Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Применение водно-масляных эмульсий с цитостатиками в лекарственной терапии злокачественных опухолей. Экспериментально-клинические исследования

! ? !

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ИМЕНИ П.А. ГЕРЦЕНА

Применение водно-масляных эмульсий с цитостати-ками в лекарственной терапии злокачественных

опухолей

Экспериментально-клинические исследования (14.00.14 - онкология)

На правах рукописи УДК 616-006-092-08.615.277.3

НИКУЛИЧЕВ

Лев Александрович

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Московском научно-исследовательскс онкологическом институте им.П.А.Герцена МЗ Российской Фед рации (директор - член-корр. РАМН, профессор В.И.ЧИССОЕ на химическом факультете МГУ им. М.ВЛомоносова (декан член-корр. РАН В.ВЛУНИН).

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

член-корр. РАМН, профессор В.И.Чиссов доктор медицинских наук И.Г.Русаков Научный консультант: кандидат химических наук С.НЛанин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

- доктор медицинских яаук.прсфессер Сыркин А.Е.

- доктор биологических наук1 Якубовская Т.Й.

Ведущая организация

-НИИ диагностики

и хирургии Минздравэ'России.г.Москва.

Защита состоится "_"_ _ 1994 г. в_чао

на заседании диссертационного ученого Совета (Д.084.17.0

при МНИОИ им. П.А.Герцена МЗ РФ (125284, Москва, 2-й Бо кинский проезд, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИО им. П.А.Герцена.

Автореферат разослан "_"_199//г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета,

доктор медицинских наук, профессор И.А.МАКСИМОВ.

-1 -

Актуальность проблемы.

Современное лечение злокачественных опухолей различных покализаций, благодаря успехам хирургии, лучевой терапии, а также химиотерапии за последние два десятилетия достигло ощутимых результатов. В отношении распространения опухолей, с которыми чаще всего приходится иметь дело онкологам, возлагаются большие надежды на комплексное и комбинированное лечение. И в этом плане, безусловно, имеются еще достаточные резервы. (Блохин H.H. с соавт. 1984; Fisher В. et.al., 1987).

Современное состояние химиотерапии с очевидностью указывает на необходимость улучшения терапевтической эффективности противоопухолевых препаратов, использующихся в настоящее время в онкологии. Степень регрессии опухолей постоянно и значительно зависит от дозы и способа введения цитостатиков. Увеличение же противоопухолевого воздействия как новых, так и известных проитвоопухолевых препаратов лимитируются их токсичностью и биологической резистентностью опухолевых кле-TOK.(Schabel F.et.al., 1984; Гарин A.M. 1986; Civalleri D. et.al., 1993).

В настоящее время разработано и экспериментально изучено применение макромолекулярных терапевтических систем с контролируемым высвобождением противоопухолевых препаратов при проведении адьювантной химиотерапии солидных опухолей. (Чиссов В.И. с соавт., 1982; Kato Y. et.al., 1989; Heuser U. et.al., 1986; Iailhoger S et.al., 1993). Разработка и внедрение таких систем невозможна без тщательного исследования фармакологии цитостатиков входящих в них. Возникает необходимость специальных методик в определении концентрации препаратов в опухоли при различных путях введения, что позволяет более точно прогнозировать химиотерапевтический ответ у онкологических больных, и расширяет знания о механизме воздействия применяемых противоопухолевых препаратов на молекулярном уровне. (Ли А.Д. 1987; Волохов А.Б. 1989; De Bruijn et.al., 1992; Mirabelli С. et.al., 1980).

Фармацевтической модификацией цитостатиков без изменения его структуры является создание эмульсионных форм. В опубликованных работах сообщаются данные экспериментальных

исследований о повышении лимфатического транспорта при введении химиопрепаратов в этой лекарственной форме. (Na Kamoto U., et.al., 1979; Sesaki Нм et.al., 1984; Takakura Y., et.al., 1984). В то же время имеются трудности в создании стойких эмульсионных составов, вследствие этого отсутствует достаточная пролонгация цитостатиков из-за быстрой биодегратаций эмульсий.(Kato Т., et.al., 1980, 1984). Остается открытым вопрос и о клиническом применении этих систем в плане комплексного и комбинированного лечения онкологических больных.

Таким образом, является актуальным дальнейшее усовершенствование эмульсионных составов с применением известных противоопухолевых препаратов, изучение их фармакологического поведения, что совместно с данными по противоопухлевой эффективности позволит разработать наиболее рациональные подходы к лекарственной терапии злокачественных опухолей для этого вида макромолекулярных терапевтических систем.

Цель. Основной целью работы явилось изучение возможности повышения эффективности использования противоопухолевых веществ с различным механизмом действия путем иммобилизации их в эмульсии. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить в опытах in vitro особенности депонирования тио-ТЭФа и Блеомицина в эмульсиях в зависимости от соотношения водной и масляной фаз состава и введением биоантиокислителей.

