/ВЕ)-РОК 0.121

Т-лимф. 0.117 ¡M.IgM 0.115 Ауто-РОК 0.134 ¡ШЕ-РОК 0.041

M.lgE 0.071 ¡M-POK 0.000 |м.1дМ 0.112 М-РОК 0.000

Таблица информативности иммунологических и оптико-структурных параметров при сравнении групп здоровых мужчин и женщин и при попарном сравнении групп здоровых мужчин. Примечание: иммунологические данные получены сотрудниками Института Клинической Иммунологии СО РАМН. Обозначения параметров Т- и В-систем иммунитета: розетки: КЕ-РОК - комплексные, Ауто-РОК - аутологичные, М-РОК - мышиные, ТЕ-РОК - тотальные, ШЕ-РОК - шейкерные, РЕ-РОК - ранниз ВЕ-РОК - восстановленные, СПЛ - спонтанная пролиферация лимфоцитов, ПРЛ - индекс пролиферации лимфоцитов при стимуляции митогенами, м.1дМ, м.1дО, м.1дЕ - мембранные иммуноглобулины, с.1дМ, с.1дА, с.1дС - сывороточные иммуноглобулины, ОК+Т-кл. - активированные Т-лимфоциты, ОИ+В-кл. - активированные В-лимфоциты.

более активно проходит деконденсация хроматина и синтез ДНК (График 7). Очевидно, что в ходе активации генов, прежде всего, при транскрипции, структура хроматина должна претерпевать глубокие изменения, и эти изменения, в первую очередь, выражаются в деконденсации, деком-пактизации генетического материала (Ман-тейфель В.М., 1980, Сар-кисов Д.С., 1980, Жукоц-кий А.В. 1984, Георгиев Г.П., 1989, Harris Н., 1968, Weintraub Н. et. al., 1976).

В подтверждение этому показано, что в группе здоровых женщин активно синтезирует ДНК (S) и находится в пред-синтетическом периоде (G1) большая доля лимфоцитов, чем в группе больных РА (График 6).

В группе обследованных нами больных РА основная часть лимфоцитов находится преимущественно в состоянии покоя (GO). Низкая наполненность пула клеток в G1 фазе клеточного цикла, возможно, свидетельствует о быстром прохождении кпеток G1 фазы, а некоторое накопление лимфоцитов в S фазе клеточного цикла, возможно, связано именно с гиперактивацией В-кле-ток, которая является одной из гипотез патогенеза РА.

При аутоиммунных заболеваниях наблюдается изменение соотношения субпопуляций лимфоцитов с различной степенью дифференцированности и различным уровнем пролиферативной активности (Робинсон М.В., 1982). Иммунологическая характеристика обследованных нами больных РА совместно с д.м.н. Ширинским B.C. и к.м.н. Старостиной Н.М. была типичной: умеренная Т-лимфоцитопения, снижение у части больных активности неспецифических Т-супрессоров, увеличение содержания иммунных комплексов и др. (Ширинский B.C., 1986, Михеенко Т.В., 1989). Показано, что у здоровых лиц супрессорное влияние Т-клеток на В-клетки, активированные митогеном, достоверно выше, чем у больных РА (Ширинский B.C., 1985, Бененсон Е.В., 1991). Отмеченные сдвиги в соотношениях Т- и В-лимфоцитов могут приво дить к гиперактивации В-клеток (Бененсон Е.В., 1991).

0.44 0.39 -0.34 -0.29 -0.24 0.19 -0.14 --

2.25 3 25 4.25 5.25 6.25 7.25 8.25 9.25 10.3 1 1.3 12.3

График 6. Двумерное распределение ядер лимфоцитов по количеству и средней оптической плотности ДНК у здоровых женщин и больных РА.

- количество ДНК в лимфоцитах (у е.), БМ - средняя оптическая плотность ДНК.

8.6

8.4 • ,4!

