Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Применение нормальных фибробластов и кератиноцитов человека, культивированных in vitro, в комплексном лечении пациентов с трофическими язвами венозного генеза

ЛАПИН АНДРЕЙ ЮРЬЕВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ НОРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ И КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРОВАННЫХ IN VITRO, В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ПАЦИЕНТОВ С ТРОФИЧЕСКИМИ ЯЗВАМИ ВЕНОЗНОГО ГЕНЕЗА

14.00.27 - хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2007

003061510

ЛАПИН АНДРЕЙ ЮРЬЕВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ НОРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ И КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРОВАННЫХ IN VITRO, В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ПАЦИЕНТОВ С ТРОФИЧЕСКИМИ ЯЗВАМИ ВЕНОЗНОГО ГЕНЕЗА

14.00.27 - хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саша -Петербург 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор

Топузов Эскендер Гафурович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор Гриценко Владимир Викторович, доктор медицинских наук Барсуков Александр Емельянович

Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «27» сентября 2007 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.086 01 ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И И Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский проспект, 47)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И И Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «_» «_» 2007

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор М С Команденко

ВВЕДЕНИЕ

Трофические язвы (ТЯ) нижних конечностей - проблемное и наиболее часто встречаемое осложнение варикозной болезни (ВБ) и хронической венозной недостаточности (ХВН) (Саркисов Д С, Алексеев А А с соавт, 1996, Савельев ВС. с соавт, 2000, Rucley С V , 1997, Burton С S , 2001)

Существующие на сегодняшний день методы консервативного лечения ТЯ, сочетающие системную фармакотерапию и местное воздействие на язвенный дефект не позволяют в 76% случаях достичь позитивного результата - эпителизации трофической язвы (Кириенко А И 2000) Несмотря на внедрение в клиническую практику современных фармакологических препаратов, раневых покрытий, различного функционального назначения, частота выявления трофических язв остается постоянной, и в последнее десятилетие прослеживается явная тенденция к омоложению данного контингента больных (Савельев В С 2001, Ruckky С V , 1997) Эффективным способом устранения регионарных гсмодинамических и трофических нарушений в конечности вызванных ХВН является хирургическое вмешательство (Хохлов AM 2002, Бырихин НИ, Чермако-ва А А, 2005), однако, наличие активной трофической язвы, по мнению большинства специалистов, является противопоказанием к операции, в связи с высоким риском развития гнойно-септических осложнений (Хохлов AM, 1993, Яблоков ЕГ и соавт, 1999, Седов В М ,2006) Кроме того, в ряде случаев, проведение оперативного лечения может быть сопряжено с повышенным риском или даже невозможно, в связи с наличием у пациентов тяжелой сопутствующей системной патологии (Котлукова Т В , 2000, Магомедов М М , 2001, Priollet Р , Franceschi С , et al, 1994, Raffin В , Bellamy V , et al, 1998) Поэтому до настоящего времени актуальна проблема поиска более эффективных способов заживления 'IЯ

Вышеизложенное заставило флебологов обратиться к методам заместительной клеточной терапии Помимо применения клеточных продуктов для восстановления кожного покрова обожженных, описано их применение в лечении пролежней, длительно незаживающих ран, трофические язвы диабетической, нейротрофической и ве-

нозной этиологии В лечении венозных трофических язв использовали выращенные in vitro фибробласты (ФБ), многослойный пласт кератиноцитов (МПКТ), аналог кожи (АК) (Воусе S, et al, 2001, Phillips Т. et al, 2002, Seidman С E et al, 2003, Hjerppe A., 2004) Пропагандируется использование для заживления ТЯ живого эквивалента кожи - аналога кожи Данный метод считают современной альтернативой аутолермотопластики, и его применение признано весьма перспективным. (Trent J , et al, 1998, Eaglstein W , et al, 1998; Ballard K., et al, 2000; Brem H et al., 2000, Veves A et al, 2001; Vowden К et al, 2002)

He подвергая сомнению результаты научных изысканий, в доступной нам отечественной и зарубежной литературе мы не нашли аргументированной информации, отражающей преимущества и недостатки заместительной клеточной терапии в сравнении с традиционными подходами Отсутствуют сведения о методологии и технике пересадки того или иного вида культивированных клеток и их композиций пациентам с трофическими язвами в зависимости от исходной клинико-морфологической ситуации Не определено место клеточных технологий в общей многокомпонентной структуре лечебного процесса и экономическая целесообразность данного метода Выше изложенные моменты определили цель и задачи нашего исследования

Цель исследования

Улучшение результатов и сокращение сроков лечения пациентов с трофическими язвами венозного генеза путем применения различных композиций клеток кожи человека культивированных m vitro.

Задачи исследования

1 Оценить состояние сосудистого русла, микробного пейзажа, характер воспалительных и репаративных изменений в зоне трофической язвы в различные фазы раневого процесса (экссудация, пролиферация)

2. Определить клинические критерии и сроки готовности язвенного дефекта к пересадке клеточных продуктов

3 Разработать методику и технику пересадки различных композиций культивированных клеток кожи человека на трофические язвы, обеспечивающих в кратчайшие сроки оптимальный лечебный эффект и рациональное использование клеточного материала

4 Оценить клиническую эффективность, преимущества и недостатки предлагаемого способа лечения в сравнении с традиционными подходами

5 Определить показания, противопоказания и сформулировать рекомендации по применению различных композиций культивированных клеток кожи человека в лечении пациентов с трофическими язвами венозного генеза

Научная новизна

Впервые в клинической практике комплексно и дифференцированно применены многослойный пласт кератиноцитов, фибробласты человека и их комбинации, культивированные m vitro у пациентов с трофическими язвами нижних конечностей вследствие варикозной болезни в сочетании с посттромботической болезнью и хронической венозной недостаточностью

Впервые разработана методика и техника лечения трофических язв, с применением различных клеточных композиций

Доказано существенное преимущество предлагаемого способа в сравнении с традиционными подходами в лечении трофических язв венозного генеза Определены показания к применению того или иного вида клеточного материала в лечебном процессе

