Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Саногенез печеночной недостаточности под влиянием ксенотрансплантации клеток печени и селезенки

На правах рукописи

ЛЕПЕХОВА Светлана Александровна

САНОГЕНЕЗ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПОД ВЛИЯНИЕМ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ

КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ИТЕЛЕЗЕНКИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

004607169

Иркутск-2010

004607109

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН (г. Иркутск)

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Апарцин Константин Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Константинов Юрий Михайлович

доктор медицинских наук, профессор

Пивоваров Юрий Иванович

доктор медицинских наук, профессор

Бенеманский Виктор Викторович

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

ционного совета Д 001.038.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН.

Защита состоится «24» сентября 2010 года в

часов на заседании диссерта-

Автореферат разослан «

»

2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Процессы восстановления утраченных функций печени под воздействием ксенотрансплантации культур клеток до настоящего времени остаются недостаточно изученными. В медицине используются свиные ткани, в том числе биоискусственные системы при различных вариантах печеночной недостаточности (Онищенко Н.А. с соавт., 1999; Соловьев В.В., 2001), трансплантация островков Лангерганса - при лечении сахарного диабета (Aoki T. et al., 2005; Шумаков В.И. с соавт., 2006). Предлагается использовать ксенотрансплантацию гепатоцитов в качестве временной меры перед аллотрансплантацией печени (Ise A. et al., 2004; Aoki T. et al., 2005; Fiegel H.C. et al., 2008; Weber A. et al., 2009).

Известно применение ксеноселезенки для лечения больных с иммунными нарушениями (Цыпин А.Б., 1980; Бородин Ю.И., 1998) и в условиях хирургической инфекции (Чикаев В.Ф. с соавт., 2000), причем лечебное воздействие объясняется эффектами биологически активных веществ ксеноселезенки и непосредственным воздействием живых клеток (Цыпин А.Б. с соавт., 1992; Бородин Ю.И. с соавт., 1999). Известны саногенные эффекты воздействия ксенотрансплантации культуры клеток селезенки при постспленэктомическом гипоспленизме (Апарцин К.А., 2001).

Литературные данные свидетельствуют о том, что клетки, выделенные из органа, сохраняют функциональные свойства и характерную структуру (Гальперин Э.И., 1978; Van de Kerkhove М.Р., 2004; Castell J.V. et al., 2009).

До настоящего времени разрабатываются технологии выделения (Gourlay WA. et al., 1999; Рябинин В.Е., 2002; Castell J.V. et al., 2009), культивирования и криокон-сервации (Wang S.Y. et al., 1998; Лебединский A.C. с соавт., 2003; КолокольцоваТ.Д„ 2008) клеток печени и селезенки, дискутируются оптимальные способы их введения в организм реципиента (Ota H. et al., 1997; Кузнецов С.И., 1997; Мамхегова Т.Р., 1998; Sgroi A. et al., 2009).

Известно, что трансплантированные изолированные гепатоциты не столько увеличивают функционирующую массу печени, сколько изменяют гуморальные и молекулярные механизмы, отвечающие за активацию функций оставшихся гепатоцитов реципиента и регенерацию путем выработки регуляторных пептидов, среди которых ведущая роль принадлежит факторам роста (Shimizu M. et al., 2001; Liu K.X. et al., 2009). Среди известных факторов роста выделяют один, обладающий наиболее выраженным мнтогенным эффектом на гепашциты - фактор роста гепатоцитов. Ответственными за выработку этого фактора являются клетки Ито, а также эндотелиальные и купферовские клетки печени, ретикулярные клетки селезенки. Эмбриональная ткань печени содержит большое количество фактора роста гепатоцитов и его рецепторов; гепатоциты зародыша в первом триместре развития активно отвечают на стимуляцию фактором роста гепатоцитов (Yamaguchi Y. et al., 1997; Shikanai M. et al., 2009).

Спектр эффектов фактора роста гепатоцитов многообразен. Прежде всего, это модулятор митогенеза гепатоцитов; показана стимуляция активности других эпителиальных клеток, эндотелия. Воздействие этого фактора обеспечивает рост

и регенерацию не только печени, но других органов — почек, легких, кожи. Существуют прямые указания на протекторное воздействие фактора роста гепатоцитов на клетки печени при остром токсическом повреждении, индуцированном ЧХУ, а также улучшение конъюгации билирубина и транспорта желчи (Wolf Н.К., Michalopoulos G.K., 1992; Ido A. et al., 2008). Кроме стимуляции митогенеза, он способен вызывать миграцию эпителиальных клеток, стимулировать морфогенез (Miki С. et al., 1999; Li Z. et al., 2007).

Таким образом, выяснение механизмов саногенеза представляется ключевым для понимания эффектов трансплантации клеток.

Цель исследования: определить закономерности развития и саногенетические механизмы острой печеночной недостаточности под влиянием ксенотрансплантации культуры клеток печени и селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Разработать технологию получения ассоциированной культуры клеток печени или селезенки свиньи с высоким показателем жизнеспособности после длительной криоконсервации.

2. Исследовать закономерности продукции фактора роста гепатоцитов эмбриональными и неонатальными клетками печени или селезенки свиньи в динамике культивирования.

3. Оценить жизнеспособность и иммуногенность криоконсервированной культуры клеток печени или селезенки свиньи при подкожной трансплантации крысе на модели острой печеночной недостаточности, вызванной острым токсическим повреждением, обширной резекцией или воспалительным повреждением вследствие аспленизации.

4. Исследовать эффекты ксенотрансплантации культуры клеток печени или селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов на течение печеночной недостаточности, вызванной острым токсическим повреждением.

5. Раскрыть механизмы саногенеза и стимуляции митогенной активности гепатоцитов под воздействием ксенотрансплантации клеток печени или селезенки в условиях острой пострезекционной печеночной недостаточности.

6. Раскрыть патогенетические механизмы формирования печеночной недостаточности вследствие воспалительного повреждения печени, индуцированного аспленизацией и на этой модели оценить эффективность ксенотрансплантации клеток печени или селезенки.