8.2 -

8 ■

7.8 -

7.6 -

7.4

7.2 -

7 ■

Здоровые

36 т 33 ЭР 30 ■• 27 24 21 18 ■■ 15

Здоровые

0.45 0.4 0.35 ■ 0.3 0.25 -0.2

ЭМ

Здоровые

67 т 65 63 61

Здоровые

Больные РА

Больные РА

Больные РА

СР гЬ

-■ - I

*

Больные РА

I

Здоровые

Больные РА

20 т

18 16 -141210

.РР

Здоровые

Больные РА

0.5 т 0.46 0.42 0.38 0.34 0.3

РМ

Здоровые

Больные РА

2.5 т 2

01 -5-

--

Здоровые

Больные РА

12-г

ю--ОР 8 - -6 -42 0

I

Здоровые

Больные РА

0.22 т 0.2 0.18 -0.16 -0.14 -0.12 -0.1 •-

■ Ш!

I

Здоровые

Больные РА

График 7. Средние значения оптико-структурных параметров ДНК в лимфоцитах здоровых женщин и больных РА. П, Р1 - количества ДНК, конденсированного, деконденси-рованного хроматина (у.е.)- БР, ИР, йР - площади распределений ДНК, конденсированного, деконденсированного хроматина (мкм2). БМ, РМ, ОМ - средние оптические плотности ДНК, конденсированного, деконденсированного хроматина (у.е.). СР - площадь лимфоцитов (у.е ).

3.2 Сравнительная характеристика оптико-структурных параметров дегидрогенаэ в лимфоцитах крови групп.больных РА и здоровых женщин

Исследование метаболического спектра лимфоцитов у больных РА показало усиление координирующей роли глицерофосфатного шунта. Наблюдается тенденция к усилению анаэробных процессов: активнее работают ферменты гликолиза в сочетании с индукцией ферментных систем цикла Кребса (График 8). В этом случае возможна быстрая и адекватная генерация энергии в клетке (Racker Е., 1967, Lehninger А., 1985), этот механизм, обеспечивает стабильность энергетического гомеостаза в условиях гипоксии ткани в пораженных суставах и свидетельствует о сохранности механизмов энергообеспечения в лимфоцитах данной группы больных РА с легким и средней тяжести течением заболевания.

Таким образом, полученные нами результаты согласуются с литературными данными, в которых показано повышение активности СДГ и а -ГФДГ при обострении РА (Комиссарова И.А.,

1969, Сура В.В.,

1970, Улыбина

О.В., 1980, Побережная Т.Э., 1983). При высокой активности заболевания в лимфоцитах активизированы процессы гликолиза и цикла трикарбоновых кислот (Алиханова К. А., 1981).

4 Морфоцитохимические особенности лимфоцитов крови у больных ревматоидным артритом в динамике лечения

тактивином

4.1 Сравнительная характеристика оптико-структурных параметров ДНК в лимфоцитах крови больных ревматоидным артритом

В течение 6 месяцев лечения больных РА тактивином в лимфоцитах происходило увеличение количества ДНК, увеличение площади распределения ДНК и снижение средней оптической плотности ДНК. Все это свидетельствует об активации лимфоцитов. В процессе лечения больных РА тактивином все оптико-структурные параметры ДНК стремятся к значениям параметров здоровых женщин.

Интересно, что на протяжении 4 месяцев лечения тактивином количество

2,6

2.3 2

1,7

1.4 1,1 0,8 0,5

Fl

"Щ т

■; f

; к" л- 1

ДОГ

СДГ

а-ГФДГ

График 8. Активность дегидрогенаэ в лимфоцитах здоровых женщин и больных РА.

Обозначения: г I - здоровые женщины, СЭ - больные РА.