Предчожена бальная оценка прогноза результатов лечения

Практическая значимость и внедрение результатов исследования

Предлагаемый способ лечения позволяет значительно ускорить процесс заживления трофических язв, сократить стоимость и сроки пребывания пациентов в стационаре и в период амбулаторного лечения, а так же позволяет эффективно, в кротчайшие сроки, подготовить больных к хирургическому вмешательству

Способ лечения трофических язв нижних конечностей с применением клеточных продуктов внедрен в работу хирургических клиник СПбГМА им ИИ Мечникова, и хирургического отделения

ГУЗ МСЧ № 18 Санкт-Петербурга На базе ГУЗ МСЧ №18 совместно с отделом клеточных культур, института цитологии РАН Санкт-Петербурга создан научно-практический центр для оказания консультативной и лечебной помощи пациентам с трофическими язвами нижних конечностей венозного генеза Результаты научных исследований используются в лекционном курсе и практических занятиях на кафедре хирургических болезней с курсом детской хирургии СПбГМА им. ИИ. Мечникова и курсе подготовки врачей-интернов хирургов Российской ВМедА им С.М Кирова.

По результатам диссертационного исследования разработаны методические рекомендации для врачей-хирургов, утвержденные на научно-координационном совете СПбГМА им ИИ Мечникова от 02 04 2007 г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пересадка клеточных продуктов не оказывает прямого воздействия на звенья патогенеза хронической венозной недостаточности, однако абсолютная клеточная совместимость культивированного m vitro материала, отсутствие местной воспалительной реакции тканей на пересадку и реакции отторжения после пересадки, а также активная стимуляция репаративных процессов в зоне трофической язвы позволяет считать применение фибробластов, многослойного пласта кератиноцитов и их комбинаций рациональным способом закрытия трофических язв нижних конечностей венозного генеза

2 Применение клеточных продуктов существенно сокращает сроки заживления трофических язв в сравнении с традиционными методами лечения и позволяет в оптимальные сроки подготовить пациентов к хирургическому вмешательству

3. В случае отказа от операции стойкий положительный эффект лечения и отсутствие рецидива язвы может быть достигнут при проведении комплексной терапии, включающей системную фармакотерапию, физиопроцедуры, эластическую компрессию в сочетании с местным воздействием на трофическую язву в виде пересадки фибробластов, многослойного пласта кератиноцитов человека и их композиций

Личный вклад автора

Самостоятельно проведен анализ литературы по исследуемой проблеме, собран и проанализирован клинический материал

Автор лично принимал участие в разработке и осуществлении методики пересадки клеточных продуктов и дальнейшем лечении пациентов Автор выполнил анализ и статистическую обработку полученных данных

Апробации работы

Основные положения диссертационного исследования доложены

- на городской научно-практической конференции "Лечение ран и трофических язв с использованием дермального эквивалента и пластов кератиноцитов" (Россия СПб, 2003)

- на международной научно-практической конференции "Проблемы клеточной и тканевой трансплантологии" (Украина Ивано-Франковск, 2003)

- на X хирургическом съезде " Международный хирургический конгресс Новые технологии в хирургии" (Россия. Ростов-на-Дону, 2005)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, который содержит 283 работ 169 отечественных и 114 зарубежных авторов Ма1ериалы диссертации содержат 26 таблиц и 42 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе используется клинический материал, собранный автором за период с 2002-2006 года в хирургическом отделении ГУЗ МСЧ№18 Санкт-Петербурга, являющегося базой кафедры хирургических болезней с курсом детской хирургии СПбГМА им. И.И Мечникова (зав кафедрой д м н , проф Э.Г. Топузов) Под нашим наблюдением находились 110 пациентов с ТЯ нижних конечностей венозной этиологии Распределение больных по возрасту и полу представлено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение пациентов по возрасту и полу.

возраст мужчины % женщины % Всего %

40-50 ле! 10 40 15 60 25 22,7

51-64 лет 22 45,8 26 54,2 48 43,7

старше 65 13 35,1 24 64,9 37 36,6

76 пациентов (69,1%) из числа обследованных имели ТЯ на фоне ВБ, 34 пациента (30,9%) имели трофические язвы в сочетании с варикозной болезнью и посттромбофлебитической болезнью

Выраженность клинических симптомов определялась длительностью заболевания, площадью язвенного дефекта, выраженностью трофических изменений в тканях конечности, стадией ХВН.

Комплекс обследований включал: Общий осмотр пациента, оценку соматического статуса, исследование состояния сосудистого русла (дуплексное сканирование и по показаниям флебография), макроморфологическую оценку язвенного дефекта (площадь ТЯ, длительность существования), оценку микробного пейзажа ТЯ (бактериологическое исследование), оценку степени воспалительных изменений и репаративных процессов в ТЯ и переульцерозной зоне (цитологическое, гистологическое исследование биоптатов)

Для определения стадии ХВН использовали международную классификацию СЕАР, предусматривающую совокупный учет клинических (С), этиологических (Е), анатомических (А) и патофизиологических (Р) факторов, дающую комплексное представление о характере и степени тяжести процесса Клиническая стадия ХВН у всех 110 пациентов соответствовала С-1У, тк все пациенты имели

при первичном осмотре ТЯ. Стадия ХЕШ у обследованных больных представлены иа диаграмме (рисунок 1).

О 20 40 60 80 103 120

С-0" С-Г С -1!" С - II!" С-IV' С - V" С -V!" ЕС" ЕР" ES' AS +АР" AS+AP" PR " PR

Рис. 1 Стадия ХВН по СЕАРу обследованных пациентов (п=1Ю).

Клеточный материал производился в отделе клеточных культур института цитологии РАН Санкт-Петербург {завотделом проф. д.м.н. Пипаев Г.П,).

В работе использовали аллогенные фибр область! (ФБ) взрослых доноров в ко.1лагеновом геле, многослойный пласт кера гиноцитов человека (МПКТ) и полный аналог кожи (АК), представляющий собой фибробласты с растущими на его поверхности кератиноцитами.

