Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование эндотелиопротективных свойств ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля

На правах рукописи

Цепелев Василий Юрьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ И КЛОПИДОГРЕЛЯ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

1 О ДЕК 2009

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск - 2009

003488694

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент Лазарева Галина Анатольевна кандидат медицинских наук Пашков Денис Валерьевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « 2- » 2009 г. в I 2. часов на

заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 305041, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан « 2.1 » шм 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Патофизиология ишемической болезни сердца, артериальной гипертен-зии и ее осложнений всегда была объектом большого количества экспериментальных и клинических исследований. В настоящее время признана ведущая роль эндотелиальной дисфункции (ЭД) в развитии данных патологических состояний. Вещества, секретируемые эндотелием сосудов и участвующие в гемостазе, можно условно разделить на проагрегантные и антиагрегантные. В условиях нормального функционирования эндотелия баланс этих веществ смещен в сторону антиагрегантных, являющихся также вазодилататорами. Сочетание на эндотелии антиагрегантов и вазодилататоров в физиологических условиях является основой для адекватного кровотока, особенно в сосудах микроциркуляции.

Повреждение эндотелия и обнажение субэндотелиальных слоев запускает реакции агрегации и свертывания, препятствующие кровопотере, вызывает спазм сосуда, прекращается образование антиагрегантов. При кратковременном действии повреждающих агентов эндотелий продолжает выполнять защитную функцию, но при продолжительном их воздействии начинает играть ключевую роль в патогенезе ряда системных патологий (атеросклероз, гипертония, инсульты, инфаркты и др.). Это объясняется участием эндотелия в активизации ренин-ангиотензиновой и симпатической систем, переключением активности эндотелия на синтез оксидантов, вазоконстрикторов, агрегантов и тромбоген-ных факторов, а также уменьшением деактивации эндотелиальных биологически активных веществ из-за повреждения эндотелия некоторых сосудистых областей (в частности, в легких) (Какаг Р., 2007).

В связи с чем осложнения, развивающиеся на фоне воздействия высокого давления, как правило, носят тромботический, а не геморрагический характер (так называемый «тромботический парадокс артериальной гипертензии» или «Бирмингемский парадокс»), Антиагреганты являются одной из основных групп препаратов, применяемых в лечении данных осложнений. В настоящее время большой интерес представляют данные о влиянии их не только на систему гемостаза, но и на функциональное состояние эндотелия. Однако вопрос эн-дотелиопротективных и кардиопротективных эффектов в условиях блокады ЫО-синтазы по-прежнему остается открытым.

Номер государственной регистрации 0120.0 850766.

Цель исследования: провести комплексное изучение эндотелиопротек-тивного и кардиопротективного действия ацетилсалициловой кислоты и клопи-догреля при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Изучить эндотелиопротективную активность ацетилсалициловой кислоты при • Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

2. Исследовать эндотелиопротективную активность клопидогреля при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

3. Оценить в сравнительном аспекте эндотелиопротективную активность комбинации ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

4. Провести исследование кардиопротективной активности ацетилсалициловой кислоты при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

5. Изучить кардиопротективную активность клопидогреля при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

6. Изучить в сравнительном аспекте кардиопротективную активность комбинации ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля при Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

Научная новизна результатов и положений, полученных в диссертации

В работе впервые предложен способ коррекции Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции ацетилсалициловой кислотой (АСК), клопидогрелем, а также их комбинацией.

Впервые показано, что ацетилсалициловая кислота в дозе 25,8 и 8,6 мг/кг (однократно, внутрижелудочно, в течение 7 суток) оказывает эндотелиопротек-тивное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЭД. Клопидогрел в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг (однократно, внутрижелудочно, в течение 7 суток) также обладает эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии. Со-четанное использование ацетилсалициловой кислоты (8,6 мг/кг) и клопидогреля (3,3 мг/кг) продемонстрировало выраженное эндотелиопротективное действие.

Научная новизна подтверждается получением двух патентов РФ.

Практическая значимость

В работе обоснована эффективность применения антиагрегантов из групп ингибиторов циклооксигеназы (ЦОГ) и ингибиторов АДФ-рецепторов тромбоцитов для коррекции Ь-ЫАМЕ-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что их использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация - ЭЗВД) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация - ЭНВД) с уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), добиться положительной динамики морфофункциональных и биохимических показателей сердечнососудистой системы.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания исследуемых препаратов при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

Внедрение результатов научных исследований

Результаты диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопро-тективной и кардиопротективной активности ацетилсалициловой кислоты («Аспирин-кардио» производства «Bayer», Германия) и клопидогреля («Плавике» производства «Sanofi-Winthrop Industrie», Франция), используются в лекционных курсах по фармакологии в Белгородском государственном университете, Воронежской государственной медицинской академии, Орловском государственном университете.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на II Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2008), конференции «Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов» (Курск, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2008), Международной научно-практической конференции «Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании» (Белгород, 2008), 74-й межвузовской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2009), 74-й научной конференции КГМУ «Университетская наука: теория, практика, инновации» (Курск, 2009), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009).

Апробация диссертации проведена на межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 2, акушерства и гинекологии, биоорганической химии, анатомии человека, травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии, НИИ Экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе две из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту

1. Ацетилсалициловая кислота в дозе 25,8 и 8,6 мг/кг однократно, внут-рижелудочно, в течение 7 суток оказывает эндотелиопротективное и кардио-протективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, способности препятствовать уменьшению концентрации нитрит-ионов, повышению адренореактивности, исчерпанию миокардиального резерва и гипертрофии кардиомиоцитов.

2. Применение клопидогреля в дозе 6,5 и 3,3 мг/кг однократно, внутриже-лудочно, в течение 7 суток оказывает эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, способности препятствовать уменьшению концентрации нитрит-ионов, повышению ад-ренореактивности, исчерпанию миокардиального резерва и гипертрофии кар-диомиоцитов.