2. Разработать тест для определения тиоТЭФа и Блеомицина в биологических средах и провести сравнительную качественную оценку распределения цитостатиков в опухоли и окружающих тканях.

3. В опытах in vivo изучить токсичность и противоопухолевую эффективность наиболее активных эмульсионных составов с тио-ТЭФом и Блеомицином; определить целесообразность введения в них биоантиокислителей; оценить противоопухолевую активность эмульсионных составов.

4. Апробировать наиболее активные составы, содержащие противоопухолевые препараты, в клинике с оценкой непосредственных результатов.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследо-

ваний разработаны экспериментально обоснованные подходы к использованию эмульсий в химиотерапии злокачественных новообразований.

- Впервые предложен и применен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для контроля изменений концентрации тиоТЭФа и Блеомицина в опухолях экспериментальных животных, введенных паратуморозно в составе эмульсий.

- Рассмотрен и разработан вопрос о повышении противоопухолевой эффективности эмульсий путем включения в них биоан-тиоксидантов.

- Проведено исседование противоопухолевой эффективности и токсичности тиоТЭФа и Блеомицина в составе эмульсий при па-ратуморозном введении.

- Предложены для клинического применения и апробированы два эмульсионных состава содержащие тиоТЭФ и Блеомицин с биоантиоксидантами.

Практическая ценность и внедрение результатов исследования.

Результаты исследования свидетельствуют о целесообразности применения эмульсионных составов в лечении онкологических больных. Установлено: уменьшение токсичности, повышение противоопухолевой эффективности тиоТЭФа и Блеомицина.

Предложенные тесты для определения тиоТЭФа и Блеомицина в биологических средах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокоинформативны, что позволяет применять эту методику для других цитостатнов вводимых в эмульсионных композициях.

Введение в составы биоантиокнслителей позволяет увеличить противоопухолевую эффективность эмульсий с уменьшением местной и общей токсичности.

Исходя из проведенных экспериментальных исследований рекомендованы для применения и апробированы два эмульсионных состава для лечения онкологических больных с оценкой непосредственных результатов.

Данные научные разработки апробированы в отделениях опухолей головы и шеи, общей и пищеводной онкологии МНИОИ им.П.А.Герцена.

Публикации. По теме дисертации опубликованы 3 работы:

поданы две заявки на изобретение.

Апробация работы.

Основные положения и выводы диссертации доложены и обсуждены на: IV Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии, Москва, 4-8 октября 1993 г., Конференции по хроматографическим методам исследования (Нижний Новгород, 15-20 июня 1992 г.).

Диссертация апробирована на совместной научной конференции: отделения химиотерапии, лаборатории терапии опухолей, отделении модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии, клиники экспериментальных животных МНИОИ им. П.А.Герцена 4 ноября 1993 г.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и указателя литературы, включающих 94 источника отечественной и 104 зарубежной литературы.

Объем диссертации - страниц машинописного текста; она иллюстрирована рисунками, таблицами, 2 фотографиями.

Содержание работы.

Материалы и методы. Вся экспериментальная часть работты была проведена на 240 крысах линии Вистар разводки вивария "Столбовая". В качестве экспериментальной модели использовали перевиваемую солидную опухоль - карциному PC-I.

Перевивку опухоли подкожно осуществляли введением 0,4 мл 25%-ной взвеси опухолевой ткани в 0,9% поваренной соли. Взвесь в объеме 0,3 мл вводили в икроножную мышцу.

Об эффективности проводимой терапии судим по:

1. Продолжительности жизни животных опытных групп в отношении контроля, вычисляемого по формуле

X = ^^ х 100%

2. Коэффициент торможения (10р) опухолевого роста, вычисляли по формуле

10р = 100% ^ х 100%

где Мо - средний диаметр опухоли у крыс опытной группы;

Мк - средний диаметр опухоли у нелеченных животных конт-1ьной группы.

3. Объем опухоли вычисляли по формуле Шрека

7" х. (А х в х С) 6

где я- 3,14; А,В,С - размеры опухолей в трех взаимоперпен-сулярных диаметрах.

Определение острой токсичности цитостатиков в составе ульсий проведено по методу Личфильда и Уилконсона. Математический анализ экспериментальных данных прово-лся по экспресс-методу статистической обработки эксперимен-1ьных и клинических данных Р.Б. Стрелкова с обработкой на М "Тапсог" с использованием программы типа "Гарвард", зницу между сравниваемыми величинами считали достоверной и значимости доверительного интервала Р < 0,05 (степень до-эверности равна 95%).

В качестве масляной фазы эмульсии использовали кунжутное 1сло. Дозы цитостатиков, вводимые в состав эмульсий, расчи-тали после предварительной оценки токсичности. Для прида-1я эмульсионной форме стабильности применялись поверхност-|-активные вещества ТВИН-20, ТВИН-40. Ингредиенты после [ешения обрабатвали в ультразвуковом дезинтеграторе. Время ¡работки контролировали с помощью светового микроскопа, 1енивая агрегатное состояние эмульсий при различных ражи-1х обработки. При добавлении в эмульсии антиокислителей бы) применены масляные растворы: ретинола ацетата, ретинола 1льмитата, витамин Е, 2-метил-1,4 нафтохинон бутилокситолу-I, провитамин А.

