Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Закономерности изменений метаболизма лимфоцитов при иммунодефицитных состояниях

£

*■>■* На правах рукописи

о*

КАЗАКОВА Галина Николаевна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ МЕТАБОЛИЗМА ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЯХ (КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.16 - Патологическая физиология 14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иркутск - 1997

Работа выполнена в Институте медицинских проблем Севера СО РАМН, г. Красноярск

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Г. В. БУЛЫГИН

доктор медицинских наук, профессор Р. В. КИБОРТ

Ведущая организация

кандидат медицинских наук, доцент Т. Д. ЧЕТВЕРИКОВА

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Защита состоится "_"_ 1997 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д.001.41.01. при ГУ "Восточно-Сибирский научный центр СО РАМН" (664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ "ВосточноСибирский научный центр СО РАМН" (664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16).

Автореферат разослан "_"_ 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л. Ф. ШОЛОХОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

В.последние годы накапливаются сведения о ключевой роли иммунной системы в развитии многих патологических процессов. Например, установлено, что основными причинами хронизации неспецифических заболеваний легких, частых рецидивов и резистентности к терапии являются нарушения в системе иммунореактивности с формированием вторичного иммунодефицита (Ширинский В. С., Сенникова Ю. А., 1994; Петров Р. В. с соавт., 1995; Чуча-лин А. Г., 1995).

В отличие от первичных, вторичные иммунодефицитные состояния (ИДС) не связаны непосредственно с генетическими нарушениями, а развиваются под влиянием многочисленных поражающих факторов, действующих на первоначально неизмененную иммунную систему (Фримель X., Брок И., 1986; Петров Р. В., 1987; Ройт А., 1991; Борисов Л. Б. с соавт., 1994); причиной их развития могут служить инфекционные заболевания, нарушения питания, лекарственные средства, злокачественные опухоли (Хейуорд А. Р., 1982; Фримель X., Брок И., 1994). Вторичный иммунодефицит представляет собой кпи-нико-иммунологический синдром, возникающий вследствие количественных и функциональных нарушений различных звеньев иммунитета, и его диагноз включает в себя как клинические, так и иммунологические показатели (Земсков В. М. с соавт., 1986; Лебедев К. А., Понякина И. Д., 1990; Ширин-, ский В. С., 1991). Вариабельность параметров иммунитета не всегда позволяет охарактеризовать причины иммунологической недостаточности даже при наличии клинически выраженного ИДС (Петров Р. В., Лебедев К. А.,. 1984; Ковальчук Л. В., Чередеев А. Н., 1990; Маянский А. Н.,1992; Покровский В. И., 1992; Петров Р. В., 1995; Савченко А. А., 1996; Westermann J., Pabst R., 1990).

Одним из направлений в изучения вторичных ИДС является исследование механизмов их развития на уровне иммунокомпетентных клеток. Лимфоцит обладает определенным набором белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, ферментов (Бутенко 3. А. с соавт., 1978; Гольдберг Е. Д. с соавт., 1978; Глузман В. Ф. с соавт., 1982). Липиды являются основным, элементом мембраны - составляют липидный бислой; выполняют роль связующего звена между мембранными рецепторами и внутриклеточными , ферментами (Вельтищев Ю. Е. с соавт., 1987; Извекова В. А., 1991; Nishiruka I., 1984; Mertin J., 1988, Tu L. et al., 1995), определяют работу рецепторного аппарата

клеток и уникальную функцию лимфоцитов - "узнавание" чужеродных антигенов (Петров Р. В. с соавт., 1983; Schlossman S. F. et al., 1984; Lanier L., 1985; Nossal G, J., 1987; Hashimoto S. et al., 1991; Liu S.-Q. J. et al., 1995). Многочисленные данные свидетельствуют о тесной связи между мембранными липи-дами и способностью лимфоцитов реагировать на внешний сигнал (Баглаев Т. Н., 1986; Вельтищев Ю. Е. с соавт., 1987; Захарова Л. Б., 1988; Извекова В. А., 1991; Булыгин Г. В., 1992; Goldlyne M., 1981; Wolvetang Е. J. et al., 1994).

Функциональная активность лимфоцитов в значительной степони обусловлена их метаболизмом (Мохова Е. Н., 1987; Робинсон М. В. 1994; Hume D. А. et al., 1978; Lakombe P. et al., 1987; Di Virgilio F. et al., 1990; Cohen M. S., 1994) и полноценное ее проявление происходит только при соответствующем состоянии внутриклеточных реакций (Нарциссов Р. П., 1978; Буланова Е. Г. с соавт., 1994; Труфакин В.А. с соавт.,1995; Albert D. et al.,1990; Buttgereit F. et al.,1991). Особенно высокой информативностью для исследования метаболизма активированных лимфоцитов обладают окислительно-восстановительные ферменты, осуществляющие ключевые реакции клеточного обмена и координирующие сопряженные метаболические пути (Хватова Е. М., 1980; Ива-нищев В. В., Курганов Б. И., 1992; Board M. et al., 1990; Chakrabarti R. S. et al., 1994). Ферментативная активность - чувствительный показатель функционального состояния лимфоцитов и используется в диагностических и прогностических целях (Нарциссов Р. П., 1976; Захарова Л. Б., 1981-1990; Булыгин Г. В., 1981, 1992; Домов В. В., Рогалева Е. Ю., 1985; Савченко А. А., 1989, 1996; Wang D. j. et al., 1991; Kletzien R. F. et al., 1994). Доказано, что в основе некоторых врожденных ИДС лежат генетически обусловленные дефекты внутриклеточных ферментов (Подосинников И. С., Чухловина М. Л., 1986; Петров Р. В., 1987; Потапова Г. И., Храмцова С. Н., 1993).