7. Существенно расширить концепцию саногенеза острой печеночной недостаточности под воздействием ксенотрансплантации клеток печени или селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов.

Научная новизна

Установлена высокая эффективность разработанной технологии выделения, культивирования и криоконсервации эмбриональных и неонатальных клеток печени

и селезенки свиньи, обеспечивающая высокую жизнеспособность полученного материала после длительного (до 6 месяцев) хранения.

Приготовление клеточных ассоциатов в процессе культивирования позволяет воссоздать микроэкологию печени in vitro и повышает функционирование ассоциатов после трансплантации реципиенту.

Впервые выявлена продукция фактора роста гепатоцитов в процессе культивирования ассоциированных клеток печени или селезенки. Динамика концентрации фактора роста гепатоцитов в культуральной среде положена в основу способа оценки жизнеспособности клеточного материала. Доказано, что уровень фактора роста гепатоцитов в культуре клеток селезенки выше, чем в культуре клеток печени.

В эксперименте на крысах породы Вистар описана острая печеночная недостаточность на фоне воспалительного повреждения печени, вызванного асплени-зацией, и на этой модели выявлена эффективность коррекции с помощью ксено-трансплантации культуры клеток печени, а также культуры клеток селезенки.

Получено подтверждение гипотезы, согласно которой эффекты ксенотран-сплантации клеток печени и селезенки совпадают с эффектами фактора роста гепатоцитов при острой печеночной недостаточности. В рамках этой гипотезы экспериментально установлена эффективность коррекции печеночной недостаточности токсического и воспалительного генеза с помощью ксенотрансплантации культуры клеток селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов.

Разработана концепция саногенеза острой печеночной недостаточности под воздействием ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток печени и селезенки — продуцентов фактора роста гепатоцитов. Установлена саногенети-ческая роль воздействия повышенных концентраций фактора роста гепатоцитов, вырабатываемого перенесенным материалом, что дополняет метаболическую активность пересаженных органоспецифических клеток при печеночной недостаточности на фоне острого токсического или воспалительного повреждения печени.

Выявленные закономерности положены в основу алгоритма коррекции острой печеночной недостаточности клетками печени и селезенки в зависимости от ее генеза.

Практическая значимость работы

Разработана технология забора, выделения и культивирования эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки, позволяющая получать криоконсер-вированный материал с высокой степенью жизнеспособности и продукцией HGF после подготовки к трансплантации.

Предложены оригинальные среды для криоконсервации культур эмбриональных клеток печени и селезенки («Среда для консервации клеток печени», патент РФ № 2161198, дата получения 15.01.2001 г.; «Среда для криоконсервации клеток селезенки», патент РФ № 2194753, дата получения 08.01.2001 г.). Разработан оригинальный подход в оценке жизнеспособности культивируемого материала («Способ оценки жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени», патент РФ № 2366704, дата получения 10.09.2009 г.).

Показана целесообразность использования при лечении острой печеночной недостаточности клеточных ассоциатов, обладающих выраженной биорегулятор-ной активностью.

Для изучения роли бактериальной транслокации методом динамической и статической сцинтиграфии в патогенезе повреждения печени после апленизации, разработан способ маркировки бактерии Е. coli 99mTc («Способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфических исследований» патент РФ № 2290643, дата получения 27.12.2006 г.).

Новая концепция печеночной недостаточности при постспленэктомическом гипоспленизме позволила разработать патогенетически обоснованный метод коррекции в эксперименте.

Предложен оригинальный способ коррекции пострезекционной печеночной недостаточности («Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте», патент РФ № 2232550, дата получения 20.07.2004 г.).

Разработанные технологии позволили снизить летальность при ОПН различного генеза в эксперименте. При 90% резекции печени уровень летальности снижен со 100 до 56,6 %, при токсическом повреждении - до 36,7 %, при постспленэкто-мической ОПН - со 100 до 23,3 %.

Дано экспериментальное обоснование и доказана эффективность ксенотран-сплантации криоконсервированной культуры клеток селезенки, криоконсерви-рованной культуры эмбриональных клеток печени и неонатальных гепатоцитов свиньи при острой печеночной недостаточности в зависимости от ее генеза.

Внедрение в практику

Разработанные технологии забора, выделения, культивации и криоконсервации эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки, позволяющие получать клеточный материал с высокой степенью жизнеспособности после подготовки к трансплантации, внедрены в научном отделе экспериментальной хирургии с виварием НЦРВХ СО РАМН.

Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургии Иркутского государственного медицинского университета, Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН и биолого-почвенного факультета Иркутского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Продукция фактора роста гепатоцитов в среду культивации является критерием эффективности выделения и культивирования эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки свиньи, позволяющих получить высоко жизнеспособный криоконсервированный материал для ксенотрансплантации.

2. Аспленизация животных сопровождается развитием острой печеночной недостаточности воспалительного генеза.

3. Ксенотрансплантация криоконсервированной культуры клеток, продуцирующих фактор роста гепатоцитов в организме донора, - эффективный метод коррекции острой печеночной недостаточности токсического и воспалительного генеза.

4. Саногенетические механизмы воздействия ксенотрансплантации криокон-сервированной культуры клеток печени и селезенки зависят от генеза печеночной недостаточности и связаны с одной стороны с уровнем продукции перенесенными клетками фактора роста гепатоцитов, с другой - с их протективной функцией.