ДНК увеличивалось за счет увеличения площади распределения ДНК и снижения ее средней оптической плотности, что характерно для малодифференцирован-ных клеток, активно синтезирующих ДНК. Однако через 6 месяцев лечения происходит качественная перестройка хроматина, на что указывает корреляционный анализ: появляется более плотная упаковка хроматина в ядре, характерная для зрелых дифференцированных клеток, - это согласуется с данными о влиянии такти-вина на степень дифферен-цировки и специализации Т-лимфоцитов из незрелых клеток-предшественников.

Сопоставление этих данных с анализом фаз клеточного цикла лимфоцитов (График 9) показало, что в процессе лечения больных РА тактивином отмечается усиление активации лимфоцитов: увеличивается количество лимфоцитов в пред-синтетической и синтетической фазах клеточного цикла (Gl, S).

Литературные данные указывают на низкую про-лиферативную активность Т-лимфоцитов у больных РА и преобладание незрелых клеток (Сперанский A.M. и др., 1984, Бененсон Е.В. и др., 1984, 1988, Ши-ринский B.C. и др., 1986).

Можно предположить, что полученные нами ре-

0.59 0.49 0.39 0.29 0.19

SM

Первичные больные S

SI

0.09 ■

ч-1-1-1-

ч-н

н

2.25 3.25 4.25 5.25 6.25 7.25 6.25 9.25 10.3 1 1.3 12.3

0.59 -г 0.49 --' 0.39 •0.29 0.19 --

SM

со

1 месяц печения тактивином

SI

0.09

н-

-+-

-+-

-+-

н

2.25 3.25 4.25 5.25 6.25 7.25 8.25 9.25 10.3 11.3 12.3

2,25 3,25 4,25 5,25 6,25 7,25 8,25 9,25 10,3 11,3 12,3

График 9. Двумерное распределение ядер лимфоцитов по количеству и средней оптической плотности ДНК у больных РА в динамике лечения тактивином. - количество ДНК в лимфоцитах (у.е.), ЭМ - средняя оптическая плотность ДНК (у.е.).

Здор-е первич. 1мес. 2мес. 4мес. бмес.

зультаты свидетельствуют о возросших процессах пролиферации и дифферен-цировки, прежде всего, в Т-лимфоцитах, нормализации соотношения Т-субпо-пуляций за счет повышения активности неспецифических Т-супрессоров. Так как известно, что тактивин избирательно стимулирует регуляторные Т-клетки (Goldstein G., 1978), оказывает наибольшее иммуномодулирующее влияние на Т-супрессоры (Арион В.Я. и др., 1985).

4.2 Сравнительная характеристика оптико-структурных параметров дегидрогеназ в лимфоцитах крови

больных ревматоидным артритом в динамике лечения тактивиком

Анализ метаболической активности лимфоцитов показал (График 10), что у первичных больных РА в лимфоцитах наблюдается снижение уровня ми-тохондриальной энергопродукции, компенсаторно активированы резервные механизмы энергообеспечения - усиливается роль челночных систем (а-ГФДГ) и активнее работают ферменты гликолиза (ЛДГ).

Показано, что в результате лечения больных РА тактивином нормализуются основной и резервный пути энергообеспечения лимфоцитов (цикл Кребса и гликолиз). Однако на серьезные нарушения метаболического статуса лимфоцитов в результате длительного хронического течения РА указывает неуклонное возрастание активности (гиперактивация) а-ГФДГ, стремящееся компенсировать продолжающееся снижение активности НАД-за-висимых дегидрогеназ (НАДН-Д).

Здор-е первич. 1мес. 2мес. 4мес. бмес.

Здор-е первич. 1мес. 2мес. 4мес. бмес.

Здор-е первич. 1мес. 2мес. 4мес. бмес.

График 10. Активность дегидрогеназ в лимфоцитах больных РА в динамике лечения тактивином.

р| - активность дегидрогеназ (у.е.).