Однако до настоящего времени не проводилось исследований по выявлению особенностей липидного спектра и активности НАД(Ф)-зависимых дегид-рогеназ раздельно в двух основных популяциях иммунокомпетентных клеток -Т- и В-лймфоцитах у здорового человека и закономерностей их изменений при иммунодефицитных состояниях. Проведение подобных комплексных исследований позволит раскрыть некоторые механизмы функционирования этих клеток, охарактеризовать метаболические изменения при нарушении иммуно-реактивности и стать основой для разработки патогенетически более обоснованных путей иммунокоррекции.

Цель исследования:

На основе изучений липидного спектра клеток и активности внутриклеточных дегидрогеназ определить особенности липидного обмена и интенсивности основных метаболических циклов Т- и В-лимфоцитов доноров и закономерности их изменений при вторичных иммунодефицитных состояниях различной степени тяжести. Задачи:

1. Исследовать метаболизм липидов Т- и В-лимфоцитов доноров.

2. Оценить особенности внутриклеточного метаболизма Т- и В-лимфоцитов по активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ.

3. Исследовать липидный спектр и активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ Т- и В-лимфоцитов в зависимости от пола, возраста и группы крови доноров.

4. Изучить закономерности изменений метаболизма липидов в Т- и В-лимфоцигах при вторичных ИДС различной степени тяжести.

5. Определить особенности активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в Ти В-лимфоцитах при вторичных ИДС различной степени тяжести.

Научная новизна:

Впервые доказано, что Т- и В-лимфоциты различаются по лилидному спектру: в составе липидов Т-лимфоцитов преобладают фракции зфиров холестерина {37,51 ± 1,86 и 27,13 ± 1,69 соответственно; Р < 0,001) й фосфати-дилэтаноламина (30,69+ 1,59 и 25,76 ± 1,78 соответственно; Р < 0,05), в В-лимфоцитах большим объемом представлена доля фосфолипидов (32,26 ± 1,86 и 25,27 ± 1,22 соответственно; Р < 0,01).

Впервые установлены различия между Т- и В-лимфоцитами по интенсивности реакций внутриклеточного метаболизма: в Т-клетках выше активность фермента глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (0,63 + 0,07 и 0,39 ± 0,08 соответственно; Р < 0,05).

Впервые определены закономерности изменения липидного метаболизма и активности внутриклеточных дегидрогеназ в Т- и В-лимфоцитах при вторичных ИДС 1-2 степени тяжести в группе больных, часто и длительно болеющих острыми респираторными заболеваниями (ЧДБ ОРЗ). При данных патологических процессах в Т- и В-лимфоцитах содержится больше фосфолипидов, холестерина, фосфатидилэтаноламина и меньше сфингомиелина и эфиров холестерина, снижен показатель соотношения сфингомиелина к фос-

фатидилхолину, выше величина окисляемости липидов. Особенностью Т-лимфоцитов является снижение доли триацилглицеридов. Отличие В-лимфоцитов состоит в снижении содержания суммарной фракции фосфати-дилинозитола и фосфатидилсерина и увеличении показателя соотношения свободных жирных кислот к триацилглицеридам. И в Т- и в В-лимфоцитах повышена активность ферментов пентозофосфатного цикла, гликолиза, цикла Кребса, аминокислотного обмена.

Впервые выявлены закономерности изменений липидного спектра и активности внутриклеточных дегидрогеназ в группе больных с ИДС 3-й степени тяжести (гнойная хирургическая инфекция). Доказано, что при этом в Т-и В-лимфоцитах увеличено содержание фосфолипидов, холестерина, лизофосфо-липидов снижено содержание эфиров холестерина,. В Т-лимфоцитах, кроме этого, снижена доля триацилглицеридов и сфингомиелина при значительном увеличении лизлфосфолипидов. В В-лимфоцитах значительно снижен показатель соотношения сфингомиелина к фосфатидилхолину. Активность всех исследованных дегидрогеназ у больных с ИДС повышена по сравнению со здоровыми людьми в Т-лимфоцитах, и большинства (кроме глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы) - в В-лимфоцитах.

Практическая ценность:

> Полученные данные о закономерностях и механизмах изменений липидного обмена и активности внутриклеточных дегидрогеназ при иммунодефицит-ных состояниях различной степени тяжести, свидетельствующие о дифференцированных нарушениях функционирования иммунной системы, являются основой для разработки патогенетически обоснованных профилактических мероприятий и путей направленной иммунокоррекции. Положения, выносимые на защиту:

1. 'Т- и В-лимфоциты доноров различаются по показателям липидного спектра клеток и по активности в них окислительно-восстановительных ферментов.

2. При иммунодефицитных в Т- и В-лимфоцитах определяются изменения липидного спектра мембран, отражающие их дестабилизацию. При ИДС 1-2 степени тяжести это выражается в увеличении в Т- и в В-лимфоцитах фракций фосфолипидов, холестерина, фосфатидилэтаноламина, величины окисляемости липидов при снижении содержания эфиров холестерина, сфингомиелина и показателя соотношения сфингомиелина к фосфатидилхолину. Особенностями Т- и В-лимфоцитов при этой патологии являются:

снижение в Т-лимфоцитах доли триацилглицеридов, повышение в В-лимфоцитах показателя соотношения свободных жирных кислот к триацил-глицеридам, отражающего интенсификацию процессов липолиза. При им-мунодефицитных состояниях 3-й степени тяжести в Т-лимфоцитах значительно увеличено содержание лизофосфолипидов, что отражает усиление деструктивных процессов при данной патологии. Повышена доля фосфо-липидов, холестерина, снижено содержание триацилглицеридов и сфинго-миелина. В В-лимфоцигах изменения менее выражены и заключаются в большем содержании фосфолипидов и холестерина при уменьшении показателя соотношения сфингомиелина к фосфатидилхолину. 3. Уровни активности метаболических ферментов Т- и В-лимфоцитов позволяют объективно оценить их функциональное состояние. При иммунодефицитом состоянии в Т- и В-лимфоцитах наблюдается повышение активности ферментов цикла Кребса, гликолиза, пентозофосфатного пути, аминокислотного обмена. При ИДС 3-й степени тяжести активность всех исследованных дегидрогеназ у больных повышена по сравнению со здоровыми людьми в Т-лимфоцитах, и большинства (кроме Г6ФДГ и МДГ) - в В-лимфоцитах. Апробация материалов диссертации:

Результаты диссертации обсуждены на II съезде физиологов, Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск,1993); Региональной конференции молодых ученых "Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН (Новосибирск, 1996); Конференции, посвященной 20-летию Института медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 1996); Международной конференции "Гомеостаз и 'инфекционный процесс" (Саратов, 1996); ежегодной Научной конференции Института медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 1995, 1997); международном Симпозиуме "Гомеостаз и окружающая среда" (Красноярск, 1997).

' Публикации:

По теме диссертации опубликовано 5 работ. Подана заявка на изобретение (1997). ^ Структура диссертации:

Диссертация изложена на /(^страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследования", 3-х глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсу-

ждение; заключения, выводов и списка литературы, включающего /'¿Ъ отечественных и <^>5~Гин0СТРаннЬ|х источников.

Работа иллюстрирована ^ рисунками и таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованы 102 человека: 49 практически здоровых и 53 больных с ИДС в возрасте от 18 до 40 лет.

Практически здоровые мужчины (25 человек) и женщины (24 человека) не являлись штатными донорами и работали на предприятиях, не имеющих производственных вредностей. Группу больных составили: 24 человека с имму-нодефицитными состояниями 1-2 степеней тяжести - часто и длительно болеющие острыми респираторными заболеваниями (ЧДБ ОРЗ) в острый период заболевания; и 29 человек с 3-ей степенью тяжести ИДС с гнойной хирургической инфекцией (перитонит, сепсис). Иммунологический анализ обследуемых больных производился на базе иммунологической лаборатории Краевого клинико-иммунологического центра по профилактике и борьбе со СПИД (зав. лаб. Н. А. Шакина).

Выделение лимфоцитов из венозной крови осуществлялось по методу Воуит А. (1980). Разделение на Т- и В-популяции производилось методом фракционирования на нейлоновой вате по Д. Гаррота (1983). Для исследования липидов мембран использована методика (Ростовцев В. Н., Резник Г. Е., 1982), включающая тонкослойную хроматографию фракций нейтральных липидов (НЛ): холестерина (ХОЛ), суммарных фосфолипидов (ФЛ), свободных жирных кислот (СЖК), триацилглицеридов (ТАГ), эфиров холестерина (ЭХ) и фосфолипидов: лизофосфолипидов (ЛФЛ), сфингомиелина (СФМ), фосфати-дилхолина (ФХ), фосфатидилинозитола и фосфатидилсерина (ФИ+ФС), фос-фатидилэтаноламина (ФЭА), кардиолипина и цереброзидов (КЛ+Ц), с предварительной их экстракцией (Фолч А. с соавт. 1957). Вычислялись интегральные коэффициенты СЖКДАГ, ФЛ/ХОЛ, СФМ/ФХ и величина окисляемости липидов - ВОЛ ((ФИ+ФС)+ФЭА/СФМ+ФХ.

Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах проводилось биолюминесцентным методом с бактериальной люциферазой (Савченко А. А., Сунцова Л. Н., 1989). Данным методом определяли активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), гли-церол-3-фосфатдегидрогеназы (ГЗФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), малат-дегидрогеназы (МДГ); НАД(Ф)-зависимых: малатдегидрогеназы (НАДФМДГ), глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ), изоцитратдегидрогеназы (НАДФИЦДГ).

Активность ферментов выражали в ферментативных единицах на 104 клеток, где 1Е = 1 мкмоль/мин (Строев Е. А., 1986).

Результаты исследований обработаны с использованием ЭВМ 1ВМ/РС/АТ-486 с вычислением средних показателей и их ошибок, достоверности различий средних и коэффициентов корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании метаболизма липидов в Т- и В-лимфоцитах доноров установлено, что они существенно различаются по содержанию в них отдельных липидных фракций (табл.1). Содержание ФЛ оказалось большим в В-лимфоцитах (Р < 0,01). В Т-лимфоцитах определилось большее содержание ЭХ (Р < 0,001) и одной из структурных фракций фосфолипидов -ФЭА (Р < 0,05).

Таблица 1.

Липидный спектр (%) Т- и В-лимфоцитов периферической крови здоровых людей (М ± т).

Фракция Т-лимфоциты п=37 В-лимфоциты п=25

липидов 1 2

ФЛ 25,27±1,22 32,26+1,86 Р!<0,01

хол 17,85±0,87 19,63±0,97

НЛ сжк 4,65±0,65 4,59±0,51

ТАГ 13,53+1,63 14,18+2,01

эх 37,51±1,86 27,13+1,69 Р,<0,001

ЛФЛ 0,42+0,16 0,27±0,19

СФМ 5,98+0,61 5,34+0,66 '

ФХ 32,07±1,40 33,40+2,75

ФЛ ФИ+ФС 4,54+0,47 6,06±0,80 Р,<0,1

ФЭА 30,69±1,59 25,76±1,78 Р,<0,05

кл+ц 24,51±2,36 27,49±1,82

ФЛ/ХОЛ 1,59±0,11 1,79+0,19

СЖК/ТАГ 0,54±0,11 0,42±0,07

• СФМ/ФХ 0,22+0,02 0,17±0,03

ВОЛ 0,99±0,06 0,86x0,09

Учитывая установленные различия в липидном спектре Т- и В-клеток, можно отметить, что большее содержание в B-лимфоцитах ФЛ, вероятно, предусматривает более высокую проницаемость и текучесть их мембран, что создает наиболее благоприятные условия для работы рецепторного аппарата клеток (Вельтищев Ю. Е. с соавт., 1987; Mertin J., 1981, 1988; Nishizuka I., 1984). Из данных литературы известно также, что ФЛ являются субстратом для синтеза специфических иммуноглобулинов, участвующих в реализации иммунного ответа клетки (Дидковский H.A. с соавт., 1990; Agostini С. etal., 199О; Thompson R. A. etal., 1995).