3. Комбинированное использование ацетилсалициловой кислоты . (8,6 мг/кг) и клопидогреля (3,3 мг/кг) оказывает выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции по данным проб на эндотелийзависимую и эндотелийнезави-симую вазодилатацию, результатам нагрузочных проб, а также морфологических и биохимических исследований.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 183 источника, из которых 89 отечественных и 94 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 1 схему и 26 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. N-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг. На 7 день от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрий 50 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей. Болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы «Biopac». Функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) (Laursen J.B., 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца, и посредством датчика и компьютерной программы «Biopac» регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt шах), максимальную скорость расслабления (-dp/dt шах), частоту сердечных сокращений (ЧСС)).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность - внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида ]' 10"5моль/л, из расчета 0,1 мл на 100 г (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Нагрузка сопротивлением - пережатие восходящей аорты на 30 сек (Меерсон Ф.З., 1980).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции.

Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одно-этапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (Метель-ская В.А., Туманова Н.Г., 2005). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски.

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и комплексной оценки эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца, почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий. Материал фиксирован в 10% растворе формалина с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Pero и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. При морфометрии сердца производилось определение диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова (1994).

Обоснование доз и дизайн эксперимента.

Исследованы эндотелиопротективные свойства ацетилсалициловой кислоты («Аспирин-кардио» производства «Bayer», Германия) и клопидогреля («Плавике» производства «Sanofi-Winthrop Industrie», Франция).

Ацетилсалициловая кислота и клопидогрел вводились внутрижелудочно в средней терапевтической дозе, используемой по литературным данным в кардиологии. Суспензии препаратов в 1% крахмальной слизи вводились в пищевод животных через зонд один раз в сутки в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME.

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах (Deng L.Y., 1993).

Ацетилсалициловую кислоту применяли в дозах 25,8 и 8,6 мг/кг. Клопидогрел использовался в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг.

Комбинированное использование ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля в дозах 8,6 мг/кг и 3,3 мг/кг соответственно проводилось по ранее описанному протоколу один раз в сутки в течение 7 дней на фоне введения L-NAME.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня

определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±т) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием T-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Длительное, в течение 7 суток, однократное внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг/кг приводило к стойкому повышению артериального давления.

Проведение функциональных проб с оценкой реакций на эндотелийзави-симую и эндотелийнезависимую вазодилатацию показало существенные различия в группе с L-NAME-индуцированной патологией в отличие от интактных животных.

На рисунке 1а верхняя кривая - АД систолическое, далее - АД диастоли-ческое и ЧСС, Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением артериального давления и брадикардией.

После окончания миокардиального компонента артериальное давление восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления артериального давления принимался нами как площадь эндотелийзависимой реакции.

На рисунке 16 представлена реакция на ацетилхолин (АХ) при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции. При этом видно, что площадь эндотелийзависимой реакции в несколько раз меньше, чем у интактных животных.

Эндотелийнезависимая вазодилатация оценивалась посредством функциональной пробы с введением нитропруссида натрия (НП) интактным животным и животным с L-NAME патологией (рис. 2).

Формула расчета коэффициента эндотелиальной дисфункции была впервые предложена в лаборатории кардиофармакологии НИИ Экологической медицины КГМУ коллективом авторов под руководством профессора М.В. Покровского, и является отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ.

S АД НП

КЭД =--------

S АД АХ

Данный показатель отражает степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных и ее коррекцию исследуемыми препаратами.

' 23®,0» Р'17 Р'З* уц ТЛ ¿>3 гп. ЧРС1 8ТВТОЬ1С 1Г <МП Н& ) 912нх . «г! и»: Р01' 999 я 33999 »»С» «ТвТОИС »г ^ П Ив ) \ 912С

' 29».ее :-^ е. а». J 5ВС1 ЯавТОНС >Р <ГП ив > 51ЯН» ^^^ -1— aae.ee йьс! яаггмлс >г < п не > 513Н 79

"ПИШх 699.09 ЛРС1 Н1Я*Т КЙТ1 ( 139.99 . II Э12Н1 1

а) интактные животные б) животные с патологией

Рис. 1. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эн-дотелийзависимую вазодилатацию (внутривенное введение ацетилхолина 40 мкг/кг) у интактных животных.

Примечание. Треугольники над кривыми артериального давления - объяснение по тексту.

ч

V

111.« «М ИОТИС №

И.И »«1 МОП МП (|.«1

' ' ЯМ! ПИ

а) интактные животные

Ми ийншгм!

Л1.И МС1 (1КТ911С »

«И и кит теп

б) животные с патологией

Рис. 2. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эн-дотелийнезависимую вазодилатацию (внутривенное введение нитропруссида натрия 30 мкг/кг) у интактных животных.

Примечание. Треугольники над кривой артериального давления - объяснение по тексту.

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1, при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота - в 5 раз больше, его значение составило 5,4 (рис. 5).

Ь-ЫАМЕ-индуцированный дефицит оксида азота привел к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению мио-кардиального резерва в пробе на нагрузку сопротивлением (рис. 5).

У интактных животных показатель исчерпания миокардиального резерва к 25 секунде составил 81,3%, а у животных с Е-ЫАМЕ-индуцированной патологией значительно меньше - до 60,4% (рис. 5).

Характерная динамика биохимических маркеров ЫМАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис. 5. Так, концентрация нитрит-ионов (ЫОх) у животных, получавших Ь-ЫАМЕ, составила 61,2±3,6, тогда как у интактных - 114,1±4,1 мкМоль (рис. 5).

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, явились результаты морфологических исследований (рис. 3, 4, 5).

¿й

Рис. 3. Морфология миокарда у интактных и опытных животных.

Примечание, а - гистологическая картина миокарда у интактных крыс на поперечном срезе; б - гипертрофия кардиомиоцитов и их ядер у крыс с артериальной гипертензией в модели с ЫМАМЕ на поперечном срезе. Окр. гематоксилином и эозином, ув. 440.

Рис. 4. Морфологическая картина почечных артерий у интактных и опытных животных.