В работе также применяли медицинский инъекционный рент-ноконтрастный клей типа МИРК и МИРК-И на основе циа-1крилатов.

Хроматографическую часть работы выполняли на микроколо-эсном жидкостном хроматографе "Мнлихром"с электромехани-;ским поршневым насосом (емкость 2500 мкл, расход элюэнта •600 мкл/мин) и спектрофотометрическим детектором.

В работе использовали стальную колонку КАХ-1, заполнен-ую суспензиальным способом силикогелем. Спектры поглоще-

ния растворов, содержащих цитостатики и БАО, снимали i спектрофотометре "Hitachi".

Разработанные композици применены у 20 пациентов в вс расте от 45 до 65 лет, проходивших обследование и лечение МНИОИ им. П.А.Герцена в период 1990-1991 гг. Из обследова ных 12 - женщин, 8 - мужчин.

У всех больных диагноз был подтвержден морфологичеси ислледованием. Для определения стадии заболевания мы польз вались классификацией, опубликованной в инструктивно-мет дических указаниях МЗ СССР 1984 г.

Распределение больных по стадиям Табл 1.

Диагноз Число больных Стадии Эмульсия с тиоТЭФом Эмульси с Блеоми цином

II ст III ст IV ст

Рак молочной железы 9 2 7 + -

Рак пищевода 9 1 8 - +

Рак верхней челюсти 2 1 1 - +

Основными методами диагностики были рентгенологически эндоскопический.

У наблюдаемых 13 больных план лечения включал неадьн вантное введение эмульсий с тиоТЭФом и Блеомицином с поел' дующей операцией и дистанционной гамма-терапией. У этс группы пациентов изучалась степень лекарственного патоморф! за.

У 8 больных, ранее получивших комбинированное лечени проводилась регионарная химиотерапия Блеомицином в соста! эмульсионных композиций.

Наблюдение за больными, выписанными в стационар г окончании лечения, осуществляли путем контрольных обслед< ваний в МНИОИ им.П.А.Герцена.

Результаты исследований. Хроматографический

анализ тиоТЭФа и Блеомицина, содержащихся в эмульсиях.

При исследовании систем вода-масло-тиоТЭФ-биоантиокис-лители (БАО) изучалось оптимальное соотношение масляной и водной фаз эмульсий и распределение в них цитостатика, а также поведение БАО в эмульсиях.

Были сняты спектры поглощения всех составных частей ком-

Спектры поглощения основных компонентов эмульсии

Спектры поглощения в УФ-области компонентов эмульсии

!

11:

1

1

1 |

■и-

к »<

II

1 -Г

'Л Л|

£<0 Ш ЗЮ 1.«

Рис.2.

1. Ретинол ацетат в воде.

2. А- токоферрола ацетат в воде.

3. Викасол в гексане.

4. Дибунол в гексане.

Рис.1

1. Ретинол ацетат в воде.

2. Х- токоферрола ацетат в

воде.

3. Викасол в воде.

4. Растворимая часть -токоферрола в гексане.

5. Растворимая часть ретинола в гексане.

позиции относительно нулевого раствора воды (Рис. 1) и гексана (Рис.2).

Всю последующую работу выполняли с наиболее стойким эмульсионными составами вода:масло (3:7 об.частей) и во-да:масло (7:3 об.частей) содержащими поверхностно-активных веществ от 3% до 5% (ТВИН-20, ТВИН-40).

При спектрофотометрическом анализе ( к = 190нм и А = 240 нм) оказалось, что при введении тиоТЭФа в состав композиции оптическая плотность эмульсий понижалась (Рис. 3).

Этот результат можно объяснить тем, что в результате солевого эффекта происходит выталкивание растворимых в воде БАО

обратно в масло, вследствии чего оптическая плотность понижается. Рассчитанная, с помощью градуировочного графика, концентрация цитостатика в эмульсиях полностью подтвердила наши предположения.

График зависимости оптических плотностей от соотношения масляной и водной фазы эмульсий.

\ \

У

\

У* Рис.3.

1. А- - 190 нм Атфа

2. Я- - 190 нм Атфа-

3. А— 240 нм Атфа+

Хроматограмма выделенного тиоТЭФа из опухоли экспериментального животного методом ВЭЖХ.

Перед хромотографическим анализом тиоТЭФ в биологических пробах предварительно идентифицировали, в затем после введения эмульсий по специально разработанной методике выделяли цитостатик из опухолей РС-1 в определенные сроки эксперимента (Рис. 4)

На рисунке 5 представлено изменение концентрации тиоТЭФа, введенного парамуто-розно экспериментальным животным в различные сроки эксперимента. Так, в водном растворе пороговая концентрация цитостатика определяется к 50 часам, период полувыведения занимает интервал, равный 24 часам.

