Автореферат и диссертация по медицине (14.00.37) на тему:Применение криоконсервированных гепатоцитов в комплексном лечении больных с острой печеночной недостаточностью (клинико-экспериментальное исследование)

#

сь

^г На правах рукописи

^ «О

Лебедева Юлия Николаевна

ПРИМЕНЕНИЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ГЕПАТОЦИТОВ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ С ОСГРОЙ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ (клшшко-эксперименталыюе исследование)

14.00.37 - Анестезиология и реаниматология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата;! медицинских наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте скорой помощи им. Н.В. Склифосовского.

Научные руководители: доктор медицинских наук

профессор Й.И. Шиманко;

доктор биологических наук Н.П. Суббота.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Н.Е. Буров

доктор медицинских наук, профессор Н.А. Онищенко

Ведущая организация: Московский областной научно-

исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Защита состоится "_"_1996 г. на заседании

диссертационного совета Д 155.02.01. в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского по адресу: Москва, Б. Сухаревская пл., д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л.А. Гуляев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Острая печеночная недостаточность (ОПН) развивается как одно из грозных осложнений экзо- и эндотоксикозов различной этиологии (Э.И. Гальперин 1978; Е.А. Лужников 1989; И.И. Шиманко и С.Г. Мус-селиус 1993; F. Badosa 1988). В настоящее время проблема лечения ОПН сохраняет свою сложность и всё ещё не получила разрешения. Смертность при данной патологии остается на чрезвычайно высоком уровне, достигая 60 - 100% (A.C. Блюгер, 1984; С.Д. Подымова, 1993; В.И. Шумаков, H.A. Оншценко, 1994; A.S. Stiber, L.A. Makowka, 1988).

Низкая эффективность лечения во многом связана с отсутствием патогенетической терапии. Одной из основных задач лечения ОПН является поддержание печени больного в течение "критического" периода (Е.М. Маргулис, 1985; Н.Ю. Корухов, 1989; С.Н. Соринсон, 1987). Такой подход обусловлен значительными резервными возможностями печени для восстановлешш своих жизненно важных функций.

Неудовлетворительные результаты лечения ОПН при использовании традиционных методов лечения диктуют необходимость поиска новых. По мнению многих исследователей, наиболее перспективным направлением в комплексном лечении печеночной недостаточности является использование клеточной терапии, включающей изолированные ксено-нли аллогепатоциты (В.Г. Бруслик, 1979; В.Ю. Берелавичус, 1975; В.И. Шумаков, 1980; Е.М. Маргулис, 1986; B.Eiseman, 1966; L. Makowka 1980; A.A. Demetriou, 1986).

Вместе с тем, публикации, в которых анализируется опыт клинического использования аллогенных гепатоцитов при ОПН токсического ге-неза, немногочисленны (Б.Д. Комаров и соавт., 1982; Б.Ц. Рималнс, 1983; И.И. Шиманко и соавт., 1993).

С целью восстановления утраченных функций печени в большинстве работ, использовали гепатоциты, храшшшиеся при гипотермических (+4°С) температурах. Такой подход не позволяет внедрить методику лечения для широкого клинического использования, т.к. при гипотермических температурах клетки хранятся лишь непродолжительное время. (Н.П. Суббота, 1986; В. Fuller, 1987). Поэтому необходим поиск методов и методических приёмов, позволяющих хранить свежевыделенные гепатоциты длительное время в жизнеспособном состоянии.

Наиболее перспективным и успешно разрабатываемым направлением при решении этой проблемы является использование с целью длительной консервации клеточных суспензий субнулевых (-196°С) температур (Н.П. Суббота, 1983; A.M. Белоус и соавт., 1987; В.Ю. Тощаков, 1988; В. Rubinsky, 1987; В. Fuller et all 1985;). Благодаря использованию

этого метода стало реальным создание банка клеток и их использование "до востребования".

Создание банка клеток для клинического использования особенно актуально при экстренном поступлении больных с ОПН, а также в случае массовых отравлений гепатотоксичными ядами.

Однако остаются неизученными вопросы функционально-метаболической активности аллогенных гепатоцитов после деконсервации, их влияния на восстановительные процессы в печени реципиента при использовании в клинике у больных с ОПН. Не исследована эффективность применения в клинике гепатоцитов плода человека. У больных с ОПН не проведена оценка эффективности клеточной терапии с использованием изолированных криоконсервированных гепатоцитов при их применении в комплексе с активными методами детоксикации.

Вместе с тем, в литературе имеются данные об эффективности использования в эсперименте не только изолированных клеток, но и гомо-генатов, и цитозольных фракций печени. (La Brecque, 1979; В.Г. Бруслпк, 1989; O'Neill et all, 1982; L. Makowka, 1980; R. Grundmann, 1986). Однако, механизм их действия при ОПН окончательно не выяснен ни в эксперименте, ни в клинике. Неизученными остаются вопросы воздействия биосубстратов печени (гомогенат, суспензия клеток, цитозольные фракции) выделенных из органа человека или животных разного уровня онтогенетического развития.

Решение вышеизложенных проблем позволит расширить новые научно-обоснованные подходы к лечению ОПН и выработать рекомендации по их применению в клинике.

Актуальность работы обусловлена необходимостью поиска новых эффективных методов лечения ОПН, позволяющих снизить летальность в этой тяжёлой группе больных.

Цель работы

Целью настоящего исследования является сравнительное изучение эффективности использования аллогенных гепатоцитов, хранившихся при различных температурных условиях (2 + 4°С; -196°С) в комплексном лечении больных с ОПН и в модельных экспериментах на животных.

Задачи исследования

1. Изучение структурно-функционального состояния гепатоцитов животных и человека после выделения и различных условий низкотемпературного (-19б°С) хранения.

2. Исследование динамики клинических, биохимических и инструментальных показателей у больных с ОПН при использовании в комплексном лечении криоконсервированных гепатоцитов.

3. Проведение сравнительного анализа клинической эффективнос-

ти использования гепатоцитов, хранившихся при гипотермических (2 +■ 4"С) и субнулевых (-1%"С) температурах.

4. Исследование в эксперименте лечебного эффекта биосубстратов печени (гомогенат, гепатоциты, цитозольные фракции), выделенных из печени плода человека и взрослых доноров.

Научная новизна

Впервые изучены в сравнительном аспекте морфофункциональные параметры гепатоцитов, изолированных из печени людей, скоропостижно скончавшихся от острой сердечно-сосудистой недостаточности, и печени плода человека, полученных в результате абортов поздних сроков развития по медицинским показаниям. Показано, что изолированные из печени плода гепатоциты характеризуются сохраненными морфофункциональны-мн свойствами и обладают способностью к выполнению органоспецифи-ческих функций, в частности к захвату ксенобиотика бифенила.

Впервые изучена динамика биохимических показателей у животных с моделью ОПН при использовании натнвных и криоконсервирован-ных биосубстратов печени: гомогенатов, гепатоцитов, цитозольных фракций. Установлено, что наиболее выраженным эффектом обладает препарат, включающий деконсервированную цитозольиую фракцию из печени плода.

В работе впервые проведено комплексное сравнительное изучение эффективности использования аллогенных гепатоцитов у больных с ОПН, развившейся вследствие отравления гепатотропными ядами.

Установлено, что эффективность действия клеток, хранившихся длительное время при температуре жидкого азота, не снижается. Показано что улучшение результатов лечения ОПН достигается при включении в комплекс активных методов детоксикации "клеточных диализов" с аллогенными гепатоцитами, хранившимися как при гипотермических, так и при субнулевых температурах. Впервые в комплексном лечении больных с ОПН были использованы в качестве компонента диализирукпцей среды гепатоциты печени плода человека.

Практическая значимость

Метод криоконсервирования изолированных аллогенных гепатоцитов по 2-этапной программе в среде с 10% димексидом позволяет сохранять их неограниченное время в криобанке клинического профиля. Стало возможным создать запас клеток и использовать их не только в плановом лечении больных, но и в экстренных случаях, а также при необходимости транспортировать биопрепараты в сосудах Дыоара на большие расстояния.