Апробация работы

Материалы исследования были представлены на Всероссийской конференции «Реконструкция - основа современной хирургии» (Москва, 1999), Международном съезде гастроэнтерологов «GASTRO-99» (Vancouver, Canada, 1999), 9-м международном конгрессе гастрохирургов (Nagasaki, Japan, 1999), Всероссийской конференции «Новые направления в клинической медицине» (Ленинск-Кузнецкий, 2000), межрегиональной научно-практической конференции «Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии» (Омск, 2000), Международном симпозиуме «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии» (Новосибирск, 2000), Общероссийской конференции с международным участием «Проблемы морфологии: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2002), XII Всероссийской научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2004), Всероссийской научной конференции «Восстановительные и органосохраняющие технологии - главный путь развития хирургии XXI века» (Москва, 2004), III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004), VI Международном конгрессе «Науки о человеке» (Томск, 2005), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), XIII научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2005), Научно-практической конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005), XII Международной конференции хирургов-гепатологов стран СНГ и X научно-практической конференции «Вахидовские чтения — 2005» «Актуальные проблемы хирургической гелатологии» (Ташкент, Узбекистан, 2005), научно-практической конференции «Высокотехнологические методы диагностики и лечения в абдоминальной хирургии - проблемы визуализации» (Москва, 2006), XIII Международной конференции хирургов-гепатологов стран СНГ (Алматы, Казахстан, 2006), Международной медицинской научной конференции между Автономной Республикой Внутренней Монголией КНР и Республикой Бурятия РФ: (Маньчжурия, Китай, 2007), VII Всероссийской научно-практической конференции РАСХИ (Москва, 2008).

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета НЦРВХ СО РАМН (сентябрь, 2006). По материалам диссертационного исследования опубликована 55 работа, в т.ч. 24 статьи в рецензируемых журналах, 2 монографии (в соавторстве), 5 патентов на изобретения Российской Федерации. В работах изложены основные положения диссертации.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, четырех глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы.

Текст изложен на 278 страницах, иллюстрирован 58 таблицами и 71 рисунком. Библиография включает 511 источников, из них 141 отечественный и 370 - иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика экспериментального материала и методов

исследования

Все исследования выполнены на базе научного отдела экспериментальной хирургии с виварием Учреждения Российской академии медицинских наук Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН (директор -член-корр. РАМН, профессор Е,Г. Григорьев).

В процессе выполнения работы были проведены два раздела экспериментов. В первый вошли 3 серии стендовых исследований in vitro с применением клеток печени и селезенки (л = 970). Во втором разделе выполнены 3 серии экспериментов in vivo с использованием белых крыс породы Wistar (п = 1171).

Для получения НГ, НКС и ККС использовали печень и селезенку новорожденных (до первого кормления) свиней породы Белая русская (п = 350). Культуру эмбриональных клеток печени (ККП) получали от плодов свиньи 2-2,5-месячного срока внутриутробного развития. Заготовку биоматериала проводили под внутримышечным наркозом по методике Г. Старке (1970) в стерильных условиях.

В первой серии стендовых экспериментов (и = 138) разрабатывали метод выделения клеток печени и селезенки. Эффективность технологий оценивали по известным критериям -жизнеспособность и относительное количество клеточного материала, получаемое из единицы массы донорской ткани. Во второй серии (и = 520) подбирали оптимальные условия для культивирования клеток печени и селезенки с изучением жизнеспособности клеток, пролиферативной активности и уровней альбумина (клетки печени), HGF, выполняли гистологические и цитологические исследования. Для определения оптимальной величины рН среды для культивирования к 0,2 мл клеточной взвеси, полученной комбинированным методом дезагрегации, добавляли 1 мл среды RPMI с исходным показателем рН от 6,8 до 8,2 (закисление среды проводили с помощью цитрата, ощелачивание - добавлением 0,1N NaOH). Инкубировали культуру в течение 1 ч при температуре 37 °С, после чего повторно измеряли величину рН среды и подсчитывали жизнеспособность клеток. В третьей серии экспериментов in vitro разрабатывали метод криоконсервации клеток печени и селезенки с изучением жизнеспособности клеток, величины рН среды криоконсервации, выполняли гистологические и цитологические исследования.

Клетки получали комбинированным методом дезагрегации, за основу был взят метод М. Berry (1969). Органы инфильтрировали раствором коллагеназы (2,5 мг /1 г массы). После этого органы механически измельчали до получения фрагментов 0,05-0,1 мм, удаляли соединительнотканные элементы. Проводили очистку в фи-колловом градиенте. Добивались удаления клеточного детрита, элементов крови, гемопоэтических клеток эмбриональной печени, крупных фрагментов. Взвесь 8

микрофрагментов отмывали средой RPMI. Посчет клеток проводили с помощью теста на исключение красителя с использованием камеры Фукса-Розенталя.

Культивирование выделенных клеток (ККП, ККС) проводили в матрацах Ру с использованием стандартных питательных сред и добавок («Панэко», Россия) по методу Р. Фрешни (1989). Пролиферативную активность культивируемых клеток оценивали по митотическому индексу, который рассчитывали по количеству клеток, находящихся в различных стадиях митоза (из расчета на 1000 клеток) к общему количеству клеток.

Функциональную активность клеток оценивали по уровню альбумина в среде культивирования клеток печени и величине HGF в среде культивирования клеток печени и селезенки («Способ оценки жизнеспособности культивируемых эм-бриональных клеток печени», патент РФ № 2366704, дата получения 10.09.2009 г.).

Для снятия культуры клеток со стенок посуды применяли версен 0,2 г/л раствора Хенкса по методике Р. Адамса (1983). Полученные клетки центрифугировали, после удаления надосадочной жидкости в клеточную взвесь добавляли среду консервации, приготовленную по оригинальной прописи («Среда для консервации клеток печени», патент РФ № 2161198; «Среда для консервации клеток селезенки», патент РФ № 2194753) до концентрации 0,5-2,0 х 10б клеток в 1 мл суспензии. Полученную суспензию клеток разливали по полиэтиленовым ампулам объемом 4,5 мл. Охлаждение материала проводили поэтапным методом по методике М.С. Маргулиса (1992).

Консервированные клетки хранили при температуре -70 °С в течение 3-6 мес. Для КТ использовали клетки, консервированные от 5 сут. до 1 мес., а материал, сохраненный в течение 6 мес., исследовали для сравнительной оценки жизнеспособности клеток. Ампулы с клетками отогревали на водяной бане при температуре 41 °С. Для ксенотрансплантации использовали клетки с содержанием не менее 85 % жизнеспособных клеток.