ФБ и MIIKT применяли как таковые или в режиме последовательной пересадки на ТЯ- сначала ФБ, а затем, через 3 суток МПКТ (ФБ+МГТКТ),

В зависимости от примененного в лечении клеточног о материала пациенты были разделены на iV группы (таблица 2).

Таблице 2

Распределение пациентов по группам

Группы Метод лечения N- пациентов

Í Фиброблас гы 11

И Фибробласты через 3 дня керати попиты 17

III Аналог кожи 38

IV М послойный пласт кератнвонитов 14

V Группа сравнения 30

Всего 110

Для объективного контроля эффективности проводимого лечения была сформирована группа сравнения (V) — 30 больных, полу-

i Í I 1

. Г'"1™1......Г

1....... )

1 1 ,

.:. -.....—!— ' г. .. ..

,..! ' 11| " "

чавших стандартную терапию без применения клеточных продуктов По длительности и характеру основного заболевания исходной площади ТЯ, продолжительности ее существования и частоте рецидивов, возрасту, другим показателям пациенты группы сравнения (V) были сопоставимы с основной (I-IV)

Полученные в процессе исследования данные обрабатывались на ЭВМ типа IBM-PC с помощью программной системы STATISTICA for Windows (версия 5 11) С целью обоснования комплекса показателей, необходимых для оценки риска неблагополучного исхода лечения, мы использовали метод построения классификационных деревьев Деревья классификации способствую! определению принадлежности наблюдений или объектов к тому или иному классу категориальной результирующей переменной в зависимости от соответствующих значений одной или нескольких пре-дикюрских переменных, те показателей, которые можно считать причинами исследуемого явления Для визуализации структуры исходных данных и полученных результатов их анализа, мы использовали как графические возможности системы Statstica for Windows, так и модуль построения диаграмм системы Microsoft Office Количественные показатели в различных исследуемых подгруппах для полноты описания и удобства восприятия и сравнения мы представили в форме «Box & Whisker Plot», когда на одном поле при различных группировках на основе качественных критериев отражены среднее значение, ошибка среднего и стандартное отклонение для указанного параметра Доверительные интервалы для частотных показателей рассчитывались с использованием точного метода Фишера

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы, мы должны были составить собственное представление о характере заболевания у курируемых пациентов, путем многофакторного анализа, включающе1 о наряду с клинической симптоматикой и данных анамнеза - оценку состояния венозного и артериального кровообращения в нижних конечностях, исследование микробного пейзажа, степени альтеративных изменений в переульцерозной зоне ассоциированных с присутствием патогенной микрофлоры и репаративных процессов в зоне ТЯ (рис 2)

ическая характеристика ТЯ

Стадия ХИН. Тип нарушения венозного оттока

анатомические

аанные

Изучение активности репа-ративных процессов в ТЯ

Исследование микробного пей зажи и степени

оактериаль.-юй о Сем с ценности

Определение степени Воспалительных изменений ь нереуль-церозной зоне.

Рис. 2. Комплекс диагностических мероприятий у пациентов с трофическими язвами венозного генсза.

Анализ клинических симптомов и причин их развития у обследованных пациентов не противоречит данным других авторов. Ведущей причиной развития ТЯ остается ХВН. Оптимальным способом оценки стадии ХВН можно считать унифицированную классификацию СВАР.

У подавляющего числа пациентов - 72(65,4%), длительность существования трофической язвы превышала 3 года. Не удивительно, что у лиц с более длительным стажем заболевания, превышающим 8,4±0,5 лег, как правило, наблюдаются выраженные нарушения венозного оттока в конечности, обусловленные несостоятельностью клапанного аппарата в системе магистральных подкожных вен, пер-форантных вен и глубоких вен голени и бедра. Средняя площадь ТЯ

у лиц с комбинированным нарушением функции клапанного аппарата была достоверно больше и составила 10-19 см2 (р.<0,001), а пациенты с большей площадью язвенного дефекта имели более длительный стаж заболевания. Авторы связывают длительное хроническое течение заболевания с присутствием в ТЯ патогенной микрофлоры (Кириенко А.И. 2001).

Поскольку для нас принципиально важным вопросом являлось определение четких критериев готовности трофической язвы к пересадке клеточного материала, обеспечивающих хороший результат лечения, мы решили изучить состояние микробного пейзажа ТЯ у курируемых пациентов и уточнить влияние микрофлоры на течение раневого процесса до, в период и после трансплантации клеточных продуктов. По нашим данным подавляющее число пациентов поступило в отделение в фазу экссудации (п=104; 94,6%) (рис. 3).

120 на 118 117 116 115 114 113 112 111 110 109 108 107

10в 104 103

1 2 3 4 5 6 7 а 9 10 11 12 13 14 15 16 Число пациентов

Рис. 3, Первичные результаты бактериологического исследования ТЯ,

Более выраженной степени бактериальной обсемененности язвенного дефекта соответствовала более выраженная [ рапулоцитар-ная инфильтрация ткани в переульцерозной зоне, свидетельствующая об активном бактериальиоасеоцииро ванном воспалительном гроцсссс и этиологической роли патогенных микроорганизмов в развитии и хроническом течении заболевания (рис. 4).