В Т-лимфоцитах поддержание оптимального уровня проницаемости мембран происходит за счет других механизмов, как, например, повышения содержания одного из липидных компонентов - ФЭА. Эта фракция, сконцентрированная в основном на внутренней стороне билипидного слоя, оказывает специфическое влияние на процессы проницаемости мембранных структур (Рачев Р. Р. с соавт., 1975), регулирует активность ряда ферментов (Владимиров Ю. А., 1973; Бурлакова Е. Б.,1980) за счет большого содержания в ней ненасыщенных жирных кислот. Одним из факторов, повышающих проницаемость мембран Т-лимфоцитов, можно считать и высокое количество в них ЭХ, содержащих полиеновые жирные кислоты (Кисляковская В. Г. с соавт., 1975; Ананенко A.A. с соавт., 1977), которые обеспечивают клеточным мембранам необходимую текучесть (Кагава Я., 1985; Крылов В. И., 1985). Можно предположить, что большая доля ЭХ в Т-лимфоцитах характеризует более активный процесс эстерификации свободного холестерина, что,, по-видимому, приводит к уменьшению жесткости мембраны, ее ригидности, в результате чего создаются благоприятные условия для активности липидза-висимых ферментов и функционирования мембраны и клетки в целом (Найденова Н, Н„ 1992; Brottomley G. М., 1980).

Результаты биолюминесцентного исследования ферментов показали, что Т- и B-лимфоциты различаются по активности фермента ГЗФДГ, уровень которого оказался выше в Т-лимфоцитах (Р < 0,05) (табл. 2). Это позволяет заключить, что в Т-лимфоцитах по сравнению с B-лимфоцитами происходит повышенное окисление в энергетических реакциях гликолиза продуктов ли-пидного обмена, обычно происходящего при потребности быстрой мобилизации энергии в клетке (Deborah F. Z., Hartzell С. R., 1986). Большая активность в Т-клетках ГЗФДГ предполагает и большее обеспечение в них цикла Кребса водородом через глицерофосфатный шунт (Ньюсхолм Э., Старк X., 1977).

Можно предположить, что в Т-лимфоцитах метаболизм в нем протекает более интенсивно, что подтверждает и тенденция к повышению показателя одного из ферментов цикла Кребса - МДГ.

Таким образом, в результате исследования липидного спектра и активности внутриклеточных дегидрогеназ в Т- и В-лимфоцитах, установлены особенности как метаболизма липидов, так и функционирования цикла Кребса и гликолиза - более интенсивных в Т-лимфоцитах, что, по-видимому, обусловлено различным функциональным предназначением лимфоцитов.

Таблица 2.

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ (мкЕ/104 кл) в Т- и В-лимфоцитах крови здоровых людей (М ± т).

Фермент Т-лимфоциты п=44 В- лимфоциты п=44

1 2

Г6ФДГ 1,89±0,33 1,51±0,31

ГЗФДГ 0,63+0,07 0,39+0,08 Р,<0,05

лдг 0,64±0,09 0,85+0,19

МДГ 18,13±2,09 13,39+1,60 Р,<0.1

НАДФМДГ 0,30+0,04 0,45+0,08 Рп<0,1

НАДФГДГ 0,31±0,06 0,39+0,11

НАДФИЦДГ 14,50±1,91 14,52+2,90

Различия между мужчинами и женщинами выявились в активности внутриклеточных ферментов в В-лимфоцитах женщин, в которых определилась большая активность Г6ФДГ (Р < 0,05) и ГЗФДГ (Р < 0,01). Так как Г6ФДГ является ключевым ферментом пентозофосфатного цикла, его более высокая активность обусловливает повышение наработки субстратов для реакций макромолекулярного синтеза в В-лимфоцитах женщин; параллельно с этим происходит интенсификация процессов гликолиза, обеспечиваемых ГЗФДГ.

Полученные результаты подтверждают данные литературы о большей функциональной роли В-системы у женщин (Ройт А., 1991; Лебедев К. А., По-някина И. Д., 1990; Петров Р. В., 1994).

При сравнении параметров липидного спектра лимфоцитов двух групп доноров - от 18 до 30 лет и от 30 до 40 лет - были установлены различия в содержания фракции СФМ в В-лимфоцитах, доля которой оказалась выше в

группе более молодых доноров (Р < 0,01), а также в величине показателя СФМ/ФХ для этих клеток, более высокого в группе от 18 до 30 лет (Р < 0,05). Можно предположить, что повышенный уровень СФМ, обладающего способностью к электрической изоляции клеток (Васильева Е. И., 1996), определяет стабилизацию липидной фазы мембран В-лимфоцитов в более молодом возрасте.

Корреляционным анализом установлено, что с увеличением возраста доноров значительно увеличивается число взаимосвязей между показателями Т-лимфоцитов, в основном - за счет высокодостоверных связей. По данным литературы (Ваиг Р.Б. е! а!., 1975) это расценивается как свидетельство нарастания напряженности функционирования клеток.