Примечание, а - неизмененная артерия почки у интактных крыс; б - перестройка стенки почечной артерии с резким утолщением ее стенки и сужением просвета, гиперплазией эластических структур и гипертрофией гладкомышеч-ных элементов у крыс с артериальной гипертензией в модели с Ь-ЫАМЕ. Окр. гематоксилином и эозином, ув. 440.

На представленных гистологических препаратах слева (а) - интактные миокардиоциты, справа (б) - миокардиоциты животных на 7-е сутки с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией. Наглядно видно, что площадь поперечного сечения резко увеличена при сохраненном диаметре ядер при одном увеличении. Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,1±1,1, а у животных, получавших ЫМАМЕ,-18,4±1,1 мкм (рис. 5).

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артериол (рис. 4). У интактных животных (а) клетки эндотелия расположены плоско, при Ь-ЫАМЕ-патологии (б) - сосуд спазмиро-ван, стенки утолщены, эндотелий «вздыблен».

Таким образом, ежедневное в течение 7 суток внутрибрюшинное введение Ь-МАМЕ в дозе 25 мг/кг вызывает развитие эндотелиальной дисфункции, характеризующейся резким увеличением КЭД, АД, повышением адренореак-тивности с развитием скрытой сердечной недостаточности, характерными биохимическими сдвигами и гистологической картиной гипертрофии миокарда и гиперплазии сосудистого русла.

Рис. 5. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NАМЕ-индуцированного дефицита N0. Здесь и далее: АД - артериальное давление, КЭД - коэффициент эндотелиаль-ной дисфункции, АДр - адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением, NOx - total NO.

* - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р < 0,05 в сравнении с группой L-NAME.

2. Изучение эндотелиопротективных свойств ацетилсалициловой кислоты при Ь^АМЕ-нндуцированной модели эндотелпалыюй дисфункции.

Применение ацетилсалициловой кислоты в дозах 8,6 и 25,8 мг/кг на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции не приводило к снижению показателей артериального давления (рис. 6).

В ходе проведенных исследований было обнаружено, что ацетилсалициловая кислота в дозах 8,6 и 25,8 мг/кг обладает выраженным эндотелиопротек-тивным действием. Так, КЭД у интактных животных составил 1,1±0,1, у животных с Ь-ЫАМЕ - 5,4±0,6, в группе с АСК (8,6 мг/кг) на фоне Ь-ЫАМЕ -2,1±0,3, в группе с АСК (25,8 мг/кг) на фоне Ь-ЫАМЕ - 2,1±0,2 (рис. 6).

В пробе на адренореактивность выявлена тенденция к снижению абсолютных значений ЛЖД под влиянием ацетилсалициловой кислоты на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологии (рис. 6).

В пробе на нагрузку сопротивлением ацетилсалициловая кислота в исследуемых дозах предотвращала падение сократимости от 5 к 25 секунде пережатия аорты. Так, ЛЖД на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составило 81,3% от величины на 5 секунде (что принято за 100%). В контрольной группе (Ь-ЫАМЕ-индуцированная ЭД) - 60,4%. В группе животных, получавших АСК, отмечается четкое предотвращение исчерпания миокарди-ального резерва. Сократимость к 25 секунде в группах с применением АСК (8,6 и 25,8 мг/кг) на фоне Ь-ЫАМЕ составила 87,3% и 73,4% соответственно (рис. 6).

Ацетилсалициловая кислота 8,6 мг/кг и 25,8 мг/кг увеличивала содержание нитрит-ионов в плазме лабораторных животных в условиях Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 (рис. 6).

Также выявлена способность препарата предотвращать развитие гипертрофии миокарда (рис. 6).

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей ацетилсалициловая кислота в дозах 8,6 мг/кг и 25,8 мг/кг проявляла выраженную эндотелиопротективную и кардиопротектив-ную активность на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

ММЕ АСХ (25,8 мг/«г) АСК (8,6 иг/яг) ¡□САДВДАД)

кэд

Адр

НС

249,9 227, В"

А 2043"

• Интакгныа -»- 1_-МАМЕ • АСК (25,6 -» - АСК (9,8 мг/кг)1

1\Ох

ДМ

Интактные

Ь^АМЕ

АСК 25,8 мг/кг

АСК 8,6 мг/кг

Рис. 6. Влияние ацетилсалициловой кислоты (25,8 и 8,6 мг/кг) на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь^АМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Примечание. ** - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных, * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных.

3. Изучение эндотелиопротективных свойств клопндогреля при 1_^АМЕ-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции.

Применение клопидогреля в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции не приводило к снижению показателей артериального давления (рис. 7).

Рис. 7. Влияние клопидогреля (6,5 и 3,3 мг/кг) на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Примечание. ** - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных, * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных.

В ходе проведенных исследований было обнаружено, что клопидогрел в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг также обладает выраженным эндотелиопротективным действием. Так, КЭД у интактных животных составил 1,1±0,1, у животных с Ь-ЫАМЕ - 5,4±0,6, в группе с применением клопидогреля (6,5 мг/кг) на фоне Ь-МАМЕ - 2,0±0,2, в группе с применением клопидогреля (3,3 мг/кг) на фоне Ь-ЫАМЕ — 2,0±0,1 (рис. 7).

В пробе на адренореактивность выявлена тенденция к снижению абсолютных значений ЛЖД на фоне терапии клопидогрелем Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологии (рис. 7).

В пробе на нагрузку сопротивлением клопидогрел в исследуемых дозах предотвращал падение сократимости от 5 к 25 секунде пережатия аорты. ЛЖД на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составило 81,3% от величины на 5 секунде (что принято за 100%). В контрольной группе (Ь-ЫАМЕ-индуцированная ЭД) — 60,4%. В группе животных, получавших клопидогрел, отмечается четкое предотвращение исчерпания миокардиального резерва. Сократимость к 25 секунде в группах с применением клопидогреля (6,5 и 3,3 мг/кг) на фоне Ь-ЫАМЕ составила 89,5% и 89,3% соответственно (рис. 7).