Общая характеристика экспериментального материала /и vivo

Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище в соответствии с нормативами ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (виварий I категории, вет. удостоверение 238 № 0015220 от 25 марта 2009 г, служба ветеринарии Иркутской области). В эксперимент включали крыс-самцов породы Вистар в возрасте не менее 6 месяцев весом 200-250 г. Опыты на животных выполнялись в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР № 742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных», а также основывались на положениях Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.

Для исследования закономерностей развития острой печеночной недостаточности, индуцированной токсическим повреждением под влиянием ксенотрансплантации клеток печени и селезенки, проведена 1-я серия экспериментов (и = 365). Моделиро-

вали острое токсическое повреждение печени путем подкожного введения чистого СС14 для анализов из расчета 0,5 мг/ 100 г массы животного по А. Фишеру (1961).

Через сутки после индукции ОТП животных относили к экспериментальным группам методом случайного распределения. Отправной точкой эксперимента было введение крысам препарата, определяющего в дальнейшем их групповую принадлежность. Проведено исследование летальности, показателей гомеостаза(масса печени, биохимические тесты, оценка системы гемостаза, ОАК, иммунологические тесты) анализ количества МОР и морфологии печени под влиянием КТ криоконсервирован-ной культуры эмбриональных клеток свиной печени (1.1), КТ криоконсервирован-ных НГ (1.2), введения физиологического раствора (1.3), лекарственного препарата гептрал (1.4) и питательной среды для культивирования клеток печени (1.5).

Распределение животных на группы в зависимости от характера воздействия представлено в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика экспериментальных групп

№ п/п Характер воздействия Кол-во животных

Острое токсическое повреждение печени

1.1 Подкожная инъекция 2 * 10° (1 мл) криоконсервированной ККП 50

1.2 Подкожная инъекция 2 * 10" (1 мл) криоконсервированных НГ 50

1.3 Подкожная инъекция 1 мл физиологического раствора 50

1.4 Подкожная инъекция 0,5 мл гептрала 50

1.5 Подкожная инъекция 1 мл питательной среды 50

1.6 Подкожная инъекция 0,3 мл (200 нг) НвР 50

1.7 Подкожная инъекция 2 х 10° (1 мл) криоконсервированной ККС 50

1.8 Внутривенная инъекция 0,5 мл антител к НвР 15

Резекция 70 % печени

2.1 Подкожная инъекция 2 х 10° (1 мл) криоконсервированной ККП 50

2.2 Подкожная инъекция 2 * 10" (1 мл) криоконсервированных НГ 50

2.3 Подкожная инъекция 1 мл физиологического раствора 50

2.4 Подкожная инъекция 0,5 мл гептрала 50

2.5 Подкожная инъекция 1 мл питательной среды 30

2.6 Подкожная инъекция 0,3 мл (200 нг) НвР 50 •

2.7 Подкожная инъекция 2 * 10" (1 мл) криоконсервированной ККС 30

Резекция 90 % печени

2.8 Подкожная инъекция 2 * 10" (1 мл) криоконсервированной ККП за 2 сут. до и во время 90% резекции 50

2.9 Подкожная инъекция 2 х ю" (1 мл) криоконсервированных НГ за 2 сут. до и во время 90% резекции 50

2.10 Подкожная инъекция 1 мл физиологического раствора 70

Спленэктомия (аспленизация)

3.1 Подкожная инъекция 2*10"(1 мл) криоконсервированной ККП 60

3.2 Подкожная инъекция 2 * 10" (1 мл) криоконсервированной ККС 60

3.3 Подкожная инъекция 2 * 10" (1 мл) криоконсервированных НКС 60

3.4 Подкожная инъекция 1 мл физиологического раствора 50

3.5 Подкожная инъекция 1 мп питательной среды 30

3.6 Подкожная инъекция 0,3 мл (200 нг) НвР 60

3.7 Здоровые животные 6

Всего: 1171

Для изучения роли фактора роста гепатоцитов в защите и регуляции регенерации печени после токсического повреждения, были введены 3 дополнительные группы. Животным с ОПН вводили HGF (1.6), культуру клеток селезенки (1.7) и антитела к фактору роста гепатоцитов (1.8). Выживших животных каждой группы, кроме 1.8, выводили из эксперимента на 2-е, 4-е и 6-е сут (по 6 крыс в каждой группе). Проводили забор крови для оценки выбранных биохимических показателей и системы гемостаза, проводили аутопсию, взвешивали печень, ее ткань фиксировали для последующего патоморфологического исследования. Кроме того, у крыс с КТ клеток печени и селезенки иссекали ткани в зоне инъекции клеток для патоморфологического исследования.

Для оценки эффективности коррекции пострезекционной печеночной недостаточности путем КТ ККП и ККС была выполнена вторая серия экспериментов (п = 480). У всех экспериментальных животных в стерильных условиях под внутримышечным калипсоловым наркозом моделировали ПН путем удаления левой и медиальной долей печени, что составляло 70 % объема печени (Фишер А., 1961).

Через 1 ч после оперативного вмешательства животных относили к экспериментальным группам методом случайного распределения. Отправной точкой эксперимента было введение крысам препарата, определяющего в дальнейшем их групповую принадлежность. Проведено исследование летальности, показателей гомеостаза (масса печени, биохимические тесты, оценка системы гемостаза, OAK, иммунологические тесты) и морфологии печени под влиянием КТ криоконсерви-рованной культуры эмбриональных клеток свиной печени (2.1), КТ криоконсер-вированных НГ (2.2), введения физиологического раствора (2.3), лекарственного препарата гептрал (2.4), питательной среды для культивирования клеток печени (2.5), фактора роста гепатоцитов (2.6), криоконсервированной культуры клеток свиной селезенки (2.7). Летальность контролировали на протяжении 11 сут. эксперимента. У погибших животных проводили аутопсию с ревизией органов брюшной полости. Животных выводили из эксперимента на 2-е, 5-е, 11-е сут. Забор крови проводили у крыс в утренние часы на голодный желудок. После эвтаназии выполняли аутопсию и забирали ткань печени и селезенки. У крыс опытных групп дополнительно иссекали зону трансплантации для последующего патоморфологического исследования.