На основании изучения динамики клшшко-биохимических показателей у больных с ОПН токсического генеза доказана необходимость вве-

дення п комплекс активных методов детоксикации "клеточных диализов" с криоконсервированнымигепатоцитами.

Показано, что использование криоконсервированных гепатоцнтов позволяет снизить летальность и сократить время пребывания в стационаре больных с данной патологией.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Криоконсервированные по 2-этапной программе в среде с 10% димексидом аллогенные гепатоциты сохраняют высокий уровень жизнеспособности н органоспецифические свойства.

2. Применение в комплексе активных методов детоксикации клеточной терапии с использованием гепатоцигов повышает эффективность лечения у больных с ОПН.

3. Использование аллогенных гепатоцнтов, хранившихся в условиях низкотемпературного банка, эффективнее гепатоцнтов, хранившихся при гипотермических температурах (от 2 до 10 суток).

4. В эксперименте показано, что для лечения ОПН можно использовать не только изолированные гепатоциты, но и биосубстраты печени, а наиболее эффективным является использование деконсервированной цитозольной фракции из печени плода.

Практическое внедрение работы

Результаты работы внедрены в клиническую практику отделения по лечению острых эндотоксикозов НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, реанимационного отделения областной больницы и токсикологического центра Ульяновска, реанимационного отделения 1-й гор. больницы Омска, реанимационного отделения больницы СМП. Архангельска, токсикологического центра больницы СМП Тулы, реанимационного и токсикологического отделений 33-й больницы Нижнего Новгорода.

Апробация работы

Материалы настоящего исследования доложены на межклинических конференциях и заседаниях проблемно-плановых комиссий НИИ СП. им. Н.В. Склифосовского (1993, 1994,1995 гг.); на 17-й, 21-й, 23-й научных конференциях гастроэнтерологов с участием зарубежных ученых (Москва, 1988, 1992, 1994 гг.); советско-американских конференциях "Экстренная помощь при неотложных состояниях" (Санкт-Петербург 1992, 1993 гг.); 2-й Международной конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков 1992 г.); Международной конференции "Теоретические основы криоконсервирования" (Градец Кралов, ЧСФР, 1992 г.); на заседании круглого стола "Холелитиаз и его осложнения" 1-х международных хирургических дней молодых учёных (Киев, 1993 г.); научно-практической конференции НИИ СП им. Н.В. Склифосовского "Новое в экспериментальной и клинической патологии неотложных состояний

(Москва, 1993); 1-й украинско-американской конференции по неотложной помощи (Одесса, 1993 г.); на 1-м Международном конгрессе "Эндогенные интоксикации" (Санкт-Петербург, 1994); 1-м Международном конгрессе по Биологической медицине (Тель-Авив, Израиль, 1994 г.); на 1-м Международном съезде хирургов (Москва, 1995); на 32-м Международном конгрессе "Крио-95" (Висконзен, США, 1995 г.); на заседании круглого стола "Клеточная терапия" 1-го съезда криобиологов Украины (Харьков, 1995 г.); международном симпозиуме "Сорбционная детоксика-ция внутренних сред организма." (Новосибирск, 1995 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы в отечественной и зарубежной печати.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, одной главы "Материалы и методы", четырех глав изложения результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 23 таблицы, 21 рисунок, 1 схему. Библиографический указатель включает 96 источников отечественных и 118 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве донорского материала использовали печень человека разных возрастных периодов.

Печень плода человека (24 - 26 недель внутриутробного развития) получали в результате абортов поздних сроков по медицинским показаниям в отделении патологии беременности 1-й Городской больницы г. Харькова (Украина).

Печень взрослых доноров получали в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского от людей, скоропостижно скончавшихся от острой сердечно-сосудистой патологии. Срок ишемии органа составлял не более 1,5 - 2,0 часов.

Получение гепатоцитов производили из донорского органа без патологических процессов (цирроз, различной формы гепатиты и выраженная жировая дистрофия гепатоцитов). Противопоказаниями к получению биоматериала из печени плода служили: наличие в анамнезе у матери вирусного гепатита, туберкулёза, сифилиса, ВИЧ, гонореи или цитомегало-вирусной инфекции; перенесенные во время беременности корь, краснуха.

Выделение гепатоцитов и получение нитбзольной фракции. Гепа-тоциты из печени крыс получали с использованием для дезагрегации пече-

ни низкочастотной вибрации (50 - 70 Гц). Перфузию печени наркотизированных крыс проводили через портальную вену в течение 20 минут тёплым (37°С) раствором, содержащим 140 ммоль NaCI, 5 ммоль KCl, Зммоль NaHC03,2ммоль ЭДТА, РН = 7,4. Для получения гепатоцитов из печени плода человека использовали методику, описанную в работе (Н.П. Суббота, 1993). Гепатоциты из печени взрослых доноров получали ферментно-механическим способом (M.N. Berry, P.S. Friend, 1969).

Цитозольную фракцию получали после 3-кратного замораживания-отогрева и последующего 10-минутного центрифугирования 10% го-могената печени при 1,5 тыс. оборотов в мин.

Определение функционально-метаболической активности гепатоцитов. Жизнеспособность гепатоцитов определяли по исключению гепа-тоцитами 0,4% витального красителя трипанового синего.

Количество клеток подсчитывали в камере Горяева.

Определение белоксинтезируюшей способности в печени и изолированных гепатоцитах производили после инкубации 37°С клеток или го-могената печени в течение 30 минут с меченым нС-лейцшгом, или ,4С-гидролизатом белков хлореллы (5 мкмоль/мл). Подсчет проб проводили на жидкостно-сцинтилляционном счетчике "Бекман"- 1- 7800.

Определение количества гликогена в ткани печени крыс проводили при десмолизе ткани 30%-ным раствором КОН, последующем прибавлении к смеси 1,2 объема этилового спирта и охлаждении. Гликоген гидро-лизовали серной кислотой до глюкозы, по количеству которой вычисляли содержание гликогена.

Определение проницаемости плазматических мембран гепатоцитов "сукцинатным тестом" основано на неспособности сукцината проникать через неповрежденные мембраны клеток. Уровень эндогенного дыхания гепатоцитов определяли на полярографе "ПА-2 Прага"с помощью электрода кларковского типа. Концентрация клеток в среде инкубации составляла в среднем 2*106/мл. Анализ проводили, сопоставляя дыхательную активность после добавления двух последовательных добавок сукцината в нарастающих концентрациях: 1,0 и 10,0 ммоль.

Определение способности к захвату гепатоцитами ксенобиотика бифенила проводили по методу описанному в работе (А.Н. Сукач, 1991) по изменению его концентрации в среде инкубации после экстракции н-гептаном. Интенсивность флуорисценции измеряли по спектрофлуоримет-ре "Xitachi" MPF-2A.

На всех этапах получения клеток (исходное состояние ткани, этапы перфузии, изолированные клетки) проводилось их гистологическое и гистохимическое и электронно-микроскопическое изучение отделе пато-морфологии (д.м,н. JI.H. Зимина).

При срочном гистологическом исследовании оценивалась микроструктура органа и состояние гепатоцитов с целью определения отсутствия

противопоказаний к использованию печени в качестве донорского материала.

Экспериментальная часть работы по выделению гепатоцитов животных, их криоконсервация, а также определение их барьерных свойств, способность к захвату ксенобиотика бифенила, синтезу белка, и изучения действия биосубстратов печени в эксперименте проводилось совместно с д.б.н. Н.П. Субботой, (г. Харьков, Институт проблем криобиологии и криомедицины HAH Украины).

Схема проведения эксперимента: ОПН у экспериментальных животных моделировали внутрибрюшинным (в/б) введением 0,5 мл 50% масляного раствора СС14 на 100 г массы тела крысы. Биосубстраты вводили в/б по 1 мл на 100 г массы тела животного по схеме: 1) нативные гепатоциты; 2) криоконсервированные гепатоциты; 3) криоконсервиро-ванный гомогенат печени плода человека; 4) криоконсервированная цито-зольная фракция печени плода человека.