При введении эмульсии, где масляный компонент был преобладающим, период полувыведения приблизился к 150 часам. В варианте композиции с преобладанием водной фазы отмечено более усиленное уменьшение концентрации тиоТЭФа в первые 12 часов, затем уровень цитостатика стабилизировался в период полувыведения составил 100 часов. При этом фиксировано более равномерное

Рис.4

Изменение концентрации тиоТЭФа в опухоли РС-1 в зависимости от сроков эксперимента.

Рис.5.

1. Эмульсия вода-масло /3:7 об.ч/

2. Эмульсия вода-масло /7:3 об.ч/

3. Водный раствор тиоТЭФа

Распределение тиоТЭФа, введенного в составе эмульсий в РС-1

Рис.6.

1. Эмульсия вода-масло /3:7 об.ч/

2. Эмульсия вода-масло /7:3 об.ч/ О - место иньекции

4-6 см - центр опухоли

8-10 см - противоположный край

опухоли

снижение концентрации противоопухолевого препарата в экспериментальной опухоли.

Из рисунка 6 очевидно, что распределение цитостатика при любой эмульсионной форме уменьшается пропорционально расстоянию от места инъекции. Изучение уровня концентрации препарата в различные сроки эксперимента и его распределение в опухоли при паратуморозном введении позволили определить режимы введения тиоТЭФа в эмульсионной форме.

При спектрофотометриче-ском анализе блеомицина, содержащегося в эмульсиях, была взята длина волны X •= 230 нм, при которой цитостатик имеет достатчное поглощение. После приготовления композиций по содержанию масляной и водной фазы, спектро-фотометрически исследовались составы с БАО и Блеомицином. Результаты анализа показали, что при введении в

состав эмульсий цитостатика регистрируется понижение оптической плотности (Рис.7).

В комбинации масло-вода-блеомицин (3:7 об.ч.) оптическая плотность максимальная, а в системах с преобладанием водной дозы - оптическая плотность минимальная. С помпщью градуи-ровочного графика выяснилась концентрация противоопухолевого препарата в водной части композиции, где она значительно

0,4

дз.

о,г 0,1

---

--3

2

£.5 ( <! 4 Ч/^

Рис.7.

1. А— 288,1 нм А-блеомицин

2. А— 288,2 нм А+блеомицин

3. А— 230,2 нм А+блеомицин

4. А— 230,1 нм А-блеомицин

Изменение концентрации блеомицина в опухоле РС-1 в зависимости от сроков эксперимента

Графики зависимости оптических плот- понижалась. После предвари-ностей от соотношения масло-вода в „

эмульсиях с блеомицином тельной идентификации и вы-

деления препарата из РС-1 в различные сроки эксперимента (Рис. 8) отмечено, что если в водном растворе пороговая концентрация цитостатика определяется к 72 часам, то при введении блеомицина в эмульсии вода-масло (3:7 об.ч.) период полувыведения составялет 210 часов, что же касается эмульсий с преобладанием водной дозы, то тот же период был ниже и составил 150 часов с момента введения состава.

Изучение противоопухолевой эффективности эмульсий, содержащих тиоТЭФ.

Исследование проведено на 60 крысах самцах в перевитой карциномой РС-1, массой 200-220 г. В качестве масляной фазы эмульсий было использовано кунжутное масло. Дозы тиоТЭФа в группах менялись от 0,1мг/кг до 1 мг/кг в эмульсиях и водном растворе. Паратуморозное введение эмульсий и системное введение водного раствора тиоТЭФа проводилось одновременно с перевивкой опухоли.

Цитостатик, введеный как в составе эмульсий, так и в водном растворе влияние на прививаемость опухолей не оказал. Опухоли выросли у всех животных. Однако, продолжительность латен-

Рис.8.

1. Водный раствор цитостатики

2. Эмульсия вода-масло /3:7 об.ч/

3. Эмульсия вода-масло /7:3 об.ч/

тного периода у животных различных групп была не одинаковой. Так средние показатели продолжительности латентного периода для эмульсий вода:масло (3:7 об.ч.) колебалась от 22,825,5 суток; для эмульсий вода:масло (7:3 об.ч.) от 19,6-23,7 суток; для водного раствора 12,7-18,6 суток.

В контроле этот период составил 12,4 суток.