Применение клопидогреля способствовало увеличению концентрации нитрит-ионов в плазме лабораторных животных в условиях Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, а также предотвращало развитие гипертрофии миокарда (рис. 7).

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей клопидогрел в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг проявлял выраженную эндотелиопротективную и кардиопротективную активность на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

4. Изучение эндотелиопротектнвных свойств комбинации ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции.

Применение комбинации ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля в дозах 8,6 и 3,3 мг/кг соответственно на фоне Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции не приводило к снижению показателей артериального давления (рис. 8).

В ходе проведенных исследований было обнаружено, что указанная комбинация также обладает выраженным эндотелиопротективным действием. Так, КЭД у интактных животных составил 1,1±0,1, у животных с Ь-МАМЕ - 5,4±0,6, в группе с применением комбинации ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля (8,6 мг/кг и 3,3 мг/кг соответственно) на фоне Ь-ЫАМЕ - 1,5±0,1 (рис. 8).

В пробе на адренореактивность выявлена тенденция к снижению абсолютных значений ЛЖД на фоне комбинированной терапии Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологии (рис. 8).

АСК+клопвдогрвл (5,* И ипкгI

Интактные

Ь-ИАМЕ

АСК (8,6 мг/кг) + Клонидогрел (3,3 мг/кг)

Рис. 8. Влияние комбинации АСК и клопидогреля (8,6 и 3,3 мг/кг) на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Примечание. ** - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ животных, * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных.

В пробе на нагрузку сопротивлением исследуемая комбинация препаратов предотвращала падение сократимости от 5 к 25 секунде пережатия аорты. ЛЖД на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составило 81,3%

от величины на 5 секунде (что принято за 100%). В контрольной группе (L-NAME-индуцированная ЭД) - 60,4%. В группе животных, получавших комбинацию ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля (8,6 мг/кг и 3,3 мг/кг соответственно), отмечается четкое предотвращение исчерпания миокардиально-го резерва. Сократимость к 25 секунде в группе с применением комбинации исследуемых препаратов на фоне L-NAME составила 75,7% (рис. 8).

Применение комбинации ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля (8,6 мг/кг и 3,3 мг/кг соответственно) способствовало увеличению концентрации нитрит-ионов в плазме лабораторных животных в условиях L-NAME-индуцированного дефицита NO, а также предотвращало развитие гипертрофии миокарда (рис. 8).

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей комбинация ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля проявляла выраженную эндотелиопротективную и кардиопротек-тивную активность на фоне L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Гипотетически механизмы эндотелио- и кардиопротективных эффектов ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля можно объяснить следующим образом. В последние годы зарубежными ученьПии было доказано, что ацетилсалициловая кислота не просто ингибирует активность циклооксигеназы, а модифицирует ее ферментативную активность. Сразу после приема внутрь препарат подвергается воздействию капиллярной сети, где он (в эндотелии и циркулирующих лейкоцитах) ацетилирует циклооксигеназу-2 и инициирует синтез 15R-HETE, метаболита, который затем ферментом 5-липоксигеназа превращается в 15-эпи-липоксин A4. А последний, в свою очередь, является стимулятором эндотелиальной (eNOS) и индуцибельной (¡NOS) NO-синтазы, увеличивая продукцию NO (Paul-Clark M.J., 2004; Gilroy D.W., 2005) (рис. 9).

Также ацетилсалициловая кислота стимулирует синтез оксида азота тромбоцитами (Madajka М., 2003; Chakraborty К., 2003) и повышает его биодоступность, снижая уровень оксидативного стресса (Grosser N., 2003; Oberle S., 1998). По всей видимости, наличие у АСК подобных свойств играет важную роль в ее эндотелиопротективных эффектах.

Рис. 9. Влияние АСК на синтез оксида азота.

Примечание. ЭК - эндотелиальные клетки, АСК - ацетилсалициловая кислота, ЦОГ-2 - циклооксигеназа-2, ЛЕЙ - лейкоциты, 15-epi-LXA4 - 15-эпи-липоксин А4, eNOS - эндотелиальная NO-синтаза, iNOS - индуцибельная NO-синтаза, NO - оксид азота.

В последнее время клопидогрел также активно изучается как потенциальный эндотелиопротектор. Данные зарубежной литературы свидетельствуют, что препарат способен увеличивать биодоступность оксида азота путем уменьшения оксидативного стресса.

Известно, что сами тромбоциты представляют собой источник кислородных радикалов, которые уменьшают биодоступность сосудистого N0, приводя к ухудшению эндотелиальной функции. Клопидогрел, блокируя АДФ рецепторы тромбоцитов, ингибирует высвобождение CD40L - важного тромбоцитар-ного медиатора, который увеличивает эндотелиальную продукцию активных радикалов кислорода, уменьшая биодоступность NO. Также блокада данных рецепторов приводит к увеличению продукции NO тромбоцитами (Heitzer Т., 2006; Jakubowski А., 2005). В настоящее время доказана способность клопидог-реля увеличивать продукцию оксида азота эндотелием коронарных сосудов, что является важным доказательством его эндотелиопротективных эффектов (Molero L., 2005) (рис. 10).

N0

Рис. 10. Влияние клопидогреля на синтез и биодоступность оксида азота. Примечание. ЭК - эндотелиальные клетки, АДФ-рец. - АДФ-рецепторы тромбоцитов, еМОБ - эндотелиальная ЫО-синтаза, N0 - оксид азота.

ВЫВОДЫ

1. Ацетилсалициловая кислота в дозах 25,8 и 8,6 мг/кг однократно, в течение 7 суток проявляла выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ИАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции по данным проб на эндотелийзависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию, характеризующееся снижением коэффициента эндотелиальной дисфункции до 2,1±0,2 и 2,1±0,3 соответственно и подтверждающееся исследованными биохимическими показателями.