У контрольных животных (без введения биосубстратов) биохимические показатели в крови (ACT, AJIT, МДА) и в ткани печени (синтез белка и гликогена) определяли через 24, 48 и 72 часа после отравления. У животных, которым вводили биосубстраты, определение показателей проводили через 24 часа после введения препаратов (48 и 72 часа после отравления соответственно).

Техника и режим замораживания гепатоиитов. Замораживание гепатоцитов проводили на програмном замораживателе с использованием 2-х этапного режима: на первом этапе со скоростью 1 - 2"С/мин. до -60°С, делали температурную остановку 3-5 минут, после чего контейнеры быстро погружали в жидкий азот (-196"С).

Препараты хранили в условиях криобанка необходимое время (лаборатория консервирования тканей, руководитель - профессор В.Б. Хватов).

Для хранения и транспортировки биоматериала применяли широко-горлые сосуды Дыоара.

Отогрев биоматериала проводили с использованием водяной бани при температуре +37°С до 2 + 4°С, вращая контейнер с суспензией гепатоцитов.

В качестве криопротектора использовали 10% раствор димексида (ДМСО). Гепатоциты инкубировали с криопротектором при температуре 2 + 4"С на протяжении 10 минут.

При гипотермическом хранении суспензию гепатоцитов хранили в среде 199 в течение 1-10 дней (2 + 4°С).

Характеристика клинических методик

Биохимические методы исследования. В соответствии с целыо настоящей работы у наблюдаемых больных определялись следующие показатели: пигментного обмена - общий билирубин и его фракции, белкового обмена - общий белок, альбумин и глобулины, азотистого обмена - мочевина и креатинин, липидного обмена - холестерин и липопротеиды, глюкозу, энзимный спектр - ACT, AJIT, ЛДГ, ШФ, ГГТП, показатели свертывающей системы - фибриноген, толерантность плазмы к гепарину, фи-бринолиз, этаноловый тест, протаминсульфатный тест, фибриноген Б, протромбиновое время, электролитный баланс - К, Na, С1 и кислотно-щелочное состояние.

Оценку уровня массы средных молекул (МСМ) в крови проводили скринпнговым методом на спектрофотометре, 1-я фракция при длине волны 254 нм, 2-я фракция при длине волны 280 им.

Все вышеперечисленные исследования проводились сотрудниками клиникобиохимической лаборатории института (руководитель - профессор П.П. Голиков).

Как экспресс метод диагностики гемодинамических и функциональных нарушений функции печени использовали вофавердиновый тест (В.И. Фомичев, 1973).

В процессе лечения всем больным проводились инструментальные методы обследования включающие проведение сцинтиграфии печени и гепатографии с J131 бенгальским розовым, ультразвуковое исследование с применением методик УЗИ допплерографии (УЗДГ).

Для уточнения сопутствующих заболеваний и сочетанного поражения других органов применялись эзофагогастродуоденоскопия, УЗИ сердца, почек, поджелудочной железы, доплерография сосудов сердца и почек, радиоизотопная ренография. В некоторых случаях для уточнения диагноза применяли компьютерную томографию органов брюшной полости.

Полученные данные обработаны методом вариационной статистики с использованием критерия достоверности Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфофункциональные свойства свежевыделенных и крноконсервнроваиных гепатоцитов

При проведении экспериментальной части работы гепатоциты выделяли из печени лабораторных животных-крыс, а также трупной печени взрослых доноров и плода человека 24 - 26 недель внутриутробного развития.

У свежевыделенных гепатоцитов крыс коэффициент стимуляции эндогенного дыхания, который как известно является параметром, характеризующим ннтактность плазматической мембраны, составлял 1,85. Это свидетельствует о низкой проницаемости свежевыделенных гепатоцитов для сукцнната.

Сохранность плазматической мембраны и внутриклеточных орга-нелл потверждалось при микроскопическом исследовании.

Вышеизложенное послужило основанием для использования гепатоцитов, полученных при дезагрегации с помощью вибрации, в модельных экспериментах (гепатоциты крыс).

Гепатоциты, выделенные из печени взрослых доноров имели большей частью четкие контуры, округлую полигональную форму (рис. 1. А). В отдельных гепатоцитах встречались вакуоли. При электронно микроскопическом исследовании видна сохранная плазматическая мембрана и клеточные органеллы, отмечается вакуолизация, единичные липидныс включения, (рис. 1. Б) Митохондрии имеют четкие кристы и наружную мембрану (рис. 1. В). Хорошо представлен шероховатый эндоплазмати-ческий ретикулум с рибосомами (рис. 1. Г). Ядра диффузно и интенсивно окрашены. Количество жизнеспособных клеток в суспензии составляло в среднем 60 ± 3,0%.

Существующие в настоящее время методы хранения гепатоцитов включают использование как гипотермических, так и субнулевых температур. Показано, что гипотермические температуры (2+4"С) не позволяют длительно поддерживать клетки в жизнеспособном состоянии. Хранение взвеси гепатоцитов в течении 24 часов при гипотермичес-кой температуре не оказывает влияния на сохранность их структур: плазматическая мембрана сохраняется, клеточные органеллы без изменений. Однако при увеличении сроков гипотермического хранения гепатоцитов происходят грубые нарушения их структурно-функциональных свойств. Перспективы более длительного хранения гепатоцитов в жизнеспособном состоянии открываются при использовании низких температур, позволяющих временно прекратить все метаболические процессы.

Pire. 1. Морфологическая сохранность гепатоцитов, полученных из труппой печени взрослых доноров-лгоден. А. - окраска гематоксилином и эозином х 400. Б - х 9500, В - х 36200, Г - х 64500.

Гепатоциты, как и все другие мембранные структуры, являются очень чувствительными к различным повреждающим факторам, в частности к низким температурам.

На этапе деконсервации в гепатоцитах выявлялись глубокие повреждения структурного состояния и функциональных свойств, развившихся в результате действия на клетки крноповреждающих факторов.

Показано, что независимо от возраста донора в характере криоло-вреждений на этапе деконсервации в гепатоцитах отмечается однонаправленность нарушения их функциональных свойств: снижение количества жизнеспособных клеток, исключающих трипановый синий (нарушение барьерных свойств), снижение интенсивности включения меченых АК в суммарные белки (угнетение белоксинтезирующего аппарата), снижение захвата бифенила (угнетение функции детоксикации), увеличение скорости окисления сукцината и угнетение эндогенного дыхания (угнетение биоэнергетических параметров).

В деконсервированных клетках, подвергшихся замораживанию в среде без криопротектора, нарушение структурной организации, несовместимо с процессами их жизнедеятельности. При этом, судя по исследованным параметрам, гепатоциты, выделенные из печени плода человека, повреждались в большей степени, чем клетки печени взрослых доноров.

С целью защиты внутриклеточных структур гепатоцитов в работе

был применен методический прием, в настоящее время используемый при криоконсервацни других клеточных суспензий. Этот прием включает в себя варьирование скоростей замораживания в различных температурных зонах: медленная (1° в мин.) начальная скорость и использование температурной остановки с целью лучшей адаптации клеток к изменению температурных условий их окружения, затем - быстрое замораживание. Увеличение скорости охлаждения, ослабляет действие таких повреждающих факторов, как обезвоживание, дегидратация макромолекул, увеличение концентрации электролитов, медленного повреждения клеток внутриклеточным льдом в опасном для них температурном диапазоне и т.д.

2-х этапный режим замораживания, используемый нами в работе, и включение в среду консервации 10% димексида в качестве криопротек-тора, позволял сохранять высокий уровень функциональной активности клеток (табл. 1).