±Б1(1 Оеу

±Б(с) Егг

□ Меап

Степень гранулоцитарной инфильтрации (0-3)

Рис 4 Зависимость степени воспалительных изменений в строме, и числа колоние-образуюншх бактерий (на мм3 ткани) в трофической язве

Неоспоримым утверждением является тезис о невозможности проведения радикальной хирургической коррекции венозной недостаточности в стадию экссудации в условиях открытой инфицированной ТЯ (Васюков В В Богачев В Ю 1999) Пересадка клеточного материала в фазу экссудации также не целесообразна и обречена на неудачу Такие язвы требуют подготовки к пересадке включающей медикаментозную коррекцию проявлений ХВН, удаление некротических тканей и деконтоминацию язвы от патогенной микрофлоры, стимуляцию репаративных процессов

Ожидаемым положительным результатом первичного курса лечения считали переход раневого процесса в фазу пролиферации По нашим данным состояние ТЯ в фазу пролиферации должно соответствовать следующим критериям

- отсутствие налета фибрина и гнойно! о отделяемого, кровотечения и экссудации,

- уменьшение бактериальной обсемененности язвы до уровня < 105 микроорганизмов на ммЗ ткани,

- регресс воспалительных изменений в ткани в зоне ТЯ (1-Пст воспалительной реакции),

- активизация репаративных процессов (1-Нст),

Соответствие перечисленным параметрам мы определили как основные критерии готовности ТЯ к пересадке клеточного материала Полученные нами данные не претендуют на оригинальность, но позволяют, на наш взгляд, четко разграничить фазы раневого процесса в динамике и контролировать факт готовности ТЯ к пересадке клеточного материала В результате проводимого многокомпонентного лечения средние сроки достижения фазы пролиферации составили довольно короткий промежуток времени 6 0±0.1 дней За этот относительно короткий временной отрезок ТЯ очистились не только от гнойного отделяемого и фибрина, но и уменьшились в размерах у некоторых лиц, однако случаев полного закрытия язв не зафиксировано. Таким образом, полученные данные подтверждают, что методично проводимое комплексное лечение трофических язв направленное на улучшение микроциркуляции, реологии крови и тканевого обмена, местная терапия в сочетании с адекватной компрессией и физиопроцедурами, оказывает заметный лечебный эффект и при дальнейшем применении с высокой долей вероятности может привести к закрытию язвенного дефекта. Не отрицая данного факта, мы задались целью - сравнить результаты традиционного способа лечения с методом, в основе которого лежит заместительная клеточная терапия, и получили следующие результаты.

В контрольные сроки язвы закрылись у 73 пациентов (99,1%) в основной группе, и у 20 пациентов (66,7%) в группе сравнения, а средние сроки достижения полной эпителизации трофических язв у основной группы оказались почти вдвое короче (16,2 (0,5дн ), нежели у пациентов группы сравнения (32,2(1,1), при р <0,001 Рецидив язвы в группе сравнения, также был более частым явлением и наступил у 4-х пациентов (13,3%) Таким образом, признать безукоризненно идеальными результаты лечения трофических язв с применением клеточных продуктов нельзя, однако, сравнительный статистический анализ по основным параметрам

- факт закрытия язвы,

- сроки наступления эпителизации,

- число рецидивов

демонстрирует существенное преимущество клеточного метода перед традиционной схемой лечения (таблица 3).

Таблица 3

Сравнительная оценка результатов лечения в основной группе и группе сравнения

Параметры Клеточные продукты п=80 Традиционный метод п=30

Факт закрытия язвы 73 - (99,1%) 20 - (66,7%)

Сроки закрытия язвы 16,2±0,5дн 32,2+1,1

Число рецидивов 1,0-1,25% 4,0-(13,3%)

Стартовые возможности пациентов в зависимости от возраста, наличия сопутствующих заболеваний, особенностей течения и тяжести основной патологии (ХВН, ТЯ), способа выбираемого лечебного воздействия не одинаковы Мы попытались проанализировать возможные причины неблагоприятных исходов лечения, когда язва либо не закрывалась, либо наступил рецидив язвообразования Применив бальный анализ, основанный на построении классификационных деревьев из всего множества исследуемых параметров и отобрав принципиально значимые факторы, установили их пороговые значения (таблица 4) По итогам проведенного анализа мы получили достоверно отличающиеся баллы риска неблагоприятного исхода лечения в зависимости от способа выбранного лечебного воздействия (р<0,001), риск неблагоприятного результата лечения для основной группы пациентов составил 12 баллов и более, риск для группы сравнения 8 баллов

Таблица 4

Бальная оценка факторов риска неблагоприятного исхода лечения, (стадия пролиферации)

Фактор № Диапазон балчов Котичество баллов Критерии наличия фактора риска

Возраст 1 0-1 1 Возраст >65 лет

Длительность ВЬ 2 0-1 1 Дчительность ВБ >15

Длительность ТЯ 3 0-1 1 Длит язвы >5 лет

Площадь язвы (Б) см2 4 0- 1 1 Исходная площадь язвы >18 см"

Б язвы(ст пролиф) см2 5 0- 1 1 Площадь язвы в стадии пролиферации >15 см2

Степень бак обсе-менеиности (ст пролиферации) 6 0- 1 1 Степень бак обсеменен-ности в фазе пролиферации >95 микроорганизмов на тампон

ПГБ 7 0-1 1 Есть

Рефлгакс 8 0-1 1 Сочетание рефлюкса и обструкции в системе глубоких и (или) подкожных вен

Диабет 9 0-1 1 Сеть

Облстерирующий атеросклероз сосудов 10 0- 1 1 Есть

Острый инфаркт миокарда 11 0-1 1 Есть

Степень воспаления 12 0-1-2 1 - 1 2-2 Оценивается степень воспаления

Проходимость артерий 13 0- 1 1 Отсутствие проходимости периферических артерий конечности

Тип кровотока 14 0-1 1 Отсутствие магистраль-ног о типа кровообращения

Проходимость глубоких вен 15 0-1 1 Огсугствис проходимости и (или) снижение проходимости по системе глубоких вен

Теоретический максимум 16 Сочокупносгь всех факторов

Фактически 1 - 15 У обследуемых нами пациентов

Таким образом, для основной группы пациентов разрешающая способность метода пересадки клеточных продуктов, с учетом бальной оценки факторов риска неблагоприятного исхода лечения, достоверно выше (р <0,05), нежели у пациентов группы сравнения, которым применена традиционная методика лечения (рисунок 5).