-185 Морфоцитохимические особенности лимфоцитов крови больных РА в динамике лечения левамизолом 5.1 Характеристика оптико-структурных параметров ДНК в лимфоцитах крови групп больных РА с различными эффектами действия левамизола

К концу года лечения больных РА левамизолом специалистами по ряду клинических признаков (время утренней скованности, сила сжатия кисти, суставной счет, окружность межфаланговых проксимальных суставов, функциональный тест, суставной .индекс и др.) "были выделены группы по исходам лечения: 15 больных с положительным клиническим эффектом, у 9 больных не наблюдалось клинического эффекта, и у 11 больных развились осложнения, потребовавшие симптоматической терапии или отмены препарата.

Ретроспективный анализ динамики оптико-структурных параметров ДНК показал, что каждая из 3 групп имеет свою характерную динамику изменений, и отражает динамическую картину перераспределения клеток по фазам клеточного цикла в процессе лечения левамизолом.

У первичных больных в группах с положительным и побочным эффектами лимфоциты распределены по всем фазам клеточного цикла, а в группе без эффекта - преимущественно в G1 фазе клеточного цикла, что можно объяснить увеличением продолжительности G1 периода за счет блоковых задержек, что согласуется с литературными данными о найденном у больных РА G1/S блоке (Бененсон Е.В. и др., 1991, Boavoisin В. et. al., 1984, De Franco et al., 1985). При этом длительность блоковых задержек пропорциональна глубине повреждения клеток (Акоев И.Г., 1988).

Необходимо отметить, что в группе больных с положительным эффектом уже через 2 месяца лечения левамизолом и до 8 месяцев лечения наблюдается увеличение пула клеток в GO периоде, а усиление активности биосинтеза ДНК в лимфоцитах (увеличение количества клеток в S-G2 фазах клеточного цикла) происходит конца лечения. Полученные результаты отражают подобие эффекта действия левамизола и тактивина, которое объясняется сходством их третичных структур (Чумакова М.М., 1978, Goldstein G., 1978). В группе больных без эффекта "восстановление" распределения клеток по фазам клеточного цикла отмечено через 8 месяцев лечения: увеличение пула клеток в GO периоде происходит до конца лечения. Можно предположить более позднее восстановление нормального соотношения субпопуляций и функционирования иммунной системы, что задержало наступление клинического эффекта. В группе больных с побочным эффектом через 2 месяца лечения не замечено влияния левамизола на перераспределение лимфоцитов по фазам клеточного цикла, а в последующем наблюдалось рассогласование в перераспределении лимфоцитов.

Можно полагать, что у больных РА рассогласование перераспределения лимфоцитов по фазам клеточного цикла отражает рассогласование процессов пролиферации, дифференцировки и гибели лимфоцитов (Труфакин В.А., 1980, Tan, 1994), что связано с дисбалансом популяций лимфоцитов при развитии аутоиммунного состояния.

-195.2 Характеристика цитохимической активности

дегидрогенаэ в лимфоцитах крови больных ревматоидным артритом с различными эффектами действия левамизола

Исследования цитохимической активности дегидрогенаэ в лимфоцитах больных РА с разными эффектами лечения левамизолом в динамике выявили гиперактивацию СДГ (График 11). Левамизол относится к группе препаратов, способных ограничить патологическую гиперактивность физиологических реакций, их действие приводит к лучшему гомеостазированию: снижение избыточной активности связано и с подъемом ослабленной (Кондрашова М.Н., 1985).

Колебания активности СДГ в динамике лечения, по-видимому, связаны как с автоколебаниями митохондрий (Холмухамедов Э.Л., 1980), так и с динамикой развития гиперактивного состояния митохондрий, в ходе которых наблюдается переход от вспышки дыхания в ответ на начальное воздействие в первом колебании, почти не сдерживаемом торможением, к ответу, сильно ограниченному торможением СДГ (Кондрашова М.Н., 1987), что связано с механизмами реципрокной регуляции активности СДГ (Chance В., 1961 ).