В В-лимфоцитах с увеличением возраста доноров не наблюдается столь выраженных, как в Т-клетках, неблагоприятных изменений. Одной из возрастных их особенностей, установленной нами корреляционным анализом, можно считать снижение на 46% количества отрицательных связей между параметрами, что указывает на снижение числа возможных вариантов работы внутриклеточных систем и снижение их резервных возможностей.

В результате исследования метаболизма липидов и активности дегидро-геназ в Т- и В-лимфоцитах доноров с различными группами крови: (0)1, (А)11, (В)Ш и (АВ)1Ч/, установлено, что эти две популяции клеток характеризуются значительными особенностями липидного спектра. Т-лимфоциты доноров (0)1 группы достоверно отличались по содержанию в них ХОЛ от групп (В)Ш (Р < 0,05) и (АВ)1\/ (Р < 0,01); по количеству ЭХ различались группы (0)| и (В)Ш (Р < 0,05); по содержанию в клетках СФМ - (В)Ш и (АВ)1У (Р < 0,05).

В липидном спектре В-лимфоцитов различия между группами крови имели свои особенности и отличались от таковых в Т-клетках. Наибольшее количество высокодостоверных различий отмечено в содержании доли СЖК, .котррая в лимфоцитах доноров (В)Ш группы превышала показатель в (А)Н (Р < 0,01) и (АВ)1\/ (Р < 0,01) группах. Большее количество различий выявлено в спектре фосфолипидов В-клеток: по содержанию ФХ в (0)1 и (А)Н группах (Р < 0,05), по соотношению СЖК/ТГ в группах (А)М и (АВ)1\/ (Р < 0,05), соотношению СФМ/ФХ, различающемся в группах (0)1 и (А)П (Р < 0,05), а также (В)Ш и (А)И (Р < 0,01).

Исследование активности ферментов в Т-, В-лимфоцитах также установило ряд различий между этими популяциями у доноров с различной группой крови. В Т-лимфоцитах доноров различия между группами крови в той или иной степени коснулись активности всех ферментов, за исключением ЛДГ:

активность НАДФМДГ у доноров с (АВ)1\/ группой оказалась минимальной среди всех групп; активность НАДФГДГ была минимальной в (0)1 группе и отличалось от показателя в лимфоцитах (А)И группы (Р < 0,05); Г6ФДГ в группе (АВ)IV в несколько раз ниже, чем в группах (А)1 (Р < 0,05) и (В)Ш (Р < 0,05), аналогичная картина выявилась и для показателя МДГ (Р < 0,05).

Различия, установленные для В-лимфоцитов, были менее разнообразны: достоверно отличалась лишь активность НАДФМДГ - минимальная в (В)1П группе, выше - в группе (0)1 (Р < 0,05) и еще выше - в группе (А)М (Р < 0,01).

При оценке результатов корреляционного анализа показателей для Т- и В-клеток установлено, что если количество достоверных корреляционных взаимозависимостей параметров Т-лимфоцитов уменьшалось от 0(1) к АВ(IV) группе (32; 26; 25; 22), то в В-клетках отмечалась обратная тенденция - нарастание числа коэффициентов корреляции (11; 15; 17; 34); это позволило заключить, что у лиц с разными группами крови имеются особенности внутриклеточного метаболизма лимфоцитов. Напряженность функционирования Т-лимфоцитов максимальна у доноров с 0(|) группой крови и минимальна в группе АВ(1У); в В-лимфоцитах зависимость обратная.

Установленные особенности связей между липидными показателями в Т-клетках позволили заключить, что у людей с 0(1) группой крови значительно в большей степени, чем при наличии других групп, интенсивен липидный обмен клеток, а у доноров с В(Ш) группой это наиболее выражено во взаимозависимостях липидных фракций, связанных с формированием мембранных структур клеток.

Результаты исследования позволяют высказать предположение о том, что у человека имеет место генетическая обусловленность метаболизма липидов и активности внутриклеточных дегидрогеназ. Она в большей степени проявляется в Т-лимфоцитах.

Полученные нами результаты согласуются с данными литературы о генетической детерминированности у человека иммунологических параметров (Земсков А. М. с соавт., 1986), силы и выраженности иммунного ответа (Зарецкая Ю. М., 1987).

При обследовании больных с клиническими проявлениями заболеваний производилась оценка их иммунного статуса по данным иммунограмм, на основании которой определялась степень тяжести ИДС (Земсков А. М. с со,-авт., 1992). У больных с ИДС 1-2 степени тяжести установлено снижение относительного (Р < 0,01) и абсолютного (Р < 0,01) содержания Т-супрессоров, увеличение иммунорегуляторного индекса (ИРИ) (Р < 0,05), уровня 1д М

(Р < 0,001). Это соответствует данным литературы об изменениях параметров иммунограммы при ИДС 1-2-й степени тяжести на фоне респираторного заболевания (Лебедев К. А., Понякина И. Д., 1990; Stoeckle М. Y. et al., 1992).

При ИДС 3-й ст. тяжести изменения иммунограммы оказались гораздо более выражены: снижено абсолютное содержание лимфоцитов (Р < 0,01), Т-лимфоцитов (Р < 0,01), Т-хелперов (Р < 0,01), Т-супрессоров (Р < 0,001); относительное содержание Т-лимфоцитов (Р < 0,01), уровень lg М (Р < 0,05). Определено значительное снижение ИРИ - 0,79 ± 0,03, что значительно ниже, чем у здоровых людей: 1,56 ±0,14 (Р < 0,01). Эти изменения иммунограммы свидетельствует о значительных нарушениях в функционировании иммунной системы при более тяжелых ИДС.

При исследовании метаболизма липидов и активности внутриклеточных дегидрогеназ в Т- и В-лимфоцитах у больных с иммунодефицитными состояниями различной степени тяжести установлены особенности изменения изучаемых показателей при данных патологических состояниях.