Таблица 1

Функциональные параметры спежевыделениых и крноконсервмроваииых под защитой 10% димексида гепатоцнтов (2-х этапное заморажнвание) п = 7-10

Исследованный парамет

Гепатоцнты взрослых доноров

Свежевыде ленные

60,0+3,0

Криокон-сервированные

50+3,0

Гепатоциты плода человека 24-26 недель развития

Свеже-выделенные

55,0+0,2

Криокон-сервированные

47,0+3,0

Гепатоциты экспериментальных животных

Свеже-выделенные

85,0±2,0

Криокон-сервированные

7516,0

Окраска трипано-вым синим

Включение 14С-лей-цина (имп/ми ЖС кл/мл)

Коэф-фицент стимуляции эндогенного дыхания

496301200 33086±9(| 530001120 37100118С

515001280 306000+210

2,0±0,1

1,24±0,1

1,8510,15

Захват бифенил (мкмоль/л)

70,0+2,0 63+2,0

65,0+2,0 48,0+2,0

80,014,0 6713,0

Действие низких температур наиболее повреждает ядро и рибосом-ный аппарат гепатоцитов, поскольку снижение белоксинтезирующей активности деконсервированных гепатоцитов является параметром, предотвратить нарушения которого не удалось ни с помощью варьирования скоростей замораживания, ни введением в среду различных криопротекторов (Н.П.Суббота, 1986; В.Ю. Тощаков, 1990; В. Fuller, 1985) что было подтверждено и в наших исследованиях. Так, способность к включению меченых аминокислот в суммарные белки после криоконсервации снижалась в среднем в 1,5 раза. Вместе с тем клетки, подвергшиеся процессу замораживания-отогрева по использованной программе, сохраняют активность цени микросомального окисления.

Способность нативных и деконсервированных гепатоцитов к деток-сикации изучена нами поглощению гидрофобного ксенобиотика бифенила. Показано, что клетки с высокой степенью жизнеспособности захватывают до 80% бифенила из среды. При низкой степени жизнеспособности клетки могут захватывать бяфенил при гипотермических температурах, однако при физиологических температурах до 50% бифенила клетками теряется.

Криоконсервированные с сохраненными морфо-функциональными свойствами гепатоциты были использованы нами в клинике у 26 больных с ОПН токсического генеза.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОСУБСТРАТОВ ПЕЧЕНИ ПРИ ОСТРОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ (Оэ11Н)

В качестве биосубстратов в работе использованы криоконсервированные и нативные препараты печени разного уровня биологической организации: гомогенаты, гепатоциты и цитозольные фракции.

Как следует из таблиц 2, 3, экспериментальное моделирование острой печеночной недостаточности отравлением СС1^ приводит к статистически достоверному снижению способности печени к биосинтезу белка и гликогена во все исследованные сроки, увеличению концентрации МДА и активности аминотрасфераз в сыворотке крови. Изменение данных параметров свидетельствует о грубых нарушениях, происшедших в печени после моделирования ОэПН.

Введение биосубстратов оказывало на печень различной степени восстанавливающее действие, зависящее от сроков введения и уровня биологической организации препаратов.

Через 48 часов после отравления способность включать меченые АК на более высоком уровне сохранялась в группе животных с предварительным введением (24 часа после отравления) криоконсервированнон

цитозольной фракции печени плода человека.

Показано также (табл. 2), что у крыс с острым отравлением СС1^ способность к синтезу гликогена спустя 24 и 48 часов снижается на 25 и 32% соответственно.

Введение биопрепаратов печени различного вида мало влияло на способность к синтезу гликогена в печени отравленных животных. Лишь в группах животных с введением криоконсервированной цитозольной фракции печени плода этот показатель был выше в среднем в 1,4 раза, чем в группе животных без введения препаратов.

Таблица 2

Динамика биохимических показателен через 48 часов после острого экспериментального отравления СС14

Условия эксперимента Синтез белка в ткани печени имп/мин/мг Синтез гликогена в ткани печени имп/мин/мг МДА в сыворотке крови, нмоль/1мл.мин

Контрольные животные 256,5 ± 16 151,5 ± 16 5,38 ±0,11

24 часа после зтрапки (до лечения) 198,3 ± 13* 113,5 ± 10* 11,58 ±0,2*

48 часов после затравки (до лечения) 127,67 ± 12* 103± 14* 8,165 ± 0,12*

Внугрибрюшинное введение:

Нативные гепатоциты 142 ± 12 111 ± 12 8,543 ± 0,13**

Криоконсериированные гепатоциты 150 ± 11 118± 12 7,028 ±0,11**

Гомогенат печени плода человека 164 ± 16 123 ± 10 5,865 ± 0,16**

Криоконсервированный гомогенат печени плода человека 1701 15** 123 ± 13 5,423 ± 0,90**

Криоконсервированная цитозольная фракция печени плола человека 178 ± 13** 140,5 ± 15** 5,423 ± 0,2

- различия достоверны по сравнению с контролем

** - различия достоверны по сравнению с исходными данными (48 часов до лечения).

Примечание: животные забивались спустя 24 часа после введения бносубстратов.

Острое отравление животных сопровождалось значительной стимуляцией процессов ПОЛ, определенных по изменению уровня МДА. Максимальное увеличение уровня МДА в сыворотке крови (в 2,2 раза) отмечено спустя 24 часа после затравки. Исследования этого параметра через 48 часов после отравления свидетельствовало о снижении показателя по сравнению с величинами, полученными спустя 24 часа (в 1,5 раза).

Введение крысы с ОПН суспензии гепатоцитов снижало показатели МДА через 48 часов после отравления в случае использования их в виде замороженно-отогретого препарата.

Наименьшее увеличение уровня МДА было отмечено в группе животных, которым вводили препараты печени плода человека: гомоге-нат или цитозольную фракцию.

Через 48 часов после затравки животных активность AJ1T увеличивалась в 5,3 раза, a ACT - в 4,8 раза.

Введение крысам с ОПН препарата, представляющего гомогенат печени плода человека или криоконсервированную цитозольную фракцию, позволяло через 24 часа получить более низкие величины исследованных параметров. Следует отметить, что по данным активности AJIT, более эффективным в этом случае было введение препарата, содержащего цитозольную фракцию печени плода.

Таблица 3

Динамика активности ферментов через 48 часов после острого экспериментального отравления CCI. N=5

Условия эксперимента Активность ферментов (мкмоль/ч.мл)

AJIT ACT

Контрольные животные 48 часов после затравки (до лечения) 0,9 ± 0,09 4,8 ± 0,04 0,81 ± 0,03 3,92 ± 0,04*

Внутрибрюшинное введение

Гомогенат печени плода человека Криоконсервированная цитозольная фракция печени плода человека 3,2+0,04** 3,0+0,03** 3,6 ± 0,04** 2,5 ± 0,09**

*

- различия достоверны по сравнению с контролем;

** !ЛО

- различия достоверны по сравнению с исходными данными (48 часов до лечения).

Таким образом, наиболее эффективным действием по всем исследованным параметрам обладали препараты, выделенные из печени плода человека и подвергшиеся криоконсервированию. Наиболее выраженное восстанавливающее действие характерно при этом для криоконсервиро-

ванного препарата, представляющего собой цнтозольную фракцию печени плода человека.

Результаты проведенной экспериментальной работы послужили обоснованием для использования криоконсервированных гепатоцитов плода человека у больных с ОПН токсического генеза.

Клиническая характеристика изучаемых больных

Проведен анализ результатов обследования и лечения 82 больных с острой печеночной недостаточностью, находившихся на лечении в НИИ СП им. Склифосовского в 1985 - 1995 гг. 12 больным "клеточные диализы" проводились при работе по линии санитарной авиации в реанимационных и токсикологических отделениях различных городов России.

В комплексе активных методов детоксикации наблюдаемым больным проводились "клеточные диализы": 26 больным с аллогенными крио-консервированными гепатоцитами (1 группа); 24 больным с аллогенными гепатоцитами, хранившимися при гипотермических температурах от 1 до 10 дней (2 группа). Сравнение результатов проводилось с контрольной группой из 32 больных, которым проводились активные методы детоксикации без включения в комплекс лечения "клеточной" терапии (3 группа).

Печеночная недостаточность во всех 3 группах развилась вследствие отравления гепатотропными ядами (хлорированные углеводороды, ядовитые грибы). Для определения степени тяжести гепатопатии использовалась классификация предложенная професором Е.А. Лужниковым (1977).

Клеточные диализы включали в комплекс терапии только у больных с гепатопатией II степени (4 больных в 1 группе и 3 больных во 2 группе) и в большинстве наблюдений с гепатопатией III степени (22 больных из 1 группы и 21 больной из 2 группы).