В группе больных с положительным эффектом наблюдается наивысший уровень митохондриальной энергопродукции, быстрее и лучше всего нормализуется низкая активность НАДН-Д, высокая активность а-ГФДГ активность ЛДГ колеблется около нормальных значений.

В группе больных с побочным эффектом минимальный уровень гиперактивности СДГ сменяется более сильной гиперактивацией СДГ, что является неадекватной реакцией на тормозящее действие левамизола. Для этой группы больных характерны колебания очень высокой амплитуды (от максимальных до минимальных) активностей НАДН-Д, а-ГФДГ и ЛДГ.

Возможно, именно максимальным уровнем перенапряжения митохондриальной энергопродукции у больных группы с положительным эффектом и объясняется наступившая после 12 месяцев лечения максимальная полная депрессия всех изучаемых дегидрогенаэ, что, однако, является очень неблагоприятных прогностическим признаком, который значительно опережает возможные негативные иммунологические и клинические проявления у данной группы больных (Нарциссов Р.П., 1984).

Надо заметить, что в группе больных РА, проходивших курс лечения так-тивином, через два месяца лечения также отмечается депрессия ведущих дегидрогенаэ цикла Кребса и гликолиза, отмечается тенденция к снижению уровня НАДН-Д и значительная "регрессия" по параметрам ДНК, - что также указывает на критическую точку - переломный момент в лечении.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения дополнительно к традиционному лечению и иммунокоррекции метаболической терапии. Использование кофакторов энергообмена связано со стимуляцией митохондриальной энергопродукции в условиях глубокого биоэнергетического дефицита (Верницкайте Р.Б., 1983, Баран.ец H.A. и др., 1985, Дауранов И.Г., 1985, Нарциссов Р.П., 1986, Куликова И.К., 1994).

24 -• 22 ■■ 20 • • 18 16 -14 •12 -10 •■ 8 ■■ 6

26 -■

24 -• 22 -20 -18 -16 ■ -14 JS 12 •• 10 8 ■■ 6

111 IV

График 11. Цитохимическая активность дегидрогеназ в лимфоцитах больных РА с разными эффектами лечения левамизолом в динамике (количество гранул/ лимфоцит).

Сроки обследования больных: К - здоровые женщины, 0 - первичные больные, I - 2 месяца лечения, II - 2 месяца лечения, III - 6 месяцев лечения, IV - 8 месяцев лечения, V - 10 месяцев лечения, VI - 12 месяцев лечения.

Обозначения: —- - положительный эффект,-- без эффекта, — . —

побочный эффект.

5.3 Прогноз эффективности лечения больных РА левамизолом по оптико-структурным параметрам ДНК и цитохимической активности дегидрогеназ в лимфоцитах

Изучалось лечебное действие левамизола при коллагенозах, включая РА (Бунчук Н.В., 1977, Фарбер H.A., 1980, Anglejan G., 1977, Huskisson Е., 1976, Ruuskanen О., 1976, Runge L., 1977, Symoens J., 1978). Показано, что терапевтический эффект достигается на 6 неделе - 3 месяце и достигает оптимума к 8 -10-12 месяцу (Матулис А. и др., 1982).

Известно, что методы прогноза результатов лечения позволяют с высокой точностью прогнозировать эффективность лечения и возможность развития осложнений, избежать необходимости ожидания в течение нескольких месяцев результатов лечения.

Проведенный нами одномерный статистический анализ оптико-струк-

турных параметров ДНК и цитохимической активности окис-

лительно-восстанови-тельных ферментов в ретроспективно выделенных группах больных РА по эффекту действия левамизола (График 11, 12), рассматривающиеся как "обучающие выборки", на основе которых в дальнейшем уже у первичных больных по параметрам 81, БР можно выделить группу без положительного эффекта, а по БМ - все три группы. Через 2-6 месяцев показатели 81, БР, БМ различаются во всех трех группах больных и т. д. Таким образом, прогноз поло-

жительного эффекта и развития осложнений возможен по оптико-структурным параметрам ДНК лимфоцитов крови на всех сроках обследования больных РА в процессе лечения левамизолом, а прогноз отсутствия положительного эффекта возможен через 2 -6 и 10 месяцев.