При ИДС 1-2 степени тяжести в Т-лимфоцитах больных определяется значительно большее содержание доли ХОЯ, ФЛ, ФЭА; снижение фракций ТАГ, СФМ, ЭХ и показателя СФМ/ФХ; увеличение показателя ВОЛ по сравнению с группой доноров (табл. 3).

Подобные изменения в составе липидного спектра могут быть расценены как отражение дестабилизации мембран при данной патологии. Повышение фракций ФЛ и ХОЛ является адаптационно-приспособительной реакцией для обеспечения функционирования мембраны и клетки в целом (Зайцева О. И., 1994). ХОЛ не только снимает последствия перекисного окисления, но и тормозит процесс липопероксидации (Лопухин Ю. М., 1983). Видимо, за счет интенсификации обмена ХОЛ, происходит снижение в лимфоцитах и доли ЭХ. Снижение содержания СФМ, в норме способствующего стабилизации мембран и доли ТАГ - одного из основных энергетических субстратов клетки, также является отражением дислипидемии. Увеличение доли фракции ФЭА, содержащей в своем составе ненасыщенные жирные кислоты, свидетельствует об изменении степени ненасыщенности фосфолипидов, что приводит к изменению подвижности мембраны и способствует агрегации рецепторов и стимуляции пролиферативной активности клеток (Извекова В. А., 1991). Уменьшение соотношения СФМ/ФХ отражает интенсификацию процессов обмена ФХ, фракции, также способствующей изменению вязкости мембран при активации клетки (Лященко В. А., Молотковская И. М., 1988).

Таблица 3.

Липидный споктр (%) Т-лимфоцитов у здоровых и больных с иммунодефицитными состояниями различной степени тяжести (М ± т).

.Показатель Здоровые п=37 ИДС 1 -2 ст.тяж. п=15 ИДС 3-й ст.тяж. п=10

1 2 3

ФЛ 25,27±1,22 43,29±2,04 Р,<0,001 34,15±4,49 Р,<0,01

ХОЛ 17,85+0,87 30,11±1,68 Р,<0,001 30,33+2,29 Р,<0,001

НЛ СЖК 4,65±0,65 5,04+0,31 4,24±0,79

ТАГ 13,53+0,63 7,26±0,89 Р,<0,001 7,74+1,30 Р,<0,001

эх 37,51 ± 1,86 11,09+1,97 Рг<0,001 15,33±3,26 Р,<0,001

ЛФЛ 0,42±0,16 0,18+0,10 1,68±0,63 Р,<0,01

СФМ 5,98±0,16 3,09±0,37 Р,<0,01 4,41±0,99 ^<0,01

ФЛ ФХ 32,07±1,40 30,68±2,33 32,36±3,27

ФИ+ФС 4,54+0,47 3,73±0,80 4,72±0,64

ФЭА 30,69±1,59 41,71 + 1,92 Р,<0,001 28,60+3,15

кл+ц 24,51+2,3 6 23,27±1,75 26,31+2,48

ФЛ/ХОЛ 1,59±0,11 1,50+0,12 1,35+0,19

СЖК/ТАГ 0,54±0,11 0,72±0,09 0,65±0,12

СФМ/ФХ 0,22±0,02 0,11 ±0,02 Р,<0,01 0,17+0,03

ВОЛ 0,99±0,06 1,32+0,17 Р-1<0,05 1,03+0,13

Увеличение индекса ВОЛ, отражающего соотношение фракций с различным количественным и качественным составом насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, свидетельствует о повышении степени окисляемости липидных компонентов. По мнению (Соловей Л. И., Манчук В. Т., 1996) это является существенным условием метаболической активности биомембран клеток. Подтверждением этому в нашем исследовании служит повышение активности мембраносвязанных ферментов (табл. 5).

Таблица 4.

Липидный спектр (%) В-лимфоцитов у здоровых и больных с иммунодефицитными состояниями различной степени тяжести (М ± т).

Показатель Здоровые п=37 ИДС 1 -2 ст. тяж. п=15 ИДС 3-й ст. тяж. п=10

1 2 3

ФЛ 32,26±1,86 42,00±4,02 Р,<0,05 46,34+4,44 Р,<0,01

ХОЛ 19,63±0,97 30,56+2,88 Р!<0,001 30,03+2,99 Р-1<0,001

НЛ сжк 4,59±0,51 7,17±1,91 3,02+0,63 Р,<0,1

ТАГ 14,18±2,01 11,38+2,20 8,99±1,38

эх 27,13±1,69 8,88+2,69 Р,<0,001 10,11±3,42 Р-,<0,001

ЛФЛ 0,27±0,19 0,33±0,23 0,72±0,34

СФМ 5,34±0,66 1,41+0,12 Р^ <0,001 3,49±0,69

ФЛ ФХ 33,40±2,75 28,67±2,00 35,26±1,55

ФИ+ФС 6,06+0,80 3,16±0,69 Р,<0,05 3,96+1,42

ФЭА 25,76±1,78 38,81±4,27 Р,<0,01 32,05+6,72

кл+ц 27,49+1,82 27,62±2,49 24,73±4,20

ФЛ/ХОЛ 1,79+0,19 1,38+0,17 1,67+0,32

СЖКДАГ 0,42+0,19 0,67±0,20 Р!<0,05 0,57+0,19

СФМ/ФХ 0,17+0,03 0,04±0,01 Р1<0,01 0,05+0,02 Р,<0,05

ВОЛ 0,86+0,09 1,43±0,22 Р!<0,05 0,97±0,21

В В-лимфоцитах при ИДС 1-2 степени тяжести изменения в составе липи-дов подобны отмечаемым в Т-лимфоцитах (табл. 4). Отличие составляет увеличение показателя СЖК/ТАГ, что свидетельствует об интенсификации липо-лиза при данной патологии в В-клетках. Снижено содержание суммарной фракции фосфатидилинозитола и фосфатидилсерина (ФИ+ФС). Определено, что ранний ответ на внешние воздействия заключается в избирательном ускорении оборота ФИ (МюИеН Я. N.. 1975). Отмечено, и то, что ФИ принимает активное участие в активизации иммунокомпетентных клеток (Лященко В. А. с

соавт.,1975). Фракция ФС содержится на внутренней стороне билипидного слоя, он активирует аденилатциклазу, катализирующую процесс превращения АТФ в 3,5-цАМФ, способного повышать активность фосфолипазы А (ЗусИэогП А., 1976).