16

14 12 10 8

ч

сЗ л

Ю °

4 2 О

о

1

1 а I

успешный успешный

неблагоприятный неблагоприятный

Группа сравнения Группа основная

~Г~ ±Б1<1 Оет I—I ±51(1 Егт □ Меап

Исход

Рис 5 Уровни бальной оценки факторов риска неблагоприятного исхода лечения

Мы провели дискретный анализ достигнутых результатов в зависимости от примененного входе лечения клеточного материала Наилучшими в сравнении с контрольной группой и подгруппами основной группы оказались результаты лечения пациентов, которым осуществлена последовательная пересадка ФБ, а затем через 2-3 дня МПКТ, АК и МПКТ Факт достижения эпителизации у пациентов в этих подгруппах, в процентном соотношении, был схожим и составил 93,0±0,6% Случаи не закрытия язв в указанных группах были единичными - 5,2±1,9%. Итоги лечения пациентов с ТЯ с применением дермального эквивалента как такового, мало чем отличался от результатов традиционного способа лечения (63,6% и 66,67% соответственно) (рисунок 6)

Группа

Сравнения

Группа í

Группа г

ш

Группа 4

Результаты

1 - ФЬ; группа2 - ФБ+М1IKT; группа3 - АК; группа 4 - МПКТ. ()-'>пителизация: 2- нет эгтителизации; 3- рецидив.

Рис. б. Результаты лечения пациентов с трофическими язвами.

Методика культивирования и техника пересадки того или иного вида клеточног о материала по степени сложности и способу последующего сохранения целостности трансплантата были не одинаковы. Прост в применении дермалъньт эквивалент, представляющий собой аналог дермы, состоящий из Ф1>, включенных в коллагеновый гель. Пересадка ФБ не представляла технических сложностей на ТЯ любой площади. Клеточный материал равномерным слоем заполнял язвенный дефект. Технически более сложной была методика пересадки МПКТ и АК. Готовый к использованию МПКТ представлял собой хрупкую прозрачную субстанцию не более 10-12 см2 и толщиной 0,2-0,3 см. Для переноса МПКТ на ТЯ последний снимался с матрицы шпателем и 0,25% раствором дне пазы. Нередко в процессе пересадки пласт деформировался, целостность пласта нарушалась. Методика последовательной пересадки ФН и МПКТ объединяла преимущества и недостатки описанных выше способов. Полный эк-

вивалент кожи, представляющий собой дермальный эквивалент, с растущими на его поверхностями кератиноцитами, можно было считать идеальным вариантом для пересадки, однако методика приготовления АК более трудоемка, а площадь клеточного материала, готового к использованию, не велика.(14-18 см2)

Анализ результатов лечения с учетом макроморфологических особенностей язвенных дефектов и технологических особенностей приготовления клеточного материала позволил сформулировать практические рекомендации.

Комбинация ФБ+МПКТ, может быть с успехом применена именно у пациентов с ТЯ большой площади (8=14,4±1,5см2)с длительным, агрессивным течением заболевания, устойчивым к традиционной терапии. ТЯ небольшой площади (8=7,4±0,7 см2), с успехом в короткие сроки могут быть устранены применением МГПСТ, а глубокие язвы, относительно небольшой площади (8=11,6±0,7 см2) и множественные язвы в том числе, могут быть ликвидированы применением АК Очевидно, что даже в случае неуспеха, после первичной пересадки того или иного клеточного продукта, когда ТЯ полностью не закрылась, но стала поверхностной, создаются условия для этапного повторного дифференцированного применения клеточного материала Традиционный способ лечения и применение ФБ как таковых, эффективны и имеют полное право на существование, но существенно уступают по результативности выше перечисленным клеточным методикам Дифференцированный подход в выборе клеточного материала в лечении ТЯ, имеющих различные клинико-морфологические характеристики в сочетании с применением традиционного способа лечения на этапах подготовки ТЯ к пересадке клеточного материала обеспечивает оптимальный результат лечения, и тем самым способствует в кратчайшие сроки подготовить пациентов к радикальному хирургическому вмешательству Мы произвели расчеты для оценки экономической целесообразности применения клеточного материала в клинической практике Учитывая существенное сокращение сроков закрытия ТЯ в основной группе (16,2±0,5 дня) по сравнению с контрольной (32,2±1,1дня) в два раза (р <0,001), очевидно, что финансовые затраты на создание и применение клеточного материала с избытком компенсируются затратами при традиционном многокомпонентном лечении, что позво-

ляет говорить об экономической эффективности и социальной целесообразности предлагаемого способа лечения (таблица 5)

Таблица 5

Затраты на лечение в основной группе и ipynne сравнения

Этапы лечения, сроки пребывания в стационаре, финансовые затраты Основная группа N=80 Группа сравнения N=30

Фаза экссудации а) срок пребывания в стационаре б) стоимость лечебных мероприятий (медикаменты, перевязки, анализы, мед процедуры) в) стоимость пребывания в стационаре (гостиничные услуги, питание) 6,0 ±0,1 (день) о г 150 до 300 рублей в сутки 300 рублей в с> тки 6,0 + 0,1 (день) от 150 до 300 рублей в сутки 300 рублей в сутки

Фаза пролиферации а) срок пребывания в стационаре б) стоимость лечебных мероприятий (медикаменты, перевязки, анализы, мед процедуры) в) стоимость пребывания в стационаре (гостиничные услуги, питание) 8 1+0,5(дней) в зависимости от выбранного клеточного материала от 3500 до 6000 рублей + 300 рублей в сутки 300 рублей в сутки 16,1±1,1(дней) о г 350 до 700 рублей в сутки 300 рублей в сутки

Общие финансовые затраты на лечение От 8360 до 10800 рублей Ог 27930 до 35800 рублей

Успехи клеточной биологии по культивированию различных типов клеток заложили основу клеточной биотехнологии В этой области на стыке биологии и медицины интенсивно развиваются наукоемкие биомедицинские технологии, применяемые в клинической практике В результате сформировалось новое направление -заместительная клеточная герапия Механизм лечебного воздействия клеточного материала до конца не изучен и является предметом дальнейших научных изысканий, однако анализ результатов применения указанных материалов в лечении пациентов с ТЯ демонстрирует неоспоримое преимущество тканевой терапии в сравнении с традиционными подходами и диктует необходимость широкого внедрения указанных методов в клиническую практику

выводы

У больных с обширными трофическими язвами упорное хроническое течение заболевания обусловлено комбинированным нарушением функции клапанного аппарата вен конечности (АБ+АР+АБ) и присутствием в трофической язве патогенной микрофлоры, вызывающей активный воспалительный процесс в переульцерозной зоне

Более высокой степени обсеменения трофической язвы соответствует более обширная площадь язвенного поражения, более длительный стаж заболевания и более длительные сроки достижения фазы пролиферации в ходе проводимого лечения.