2. Клопидогрел в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, по данным проб на эндотелийзависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию, проявляющееся уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции до 2,0±0,2 и 2,СШ),1 соответственно и приближающегося к уровню интактных животных, а также нормализацией биохимических показателей.

3. Комбинация ацетилсалициловой кислоты 8,6 мг/кг и клопидогреля 3,3 мг/кг оказывала выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-КАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, по данным проб на эндотелийзависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию и биохимическим

показателям, причем в большей степени, чем при монотерапии ацетилсалициловой кислотой и клопидогрелем,

4. Ацетилсалициловая кислота в дозах 25,8 и 8,6 мг/кг однократно, в течение 7 суток проявляла кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиалыюй дисфункции, что характеризовалось способностью препарата снижать адренореактивность, предотвращать исчерпание миокардиального резерва, а также препятствовать увеличению поперечного диаметра кардиомиоцитов.

5. Клопидогрел в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг однократно, в течение 7 суток проявлял кардиопротективное действие по совокупности проб на адренореактивность и нагрузку сопротивлением и данных морфологических исследований.

6. Выявлено кардиопротективное действие комбинации ацетилсалициловой кислоты 8,6 мг/кг и клопидогреля 3,3 мг/кг на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции по результатам нагрузочных проб и морфологических показателей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Цепелев, В.Ю. Эндотелиопротективные свойства ацетилсалициловой кислоты /В.Ю. Цепелев, A.B. Бабко // Материалы 73-й межвузовской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов». - Курск: КГМУ, 2008. -№ 1. - С. 225.

2. Цепелев, В.Ю. Эндотелиопротективные свойства клопидогреля /

B.Ю. Цепелев, С.Ю. Паюсова // Материалы 73-й межвузовской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов». - Курск: КГМУ, 2008. - № 1. -

C. 224.

3. Цепелев, В.Ю. Коррекция эндотелиалыюй дисфункции антиагрегант-ными препаратами / В.Ю. Цепелев, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская // Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании: материалы международной научно-практической конференции - Белгород, 2008.-С. 323-325.

4. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / В.Ю. Цепелев, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова // Биомедицинская инженерия и биотехнология: сборник трудов Всероссийской научно-практической .конференции, посвященной 10-летию биотехнологического факультета КГМУ. - Курск: КГМУ, 2008. - С. 202-205.

5. Эндотелиопротективные свойства клопидогреля при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / В.Ю. Цепелев, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская и др. // Российский национальный конгресс кардиологов

«Повышение качества и доступности кардиологической помощи» // Кардиова-скулярная терапия и профилактика. - 2008. - № 7 (6). - Прил. 1. - С. 396.

6. Цепелев, В.Ю. Эндотелиопротективные эффекты ацетилсалициловой кислоты / В.Ю. Цепелев, A.B. Бабко / «Фармация из века в век»: труды научно-практической конференции - СПб., 2008. - Ч. 5: Синтез биологически активных веществ для создания фармацевтических субстанций. Фармакологические исследования. - С. 180-183.

7. Цепелев, В.Ю. Эндотелиопротективные эффекты клопидогреля /

B.Ю. Цепелев, A.B. Бабко / «Фармация из века в век»: труды научно-практической конференции - СПб., 2008. - Ч. 5: Синтез биологически активных веществ для создания фармацевтических субстанций. Фармакологические исследования. - С. 178-180.

8. Способы экспериментального моделирования эндотелиальной дисфункции / М.В. Корокин, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9. - № 3. - С. 327.

9. Патогенетическая коррекция эндотелиальной дисфункции ацетилсалициловой кислотой / В.Ю. Цепелев, A.B. Демьянов, А.И. Маяков, И.В. Цыбуль-ский // Материалы 74-й межвузовской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность». - Курск: КГМУ, 2009. - № 2. - С. 223-224.

10. Применение ацетилсалициловой кислоты для коррекции эндотелиальной дисфункции / В.Ю. Цепелев, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б, Артюшкова И Университетская наука: теория, практика, инновации: сборник трудов 74-й научной конференции КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАЕН. В 2 т. - Курск: КГМУ, 2009. - Т. 2. - С. 313-315.

11. Эффективность применения клопидогреля для коррекции эндотелиальной дисфункции / В.Ю. Цепелев, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова // Университетская наука: теория, практика, инновации: сборник трудов 74-й научной конференции КГМУ и сессии ЦентральноЧерноземного научного центра РАЕН: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2009. - Т. 2. -

C. 315-317.

12. Фармакологическая коррекция эндотелиальной дисфункции ацетилсалициловой кислотой / В.Ю. Цепелев, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская и др. // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - М., 2009. -С. 761.

13. Фармакологическая коррекция эндотелиальной дисфункции клопи-догрелем / В.Ю. Цепелев, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская и др. // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - М., 2009. - С. 761.

14. Роль антиагрегантных препаратов в коррекции эндотелиальной дисфункции / В.Ю. Цепелев, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская и др. // Кубанский научный медицинский вестник - 2009. -№ 4 (109). - С. 149-153.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 17.11.2009 г. Подписано в печать 18.11.2009 г. Формат 30x427g Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 111А Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Актуальность исследования

Исследования последних лет существенно изменили представление о сосудистом эндотелии и эндотелиальной дисфункции. Сам эндотелий представляет собой гормонально активную ткань, являющейся самой большой "эндокринной железой" человека. Общая масса эндотелиоцитов составляет около 1,5 - 2 кг, а общая протяженность — около 7 км [65, 156, 166, 176, 182]. В результате уникального расположения на границе между циркулирующей кровью и тканями, клетки эндотелия предстают в роли первоочередного органа-мишени, так как становятся наиболее уязвимыми для различных патогенных факторов (реактивных свободных радикалов, окисленных липопротеидов низкой плотности и др.), находящихся в системном и тканевом кровотоке [27, 28, 98, 110, 131, 132, 167].