Для выяснения роли КТ ККП в защите и регуляции регенерации печени после ее тотальной резекции (органозамещение или стимуляция регенерации) были введены дополнительные группы. Моделировали ОПН обширной резекцией (левая, медиальная, хвостатая и добавочные доли) печени в объеме 90 % органа. Животным с ОПН вводили ККП (2.8), НГ (2.9) и физиологический раствор (2.10). Выполняли КТ ККП (2.1), НГ (2.2) подкожно за двое суток до операции и во время операции («Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте», патент РФ № 2232550) в концентрации 2 х 106 клеток в 1 мл суспензии.

Для выяснения механизмов компенсации воспалительной печеночной недостаточности, индуцированной аспленизацией, под влиянием ксенотрансплантации ККП и ККС выполнена третья серия экспериментов (я = 326). В стерильных условиях выполняли спленэктомию с удалением всех обнаруженных очагов резидуальной

ткани (полная аспленизация). Через 1 ч после операции животных относили к экспериментальным группам методом случайного распределения. Отправной точкой эксперимента было введение крысам препарата, определяющего в дальнейшем их групповую принадлежность. Проведено исследование летальности, показателей гомеостаза (биохимические тесты и оценка системы гемостаза), иммунологических показателей, общего анализа крови, анализа количества HGF и морфологии печени у спленэктомированных животных под влиянием КТККП (3.1), KT ККС (3.2), KT KT ИКС (3.3) после введения физиологического раствора (3.4), питательной среды для культивирования клеток печени (3.5), HGF (3.6).

Летальность контролировали на протяжении 21 сут. Производили аутопсию с ревизией органов брюшной полости. Для гистологического исследования забирали ткань печени. Выживших животных выводили из эксперимента на 2-е, 5-е, 7-е, 14-е и 21-е сут. Осуществляли забор крови для оценки выбранных лабораторных показателей. Выполняли аутопсию, забирали печень и ткань в месте трансплантации для морфологического исследования.

Методы лабораторных исследований

Определение биохимических показателей сыворотки крови подопытных животных проводили на анализаторе «Синхрон-5» (Beckman, США). Исследование всех заготовленных образцов проводили в одной серии с использованием стандартного набора реактивов. Для определения нормальных показателей использовалась сыворотка крови 6 здоровых крыс. Исследовали концентрацию общего белка (г/л), альбумина (г/л), показатели активности АЛТ (МЕ/л), ACT (МЕ/л), ХЭ (МЕ/л), ЛАП (МЕ/л), ГГТ (МЕ/л), ЛДГ (МЕ/л), уровень общего билирубина с фракциями (мкмоль/л).

Общий анализ крови выполняли общепринятыми методами, подсчитывали количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу крови. В системе гемостаза исследовали гематокрит (%), уровень фибриногена (г/л), время свертывания крови (с), протромбиновый индекс (ПТИ) (%), агрегацию тромбоцитов (%), вязкость крови. Оценивали фагоцитарный показатель и фагоцитарное число, спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) и активированный НСТ-тест (%).

Для оценки количества IL-1,6 использовали метод твердофазного иммунофер-ментного анализа с использованием иммуноферментного анализатора Stat Fax-2000 (Awareness tehnology INC, США). Использовали иммуноферментные наборы для специфического определения и измерения HGF (1L1,6 ELISA Kit Biosource, USA; HGF ELISA Kit Biosource, Бельгия) в сыворотке крови крысы, в супернатанте и среде клеточных культур, буферных растворах.

Исследование бактериальной транслокации из просвета тонкой кишки выполняли методом сцинтиграфии в радиоизотопной лаборатории НЦРВХ СО РАМН (зав. лаб. - к.м.н. Галеев Ю.М.) совместно с м.н.с. О.В. Салато. Все манипуляции, связанные с использованием радиоактивных веществ, выполняли с учетом норм радиационной безопасности.

Динамическую сцинтиграфию проводили на гамма-камере MULTISPECT-II (Siemens, Германия) с компьютерной системой обработки данных ICON 6.0.

Регистрацию сцинтиграмм проводили в динамическом режиме при следующих параметрах сбора информации: 360 кадров, 1 кадр - 60 с, матрикс 64 х 64. Исследование проводили в прямой проекции, устанавливая детектор гамма-камеры так, чтобы экспериментальное животное полностью попадало в поле детекции. Обработка данных включала визуальную оценку сцинтиграмм, выделение зон интереса (проекции кишечника, печени). Сканирование выполняли с применением бактериального радиопрепарата-меченных 99тТс бактерий Е. Coli-приготовленного по оригинальной методике (патент РФ «Способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфических исследований» № 2290643, дата получения - 27.12.2006 г.). Животным групп 3.4 и 3.7 устанавливали катетер в просвет тонкой кишки, куда вводили 1 мл бактериального радиопрепарата активностью 7,4—9,0 MBq и содержанием меченых бактерий 107 КОЕ, после чего выполняли динамическую сцинтиграфию в течение 4 ч. Исследование завершали проведением статической сцинтиграфии в течение 15 мин.

Методы количественного анализа концентрации фактора роста

гепатоцитов

Способ определения количества фактора роста гепатоцитов методом Вестерн блотгинга включал в себя 4 этапа: 1) выделение водорастворимого белка из сыворотки крови крыс и питательных сред; 2) электрофорез водорастворимого белка в полиакри-ламидном геле с последующим электрофоретическим переносом на нитроцеллюлоз-ную мембрану; 3) иммуноблоттингс использованием моноклональных антител фирмы Sigma (Monoclonal Anti-Hepatocyte Growth Factor, Purified Mouse Immunoglobulin) против фактора роста гепатоцитов и визуализация с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена; для количественной оценки содержания фактора роста гепатоцитов использовали стандарт чистого HGF; 4) полученные рентгеновские пленки сканировали и с помощью компьютерной программы Gel Analysis обсчитывали плотность свечения полос белков, соответствующих HGF.