Таблица 5.

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ (мкЕ/104 кл) в Т- и В-лимфоцитах здоровых и больных с ИДС различной степени тяжести (М + т).

Показатель Здоровые п=44 ИДС 1-2 ст. тяж. п=17 ИДС 3-й ст. тяж. п=23

1 2 3

Т-лимфоциты

Г6ФДГ 1,87±0,33 7,94+1,33 Р1<0,001 4,14+1,08 Р,<0,05

ГЗФДГ 0,63+0,07 5,56±1,10 Р,<0,001 6,03+1,33 Р,<0,001

ЛДГ 0,64±0,09 2,89+0,97 Р!<0,001 2,15+0,63 Рп<0,01

мдг 18,13+2,09 41,41+12,03 Р-1<0,01 49,84±24,34 Р!<0,05

НАДФМДГ 0,30+0,04 1,80+0,36 Р,<0,001 2,82±0,66 Р!<0,001

НАДФГДГ 0,31±0,06 13,05+3,89 Р,<0,001 9,62±2,15 Р,<0,001

НАДФИЦДГ 14,50±1,91 64,38±16,27 Р,<0,001 36,04+10,08 Р1<0,01

В-лимфоциты

Г6ФДГ 1,52+0,31 5,33±1,96 Рп<0,01 2,09±0,65

ГЗФДГ 0,39+0,08 3,24±1,28 Р,<0,001 3,53±1,09 Р,<0,001

ЛДГ 0,85+0,19 2,44+0,67 Р!<0,01 2,15+0,69 Р,<0,05'

МДГ 13,39+1,60 59,73±17,4 Р-1<0,001 12,36+5,03

НАДФМДГ 0,43+0,08 1,41+0,21 Р1<0,001 1,60+0,38 Р!<0,001

НАДФГДГ 0,39+0,10 24,83±5,97 Р-1<0,001 10,14+4,07 Р^О.001

НАДФИЦДГ 14,52+2,09 75,58±17,15 Р,<0,001 40,26+19,43 Р,<0,01

При ИДС 3-й степени тяжести в Т-лимфоцитах больных увеличена доля ФЛ, ХОЛ, ЛФЛ при снижении содержания ТАГ, ЭХ, СФМ. Можно заключить, что процессы деструктивных изменений мембран Т-лимфоцитов при ИДС 3-й степени тяжести усугубляются. Свидетельством этого является значительное увеличение фракции лизофосфолипидов (ЛФЛ). Эта фракция состоит из двух соединений - лизофосфатидилхолина (ЛФХ) и лизофосфатидилэтанолами-на(ЛФЭА). В физиологическом отношении ЛФХ является наиболее сильным детергентом. Накапливаясь в мембранах он изменяет их фазовое состояние, снижает стабильность клеток, приводя, в конечном итоге, к их гибели. Лизо-формы фосфолипидов способны снижать интенсивность окислительного фосфорилирования, активизировать лизосомальные ферменты, ингибировать цитохром Р-450. Лизоформы являются поверхностно активными веществами, уменьшающим потенциал электрического пробоя мембран (Лопухин Ю. М. с соавт., 1983; Абилов В. А., 1991). Это отражает интенсификацию мембрано-десгруктивных изменений, прежде всего за счет перекисного компонента (Васильева Е. А., 1996).

В B-лимфоцитах при ИДС 3-й степени тяжести, объем ФЛ и ХОЛ значительно увеличен; снижена доля ЭХ. Отличием от состава липидов Т-лимфоцитов в данной группе больных определилось снижение интегрального показателя СФМ/ФХ, что свидетельствует о преобладании факторов стабилизирующих клеточные мембраны над элементами деструкции, в частности, процессами переокисления липидов (Fiassadori Е. et al., 1990; Gonzales М. et al„ 1994).

Исследована активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в Т- и В-лимфо-цитах при вторичных ИДС различной степени тяжести (табл. 5).

Установлено, что при ИДС 1-2 степеней тяжести и в Т- и в В-лимфоцитах повышено большинство показателей активности внутриклеточных ферментов цикла Кребса, гликолиза, пентозофосфатного цикла, аминокислотного обмена. Это свидетельствует о том, что в них происходит активация основных метаболических циклов клеток. Такое положение подтверждается данными литературы (Робинсон М. В., 1994).

s Оценка корреляционных взаимосвязей параметров Т- и B-лимфоцитов по-,зволила раскрыть некоторые особенности формирования функциональной недостаточности ИКК. Они связаны с интенсификацией процессов, направленных на синтез липидных компонентов, защищающих структуры клеток от реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) и липолиза, уровень активно- 16 -

сти которых в ИКК, как известно, возрастает при напряженном функционировании иммунной системы.

Метаболические процессы в клетках при ИДС 1-2 степеней тяжести, по сравнению с группой доноров, изменяют свою сопряженность, интенсивность и направлены в основном на повышение выработки энергетических потенциалов. Это связано с активацией лимфоцитов при развитии инфекционно-воспалительного процесса в сочетании с ИДС и расценено как проявление одного из вариантов адаптационной реакции на состояние их напряженного функционирования.