При наблюдении за животными зафиксировано, что в течение 12 суток с момента введения эмульсий и водного раствора с ци-тостатиком средний размер опухолей у животных групп, получавших эмульсию состава вода-масло (3:7 об.ч.) достоверно отличались от средних размеров опухолей остальных групп. Имелось очевидное отставание темпов роста опухолей аналогичных

групп в варианте введения эмульсий вода-масло (7:3 об.ч.) и в водном растворе (Рис.9), в них после 35 суток эксперимента отмечался бурный рост опухолей. После 56 суток эксперимента сравнивать размеры опухолей у животных по группам стало бессмысленно, так как часть животных получавших тиоТЭФ системно погибла, в то время, как среди животных, получивших эмульсию в составе вода-масло (3:7 об.ч.) отмечалась полная регрессия опухолей через 46,0+3,2 суток в 10% наблюдений. У всех животных этих групп отмечались в последующем рецидивы, но крысы были живы до 90 суток эксперимента.

Средняя продолжительность жизни животных, получивших с большей концентрацией кунжутного масла была на 41,6% больше по сравнению с группой, где масляной фазы было меньше (Р£ 0,05) и на 55,9% больше с группами, где тиоТЭФ вводился в водном растворе (Р^ 0,05).

Изменение средних объемов опухолей у животных, получавших эмульсии с тио-" ТЭФом.

1. Контроль

2. Водный раствор

3. Эмульсия вода-масло /3:7 об.ч./

4. Эмульсия вода-масло /7:3 об.ч./

Полученные результаты показывают, что введение тиоТЭФа в состав эмульсий в зону опухоли (карцинома РС-1) тормозит ее рост и продлевает жизнь животных вплоть до полного в 10% излечения животных, в большей степени, чем внутривенное введение цитостатика.

Изучение противоопухолевого действия тиоТЭФа в составе эмульсий с биоантиокислителями и в клеевой композиции

С целью изучения возможности повышения противоопухолевого действия тиоТЭФа в настоящем разделе нами изучалось воздействие цитостатиков в составе эмульсий с биоантиоксидан-тами и сравнение этого лечения с иммобилизованным препаратом в составе клеевой композиции. Дозы антиокислителей представлены в таблице /Таб.2/

Дозы антиокислителей на 100 мл масла (в гр.)

Провита мин А Витамин А Витамин Е Витамин Кз Дибунол

до 100 0,18 0,05 0,02

Всех животных разделили на 4 группы по 10 животных в каждой, препарат введен на 14 сутки после перевивки опухоли

о

после достижения их средних размеров от 4,3-6,4 см . Доза тиоТЭФа составила во всех группах 0,8 мг/кг.

Животным 1 группы в область опухоли введено двухканаль-ным инъектором 1,0 клеевой композиции.

Животным 2 группы в зону опухоли ввели эмульсию (Вода-масло 7:3) с БАО.

Животным 3 группы в зону опухоли ввели эмульсию (Вода-масло 3:7) с БАО.

Животные 4 группы (контрольной) никаким дополнительным лечебным воздействиям не подвергались.

Из реузльтатов, представленных на рисунке 10, видно, что с истечением 28 суток у животных, получавших тиоТЭФ в составе клеевой композиции средний диаметр опухолей достоверно

Динамика роста опухоли РС-1 при введении клеевых и эмульсионных составов и тиоТЭФом и биоантиокислителями.

190 »«

И

к к 1» и 34 10 <е

1

(Р^ 0,05) отличался от размеров опухолей контрольной группы с очевидной тенденцией к отставанию. После 30 суток эксперимента отмечен рост опухолей. Среди животных, получавших эмульсию вода-масло (3:7 об.ч.) с БАО отмечалась полная регрессия опухолей через 44,0+3,2 суток в 40 процентах случаев, причем рост опухолей не возобновлялся. Отмечена также полная регрессия опухолей и у животных 1 группы через 48,0+6,1 суток в 20 процентах случаев (Рз0,05). У всех животных с регрессией опухоли через 68 суток отмечены рецидивы, но они оставались живы до окончания эксперимента. Средняя продолжительность жизни составила: 80,9+4,2 (70,9 - 91,2) - 156%; 102,3± 3,5 (89,2 - 18,0) - 200%; 116,8±3,4 (109,4 - 123,3) -225,4%; 51,7± 3,2 (44,5 - 59,0) - 100%. Средняя продолжительность жизни животных второй группы была на 69,6% больше по сравнению с 1 группой (Р<0,05) и на 125% больше по сравнению с контролем (Р<0,05).

Полученные результаты показывают, что введение тиоТЭФа в составе эмульсий с включением БАО целесообразно, так как

происходит более ак-

Рис.Ю.

1. Клеевая композиция

2. Эмульсия вода-масло /3:7 об.ч./+БАО

3. Эмульсия вода-масло /7:3 об.ч./+БАО

ШШШ!

тивное торможение роста опухолей и продление жизни животным до 40% излеченных животных. (Фото.1). Включение в клеевую композицию тиоТЭФа также приводит к увеличению жизни животных в сравнении с животными, получавшими тиоТЭФ системно (Р^0,05).

И

Острую токсичность тиоТЭФа определяли в водно-масляной эмульсии (3:7 об.ч.) и масляно-водной (3:7 об.ч.) с БАО на ин-тактных крысах линии Вистар. Наблюдение за животными вели в течение пяти дней после введения композиции. При этом учитывали сроки смертельного исхода и число погибших животных. Среднюю летальную дозу (ЛД-50) определяли по методике Прозоровского В.Б.