Клетки эндотелия выделяют большое количество различных веществ, как в-кровь, так и в окружающие ткани [156, 166, 176, 182]. Биологически активные вещества (БАВ), вырабатываемые эндотелием, действуют в основном паракринно (на соседние клетки) и аутокринно-паракринно (на эндотелий), но сосудистая стенка - структура динамичная. Ее эндотелий постоянно обновляется, отжившие фрагменты вместе с БАВ попадают в кровь, разносятся по всему организму и могут оказывать влияние на системный кровоток. Об активности эндотелия можно судить по содержанию его БАВ в крови. В нормальных условиях секретируются преимущественно вещества, обладающие вазодилатирующим и антиагрегантным действием. Одним из основных гуморальных эндотелиальных модуляторов является оксид азота (N0) - эндотелиальный фактор релаксации [30, 74, 119, 141, 145, 152, 153]. Дисфункция эндотелия, наступающая при воздействии повреждающих агентов (механических, инфекционных, обменных, иммунокомплексных и т. п.), резко меняет направление его эндокринной активности на противоположную: образуются вазоконстрикторы, проагреганты.

Таким образом, эндотелиальная дисфункция представляет собой дисбаланс между продукцией вазодилатирующих, ангиопротективных, антипролиферативных факторов с одной стороны (NO, простациклин, тканевой активатор плазминогена, С-тип натрийуретического пептида, эндотелиального гиперполяризующего фактора) и вазоконстриктивньтх, протромботических, пролиферативных факторов, с другой стороны (эндотелии, супероксид-анион, тромбоксан А2, ингибитор тканевого активатора плазминогена) [137, 178, 179]. При этом механизм их окончательной реализации неясен.

Патогенетическая роль эндотелиальной дисфункции (ЭД) доказана при ряде наиболее распространенных заболеваниях и патологических состояниях: атеросклерозе, легочной гипертензии, сердечной недостаточности, дилатационной кардиомиопатии, ожирении, гиперлипидемии, сахарном диабете (СД), гипергомоцистеинемии [9; 15, 36, 39; 45, 59; 61, 63, 87,.147, 157,164, 168, 177].

В настоящее время, достаточно большое внимание уделяется влиянию антиагрегантных препаратов на клетки сосудистого эндотелия, однако изучение их эндотелиопротективных эффектов при экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции в литературе нами не обнаружено.

Цель исследования: Провести комплексное изучение эндотелиопротективного и кардиопротективного действия ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Для достижения поставленной цели необходимо- решить следующие задачи исследования:

1. Изучить эндотелиопротективную активность ацетилсалициловой кислоты при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

2. Исследовать эндотелиопротективную активность клопидогреля при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

3. Оценить в сравнительном аспекте эндотелиопротективную активность комбинации ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

4. Провести исследование кардиопротективной активности ацетилсалициловой кислоты при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

5. Изучить кардиопротективную активность клопидогреля при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

6. Изучить в сравнительном аспекте кардиопротективную активность комбинации ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ коррекции L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции ацетилсалициловой кислотой, клопидогрелем, а также их комбинацией.

Впервые показано, что ацетилсалициловая кислота в дозе 25,8 и 8,6 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) оказывает эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной ЭД. Клопидогрел в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) также обладал эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии. Сочетанное использование АСК (8,6 мг/кг) и клопидогреля (3,3 мг/кг) также продемонстрировало выраженное эндотелиопротективное действие.

Научная новизна подтверждается получением двух положительных решений на выдачу патента РФ.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность применения антиагрегантов из групп ингибиторов ЦОГ и ингибиторов АДФ-рецепторов тромбоцитов для коррекции L-NAME-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что их использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания исследуемых препаратов при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

Внедрение результатов научных исследований. Результаты диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной и кардиопротективной активности ацетилсалициловой кислоты- («Аспирин — кардио» производства «Вауег», Германия) и клопидогреля («Плавике» производства «Sanofi - Winthrop Industrie», Франция) используются в лекционных курсах по фармакологии в Белгородском государственном университете, Воронежской государственной медицинской академии, Орловском государственном университете.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на II международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2008), конференции «Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов» (Курск, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2008), международной научно-практической конференции «Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании» (Белгород, 2008), 74 межвузовской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2009), 74-й научной конференции КГМУ

Университетская наука: теория, практика, инновации» (Курск, 2009), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009). Апробация диссертации проведена на межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 2, акушерства и гинекологии, биоорганической химии, анатомии человека, травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии, НИИ Экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе две из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание-ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту.

1. Ацетилсалициловая кислота в дозе 25,8 и 8,6 мг/кг однократно, внутрижелудочно, в течение 7 суток оказывает эндотелиопротективное и-кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной ЭД, выражающееся- в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, способности препятствовать уменьшению концентрации нитрит-ионов, повышению адренореактивности, исчерпанию миокардиального резерва и гипертрофии кардиомиоцитов.

2. Применение клопидогреля в дозе 6,5 и 3,3 мг/кг однократно, внутрижелудочно, в течение 7 суток оказывает эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной ЭД, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, способности препятствовать уменьшению концентрации нитрит-ионов, повышению адренореактивности, исчерпанию миокардиального- резерва и гипертрофии кардиомиоцитов.

3. Комбинированное использование АСК (8,6 мг/кг) и клопидогреля (3,3 мг/кг) оказывает выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной ЭД, по данным проб на эндотелийзависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию, результатам нагрузочных проб, а также морфологических и биохимических исследований.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 183 источника, из которых 89 отечественных и 94 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 1 схему и 26 рисунков.

выводы

1. Ацетилсалициловая кислота в дозах 25,8 и 8,6 мг/кг однократно, в течение 7 суток, проявляла выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, по данным проб на эндотелийзависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию, характеризующееся снижением коэффициента эндотелиальной дисфункции до 2,1±0,2 и 2,1±0,3 соответственно и подтверждающееся исследованными биохимическими показателями.

2. Клопидогрел в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, по данным проб на эндотелийзависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию, проявляющееся уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции до 2,0±0,2 и 2,0±0,1 соответственно и приближающегося к уровню интактных животных, а также нормолизацией биохимических показателей.