При более тяжелых формах ИДС и в Т-, и в В-лимфоцитах снижается интенсивность обменных реакций и, по данным корреляционного анализа, можно предположить, что при ИДС 3-й степени тяжести наступает разобщенность, дискоординация метаболических процессов.

Разная степень тяжести ИДС обусловливает изменение уровня метаболизма липидов и активности внутриклеточных дегидрогеназ. По-видимому, функциональные возможности В-лимфоцитов в большей степени поддерживаются усилением сбалансированности липидного обмена на фоне имеющейся дискоординации реакций, катализируемых указанными ферментами. Для Т-лимфоцитов же, по имеющимся данным, наличие такого пути сохранения функциональных возможностей предположить трудно. Вероятно, разбаланси-ровка процессов внутриклеточного метаболизма и нарушение обновления клеточных структур приводят к значительному снижению функциональных возможностей Т-звена при тяжелых формах ИДС.

ВЫВОДЫ

1. Особенности внутриклеточного метаболизма Т- и В-лимфоцитов доноров заключаются в большем объеме в Т-клетках по сравнению с В-лимфоцитами фракций ФЭА (30,69 ± 1,59 и 25,76+ 1,78 соответственно; Р < 0,05), ЭХ (37,51 ±1,86 и 27,13 + 1,69 соответственно; Р< 0,001), и в преобладании В-лимфоцитах - доли ФЛ (32,26 ± 1,86 и 25,27 + 1,22 соответственно; Р<0,01). Отличие этих клеток по ферментным показателям выявляется в высокой активности фермента цикла Кребса и гликолиза ГЗФДГ в Т-лимфоцитах (0,63 + 0,07 и 0,39 + 0,08 соответственно; Р < 0,05).

2. Влияние пола доноров на исследованные метаболические показатели проявляется в повышении в В-лимфоцитах женщин показателей активности ферментов, связанных с пентозофосфатным путем и гликолизом

- 17 -

(Г6ФДГ и ГЗФДГ). В В-лимфоцитах более молодых доноров (18-30 лет) отличия от старшей группы заключаются в преобладании фракции СФМ и показателя СФМ/ФХ, что определяет большую стабильность их мембран..

3. В зависимости от наличия определенной группы крови доноров, в Т-лимфоцитах различно содержание фракций липидов ХОЛ, ЭХ, ТАГ; в В-лймфоцитах - фракций СЖК, ФХ и соотношения СФМ/ФХ. Различия в активности дегидрогеназ в Т-лимфоцитах выявляются по ферментам цикла Кребса, пентозо-фосфатного цикла, аминокислотного обмена (Г6ФДГ, МДГ, НАДФМДГ, НАДФГДГ), в В-лимфоцитах - по активности НАДФМДГ.

4. У больных с ИДС 1-2 степени тяжести дестабилизация липидного обмена в Т- и В-лимфоцитах выражается в увеличении, по сравнению со здоровыми, доли ФЛ, ХОЛ, ФЭА, ВОЛ и уменьшении содержания ЭХ, СФМ, соотношения СФМ/ФХ. Особенность Т-лимфоцитов состоит в снижении доли ТАГ. В В-лимфоцитах процесс дестабилизации сопровождается интенсификацией липолиза, что характеризуется увеличением показателя соотношения СЖК/ТАГ и снижением содержания суммарной фракции ФИ+ФС. При этом и в Т- и в В-лимфоцитах определяется высокая активность внутриклеточных дегидрогеназ пентозофосфатного цикла, гликолиза, цикла Кребса, аминокислотного обмена (Г6ФДГ, ГЗФДГ, ЛДГ, МДГ, НАДФМДГ, НАДФГДГ, НАДФИЦДГ).

5. В Т-лимфоцитах больных с ИДС 3-й степени тяжести дестабилизация мембран становится более выраженной, о чем свидетельствует значительное увеличение фракций ЛФЛ. В В-лимфоцитах, в отличие от Т-лимфоцитов, снижается показатель СФМ/ФХ. Активность ферментов цикла Кребса, гликолиза, аминокислотного обмена, пентозофосфатного цикла повышена по сравнению со здоровыми в Т-лимфоцитах. В В-лимфоцитах активность ферметов также повышена, за исключением Г6ФДГ и МДГ,

Список работ по теме диссертации

1.. Сравнительная характеристика Т- и В-лимфоцитов крови человека по некоторым структурно-функциональным параметрам // Тез. докл. II съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока; Новосибирск, 15-17 июня 1995 г. - С. 63-64. (В соавт. с Булыгиным Г. В., Шигановым С. В., Меньшовой Т. Д.).

2. Различия, активности некоторых внутриклеточных ферментов в Т- и В-лимфоцитах крови здоровых доноров // Клинические и эксперименталь-

ные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. -Новосибирск, 1996 г. - С. 51.

3. Структурно-метаболические показатели Т- и B-лимфоцитов крови человека и влияние на них некоторых физиологических параметров организма // Мат. научн. конф., посвященной 20-летию Института мед. проблем Севера СО РАМН. - Красноярск, 29 октября 1996г. - С. 10-11. (В соавт. с Булыги-ным Г. В.).

4. Изменения функционального состояния лимфоцитов крови при ангине // Тез. 60-й итоговой научно-практической конференции "Студент, наука, цивилизация". - Красноярск, 1996. - С. 10. (В соавт. с Шигановым С. В., Бу-лыгиным Г. В., Юрьевым С. И.).

5. Активность внутриклеточных дегидрогеназ лимфоцитов у больных с различной степенью выраженности вторичного иммунодефицитного состояния /,/ Тез. докл. международ, конф. "Гомеостаз и инфекционный процесс". - Саратов, 1996. - Ч. 1. - С. 115. (В соавт. с Булыгиным Г. В., Петровой О. С.).