При внутримышечном введении тиоТЭФа на 3-4 сутки в виде водно-масляной (3:7 об.ч.) эмульсии наблюдались следующие признаки токсичности: взъерошенность шерстного покрова .диарея, кровянистые выделения из носа, коньюктевит и небольшая потеря веса ( от 5,8% до 14,5% с увеличением дозы препарата). Гибель животных наступила на 4 сутки. ЛД-10 — 1,1 — 1,5мг/кг (1,3 мг/кг), ЛД-50 - 7,0 - 9,7 мг/кг (8,26 мг/кг).

В следующей серии эксперимента тиофосфамид вводили в масляно-водной эмульсии. В этом случае на 3-4 сутки наблюдались те же признаки токсичности. Потеря веса в этой группе составила от 3% до 9% в зависимости от дозы препарата. Гибел1 животных отмечается на 4 сутки. ЛД-10 - 0,8 - 1,3 мг/кг (1,0 мг/кг), ЛД-50 = 4,0 -6,0 мг/кг (5,12 мг/кг).

При вскрытии животных на 3 сутки было отмечено, что в месте введения композиции ткани несколько отечны, не геперими-рованы, формирование капсулы на этом сроке не наблюдается Печень в состоянии не резко выраженной жировой дистрофии легкие без особенностей, лимфатические узлы подвержены атро фическим изменениям. Отмечено также уменьшение надпочеч ников, селезенки и вилочковой железы.

Изучение противоопухолевой эффективности эмульсий содержащих Блеомицин.

Изучение противоопухолевой эффективности эмульсий содер жащих Блеомицин проведено на 40 крысах самцах с перевито! карциномой РС-1, массой 200-220 гр. Дозы блеомицина для вве дения в водном растворе и в эмульсиях составили 30 мг/кг. Вве дение композиций и водного раствора цитостатика проводилос одновременно с перевивкой опухоли.

Длительность латентного периода в сутках для составов

- вода-масло (3:7 об.ч.) составила 18,6-Ю,4 - I гр.

- вода-масло (7:3 об.ч.) составила 15,7+0,4 - II гр.

- в цитостатик в водном растворе 14,2-Ю,3 - III гр.

- в контроле 10,1+0,2 - IV гр.

Анализ данных, приведенных в табл 3, показывает, что к 28

IK

*л

А, OJ м — ^ г 1 »

^ Öv j-J ~ о® Vi ü S ä № а® t» то

SS — о 1+ 1* ы i-5 о V. г>» -» -и. M ОС

S К 5 .-» V. V» "<=> «J 1+ 1+ »■»■ ¡1 i" J3 - vO *Ьо ОИ OS № ч* — Ott ы о о "—I о, ОО lf 1+ 1+ 1+ л О КЗ То ui 4} Cd Co

>0 5« U, es С» L4 оч Ä Vi 1+ И- 1+ 1+ ^ yi -va Vi V- w so

M S\ 1° es Vs Г71 I* 1+ ü 3 -« О Cr» ОЧ

Cr* О С* ^o »J O» oo _0 W V lf 14- 1+ ff w Ы oo so Vj — 'M а * -o 1 i 5 1 * ?

s i?

з

о о ä о

о о

S

о *

S

о

э <

X

о а о

S

суткам эксперимента имелась очевидная разница средних объемов опухолей в группе. Так к 35 суткам эксперимента опухоли у животных 1 группы более 4-х раз (Р<0,05) и в 2,9 раза 2 группы (Р^0,05). Средние размеры опухолей животных 3 и 4 группы практически не отличались (Р>0,05) и с 45 суток эксперимента разница у средних объемов опухолей у группы, получавшей блеомицин внутривенно (по статической обработке) показала, что это различие несущественно. Таким образом, оптимальную противоопухолевую активность блеомицина в составе эмульсий обеспечивает состав, примененный у животных 1 группы. Продолжительность жизни по группам составила: 90,6±8,2; 68,6±4,1; 65,3±3,7. В группе контрольных животных средняя продолжительность жизни составила 52,1 ±3,5 суток.

Изучение противоопухолевого действия блеомицина после введения его в состав эмульсий с биоантиокислителями.

С целью изучения возможности повышения противоопухолевого действия Блеомицина нами изучалось воздействие цитоста-

тика в составе эмульсий с биоантиоксидантами.

Динамика изменения объ-3

ема опухолей в см представлена на рис.11.

Анализ данных показывает, что к 28 суткам эксперимента средние размеры опухолей были не одинаковы. Так, к 35 суткам опухоли контрольных животных превосходили опухоли группы животных, получивших композицию вода-масло (3:7 об.ч.) в 11,7 раз (Р< 0,05). В этой группе животных от-

Изменение средних объемов опухолей у животных получавших различные эмульсионные составы с олеомицином.