Клинико-морфологическими критериями готовности трофической язвы к пересадке клеточного материала являются-

а) отсутствие налета фибрина, экссудации и кровотечения из трофической язвы;

б) уменьшение бактериальной обсемененности язвы до уровня <105 микроорганизмов на мм3 ткани;

в) регресс воспалительных изменений в переульцерозной зоне; г) активизацию репаративных процессов в трофической язве -

появление капиллярной сети, грануляций, краевой эпителизации

Факт закрытия язвы у 99,1 % пациентов в основной группе и у 66,7% пациентов в группе сравнения, более короткие сроки наступления эпителизации (16,2±0,5 дней и 32,2±1,1 дней), соответственно меньшие число рецидивов язвообразования (1,25% и 13,3%) - доказывают существенное преимущество методов клеточной терапии перед традиционной схемой лечения

Оптимальный результат лечения обеспечивается дифференцированным подходом в выборе вида клеточного материала, и позволяет в кратчайшие сроки с наименьшими финансовыми затратами достичь закрытия трофических язв

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Консервативное лечение пациентов с трофическими язвами венозной этиологии должно носить комплексный характер, включающий эластическую компрессию, комплексную многокомпонентную фармакотерапию и местное лечение

Для более точного определения стадии раневого процесса (экссудация, пролиферация, эпителизация) целесообразно наряду с мак-ро-морфологической оценкой состояния трофической язвы определять степень бактериальной обсемененности язвенного дефекта, степень воспалительных изменений и состояние рспаративных процессов в переульцерозной зоне Оптимальным состоянием трофической язвы для пересадки клеточного материала является фаза пролиферации В фазу экссудации и в период пограничный между фазами экссудации и пролиферации, когда степень бактериальной обсемененности ТЯ остается значительной (>105 мктел на ммЗ ткани), пересадка клеточного материала обречена на неуспех

С учетом клинико-морфологических особенностей течения заболевания и технических условий культивирования клеточного материала комбинация фибробластов и через 3 дня многослойного пласта кератиноцитов, может быть с успехом применена именно у пациентов с трофической язвой большой площади (свыше 20см2),с длительным, агрессивным течением заболевания, устойчивым к традиционной терапии Трофические язвы небольшой площади (5=7,4±0,7 см2), в короткие сроки могут быть устранены применением многослойного пласта кератиноцитов, а глубокие язвы, относительно небольшой площади (8=11,6+0,7 см2) и множественные язвы в том числе, могут быть ликвидированы применением аналога кожи

Решающее значение в возникновении трофических язв, обусловленных хронической венозной недостаточностью, имеет степень нарушения регионарного венозного и артериального кровообращения Венозный стаз, нарушение микроциркуляции, гипоксия тканей, хронический лимфостаз - основные причины, сдерживающие процесс эпителизации Поэтому до пересадки, в процессе пересадки и в послеоперационном периоде следует продолжить интенсивную многокомпонентную терапию ангиопротекторами, венотониками, дезагрсгантами, антиоксидантами

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лапин АЛО Первый опыт использования культивированных нормальных фибробластов и кератиноциов человека в комплексном лечении трофических язв нижних конечностей сосудистого генеза / А Ю. Лапин, Э Г Топузов, M А. Рубцов, Г.П Пинаев // Трансплантология.- Киев, 2003 -Т 4, №1.- С 157-159

2 Лапин А.Ю Первый результат применения нормальных фибробластов и кератиноциов человека в комплексном лечении трофических язв нижних конечностей сосудистого генеза / А Ю Лапин, Э.Г Топузов, Г П Пинаев, Б.В Поздняков, M А.Рубцов // Материалы III российского конгресса по патофизиологии,- Москва, 2004,-С 231

3 Лапин А Ю Заместительная клеточная терапия в лечении трофических язв нижних конечностей сосудистого генеза / А Ю Лапин, Э Г Топузов, Г П Пинаев, Б В Позняков, M А Рубцов // Материалы науч -практ конф СПбГМА им.И И. Мечникова -СПб , 2005 -С 155

4. Лапин А Ю Результат применения нормальных фибробластов и кератиноциов человека культивированных m vitro в комплексном лечении трофических язв нижних конечностей сосудистого генеза / А Ю Лапин, Э Г Топузов // Материалы международного хирургического конгресса - Ростов-на-Дону, 2005 -С.298

5. Лапин А 10. Использование культивируемых клеток кожи человека для лечения трофических язв /МИ Блинова, H В. Калмыкова, H M Юдинцева, Л В Кухарева, Г.П Пинаев, А Ю. Лапин, А Ж. Мельцова, Т В Серговская, В Ф. Синицина, А.С Власов // Информационный бюллетень "Клеточные культуры"- СПб, 2006 -№21 -С.33-44

6 Лапин А Ю Применение заместительной клеточной терапии в лечении трофических язв венозного генеза /Э Г Топузов, А Ю Лапин, M А Рубцов // Методические рекомендации - СПб., 2007 -22с

7 Лапин А Ю. Заместительная клеточная терапия в лечении трофических язв вызванных хронической венозной недостаточностью. / А.Ю. Лапин, Э Г.Топузов , Г.П Пинаев , М.А Рубцов // "Стационарозамещающие технологии. Амбулаторная хирургия"-СПб , 2007 - №1 - С 24-26

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК аналог кожи

ВБ варикозная болезнь

КОЕБ колониеобразующие единицы бактерий

МПКТ многослойный пласт кератиноцитов

ПТБ посттромботическая болезнь

ФБ фибробласты

ХВН хроническая венозная недостаточность

ТЯ трофическая язва

Формат 60 х 90'/16 Печать офсетная Печ л 1,5 Тираж 100

Отпечатано в ООО «Аспринт»

Актуальность проблемы.