По показателям цитохимической активности у первичных больных можно выделить группу больных с положительным эффектом по высокой активности ЛДГ и а-ГФДГ, а группу больных с побочным эффектом по более низкой активности ЛДГ и а-ГФДГ (График 11). Через 2 месяца лечения левамизолом по высокой активности НАДН-Д можно выделить группу больных с положительным эффектом. Через 4 месяца по показателям активности НАДН-Д, ЛДГ, СДГ, а-ГФДГ различались все три группы больных и т. д. Таким образом, прогноз положительного эффекта и развития осложнений возможен по

5.5 -1-:--1-1-1-1-1-К

здрр-е переж. 2мес. 4мес. бмес. 8мес. 10мес. 12мес.

0.17

эдор-е лервт. 2мес. 4мее. бмес. 8мес. 10мес. 12мес.

График 12. Средние значения оптико-структурных параметров ДНК в лимфоцитах больных РА с разными эффектами лечения левамизолом в динамике. - количество ДНК (у.е.), ЭР - площадь распределения ДНК (мкм2), ЭМ - средняя оптическая плотность ДНК (у.е.). Обозначения: - положительный эффект,- - без положительного эффекта, — ■ - побочный эффект.

цитохимической активности дегидрогеназ в лимфоцитах крови на всех сроках обследования больных РА в процессе лечения левамизолом (за исключением 2 месяцев лечения для прогноза побочного эффекта), а прогноз отсутствия положительного эффекта возможен через 4, 6 и 10-12 месяцев.

Суммируя полученные результаты, показано, по данным одномерного статистического анализа прогноз эффективности лечения левамизолом возможен и позволяет до лечения, на ранних и на более поздних сроках лечения выделять группы больных, у которых левамизол вызывает побочный эффект, либо не дает положительного эффекта.

ВЫВОДЫ

1. Разработано методическое и программное обеспечение для определения оптико-структурных параметров ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах.

2. В группе здоровых женщин по сравнению с мужчинами больше площадь лимфоцитов, площадь распределения ДНК, количество ДНК в лимфоцитах, активированы процессы биосинтеза ДНК (Б фаза) и большее число лимфоцитов находится в предсинтетическом периоде (в1 фаза), преобладают лимфоциты с высоким уровнем митохондриальной энергопродукции (СДГ и НАДН-Д).

3. В группе здоровых мужчин в лимфоцитах отмечается более плотная упаковка ДНК в ядре, наблюдается угнетение ферментных систем цикла Креб-са и НАД-зависимых дегидрогеназ и активизация резервных путей энергопродукции (а-ГФДГ); определены более многочисленные, чем у женщин, корреляционные связи между параметрами ферментов.

4. По оптико-структурным параметрам ДНК и дегидрогеназ в лимфоцитах крови группа здоровых женщин оказалась единым целым классом с "активированным" типом иммунной системы, а из группы здоровых мужчин выделилось 3 класса с различным типом функционирования иммунной системы: "активированный", "неактивированный", "дефицитный".

4.1."Активированный" тип иммунной системы характеризуется более высокой активностью биосинтеза ДНК в лимфоцитах и более высоким уровнем митохондриальной энергопродукции.

4.2."Неактивированный" тип иммунной системы характеризуется тем, что большинство лимфоцитов находится в состоянии покоя (СО фаза), а некоторое угнетение основного пути энергопродукции (цикла Кребса) влечет компенсаторное усиление роли'челночных систем (а-ГФДГ).

4.3.При "иммунодефицитном" типе обнаруживаются нарушения в распределении клеток по фазам клеточного цикла и отсутствие процессов генерации энергии, как на уровне реакций биологического окисления, так и на уровне гликолиза.