1. Эмульсия вода-масло /3:7 об.ч./

2. Эмульсия вода-масло /7:3 об.ч./

3. Эмульсия вода-масло /7:3 об.ч./+БАО

4. Эмульсия вода-масло /3:7

мечена полная регрессия опухолей у 30% животных к 30-35 дню эксперимента, в дальнейшем рост опухолей не возобновился .Имелось некоторое уменьшение опухолей в группе животных, получивших эмульсии вода-масло (7:3 об.ч.) с БАО, но эти различия не достоверны (Ps 0,05). Торможение роста опухоли РС-1 при введении эмульсий с блеомицином в композиции с БАО и

водном растворе представлены на рис.12.

Средняя продолжительность жизни группы животных, где применялся наиболее активный эмульсионный состав с преобладанием масляной фазы эмульсии с БАО была на 120% больше в сравнении с контрольной группой животных и на 60% больше, где этот же состав применялся без БАО.

Острую токсичность блео-мицина определяли в водно-масляной и масляно-водной эмульсиях на 30 интактных крысах Вистар массой 178200 гр.

Препарат вводили однократно внутримышечно. Наблюдения за животными вели в течение одной недели после введения Блеомицина. При этом учитывали сроки смертельного исхода и число погибших животных в каждой группе. Среднюю летальную дозу ЛД-50 определяли по методике Прозоровского В.Б.

После введения блеомицина, начиная с 3-х суток в водно-масляной (3:7 об.ч.) эмульсии + БАО наблюдалли следующие признаки токсичности: взъерошивание шерстного покрова, диарея, конъ-

Торможение роста опухоли РС-1 при введении блеомицина в составе эмульсий по отношению к контролю с БАО.

Рис.12.

1. Эмульсия вода-масло /3:7 об.ч./+БАО

2. Эмульсия вода-масло /7:3 об.ч./+БАО

3. Эмульсия вода-масло /3:7 об.ч./

4. Эмульсия вода-масло /7:3 об.ч./

5. Водный раствор

кжтивит, кровянистые выделения из носа. Изменения массы животных практически не наблюдалось. Смерть животных наступала на 4-е сутки. ЛД-10 « 53,0 - 100 мг/кг (73,6 мг/кг), ЛД-50 = 260 - 500 мг/кг (368 мг/кг)

При определении токсичности блеомицина в масляно-водной эмульсии на 5-7 сутки наблюдались те же признаки токсичности, что и в предыдущей группе. Смерть животных натупала на 7-е сутки (рис.13. ). ЛД-10 = 12,0 - 19,0 мг/кг (15,2 мг/кг),

ЛД-50 = 59,0 - 95,0 мг/кг (76,2 мг/кг)

Апробация эмульсий в клинике у больных со злокачесвенными опухолями.

Полученные физико-химические характеристики эмульсий с тиоТЭФом и Блеомицином, а также данные по противоопухолевой эффективности, позволили нам применить разработан-

1. Эмульсия вода-масло /7:3 НЬ1е С0СТавЫ У ОНКОЛОГИче-

об.ч./+БАО ских больных с различий ло-

2. Эмульсия вода-масло /3:7

об.ч./+БАО кализациеи опухолевого про-

цесса.

При раке молочной железы (9 больных) применяли тиоТЭФ неоадьювантно за 8-14 дней перед операцией путем паратумо-розного введения с последующим изучением опухоли на наличие лекарственного патоморфоза.

При апробации данного состава доза химиопрепарата составила 60 мг. После применения этой дозы, мы наблюдали у одной больной признаки транзиторной микроэмболии (повышение АД, головокружение, парастезии конечностей) на 3 сутки после введения состава,которые были быстро купированы. В дальнейшем особое внимание обращалось на возможность повреждения кровеносных сосудов в момент введения композиции. Местных и об-

Изменение летальных доз блеомицина при различных соотношениях водной и масляной фаз эмульсии

А

1/

---

/

1

1

^и ^чо

Рис.13.

щих осложнений связанных с применением данного состава, не отмечалось.

Лекарственный патоморфоз имелся у всех пациентов, в 33% случаях I-II степени, 55% - II-III степени, 12% - III степени. После хирургического вмешательства пациенты получали лечение в зависимости от стадии процесса в МНИОИ им.П.А.Герце-на.

Рецидив плоскоклеточного рака пищевода с отдаленными метастазами диагносцировали у 9 пациентов ранее получивших комбинированное лечение в МНИОИ. Была предпринята попытка использовать эмульсионный состав с Блеомицином для регионарной химиотерапии. Композиция вводилась 1 раз в 7-10 дней в область средостения. На первом этапе апробации доза хнмиоп-репаратов составляла 15 мг. После применения этой дозы у 3-4 больных, когда мы убедились в отсутствии побочных общих и местных проявлений, доза была увеличена и составляла 30-45 мг.