Трофические язвы (ТЯ) нижних конечностей - проблемное и наиболее часто встречаемое осложнение варикозной болезни (ВБ) и хронической венозной недостаточности (ХВН). (Саркисов Д.С., Алексеев А.А.с соавт., 1996; Савельев B.C. с соавт., 2000; Rucley C.V., 1997; Burton C.S., 2001).

Существующие на сегодняшний день методы консервативного лечения ТЯ, сочетающие системную фармакотерапию и местное воздействие на язвенный дефект не позволяют в 76% случаях достичь позитивного результата — эпителизации трофической язвы. (Кириенко А.И. 2000). Несмотря на внедрение в клиническую практику современных фармакологических препаратов, раневых покрытий, различного функционального назначения, частота выявления трофических язв остается постоянной, и в последнее десятилетие прослеживается явная тенденция к омоложению данного контингента больных (Савельев B.C. 2001, Ruckky C.V., 1997). Эффективным способом устранения регионарных гемодинамических и трофических нарушений в конечности вызванных ХВН является хирургическое вмешательство (Хохлов A.M. 2002, Бырихин Н.И., Чермакова А.А., 2005), однако, наличие активной трофической язвы, по мнению большинства специалистов, является противопоказанием к операции, в связи с высоким риском развития гнойно-септических осложнений (Хохлов A.M., 1993; Яблоков Е.Г. и соавт., 1999; Седов В.М.,2006). Кроме того, в ряде случаев, проведение оперативного лечения может быть сопряжено с повышенным риском или даже невозможно, в связи с наличием у пациентов тяжелой сопутствующей системной патологии. (Котлукова Т.В., 2000; Магомедов М.М., 2001; Priollet P., Franceschi С., et al., 1994; Raffin В., Bellamy V., et al., 1998).Поэтому до настоящего времени актуальна проблема поиска более эффективных способов заживления ТЯ.

Вышеизложенное заставило флебологов обратиться к методам заместительной клеточной терапии. Помимо применения клеточных продуктов для восстановления кожного покрова обожженных, описано их применение в лечении пролежней, длительно незаживающих ран, трофические язвы диабетической, нейротрофической и венозной этиологии. В лечении венозных трофических язв использовали выращенные in vitro фибробласты (ФБ), многослойный пласт кератиноцитов (МПЕСТ), аналог кожи (АК). (Воусе S., et al., 2001; Phillips Т. et al., 2002; Seidman C.E et al., 2003; Hjerppe A., 2004). Пропагандируется использование для заживления ТЯ живого эквивалента кожи - аналога кожи. Данный метод считают современной альтернативой аутодермотопластики, и его применение признано весьма перспективным. (Trent J., et al., 1998; Eaglstein W., et al., 1998; Ballard K., et al., 2000; Brem H. et al, 2000; Veves A. et al., 2001; Vowden K. et al., 2002).

He подвергая сомнению результаты научных изысканий, в доступной нам отечественной и зарубежной литературе мы не нашли аргументированной информации, отражающей преимущества и недостатки заместительной клеточной терапии в сравнении с традиционными подходами. Отсутствуют сведения о методологии и технике пересадки того или иного вида культивированных клеток и их композиций пациентам с трофическими язвами в зависимости от исходной клинико-морфологической ситуации. Не определено место клеточных технологий в общей многокомпонентной структуре лечебного процесса и экономическая целесообразность данного метода. Выше изложенные моменты определили цель и задачи нашего исследования.

Цель исследования

Улучшение результатов и сокращение сроков лечения пациентов с трофическими язвами венозного генеза путем применения различных композиций клеток кожи человека культивированных in vitro.

Задачи исследования

1. Оценить состояние сосудистого русла, микробного пейзажа, характер воспалительных и репаративных изменений в зоне трофической язвы в различные фазы раневого процесса (экссудация, пролиферация)

2. Определить клинические критерии и сроки готовности язвенного дефекта к пересадке клеточных продуктов.

3. Разработать методику и технику пересадки различных композиций культивированных клеток кожи человека на трофические язвы, обеспечивающих в кратчайшие сроки оптимальный лечебный эффект и рациональное использование клеточного материала.

4. Оценить клиническую эффективность, преимущества и недостатки предлагаемого способа лечения в сравнении с традиционными подходами.

5. Определить показания, противопоказания и сформулировать рекомендации по применению различных композиций культивированных клеток кожи человека в лечении пациентов с трофическими язвами венозного генеза.

Научная новизна

Впервые в клинической практике комплексно и дифференцированно применены многослойный пласт кератиноцитов, фибробласты человека и их комбинации, культивированные in vitro у пациентов с трофическими язвами нижних конечностей вследствие варикозной болезни в сочетании с посттромботической болезнью и хронической венозной недостаточностью.

Впервые разработана методика и техника лечения трофических язв, с применением различных клеточных композиций.

Доказано существенное преимущество предлагаемого способа в сравнении с традиционными подходами в лечении трофических язв венозного генеза. Определены показания к применению того или иного вида клеточного материала в лечебном процессе.

Предложена бальная оценка прогноза результатов лечения.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования.

Предлагаемый способ лечения позволяет значительно ускорить процесс заживления трофических язв, сократить стоимость и сроки пребывания пациентов в стационаре и в период амбулаторного лечения, а так же позволяет эффективно, в кротчайшие сроки, подготовить больных к хирургическому вмешательству.