У 16 больных (61,5%) в 1 группе и у 17 больных (70,1%) во 2 группе подключение гепатоцитов сочетали с другими активными методами детоксикации.

Плазмаферез (ПлАф) выполняли у 10 больных с помощью проточного фракционатора крови ПФ-0,5. У 15 больных ПлАф проводили "дискретным" способом, с использованием стерильных пакетов 300 - 500 мл типа "Haemicon". Кровь центрифугировалась при 2200 об. в мин. в течение 10 минут, с последующим удалением плазмы и возвратом клеточных элементов больному. Объем удаленной плазмы составлял от 500 до 1500 мл. Замещение проводили эквивалентным количеством свежезамороженной плазмы и альбумина.

Сорбционная детоксикация крови, плазмы и лимфы выполнена у 20 больных. Для проведения 26 операций использовались отечественные сорбенты объемом 150 - 200 млн.: СКТ, СКН, ФАС.

Дренирование грудного лимфатического протока было выполнено у

18 больных. Детоксикациго стерильно собранной лимфы, осуществляли с помощью сорбента статическим, рециркуляторным или капельным методом.

У 34 больных проводилось внутрипортальное введение лекарственных препаратов.

У 19 больных (73%) 1 группы, 15 больных (62,5%) 2 группы и 22 больных (68,6%) 3 группы развитие острой почечной недостаточности потребовало лечения гемодиализом (112, 84 и 93 сеанса соответственно). Применялись отечественные пластинчатые диализаторы "ДИП 02-02", зарубежные капиллярные диализаторы - "НешоЯои", АРЕ 1,6; АРЕ 1,8.

Постоянная артерио-венозная гемофильтрация проводилась у 9 больных с использованием гемофильтров типа "МиШПои" с мембраной АН-69, позволяющей выводить метаболиты до 19 тысяч дальтон. Время проведения процедуры составляло 8-32 часа.

Техника проведения диализа с использованием изолированных гепа-тонитов ("клеточных диализов").

В основу данного метода положен принцип обычного гемодиализа, однако в качестве диализирующего раствора использовали взвесь гепато-цитов в растворе Хенкса (В.Г. Бруслик, 1979). Диализирующий раствор состоит из клеточной взвеси, которая бралась из расчета 5 мг взвеси на 1 кг веса больного и раствор Хенкса в количестве 1,5 - 2,0 литров, глюкозы 40% - 20 мл. Раствор готовили со слабощелочной реакцией (РН-7,45-7,6). Клеточный диализ проводили, используя стандартные пластинчатые и капиллярные диализаторы с мембраной купрофан площадью 0,9 - 1,2 м2 и магистрали от аппарата "искусственная почка". Взвесь гепатоцитов в растворе Хенкса помещали в оксигенератор-перфузатор. Циркуляция крови по магистралям системы осуществлялась с помощью роликового мотора. Скорость кровотока составляла 50 - 100 мл/мин. Циркуляция биологической жидкости через диализатор осуществлялась противотоком с помощью воздушно пузырькового насоса. Биологическая жидкость в диализатор поступала капельно со скоростью 60 капель в мин. Скорость подачи кислорода - 4 литра в минуту. Давление в перфузаторе по контрольному манометру - 100 мм.рт.ст. (Д.В. Яншин, 1990) Подключение больного к системе проводили с использованием артерио-венозного шунта. Перед проведением процедуры больному в/в вводили 5000 ед. гепарина.

Однако при использовании вышеописанной методики интерпретация полученных результатов была затруднена, т.к. улучшение клинико-биохимических показателей у больных могло быть связано с гемоксигена-цией или влиянием диализирующей жидкости. В связи с этим у 20 больных подключение гепатоцитов проводили без использования дополшггель-ной оксигенации и в малом объёме разведения клеточной взвеси.При этом взвесь гепатоцитов в количестве 40 - 80 мл в среде 199 или раство-

ре Хенкса (100 ил) вводилась непосредственно п диализирующий контур диализатора. Аналогичную методику использовал в своих работах К.1Ч. Ма15штшга (1987).

При использовании обеих методик, время одного "клеточного диализа" составляло 1 час.

В том случае, когда у больного наряду с печеночной развивалась острая почечная недостаточность, гепатоциты подключали после проведения гемодиафпльтрацпп (ГДФ). При этом кровь больного продолжала циркулировать по системе АИП, подача диализирующего раствора отключалась, а гепатоциты помещались в диализирующнй контур. Такая методика позволяет использовать в один диализатор при проведении двух активных методов - ГДФ и КД.

У наблюдаемых больных было проведено 62 сеанса клеточных диализов в 1 группе и 54 сеанса во 2 группе. Клеточные диализы проводили через 24 - 48 часов. Количество сеансов у 1 больного составляло от 1 до 5 (в большинстве наблюдений 2-3 сеанса). Лечение с использованием гепатоцитов заканчивали при стойкой тенденции к разрешению ОПН (отсутствии энцефалопатии, снижении показателей билирубина, активности аминотрансфераз, повышении уровня протромбина).

Динамика клшшко-биохимическнх показателей у больных в ходе проведения "клеточных диализов"

Все исследованные больные имели развернутую картину ОПН, которая проявлялась нарушением основных функций печени. В наших исследованиях у 25% больных имелись признаки печеночной энцефалопатии 1 ст. - слабость, эмоциональная лабильность, инверсия сна. В 60% наблюдений у больных имелась энцефалопатия 2-3 ст., которая проявлялась в выраженной заторможенности, сонливости, либо наоборот в развитии психомоторного возбуждения, агрессивности, неадекватности. В 15% случаев больные находились в печеночной коме (энцефалопатия 4 ст.)

Через 2-12 часов после проведения процедуры "клеточных диализов" отмечалось уменьшение проявлений печеночной энцефалопатии. Улучшалось общее самочувствие, отмечалось прояснение сознания, адекватность поведенческих реакций. В некоторых случаях через 1-2 суток вновь наступало ухудшение состояния, появление энцефалопатии, что служило показанием к проведению повторных сеансов "клеточных диализов".

Однако у больных, находящихся в состоянии печеночной комы не было отмечено положительной психоневрологической динамики в большинстве наблюдений, как при использовании нативных, так и криокон-сервированных гепатоцитов. Применение другцх методов детоксикации также не было эффектнпным.Из шести четверо больных скончались на

фоне углубления печёночной комы, при явлениях острой сердечно-сосудистой недостаточности. Из этого следует, что применение клеточной терапии с использованием гепатоцнтов необходимо включать в комплекс де-токсикационных мероприятий на более ранних стадиях заболевания, чтобы предупредить развитие печеночной комы.

При ОПН токсического генеза желтуха носит паренхиматозный характер. В наших наблюдениях уровень прямого билирубина был повышен во всех исследованных группах и составил в среднем 301,96 ±33,0 мкмоль/л. Непрямой билирубин в исследованных группах был также повышен, однако не столь значительно, составляя в большинстве наблюдений 30 - 40% от содержания прямого билирубина.

Сразу после проведения КД с использованием криоконсервирован-ных геиатоцитов отмечалось снижение общего билирубина на 15%, в основном за счет непрямой его фракции (на 29%). Более выраженное снижение содержания билирубина отмечалось через 16 - 24 часа - на 42%, в одинаковом соотношении между прямой и непрямой его фракциями (табл. 4). По окончании курса КТ (1-4 сеанса) общий билирубин снижался на 72% (прямой на 70%) и составил 83,65 ± 8,9 мкмоль/л.

Одним из основных показателей активности патологического процесса в печени является цитолиз. У исследованных групп больных активность индикаторных ферментов была резко повышена. Так, активность AJIT повышалась в 10 - 20 раз, составляя и среднем 7,97 ± 1,009 мкмоль/ч.мл, ACT в 3 - 8 раз, что в среднем составило 2,69 ± 0,039 мкмоль/ч.мл, ЛДГ в 2,5 - 5 раз, средние значения составили 21,39 ± 2,139 мкмоль/с/л.

Непосредственно после проведения КД не происходило статистически достоверных изменений цитоплазматическнх ферментов. Через 24 часа только активность AJ1T снижалась на 24%. Статистически достоверное снижение активности ферментов отмечено через 2-3 суток после проведения "клеточного диализа": ACT на 26%, АЛТ на 37%, ЛДГ на 47% (табл. 4).