3. Комбинация ацетилсалициловой кислоты 8,6 мг/кг и клопидогреля 3,3 мг/кг оказывала выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, по данным проб на эндотелийзависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию и биохимическим показателям, причем, в большей степени, чем при монотерапии ацетилсалициловой кислотой и клопидогрелем.

4. Ацетилсалициловая кислота в дозах 25,8 и 8,6 мг/кг однократно, в течение 7 суток, проявляла кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, что характеризовалось способностью препарата снижать адренореактивность, предотвращать исчерпание миокардиального резерва, а также препятствовать увеличению поперечного диаметра кардиомиоцитов.

5. Клопидогрел в дозах 6,5 и 3,3 мг/кг однократно, в течение 7 суток, проявлял кардиопротективное действие по совокупности проб на адренореактивность и нагрузку сопротивлением и данных морфологических исследований.

6. Выявлено кардиопротективное действие комбинации ацетилсалициловой кислоты 8,6 мг/кг и клопидогреля 3,3 мг/кг на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, по результатам нагрузочных проб и морфологических показателей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Патофизиология ишемической болезни сердца, артериальной гипертензии и ее осложнений всегда была объектом большого количества экспериментальных и клинических исследований. В настоящее время признана ведущая роль эндотелиальной дисфункции в развитии данных патологических состояний.

Основным механизмом, лежащим в основе ЭД, является снижение образования и биодоступности оксида азота (NO), при одновременном повышении уровня супероксид-аниона и продукции мощных вазоконстрикторов [14], т.е. характеризуется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов [2, 14, 15, 17, 18, 21, 23, 27, 29].

Эндотелий контролирует сосудистый тонус, рост гладкомышечных клеток, тромбообразование, фибринолиз и многие другие процессы. Сосудистый гомеостаз регулируется посредством высвобождения* клетками эндотелия ряда вазоактивных веществ, которые поддерживают базальный тонус сосудов, обладают ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов, предотвращают ремоделирование сосудистой стенки, ингибируют агрегацию и адгезию тромбоцитов, лейкоцитарные взаимодействия и миграцию моноцитов, оказывают антиоксидантное действие.

В результате нарушения нормального функционирования эндотелия усиливаются процессы агрегации и свертывания, играющие немаловажную роль в развитии предтромбозного состояния при артериальной гипертензии. В артериях при высоком давлении и большой скорости кровотока образуются тромбы, преимущественно состоящие из тромбоцитов, а не из фибрина. Артериальные тромбы прочно связаны со стенкой сосуда. Они могут быть постоянными или преходящими, обтурировать просвет сосуда полностью или частично. Основное значение для активации такого тромба имеет активация тромбоцитов в месте повреждения эндотелия.

В связи с чем, осложнения, развивающиеся на фоне воздействия высокого давления, как правило, носят тромботический, а не геморрагический характер (так называемый «тромботический парадокс артериальной гипертензии» или «Бирмингемский парадокс») [150].

Антиагреганты являются основной группой препаратов, применяемых в лечении данных осложнений. В настоящее время, большой интерес представляют данные о влиянии их не только на систему гемостаза, но и на функциональное состояние эндотелия.

Методы исследования функции эндотелия периферических артерий основываются на оценке его способности продуцировать NO в ответ на фармакологические (ацетилхолин, метахолин, брадикинин, гистамин) или физические (изменение кровотока) стимулы, а также на прямом определении уровня NO и оценке уровня косвенных показателей эндотелиальной функции (эндотелии, фактор фон Виллебранда, тканевой активатор плазминогена, тромбомодулин)1 [2,4, 101, 103, 139,142].

Физиологические методы исследования включали моделирование эндотелиальной дисфункции ежедневным в/б введением L-NAME в дозе 25 мг/кг в течение 7 суток, которая характеризовалась снижением эффектов эндотелийзависимых вазодилататоров и повышением вазоконстрикторных влияний, ростом артериального давления, нарушением системной и региональной гемодинамики, увеличением экспрессии адгезивных молекул эндотелия, увеличением агрегации тромбоцитов; прилипанием их и лейкоцитов к сосудистой стенке; пролиферацией и миграцией гладкомышечных клеток с образованием неоинтимы, синтезом внеклеточного матрикса и др. [58, 61, 143, 146].

Для оценки степени развития эндотелиальной дисфункции на восьмые сутки животных наркотизировали, брали в эксперимент и на первом этапе оценивали реакции артериального давления на эндотелийзависимую (ацетилхолин) и эндотелийнезависимую (нитропруссид) вазодилатацию. [52, 53].

Степень эндотелиальной дисфункции рассчитывали как коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) - отношение площадей треугольников над кривой восстановления артериального давления на нитропруссид и ацетилхолин.

При расчете коэффициента эндотелиальной дисфункции в группе животных с L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункцией, обнаружено увеличение данного показателя в 5 раз относительно интактных животных - соответственно 1,1 у интактных и 5,4 у животных, получавших L-NAME. Полученные результаты позволяют с уверенностью говорить о адекватности выбранной модели патологии для исследования фармакологической активности антиагрегантных препаратов.

Полученные данные подтвердились при определении биохимических маркеров ЭД. NO-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании данных содержания нитрит-ионов NOx, и обнаружено, что моделирование L-NAME-индуцированного дефицита NO приводило к резкому снижению концентрации нитрит-ионов (NOx).

Результаты гистологических исследований обнаружили, что моделирование L-NAME-индуцированного дефицита NO на 7-е сутки приводит к яркой гипертрофии миокардиоцитов, утолщению мышечного слоя сосудистой стенки и спазму артериол, наиболее выраженному в почечных артериях, а также отеку и дезорганизации расположения эндотелиоцитов.

Следует отметить, что предложенный методический комплекс, функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита N0, вследствие блокады NO-синтетазы, позволяет в достаточной степени объективно оценивать эндотелиотропное действие фармакологических агентов.