Способ лечения трофических язв нижних конечностей с применением клеточных продуктов внедрен в работу хирургических клиник СПбГМА им. И.И.Мечникова, и хирургического отделения ГУЗ МСЧ № 18 Санкт-Петербурга. На базе ГУЗ МСЧ №18 совместно с отделом клеточных культур, института цитологии РАН Санкт-Петербурга создан научно-практический центр для оказания консультативной и лечебной помощи пациентам с трофическими язвами нижних конечностей венозного генеза. Результаты научных исследований используются в лекционном курсе и практических занятиях на кафедре хирургических болезней с курсом детской хирургии СПбГМА им.И.И.Мечникова и курсе подготовки врачей-интернов хирургов Российской ВМедА им С.М. Кирова.

По результатам диссертационного исследования разработаны методические рекомендации для врачей-хирургов, утвержденные на научно-координационном совете СПбГМА им.И.И.Мечникова

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пересадка клеточных продуктов не оказывает прямого воздействия на звенья патогенеза хронической венозной недостаточности, однако абсолютная клеточная совместимость культивированного in vitro материала, отсутствие местной воспалительной реакции тканей на пересадку и реакции отторжения после пересадки, а также активная стимуляция репаративных процессов в зоне трофической язвы позволяет считать применение фибробластов, многослойного пласта кератиноцитов и их комбинаций рациональным способом закрытия трофических язв нижних конечностей венозного генеза.

2. Применение клеточных продуктов существенно сокращает сроки заживления трофических язв в сравнении с традиционными методами лечения и позволяет в оптимальные сроки подготовить пациентов к хирургическому вмешательству.

3. В случае отказа от операции стойкий положительный эффект лечения и отсутствие рецидива язвы может быть достигнут при проведении комплексной терапии, включающей системную фармакотерапию, физиопроцедуры, эластическую компрессию в сочетании с местным воздействием на трофическую язву в виде пересадки фибробластов, многослойного пласта кератиноцитов человека и их композиций.

Личный вклад автора

Самостоятельно проведен анализ литературы по исследуемой проблеме, собран и проанализирован клинический материал.

Автор лично принимал участие в разработке и осуществлении методики пересадки клеточных продуктов и дальнейшем лечении пациентов.

Автор выполнил анализ и статистическую обработку полученных данных.

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования доложены:

- на городской научно-практической конференции "Лечение ран и трофических язв с использованием дермального эквивалента и пластов кератиноцитов". (Россия. СПб, 2003).

- на международной научно-практической конференции "Проблемы клеточной и тканевой трансплантологии". (Украина. Ивано-Франковск, 2003).

- на X хирургическом съезде " Международный хирургический конгресс.

Новые технологии в хирургии". (Россия. Ростов-на-Дону, 2005). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, который содержит 283 работ: 169 отечественных и 114 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 26 таблиц и 42 рисунка.

145 ВЫВОДЫ

1. У больных с обширными трофическими язвами упорное хроническое течение заболевания обусловлено комбинированным нарушением функции клапанного аппарата вен конечности (А8+АР+А1)) и присутствием в трофической язве патогенной микрофлоры, вызывающей активный воспалительный процесс в переульцерозной зоне.

2. Более высокой степени обсеменения трофической язвы соответствует более обширная площадь язвенного поражения, более длительный стаж заболевания и более длительные сроки достижения фазы пролиферации в ходе проводимого лечения.

3. Клинико-морфологическими критериями готовности трофической язвы к пересадке клеточного материала являются: а) отсутствие налета фибрина, экссудации и кровотечения из трофической язвы; б) уменьшение бактериальной обсемененности язвы до уровня <105 микроорганизмов на мм3 ткани; в) регресс воспалительных изменений в переульцерозной зоне; г) активизацию репаративных процессов в трофической язве -появление капиллярной сети, грануляций, краевой эпителизации.

4. Факт закрытия язвы у 99,1% пациентов в основной группе и у 66,7% пациентов в группе сравнения, более короткие сроки наступления эпителизации (16,2±0,5 дней и 32,2±1,1 дней), соответственно меньшие число рецидивов язвообразования (1,25% и 13,3%) - доказывают существенное преимущество методов клеточной терапии перед традиционной схемой лечения.

5. Оптимальный результат лечения обеспечивается дифференцированным подходом в выборе вида клеточного материала, и позволяет в кратчайшие сроки с наименьшими финансовыми затратами достичь закрытия трофических язв.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Консервативное лечение пациентов с трофическими язвами венозной этиологии должно носить комплексный характер, включающий: эластическую компрессию, комплексную многокомпонентную фармакотерапию и местное лечение.

2. Для более точного определения стадии раневого процесса (экссудация, пролиферация, эпителизация) целесообразно наряду с макро-морфологической оценкой состояния трофической язвы определять степень бактериальной обсемененности язвенного дефекта, степень воспалительных изменений и состояние репаративных процессов в переульцерозной зоне. Оптимальным состоянием трофической язвы для пересадки клеточного материала является фаза пролиферации. В фазу экссудации и в период пограничный между фазами экссудации и пролиферации, когда степень бактериальной обсемененности ТЯ

-у остается значительной (>105 мк.тел на мм ткани), пересадка клеточного материала обречена на неуспех.

3. С учетом клинико-морфологических особенностей течения заболевания и технических условий культивирования клеточного материала комбинация фибробластов и через 3 дня многослойного пласта кератиноцитов, может быть с успехом применена именно у пациентов с трофической язвой большой площади (свыше 20см"),с длительным, агрессивным течением заболевания, устойчивым к традиционной терапии. Трофические язвы небольшой площади (8=7,4+0,7 см2), в короткие сроки могут быть устранены применением многослойного пласта кератиноцитов, а глубокие язвы, относительно небольшой площади (8=11,6+0,7 см") и множественные язвы в том числе, могут быть ликвидированы применением аналога кожи.

4. Решающее значение в возникновении трофических язв, обусловленных хронической венозной недостаточностью, имеет степень нарушения регионарного венозного и артериального кровообращения. Венозный стаз, нарушение микроциркуляции, гипоксия тканей, хронический лимфостаз - основные причины, сдерживающие процесс эпителизации. Поэтому до пересадки, в процессе пересадки и в послеоперационном периоде следует продолжить интенсивную многокомпонентную терапию ангиопротекторами, венотониками, дезагрегантами, антиоксидантами.

148