Для оценки HGF использовали метод Вестерн блотгинга (Western Blotting), при котором белки сначала разделяются при помощи электорофореза в полиакриа-мидном геле, где разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле усиливалась путем выборочного связывания антител или специфических реагентов - лигандов с компонентами белковой смеси, иммобилизированными на мембране. Разделение белковых полос сохраняется при переносе на мембрану и не подвергается диффузии во время последующей обработки. Работу проводили по методу Timmons (1990).

Методы патоморфологического исследования

Обзорная световая микроскопия, контроль жизнеспособности клеток для трансплантации были выполнены на базе лаборатории патоморфологии совместно с заведующим - канд. мед. наук O.A. Гольдбергом.

Для световой микроскопии материал фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина. Исследовали депарафинированные срезы, окрашенные гематоксилином и

эозином, часть срезов с ПАС - реакцией и с окраской на липиды. Препараты исследовали в фотомикроскопе 111 (К. Цейсс, Германия). Для определения клеточного состава ткани печени на 2-е, 5-е, 11-е сут эксперимента проводили количественную оценку методом счетного квадрагга по Автандилову с использованием окуляр-микрометра.

Массу печени и селезенки измеряли на электронных весах Adventurer™ Balances (OHAUS, США) при комнатной температуре сразу после аутопсии.

Иммуноморфологическое исследование экспериментального материала проводили совместно с Л.Ю. Раевской. Для иммуноморфологического исследования материал фиксировали в 5% нейтральном формалине в течение 24 ч с последующей заливкой в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм после депарафинизации нагревали в микроволновой печи при 700 W в 10 мМ цитратном буфере с рН = 6,0 4 раза по 5 мин. Для исследования пролиферативной активности использовали готовое к применению моноклональное антитело Ki 67, клон ММ1 (Novocastra Laboratories Ltd.). Апоптоз оценивали с помощью поликлонального антитела Anti-Bax (BD Biosciences) в разведении 1 : 1 ООО. Блок эндогенной пероксидазы в срезах осуществляли Peroxidase-Blocking Solution, DAKO. Визуализация- DAKO LSAB + Kit Peroxidase и DAB + Chromogen, DAKO. Для количественной оценки экспрессии подсчитывали клетки со специфическим позитивным окрашиванием ядер (Ki 67) и специфическим позитивным окрашиванием в цитоплазме (Вах) в 1000 гепатоцитов в каждом случае.

Для электронной микроскопии фрагменты печени, забранные на 2-е, 4-е 6-е сут (1 -я серия экспериментов) эксперимента помещали в 10% раствор параформальдегида на ОД М фосфатном буфере (рН = 7,4) и фиксировали в течение 24 часов. После промывки постфиксировали в 1% растворе 0s04 на том же буфере с 0,1 М сахарозой в течение 2 часов, дегидратировали в спиртах восходящей концентрации и заливали в эпон-араддит. Ультратонкие срезы толщиной 300-400 А0 нарезали на ультратоме LKB-Nova (Швеция), монтировали на сетки, покрытые формваром. После окрашивания насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца просматривали в электронном микроскопе ЕМ 400 D (Phillips, Голландия) при ускоряющем напряжении 80 КВ. На ультратонких срезах, полученных с каждого блока, фотографировали по 2 случайно выбранных участка цитоплазмы гепатоцитов так, чтобы на одно наблюдение приходилось 8-10 фотопластинок, при увеличении х 24000.

Морфометрический анализ ультраструюурной организации паренхиматозных клеток печени проводили на фотографиях при конечном увеличении х 45000 с помощью открытой тестовой системы по формуле V = (Pt / Pk) х 100, где Pt - число узлов тестовой решетки, попавшей на митохондрии или мембраны гранулярного эндоплазматического ретикулума; Pk - число узлов тестовой решетки. Всего было исследовано 90 фотографий.

Патоморфологический раздел работы проведен совместно со старшими научными сотрудниками О.А. Гольдбергом и Ю.В. Гладышевым. Количественная цитофотометрия была проведена совместно с Ю.В. Гладышевым в лаборатории иммуноморфологии Института физиологии СО РАМН (зав. лабораторией и директор - академик РАМН В.А. Труфакин) г. Новосибирска. 14

Для исследования содержания количества ДНК в ядрах паренхиматозных клеток печени парафиновые срезы толщиной 5 мкм нарезали на микротоме LKB (Швеция), монтировали на стекла, окрашивали реактивом Шиффа после предварительного гидролиза в 1N соляной кислоте по методу Томази. Реактив Шиффа готовили по стандартной методике. Количественную цитофотометрию проводили на автоматическом анализаторе «Протва» методом сканирования. Измерения проводили при освещении монохроматическим светом с длиной волны 550 нм, увеличением объектива х 90, шагом сканирования 0,01 мкм и диаметром зонда 0,1 мкм в Институте физиологии СО РАМН г. Новосибирска. В каждой группе количество ДНК было измерено в 100-120 ядрах. Кроме содержания ДНК, анализатор вычислял и площадь ядер клеток. Во всех случаях исследовали только одноядерные гепатоциты. Методы статистической обработки результатов Данные представляли в виде медианы с нижним и верхним квартилями (25-й и 75-й процентили). Величины, выраженные в процентах, приведены в тексте с ошибкой процента. Определение статистической значимости различий (р) в сравниваемых выборках проводили по критериям Даннета (D), Ньюмана-Кейлса (N-K), Манна-Уитни (U), Вилкоксона (W), с помощью точного метода Фишера (F) и критериялм-квадрат (C-S). Корреляционный анализ проведен с применением коэффициента корреляции Кендала. Статистическую обработку результатов производили с помощью пакета программ Statistica б for Windows.