В дальнейшем с помощью вышеизложенных методологических подходов были проведены сравнительные исследования антиагрегантных препаратов - ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля в двух дозах и их комбинации.

Почти 100 лет АСК активно используется в медицинской практике. Наиболее широкое применение ацетилсалициловой кислоты, в частности, при остром коронарном синдроме (ОКС), началось с начала 80-х годов, однако еще в 1953 году Калган опубликовал первое сообщение о применении ацетилсалициловой кислоты для профилактики и лечения ИБС. Проведение нескольких значительных исследований (VA, RISC, ISIS-2 и др.) убедительно продемонстрировало его способность снизить риск развития острого инфаркта миокарда (ОИМ) и острой коронарной смерти на 41-70%.

Данные исследования продемонстрировали, что положительный эффект ацетилсалициловой кислоты не зависит от дозы и проявляется даже при назначении 75 мг в сутки. Механизм действия ацетилсалициловой кислоты основывается» на необратимом блокировании циклооксигеназы, участвующей в синтезе тромбоксана А2, а поскольку тромбоцит не содержит ядра (нет способности к синтезу новых белков), такая блокада сохраняется на протяжении всей их жизни - от 8 до 10 дней. При использовании ацетилсалициловой кислоты нет синдрома отмены или развития толерантности к нему, достаточно редко встречаются кровотечения. Важным является и наличие у АСК эндотелиопротективных свойств. Известно, что АСК способна ацетилировать циклооксигеназу - 2 и инициирует синтез 15-эпи-липоксина А4, вещества, являющегося стимулятором эндотелиальной (eNOS) и индуцибельной (iNOS) NO-синтазы, увеличивающей продукцию NO. Также, известны и свойства ацетилсалициловой кислоты стимулировать синтез оксида азота тромбоцитами и повышать его биодоступность, снижая уровень оксидативного стресса [118, 144, 148, 159].

Среди современных антитромбоцитарных средств, все большее внимание привлекает к себе клопидогрел, сочетающий высокую эффективность и безопасность при длительном применении, разработанный компанией Санофи-Синтелабо (Франция).

Изучение антиагрегационного действия клопидогреля привело к созданию двуцентровой модели АДФ-зависимой агрегации тромбоцитов. Согласно этой модели, начальная тромбоцитарная реакция связана с активацией лигандо-оперированного ионного канала, а дальнейшая агрегация тромбоцитов зависит от Р21-класса пуринергических рецепторов. Патофизиологический путь запуска Р21-рецепторов обуславливает активацию аденилатциклазного пути. Именно эти изменения необходимы для полной активации GP lib / Ilia и образования достаточно больших стабильных тромбоцитарных агрегатов, в то время как начальная (незначительная) активация GP lib / Ilia и обратимая агрегация обусловлены прямым взаимодействием АДФ с ионным каналом. Указанная модель активации тромбоцитов объясняет результаты различных научных исследований этого препарата: клопидогрел не полностью блокировал связывание фибриногена с GP lib / Ilia, что приводило к значительному ослаблению агрегации, но-не к ее - отсутствию. Возможно, именно с этим связано снижение риска геморрагических осложнений при терапии клопидогрелем по сравнению с другими препаратами антиагрегационного действия.

Эффективность клопидогреля в сочетании с аспирином или как альтернативного лекарственного средства доказана в лечении и вторичной профилактике острых коронарных синдромов, при проведении процедур реваскуляризации, а также при атеросклеротических поражениях различных отделов сосудистого русла.

Особенно важно наличие у клопидогреля свойства увеличивать биодоступность оксида азота, путем уменьшения оксидативного стресса, а также увеличивать продукцию оксида азота эндотелием-коронарных сосудов и тромбоцитами [108, 121, 127].

Данные факты подтвердились результатами наших исследований. Так, ацетилсалициловая кислота в дозах 25,8 мг/кг и 8,6 мг/кг проявляла выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAMEиндуцированной эндотелиальной дисфункции, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, приближая его к уровню интактных животных, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием АСК увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME-индуцированной патологией.

Кардиопротективные эффекты ацетилсалициловой кислоты, по-видимому, связан с циклооксигеназой - 2, которая, в настоящее время, активно изучается, как кардиопротективный белок, посредством которого сердце защищает • себя от ишемии. Недавние исследования продемонстрировали, что ишемическая адаптация, или «ischemic preconditioning», положительно регулирует экспрессию и активность ЦОГ-2 в сердце. В свою очередь, увеличение ЦОГ-2 активности, характеризовалось увеличением защитных эффектов в последней стадии ишемической адаптации против инфаркта миокарда, что, по всей видимости, связано с синтезом PGE (2) и/или PGI (2) [115].

Клопидогрел в дозах 6,5 мг/кг и 3,3 мг/кг также проявлял выраженные эндотелиопротективные свойства на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, приближая его к группе интактных животных. Причем, по данным наших исследований, эндотелиопротективные свойства клопидогреля были несколько выше, чем у ацетилсалициловой кислоты.

По результатам биохимических исследований, клопидогрел предотвращал снижение содержания нитрит-ионов NOx.

Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием клопидогреля увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME-индуцированной патологией.

Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию.

По-видимому, кардиопротективные свойства клопидогреля связаны со способностью препарата уменьшать реперфузионное повреждение через ингибирование продукции свободных радикалов [163].

Комбинация ацетилсалициловой кислоты 8,6 мг/кг и клопидогреля 3,3 мг/кг также проявила выраженное эндотелиопротективное и кардиопротективное действие, причем, влияние на коэффициент эндотелиальной дисфункции проявлялось в большей степени, чем монотерапия ацетилсалициловой кислотой и клопрщогрелем в двух дозах.

Таким образом, данные, полученные в ходе проведенных исследований, могут существенно расширить спектр плейотропного действия препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью за счет добавления препаратов, относящихся к группе антиагрегантов. Расширение диапазона их действия приведет к упрощению патогенетической терапии и улучшению качества жизни пациента.