У 8 больных была исследована активность гаммаглутамнлтранс-пептлдазы (ГГТП) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Повышение активности ГГТП отмечено при цитолизе и холестазе. В наших исследованиях активность ГГТП повышалась в 3 - 8 раз, что в среднем составило 8,53 ± 0,2 мккат/л.

Снижение активности ГГТП происходило медленнее, чем снижение активности ACT, АЛТ и ЛДГ. Так, через 3 суток после проведения КД активность ГГТП снижалось на 16% и только через 7-8 суток отмечалось статистически достоверное уменьшение ее активности (на 51%).

Повышение активности ЩФ при заболеваниях печени чаще указывает на холестаз. Резкий подъем 1ЦФ возможен при массивных некрозах печени. Активность ЩФ в обследуемой группе больных была повышена в

Таблица 4

Изменение биохимических показателей в крови больных с ОПН при лечении с использованием криоконсервированных гепатоцитов

Показатели Исход 1-го "клеточного шализа"(КД] Конец 1-го КД 16 - 24 часа после 1-го КД Дсход 2-го КД (48 - 72 ч после 1-го КД) Конец 1-го КД 16-24 часа после 2-го КД Через 1 неделю Через 2 недели

Билирубин общий, мкмоль/л 301,9б±33,0 257,83±24,63 191,7+19,72* 175,95±б,61** 146,8±8,64** 133,5б±11,80** 83,65±9,62** 29,78±3,18**

Билирубин прямой, мкмоль/л 203,9±24,63 188,34+24,27 135,53±11,58* 130,53±11,5* 108,17+12,37 107,09±19,36 53,63±6,02** 20,53 ± 3,03**

ACT мкмоль/ч.мл АЛТ мкмоль/ч.мл лдг мкмоль/с/л 2,69±0,039 7,97±1,009 21,39+2,13! 2,49±0,371 7,84±0,995 19,71±1,63 2,337±0,634 6,118+0,631' 18,28±1,33 2,017±0,079 5,026±0,712' 11,39+1,46:?* I,982+0,227 : 4,383±0,165 II,26+1,3 I,48±0,276 3,928+0,706** II,5±1,0** 0,88±0,067** 1,806+0,181 10,8±0,884** 0,523+0,008** 0,668±0,08** 9,23±0,769**

*- различие достоверно относительно исхода 1 КД; **-различие достоверно относительно исхода 2 КД.

to

to ю

Изменение биохимических показателей в крови больных с О ГШ при лечении с использованием гепатоцптов, хранившихся при гипотермических температурах

Таблица 5

Показатели Исход 1-го "клеточного диалнза"(КД) Конец 1-го КД 16-24 часа после 2-го КД Исход 2-го КД (48 - 72 ч после 1-го КД) Конец 1-го КД 16-24 часа после 2-го КД Через 1 неделю Через 2 недели

Билирубин общий, мкмоль/л 140,09115,2 133121,87 126,56+23,6 130+19,76 106,7+18,3 98,3+8,64 70,41+10,78** 26.711,79**

Билирубин прямой, мкмоль/л 101,2+15,0 104111,59 90,7+10,3 95,4+13,49 90,1+10,4 70,3±8,8 48,54+3,05 ^ 16,9611,02**

ACT мкмоль/ч.мл 2,007±0,20 1,90910,114 1,8+0,196 1,76+0,24 1,6910,17 1,63+0,14 ) 1334+0,246 0,83010,018**

АЛТ мкмоль/ч.мл 5,41610,477 5,002+0,669 6,08510,796 5,2710,693 4,98+0,538 4,910,58 2,776+0,03** 1,275+0,119**

ЛДГ мкмоль/с/л 21,4613,473 23,05812,62< 22,9±2,7 22,113,83 21,9+2,02 21,6+2,97 16.3710,96 11,4+1,34**

*- различие достоверно относительно исхода 1 КД; """-различие достоверно относительно исхода 2 КД.

2 - 3,5 раза и состашша 5,85 ± 0,7 иккат/л.

Снижение данного показателя у больных происходило еще более медленно, чем ГГТП.

Так, спустя 12-14 дней после начала КТ активность ЩФ снижалась лишь на 38,5%, тогда как в эти сроки АСТ снижалась на 63,2%. AJIT на 77%, ГГТП на 76%. По-видимому, у больных с ОПН, развившейся вследствие отравления гепатотропными ядами, имеется тенденция к холестазу, который разрешается более медленно, чем ^политическим синдром.

Содержание общего белка у больных при поступлении составляло 55,5 ± 2,2 г/л, уровень альбуминов - 27,8 ± 2,8 г/л; А/Г коэффициент составлял в среднем 0,8 - 1,1. Однако в большинстве наблюдении мы не отмечали резкого снижения уровня альбумина, что, вероятно, связано с большим периодом его полураспада - 6 - 27 дней (А.И. Хазанов, 1988). После проведения КД уровень альбуминов возрастал на 19,8%. Однако оценить полученные данные сложно в связи с тем, что практически всем больным проводилось переливание белковых препаратов.

Известно, что печень является основным местом биосинтеза холестерина и плазмспных лнпопротсидоп. При этом' следует учитывать, что уровень холестерина снижается довольно медленно и поэтому при массивном некрозе печени гипохолестерпнемня нередко не успевает развиться. В исследованных группах уровень холестерина был снижен в 32% случаях (от 1,3 до 2,4 ммоль/л), в большинстве наблюдений (78%) отмечалось повышение уровня холестерина до 8,2 ммоль/л, что, вероятно, свидетельствует о пнутрипеченочном холестазе, т.к. известно, что при этом часто повышен уровень холестерина сыворотки кропи за счет индукции ферментных систем, продуцирующих холестерин.

Проведение КД не влияло на содержание в сыворотке крови холсс терина. Независимо от уровня холестерина при поступлении его показатели приходили к норме к 12 - 14-му дшо наблюдений.

Содержание (i-лнпопротеидоп находилось п пределах нормы во нее исследованные сроки.

В исследованных группах больных в большинстве случаях отмечались проявления ДВС синдрома: появление гематом в местах инъекций петехиальные кровозлияния, носовые и желудочно-кишечные кровотече ния. У умерших больных на аутопсии гемморагнчсский синдром прояв лялся множественными кровозлияними под плеврой, эпикардом, эндокардом, в слизистые дыхательных и мочевых путей, слизистых желудка и кн шечннка.

В наших исследованиях уровень протромбина был снижен в боль ишиствс количестве наблюдений и составлял в среднем 53,6 +1,9%. Пр1 этом максимальное снижение п группе выживших больных - до 27% среди умерших - 7%. Через 16 - 24 часа после проведения КД отмечална

тенденция к повышению протромбина, статистически достоверно уровень протромбина увеличивался через 48 - 72 часа после проведения метода -до 72,0 ± 2,2% (на 21 %).

Синтез мочевины относится к одной из самых устойчивых функций печени. В наших исследованиях мы также не отмечали снижения уровня мочевины, даже у больных погибших при явлениях нарастающей печеночной недостаточности. Однако, учитывая, что в 60% наблюдений у больных имелось сочетанное поражение печени и почек, возможно, снижение уровня мочевины в этих случаях нами не было зафиксировано из-за невозможности ее выведения почечным путем.

Уровень МСМ был повышен в большинстве наблюдений и составил: 1-я фракция 0,679 ± 0,02, 2-я фракция 0,856 ± 0,06. Известно, что 2-я фракция МСМ предложена для выявления фенолов, при прогнозировании печеночной недостаточности (В.В. Николайчик, 1989). После проведения клеточного диализа отмечалось некоторое снижение МСМ - 1-я фракция составила 0,604 ± 0,02, 2-я фракция - 0,740 ± 0,02. Через 24 часа после КД 1-я фракция вновь несколько повышалась (на 10%), а 2-я фракция продолжала снижаться и составила 0,714 ± 0,08 (на 17%). Возможно, что уменьшение проявления печеночной энцефалопатии при проведении "клеточных диализов" обусловлено снижением эндотоксикоза, оцениваемого по уровню средних молекул.