5. В группе больных РА по сравнению со здоровыми показана более низкая активность биосинтеза ДНК в лимфоцитах, низкая наполненность пула клеток в фазе клеточного цикла; активизированы резервные механизмы энергообеспечения (а-ГФДГ), наблюдается тенденция к усилению анаэробных процессов (ЛДГ).

6. В процессе лечения больных РА тактивином происходит активация про-

цессов биосинтеза ДНК в лимфоцитах, активности СДГ и ЛДГ в процессе лечения у больных РА приближаются к значениям здоровых женщин, активность а-ГФДГ значительно увеличивается, а НАДН-Д снижается.

7. Ретроспективный анализ динамики оптико-структурных параметров ДНК и активности дегидрогеназ у больных РА с разными эффектами лечения левамизолом показал:

7.1.В группе больных с положительным эффектом, начиная с 2 месяцев лечения левамизолом и до 8 месяцев лечения, наблюдается увеличение пула клеток в GO периоде и до конца лечения усиление активности биосинтеза ДНК в лимфоцитах. Наблюдается наивысший уровень мито-хондриальной энергопродукции, активность а-ГФДГ нормализуется быстрее, чем в других группах, активность ЛДГ близка к нормальной.

7.2.В группе больных без эффекта "восстановление" распределения клеток по фазам клеточного цикла отмечено через 8 месяцев лечения: увеличение пула клеток в GO периоде происходит до конца лечения.

7.3.В группе больных с побочным эффектом через 2 месяца лечения не замечено влияния левамизола на перераспределение лимфоцитов по фазам клеточного цикла, а в последующем наблюдалось рассогласование в перераспределении лимфоцитов. Показаны колебания с высокой амплитудой активностей НАДН-Д, а-ГФДГ и ЛДГ.

8. Возможен прогноз эффективности лечения левамизолом по оптико-структурным параметрам ДНК и активности дегидрогеназ, который позволяет до лечения, на ранних и более поздних сроках лечения выделять группы больных с различным эффектом действия левамизола.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Метод анализа цитохимического спектра лимфоцитов и оптико-структурных параметров ДНК и дегидрогеназ внедрен в следующие учреждения: 1. Институт комплексных проблем и профессиональных заболеваний (г. Новокузнецк); 2. Семипалатинский медицинский институт; 3. Институт клинической иммунологии СО РАМН; 4. Медицинские учреждения Сибирского военного округа; 5. Институт патологии кровообращения МЗ РФ; 6. Новосибирский медицинский институт и другие НИИ и практические медицинские учреждения.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Труфакин В.А., Робинсон М.В., Козырь Н.Л. Применение цитохимического анализа лимфоцитов в характеристике аутоиммунных заболеваний // Сб. "Профилактика, диагностика и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичных иммунодефицитов".- Новосибирск. 1985,- Т.1.- С.35.

2. Труфакин В.А., Робинсон М.В., Козырь Н.Л., Быханова Г.И. Цитохимия лимфоцитов как показатель реактивности организма // Тезисы 1-го съезда морфологов Таджикистана.- Душанбе. 1985.- С.228.

3. Козлов В.А., Труфакин В.А., Робинсон М.В., Козырь Н.Л. Влияние стимулятора антителопродуцентов (САП) на иммуногематологические показатели экспериментального аутоиммунного процесса // В кн. "Нейро-гуморальная регуляция иммунного гомеостаза",- Ленинград. 1986.-

С.144.

4. Козырь H.JI., Робинсон М.В., Труфакин В.А. Использование цитохими-чеких показателей лимфоцитов периферической крови для прогноза эффективности лечения больных ревматоидным артритом // Методология, организация и итоги массовых иммунологических исследований. Тез. докл. Всесоюз. конф.- Ангарск. 1986.- С.47.