Автор выражает сердечную признательность заслуженному деятелю науки, д.м.н., профессору H.A. Онищенко за помощь при подготовке материалов исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты разработки технологии выделения, культивирования и криокон-сервации клеточного материала для ксенотрансплантации

Для реализации поставленных задач оказалось необходимым разработать в деталях процесс получения ККП, НГ, ККС, НКС для ксенотрансплантации на основе известных методик. В результате комбинации приемов выделения ГЦ из зрелой печени и обработки эмбриональной ткани была модифицирована технология смешанной дезагрегации ткани эмбриональной печени, дополненная нами полифокальным интрапаренхиматозным введением раствора коллагеназы с последующей механической сепарацией стромальных элементов вручную под контролем зрения. Добивались получения не изолированных ГЦ, а микрофрагментов, содержащих ассоциации до 10 ГЦ, и непаренхиматозных клеток. Согласно исходной гипотезе, полученные клетки вырабатывают гепатотропные факторы, ведущая роль среди которых принадлежит фактору роста гепатоцитов, продуцируемого клетками Купфера и Ито, по этой причине мы посчитали важным сохранять клеточную кооперацию.

Предложенный способ позволил получать клетки с жизнеспособностью 90,3 (88,5—96,3) %-более высокой, чем при использовании известных методов (40,9 (38,6— 43,4) и 64,9 (60,1-69,7) %) (рц < 0,00001), и существенно увеличил выход количества клеток-с 7 (6,4—'7,3)до 10,4 (9,8-10,6) с 1 гткани. Клеточный состав был представлен

эмбриональными гепатоцитами полигональной формы с четко просматриваемыми ядрами без повреждений, макрофагами и гемопоэтическими клетками. Выделенные клетки большей частью располагались группами по 2-4 шт. После разделения в фикол-ловом градиенте из одного грамма ткани печени выделяли 8,6 (7,4-10) х 106 клеток. В 50 мл суспензии содержалось 40,5 (38-43) х 106 клеток. Степень жизнеспособности клеток после выделения и очистки составила 98,8 (98,3-99,3) %.

Для улучшения результатов культивирования ККП предпринята серия экспериментов с составом среды. Обнаружена прямая тесная корреляция (г = +0,71; р < 0,05) между жизнеспособностью культуры и закислением среды для культивирования. Поскольку рН ткани печени в норме составляет 7,4, при инкубации ККП ориентировались на этот физиологический показатель. Установлено, что наивысшая жизнеспособность культуры при кратковременной инкубации достигается при рН исходного раствора 7,6 с учетом закономерного снижения этого показателя при добавлении клеточной взвеси. Прирост клеточной массы в процессе культивирования к 5-м суткам был трехкратным (135 х Ю6 против 40 х 106 клеток, засеянных во флакон). Максимальный уровень пролиферативной активности клеток печени был выявлен на 5-е сут. культивирования (табл. 2).

Таблица 2

Динамика митотического индекса в культуре эмбриональных клеток

печени

МИ 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 120 ч 144 ч

Индекс пролиферативной активности 0,01 (0,01-0,01) (п = 6) 0,12* (0,0 9-0,2) (п = 6) 0,26* (0,1-0,3) С = 6) 0,39* (0,3-0,5) (п = 6) 0,65* (0,6-0,7) С = 6) 0,36* (0,1-0,4) (п = 6)

Примечание: * - рт< 0,05, по сравнению с МИ на 24 ч.

Для оценки функциональной активности клеток печени в культуре проведена оценка уровня альбумина в среде культивирования, но этот показатель был неизменным в динамике наблюдения: в первые сутки культивирования уровень альбумина составил 8,0 (6,5-9) г/л, на 5-е сутки - 8,7 (6,2-10) г/л.

В этой связи нами был разработан способ оценки жизнеспособности культивированных клеток печени по определению продуктов их жизнедеятельности в среде культивирования. Способ основан на определении в динамике содержания регулятор-ного пептида НОР в среде культивирования, по которому и судили о пролиферативной активное™ культивируемых клеток, что дало возможность установить функциональное состояние клеточной культуры и выявить пик пролиферативной активности.

Определение содержания НОР в среде культивирования позволило оценить жизнеспособность клеток в процессе роста, т.е. без снятия клеток с культивирования можно установить высокую готовность клеток к трансплантации.

При изменении условий культивирования происходит замедление процессов пролиферативной активности культивируемых клеток, что требует удлинения сроков культивирования. Определение НвР в среде культивирования в динамике, предложенное нами, позволяет независимо от календарного срока культивирования выявить максимум пролиферативной активности эмбриональных клеток печени и 16

тем самым обеспечить оптимальную пригодность клеточного материала к трансплантации. При оценке жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени по предлагаемому способу было выявлено, что содержание НОР менялось в динамике исследования.

Выявлено достоверное увеличение количества регуляторного пептида на 5-е сут. до 46,8 (38,4-50,0) нг/мл против 14,3 (13-15,6) нг/мл на 2-е сут (р№ = 0,003). Установлена положительная корреляция уровня НОР и показателя митотического индекса, характеризующего пролиферативную активность культивируемых клеток: Л= 1,0 (р = 0,042).

Если во взвеси выделенных из печени клеток их наибольшее количество было изолированным друг от друга - 85,0 (80-92) %, то после культивирования взвесь клеток состояла из эмбриональных гепатоцитов, непаренхиматозных клеток и ге-мопоэтических клеток, преобладали клеточные группы, а изолированных клеток было 42,0 (40-48) % (р№ = 0,011).

Нами разработана среда для криоконсервирования ККП. Поводом послужила низкая жизнеспособность клеток при использовании известных составов, предложенных М.С. Маргулисом (1992) и С.С. Лавриком (1990). Разработанный способ криоконсервирования эмбриональных культивированных клеток печени основан на использовании оригинальной среды («Среда для консервации клеток печени», патент №2161198от15.01.2001г.), содержащей в качестве криопротектора поливинилпир-ролидон, а в качестве жизнеобеспечивающих компонентов включены питательная среда ЯРМ1,1% раствор альбумина человеческого и калия оротат. Получены эмбриональные культивированные криоконсервированные клетки печени свиньи (ККП) с высокой степенью жизнеспособности. Результаты криоконсервации в трех режимах (заморозка - оттаивание через 2 и 6 мес.) с использованием различных сред выявили, что оригинальная среда криоконсервации позволила сохранять клетки печени с существенно более высоким показателем жизнеспособности - 86,9 (83,8-89) % на протяжении 6 мес., по сравнению с контролем - 59,4 (58,5-60,3) % (ри < 0,001) (среды М.С. Маргулиса и С.С. Лаврика, заморозка - оттаивание). Отметим статистически значимое (рш < 0,001) снижение жизнеспособности культуры клеток печени при консервации на протяжении 2 мес. с 97,6 (93,1-98,7) % до 90,3 (85,7-92,9) %. В дальнейшем наблюдали лишь тенденцию к снижению этого показателя к 6 мес. - 86,9 (83,8-89) % (р,у-0,089). Гистологическое исследование деконсервированной взвеси клеток выявило сохранность мембран и внутриклеточных структур.