Нами были выявлены значительные нарушения гемодинамики печени у больных с ОПН как при исследовании данных вофаверднновой пробы, так и при инструментальных методах исследования - геиатогра-фии и УЗДГ.

Так, по данным вофаверднновой пробы, у больных отмечалось снижение печеночного кровотока (ПК) до 285 ± 33,4 мл/мин., замедление полупериода выведения (Тш) до 16,5 ± 2,3 мл/мин. Через 16 - 24 часа отмечалось улучшение ПК в 1,5 раза. Т1/2 увеличивался в 2 раза на 3 сутки после проведения КД. Улучшение печеночного кровотока по данным ге-патографии и УЗДГ происходило более медленно. До начала лечения отмечалось повышение индекса резистентности (Ш)1 на общей печёночной артерии (ОПА) до 0,82 ± 0,02. Индекс резистентности на ОПА снижался на 25% через 3 недели после начала лечения, тогда как основные биохимические показатели в эти сроки приближались к границам нормы.

Морфологическая картина органа по данным сцинтиграфии печени и УЗИ также оставалась без значительных изменений до 12 - 14 дня исследований.

В связи с этим, для динамической оценки эффективности клеточной терапии, более информативными являются клннико-биохимические показатели, т.к. нормализация данных, определяемых при раднонзотопных и УЗИ исследованиях, происходит более медленно.

Применение метода экстракорпорального подключения геиатоцн-тов через полупроницаемую мембрану у больных показало его эффективность и целесообразность включения в комплекс активных методов детоксикации.

150*

%

100

50

3 сутки 7-8 сутки 12-14 сутки 21 сутки

I 3 группа

группа

2 группа

Рнс.2 Сравнительная динамика показателей общего билирубина 1,2 групп больных п контроля (3 группа)

%

140| 120 100 80 60 40 20 0

3 сутки 7-8 сутки 12-14 сутки 21 сутки 1 Группа [ЯЩ 2 Группа Н 3 Группа

Рис.З Сравнительная динамики яктипиостн ACT 1, 2 групп больных и контроля (3 I руина)

%

3 сутки 7-8 сутки 12-14 сутки 21 сутки 1 Группа И 2 Группа В 3 Группа

Рис.4 Срашштслышя динамика активности АЛТ 1,2 групп больных и контроля (3 группа)

%

100 80 60 40 20 О

3 сутки 7-8 сутки 12-14 сутки 21 сутки ИЗ 1 Группа И 2 Группа ■ 3 Группа

1'нс.5 Сравнительная динамика актнинисти ЛДГ 1,2 групп больных и контроля (3 группа)

Таблица ()

Летальность больных с острой печеночной недостаточностью_

1 группа 2 группа 3 группа

Нозологические формы Кол-во больных Из них умерло Летальность, % Кол-во больных Из них умерло Летальность, % Кол-по больных Из них умерло Летальность, %

Отравление CCI, 14 3 21,4 15 6 40 11 6 45,5

Отрап-лсиие дихлорэтаном 4 1 25 3 1 33 7 3 42,9

Отравление ядопи-тыми грибами 8 1 12,5 6 2 33 14 6 42,9

ИТОГО 26 5 19,2 24 9 37,5 32 15 46,9

Таблица 7

_Средняя продолжительность пребывания больных в стационаре_

Тяжесть гепатопатии _Группа больных_

1 группа 2 группа 3 группа

Гепатопатия 2 ст. 19,3 ±2,5 21,4 ± 3,2 25,3 + 2,3

Гспатонатия 3 ст. 31,1 ±4,5 34,6 ± 5,4 39,3 + 4,1

ИТОГО 25,2 ± 3,3 28,0 ±3,1 32,3 ±2,7

В группе больных, где проводились клеточные диализы отмечено более выраженные снижение основных биохимических показателей (билирубина, ЛСТ, АЛТ, ЛДГ) во все исследованные сроки (рис. 2 - 5).

Применение КД с использованием криоконсервированных гепатоцн-тов позволило снизить летальность на 27,7% относительно контрольной группы, где КД не применялись (табл. 6). Использование данного метод;' лечения приводит также к уменьшению длительности пребывания больных в стационаре как больных со среднетяжелой, так и тяжелой степенью гепатопатии - на 22% относительно контрольной группы (табл. 7).

При сравнении эффективности использования гепатоцитов, хра пившихся при гипотермических температурах и криоконсервированных оказалось, что применение последних более эффективно. При исполью вашш криоконсервированных клеток отмечалась (по данным биохимических анализов) более выраженная тенденция к восстановлению функцш печени (табл. 4, 5). Летальность в группе, где использовались криокоп сервированные гепатоцигы была ниже на 18,3%. Длительность пребыва ния больных в стационаре при этом меньше на 10%. (табл. 6, 7).

На основании анализа проведённой экспериментальной работы п< использованию нативных и криоконсервированных биосубстратов печет и описанных клинических наблюдений, выдвинуто несколько гипотез дл объяснения этого факта.

В 1 группе больных наряду с гепатоцитами взрослых доноров у < больных (23%) использовались гепатоциты плода человека поздних сро ков развития. Во всех наблюдениях отмечена положительная динамик; которая выражалась как в уменьшении печёночной энцефалопатии, rai и в улучшении биохимических показателей. В некоторых случаях отме чалась более выраженная тенденция к их нормализации, чем при исполь зовании клеток взрослых допоров.

Однако незначительное количество наблюдений не позволяет ечн тать это предположение доказанным.

При гипотермическом хранении клеток активация процессов ПОЛ фосфолипазы А и др. индуцирует необратимые повреждения в гепатоцп тах. Высвобождающиеся эндогенные протеазы могут повреждать факто ры стимуляции пролиферации гепатоцитов (ФСПГ). В тоже время пр глубоком замораживании эти процессы приостанавливаются. Повреждение клеток происходит только в процессе замораживания и отогрева. Пр* проведении клеточных диализов низко и среднемолекулярные ФСПГ мо гут проходить через полупроницаемую мембрану и влиять на процеса регенерации в печени больного.

В наших исследованиях наиболее выраженное снижение биохимп ческих показателей отмечалось через 2-3 суток после подключения гс патоцитов (что отмечалось и другими авторами (НЛО. Корухов, 1989) что косвенно подтверждает вышеизложенный механизм.

В настоящее время механизм действия гепатоцитов, применяемы при лечении печеночной недостаточности, нельзя считать выясненньн окончательно.

Ряд авторов (В.Г. Бруслик, 1978; И.И. Шиманко, 1982 и др.) пола гает, что лечебный эффект в основном связан с органозамещающе функцией. Такой механизм преобладает, по всей вероятности, при не пользовании клеток с высокой степенью жизнеспособности в система? где созданы условия для их длительного функционирования (Bioartificis liver) (A. Demilrou, 1994; L. Podesta, 1994; С. Chen et al., 1995).

С другой стороны, имеются материалы, показывающие, что гена тоциты способны оказывать стимулирующее действие на собственную печень больного, причем для последнего не обязательно применение гепа тоцитоп с высокой степенью жизнеспособнос ти.

Предположительные механизмы положительного действия гепато Питов при использовании через полупроницаемую мембрану, представлены на схеме.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что коррекция ОПН может реализовываться двумя путями: 1) за счет увеличения скорости регенераторных процессов; 2) путем временного замещения функций пораженного органа с использованием различных методов, которое включает детоксикацпонные мероприятия и поддержание секреторной функции.

Схем;!

Иозможпыс причины положительного действия изолированных гепатоцитов на организм больного при проведении "клеточных диализов"

выводы

1. Использование 2-этапной программы замораживания и введение в среду консервации 10% днмексида позволяет сохранить органоспецпфп-ческие функции на этапе деконсервации.

2. Применение метода криоконсервации гепатоцитов позволяет создать банк клеток, использовать гепатоциты как в экстренном, так и в плановом порядке.

3. Хранящиеся в низкотемпературном банке гепатоциты возможно транспортировать на большие расстояния, что особенно актуально при необходимости их использования в случае массового отравления гепатот-ропными ядами.