5. Труфакин В.А., Робинсон М.В., Козырь Н.Л., Быханова Г.И. Оценка им-ммунологической реактивности у больных ревматоидным артритом с помощью цитохимического анализа лимфоцитов // В кн. "Актуальные вопросы практ. иммунологии".- Таллин. 1986.- С.34.

6. Козырь Н.Л., Робинсон М.В., Труфакин В.А. Использование цитохими-чеких показателей лимфоцитов периферической крови для прогноза эффективности лечения больных ревматоидным артритом // Оценка и коррекция состояния иммунной системы в клинике и эксперименте.- Новосибирск. 1987,- С.32-36.

7. Труфакин В.А., Робинсон М.В., Козырь Н.Л. Активность мембранных ферментов лимфоцитов в норме и при аутоиммунных процессах и заболеваниях // Тез. докл. "IV Всесоюз. конф. по патологии клетки".- Москва.

1987,-С. 162.

8. Костерина Л.П., Труфакин В.А., Козырь Н.Л., Коновалова Л.А. Оценка метаболизма циркулирующих лимфоцитов у мышей при развитии аутоиммунной патологии // Механизмы патологических реакций,- Томск.

1988.- Т.5.- с.81-85.

9. Козырь Н.Л., Белан И.Б. Применение метода автоматизированной обработки изображений для исследования морфофункциональных особенностей иммунокомпетентных клеток // Механизмы повреждения и регуляция восстановительных. Тез. докл. школы-конф. молодых ученых.- Новосибирск. 1988,- С.79.

Ю.Шурлыгина A.B., Робинсон М.В., Литвиненко Г.И., Козырь Н.Л. Мор-фоцитохимические параметры лимфоцитов в биоритмологических и экологических исследованиях // Тез. докл. XI съезда АГЭ.- Полтава. 1992,-С.159.

11.Козырь Н.Л., Белан И.Б. Изучение активности окислительно-восстановительных ферментов и структуры ядерного хроматина в лимфоцитах периферической крови у больных ревматоидным артритом и здоровых людей с помощью оптико-структурного компьютерного анализа // Тез. докл. школы-конф. молодых ученых.- Москва. 1993.- С.79.

12.Robinson М., Kozyr N., Trufakin V. The activity of dehydrogenases and DNA content in the lymphocytes of rheumatoid arthritis patients // Abstr. of the 12th European Immunology Meeting.- Barcelona. 1994.- P.236.

13.Trufakin V., Robinson M., Kozyr N., Belan I. Image analysis of lymphocytes: the way to the understanding of physiological and pathological processes II Proc. Royal Microscopical Society.- 1994,- V.29.- N 4,- P.243.

14.Козырь Н.Л., Белан И.Б., Робинсон M.B., Труфакин В.А. Применение оптико-структурного машинного анализа лимфоцитов в физиологических и

патологических исследованиях. // Матер. 3-го съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока,- Новосибирск. 1997.- С. 168.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РА - ревматоидный артрит

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

НАДН-Д - НАДН-диафораза

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

а-ГФДГ - а-глицерофосфатдегидрогеназа

СР - площадь лимфоцитов

81 - количество ДНК

БР - площадь распределения ДНК

ЭМ - средняя оптическая плотность ДНК

Р1 - активность фермента

РР - площадь распределения фермента

РМ - средняя оптическая плотность фермента

КЕ-РОК - комплексные розетки

Ауто-РОК - аутологичные розетки

ТЕ-РОК - тотальные розетки

ШЕ-РОК — шейкерные розетки

РЕ-РОК - ранние розетки

ВЕ-РОК - восстановленные розетки

СПЛ - спонтанная пролиферация лимфоцитов

ПРЛ - индекс пролиферации лимфоцитов при стимуляции митогенами ВЯ+В-клетки - активированные В-клетки.

»

Заказ 35. Тираж 100. Печ. л. 1,0. Формат 60x84/16. Бумага офсетная №1

Типография СО РАМН, 630117, Новосибирск, ул. Ак. Тимакова, 9, 1999 г.