После применения блеомицина в дозе 45 мг у 50% больных была отмечена гипертермия до 37,5 -38 °С в течение 6-7 дней. Других местных и общих осложнений, связанных с применением данного состава не отмечалось. Общая доза цитостатика составила составляла 180-210 мг.

Все больные наряду с общим клиническим обследованием подвергались целенапрвленному рентгеноскопическому обследованию. У 4 пациентов зарегистрирована стабилизация процесса. Одному пациенту после операции одновременно с введением эмульсий проводился курс лучевой терапии по схеме динамического фракционирования дозы.

У двух больных диагносцирована распространенная опухоль верхней челюсти. У наблюдаемых больных был использован принцип комбинированного лечения, включающий дистанционную гамма-терапию в СОД 40-50 гр и последующее хирургическое вмешательство.

В предоперационном периоде, а также во время хирургического вмешательства проводилась локальная химиотерапия блеомицина в составе эмульсий с БАО, которые вводились паратумо-розно. Доза цитостатика составила 60 мг.

Токсикоаллергических ракций, а также влияние на послеоперационный период эмульсионного состава нами выявлено не было.

Обсуждение полученных результатов.

В результате проведенных исследований впервые разработана методика по определению тиоТЭФа и Блеомицина методом высокоэффективной жидкостной хромотографии в биологических средах, позволяющая эффективно контролировать концентрацию цитостатиков в опухоли.

Включение цитостатиков в эмульсии и введение их паратумо-розно целесообразно, так как это позволяет создать высокие концентрации без повышения местной и общей токсичности. При этом изменяя соотношение водной и масляной эмульсий можно добиться программируемого выхода препаратов в зону опухоли. Комбинированное применение в составе эмульсий тиоТЭФа, Блеомицина и биоантиокистлителей повышает противоопухолевую эффективность композиции по сравнению с эмульсиями, где каждый компонент используется отдельно, а также снижается токсичность композиции.

Приведенные данные показали эффективность применения цитостатиков тиоТЭФа и Блеомицина в эмульсионных составах при лечении злокачественных новообразований молочной железы, пищевода, верхней челюсти. Введение композиций не отягощает процесс лечния онкологических больных. Целесообразно продолжить изучение новых лекарственных веществ, и использовать этот вариант локальной химиотерапии в комплексном лечении злокачественных новообразований.

Выводы

1. Выявлена закономерность распределения тиоТЭФа и Блеомицина в эмульсионных составах с биоантиокислителями. Установлено, что при увеличении масляной дозы повышается депонирующая способность композиции.

2. Разработан тест для определения тиоТЭФа и Блеомицина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющий эффективно оценивать накопление противоопухолевых препаратов вводимых паратуморозно в составе эмульсий. Так, для тиофосфамида период полувыведения составляет от 50-150 часов, а для Блеомицина этот период колеблется от 170-210 часов в зависимости от соотношения масляной и водной дозы со-

става.

3. Макромолекулярные терапевтические системы на основе эмульсий содержащие в своем составе противоопухолевые препараты различного механизма действия, обладают в условиях эксперимента противоопухолевой активностью, значительно превосходящей активность инъекционных форм этих препаратов, так как происходит более активное торможение роста опухолей и продление жизни животных до 40% для тиоТЭФа и 30% при применении Блеомицина достигается полная регрессия опухоли.

4. Применение эмульсий с биоантиокислителями позволяет снизить токсичность тиофосфамида (ЛД50 = 8,26 мг/кг) и Блеомицина (ЛД50 =■ 368 мг/кг).

5. Химиотерапия тиоТЭФа и Блеомицина в составе эмульсий с биоантиоксидантами, вводимых паратуморозно не вызывает общих и местных осложнений; у 67% пациентов при использовании композиции определяется лекарственный патоморфоз II-III степени. Рассмотренные составы могут применяться как самостоятельно, так и в комбинации с хирургическим и лучевым методом лечения.

Список опубликованных работ

1. «Экспериментальная оценка противоопухолевого эффекта

1

тиоТЭФа в водном растворе и депонированных вариантах».

Актуальные вопросы онкологии. Сборник науных трудов, посвященных 15-ию кафедры онкологии Барнаульского медицинского института г. Барнаул. 1992, стр. 292-296, Русаков И.Г., Щитков К.Г., Ланин С.Н., Баженова Н.В., Зарецкая И .С., Рож-манова Н.Б.

2. «Сравнительная противоопухолевая активность циклофос-фата и тиоТЭФа при паратуморозном введении в водном растворе и депонированных вариантах.»

Там же, 1992, стр.281-285, Демидов В.П., Борисов В.И., Русаков И.Г., Щитков К.Г.

3. «Контроль противоопухолевой эффективности триэтилен-тиофосфамида методом ВЭЖХ.»

Журнал Аналитической химии.Т.48, вып. 3., 1993, стр. 564567, Ланин С.Н., Рожманова Н.Б., Борисов В.И., Русаков И.Г