4. У больных с ОПН токсического генеза использование гепатоцитов аллогенной печени человека разного уровня онтогенетического развития (печень плода человека к взрослых доноров) сопровождается положительной динамикой клинико-баохимических показателей, способствует уменьшению проявлений гепатоцеребральной недостаточночти, предупреждает развитие печеночной комы.

5. Включение "клеточных диализов" с крноконсервированными ге-патоцитами в комплекс активных методов детоксикации позволяет значительно снизить летальность (на 27,7%) у больных с ОПН и сократить время пребывания их в стационаре.

6. Использование гепатоцитов в виде деконсервированного препарата после субнулевого (-196"С) хранения в криобанке, более эффективно, чем после непродолжительного гнпотермического хранения (от 1 до 10 дней).

7. В эксперименте на животных показано, что для лечения ОПП возможно применение не только гепатоцитов, но и других биосубстратов печени, при этом наиболее эффективно использование деконсервирован-ной цнтзольной фракции из печени плода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При криоконсервации изолированных гепатоцитов в криобанке клинического назначения рекомендовано использовать двухэтапный режим замораживания и среду, содержащую 10% димексид.

2. Определение белоксинтетической способности гепатоцитов рекомендуется в качестве наиболее адекватного метода тестирования функционально-метаболической активности на этапе выделения и деконсервации, как интегрального показателя жизнеспособности.

3. В качестве биосорбента и стимуляции,восстановительных процессов в печени реципиента можно использовать гепатоциты различной

степени жизнеспособности.

4. У больных с гспатопатией 3-й степени необходимо применять гепатоциты в комплексе с другими активными методами детокснкацни (внутрипортальное введение лекарственных средств, дренирование грудного лимфатического протока, плазмаферез). Сочетание активных методов детокснкацни определяется индивидуально в каждом конкретном случае.

5. Клеточные диализы рекомендуется проводить через 24 - 48 часов до стойкой тенденции к разрешению ОПН (снижение билирубина, ци-топлазматпческих ферментов, повышение уровня протромбина, отсутствие энцефалопатии).

6. При сохраняющейся энцефалопатии (более 12 часов после подключения гепатоцитоп) возможно ежедневное подключение гепатоцитов.

7. Противопоказанием к экстракорпоральному подключению гепатоцитов является нестабильная гемодинамика, признаки желудочно-кишечного кровотечения.

Список работ, опубликованных по теме дисертации

1. Использование аллогенных клеток печени в комплексном лечении эндотоксикозои. Соавт. В.В. Бочкарников.//Сб. "Острые токсикозы в клинической практике". Баку, 1989. С. 85 - 86.

2. Оценка клинической значимости определения уровня плазменного фибронектина при острых токсических поражениях. Соавт. И.И. Ши-манко, А.А. Назаренко, Г.И. Цепляева и др.//"Вестник Академии наук" -№ 3, 1990. С. 37 - 39.

3. Эффективность использования крноконсервнрованных гепатоцц-тов у больных с острой и хронической почечно-печеночной недостаточностью. Соавт. И.И. Шиманко, Н.В. Васина.//Сб. "Успехи современной криобиологии", 1992. С. 204.

4. Isolated hepotocytes banquiiig and firs I results of Iheir clinical aplication. V. Toschhakov, N. Subbota, A. Sukoch.//Theoretical basis of cryoprcservation, - Hradec Kralove, Crech and Slovak Federal Republic, 1992. p. 18.

5. Применение изолированных клеток печени у хирургических больных с печеночной недостаточностью. Соавт. Н.В. Васина.//Сб. "Хо-летиаз и его осложнения". Киев, 1993, С. 30.

6. Детоксикация гепатоцигами при неотложных состояниях. Соавт. Н.П. Суббога .//Сб. "Экстренная помощь при неотложных состояниях". Одесса, 1993, С. 95.

7. Experiens with using cryopreserved hcpatocytes in treatment of patients hepatic insuficiency. N.V. Vasina, N.B. Subbota, V.G. Bruslik.//l;iternational Conference "Gastroenterology - 93". London. 1993, p.43.

8. On mechanism of action of hepatocyte transplants. A. Mitin.//Interna-tional Conference "Gastroenterology - 93". London. 1993, p.49.

9. Применение клеточного диализа в лечении больных эндотокси-козом. Н.В. Васина, И.И. Шиманко, В.Г. Бруслик.//Сб. "Эндогенные интоксикации". СПб, 1994, С. 130.

10. Прогностическое значение определения плазменного фибронектина и церулоплазмина при эндотоксикозе. Соавт. А.А. Назаренко, А.А. Ярмагометов, Н.П. Кузьмина.//Сб. "Эндогенные интоксикации". СПб, 1994, С. 80.

11. Cellulat dialisis in endotoxicosis. N.P. Subbola.//Proecedings I International Congress on Biological Medicins.. Israel, Tel-Aviv, 1994, p. 51.

12. Applications of cryopreserved alloohepatocytcs fixed on a semipermeable membrane for organim deloxicalion. N.P. Subbota, V.I. Grishenko.//Dat;i Medica Journal. Vol. 2, № 2, 1995, pp.42 - 46.

13. "Клеточный диализ" с использованием крноконсервнрованных генатоцнтов как метод лечения печеночной недостаточности. Соавт

Н.П. Суббота, Н.В. Васина, Л.С. Мнтин.//Тсз. Моск. конф. по гемафс рсзу, 1995, С. 73.

14. Возможности использования лнофнлизированных клеток печет в лечении печеночной недостаточности. Соавт. Н.В. Васина, J1.B. Глад ких, И.И. Шиманко.//Тсз. Моск. конф. по гемаферезу, 1995, С. 79.

15. Extracorporal dialysis using cryohcpalocilcs - a new efficient melhot for rendering urgent detoxication therapy during acute hcpatic insufficiency S.G. Musselius, I.V. Alexandrova, N.V. Vasina el al.//8th European Congrcs of intensive care medicine. Alliens - Greecc, 1995.

16. Intensive mcdical aid using ccllulatsortional method of detoxication N.P. Subbota.//8th European Congress of intensive care mcdicine. Athens Grcccc, 1995.

17. On the Mechanism of action of implanted cryoprcscrved hepatocylcs A. Mitin, N. Subbota.//32lh the Annuai Meeting "Cryo-95", USA, 1995, p. 49

18. New sorptional - ccllular Method of intensive therapy. N.P. Subbotn

A.V. Bercsncv, A.N. Veligotsky.//24th Central Europcu Congress on Ancstcsio logy Austria Center, Viena, 1995, p. 192.

19. Применение гепатоцигов при токсическом поражении печени Соавт. С.Г. Мусселиус, И.В. Александрова, Н.П. Суббота и др.//Росс журнал гастроэнтерологии, гепатологни, колопроктологни, № 3, Т. 5 1995, С. 161.

20. К механизму действия имплантированных гепатоцптов при экс периментальной острой печеночной недостаточности. Соавт. А.С. Мигни Н.П. Суббота.//Росс. журнал гастроэнтерологии, гепатологни, колопрок тологии, № 3, Т. 5, 1995, С. 157.

21. Клеточно-сорбционный метод лечения больных с эндотокепко зами. Соавт. Н.П. Суббота, А.В. Велнгоцкий, А.В. Берсснев.//СО "Сорбциоиная детоксикация внутренних сред организма". Новосибирск 1995, С. 48 -52;

22. Применение изолированных клеток печени с целыо лечени больных с печеночной недостаточностью различного генеза. Соавт. И.И Шиманко, Н.П. Суббота, Н.В. Васина.//Проблемы криобиологии, № 2 1995, С. 49 - 51.

23. Использование гепатоцитов в лечении больных с механическо! желтухой в пред- и послеоперационном периоде. Соавт. Н.В. Васинл

B.Г. Бруслик, А.С. Митин.//Сб. трудов I Международного конгресса хп рургов, Москва, 1995, С. 335 - 336.

24. The using of isolated hepatocylcs in acutc complex therapy of hepati falure. S.G. Musselius, I.V. Alexandrova, N.V. Vasina.//The International Join nal of Artifical Organs. Vol. 18, 1995, p. 463.