Дополнительным преимуществом использования разработанной среды было отсутствие необходимости элиминации консерванта, поскольку поливинилпирро-лидон (средство для детоксикации), калия оротат (протектор ишемии) обладают полезными для коррекции ОПН фармакологическими свойствами, а среда оказывается обогащенной регуляторными метаболитами—факторами роста, продуцируемыми непаренхиматозными клетками.

Для оценки качества подготовки ксеногенного клеточного материала и определения структуры ксенотрансплантата нами проведено морфологическое исследование участков КТ ККП.

Макроскопически зона трансплантации ККП у животных с токсическим повреждением печени в подкожной основе представляла собой узелок ткани красно-коричневого цвета, напоминающий по размерам и форме рисовое зерно в пленочной капсуле с мелкими капиллярами. Описанное образование обнаруживали у каждого животного с КТ ККП, выведенного из эксперимента на 6-е сутки. Микроскопически капсула имела вид гомогенной гиалинизированной пленки с единичными малодифференцированными фибробластами. По периферии этой пленки в соединительной ткани дермы определялась высокая концентрация мало-дифференцированных фибробластов (рис. 1).

%гг !Ь * _ II i V ■

ш

Рис. 1. Структура трансплантата у крыс с КТ ККП черезбсут. после введения клеток: 1 - клетки соединительной ткани; 2 - сохранившиеся гепатоциты; 3 - зона некроза. Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 80.

Обнаруживали комплексы клеток, по форме и структуре соответствующие гепатоцитам, расположенные по периферии трансплантата, без перифокальной лейкоцитарной инфильтрации. Ядра клеток без явлений кариолиза, с четкими границами. Центральная зона трансплантата была представлена зоной некроза с единичными клетками ближе к периферии.

Таким образом, ксеногенные эмбриональные гепатоциты, пересаженные под кожу животного с индуцированным токсическим повреждением печени, частично выживают к 6-м сут. после введения.

Для определения судьбы пересаженных клеток при коррекции пострезекционной печеночной недостаточности была выполнена световая микроскопия зоны ксеиотраис плантации ККП. Макроскопически на 5-е сут. эксперимента в зоне ксенотрансплантации определялось округлое образование темно-красного цвета с тонкой соединительно-тканной капсулой. При световой микроскопии зоны КТ ККС к П-м сут. определялись группы сохранившихся ГЦ по краю трансплантата с центральной зоной некроза. Отмечалось утолщение соединительнотканной капсулы. Визуализировались пересаженные гепатоциты с сохраненной структурой. Таким образом, ксеногенные эмбриональные гепатоциты, пересаженные под кожу животного с индуцированной пострезекционной (70-90 % органа) печеночной недостаточностью, частично выживают к 11-м сут. после введения.

Структура трансплантата ККП на 2-е сутки в условиях воспалительного повреждения печени после аспленизации при макроскопическом исследовании у всех животных представляла собой узелок красно-коричневого цвета. При микроскопии определялись сохранившиеся клетки без явлений кариолиза. Ни в одном наблюдении не выявлено лейкоцитарной инфильтрации в зоне ксе-нотрансплантации. На 7-е сут. в зоне КТ ККП обнаруживали сохранившиеся ГЦ по периферии трансплантата с центральной зоной некроза, капсулу с вновь образовавшимися сосудами. Лейкоцитарной инфильтрации не было. На 14-е сут. выявляли образование красно-коричневого цвета в капсуле с прорастанием в нее сосудов. Образования имели вытянутую форму и были ориентированы в соответствии с траекторией инъекционной иглы при трансплантации. В окружающих тканях признаков воспаления не было. Структурно трансплантат был представлен центральной зоной некроза с сохранившимися группами клеток типа ГЦ по краю.

При исследовании зоны трансплантации на 21-е сут. в зоне КТ ККП выявляли уплощенное розово-коричневое образование в капсуле (рис. 2).

Рис. 2. Структура трансплантата на 21-е сутки эксперимента; А- макроскопическая картина трансплантата ККП; Б - световая микроскопия трансплантата ККП; 1 - образование в зоне КТ; 2 - сохранившиеся клетки; 3 - капсула; 4 - зона некроза. Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 80 (Б).

При микроскопии обнаруживали сохранившиеся клетки и зоны некроза в капсуле, построенной из коллагеновых волокон и проходящих сквозь нее сосудов (рис. 2Б). В тканях, окружающих трансплантаты, ни в одном наблюдении не было признаков воспаления.

Таким образом, ксеногенные эмбриональные, культивированные, криоконсер-вированные ГЦ, пересаженные под кожу животного с воспалительным повреждением печени после аспленизации, частично выживают к 21-м сут. после введения без воспалительной реакции тканей. Сструктура трансплантата во всех случаях соответствует классическим описаниям перенесенной ткани при свободной алло- и аутотрансплантации, что говорит о высокой жизнеспособности и низкой иммуно-генности приготовленной культуры клеток эмбриональной печени.

Количество НГ, получаемых по разработанной технологии из 1 г ткани печени, составило 7,7 (6,8-8,4) х ] о7. Степень жизнеспособности клеток после выделения и очистки составила 96,9 (96,0—98,3) %. Криоконсервировали неонатапьные ГЦ с использованием оригинальной среды, разработанной для эмбриональных ГЦ. После 2 мес. хранения получали материал с жизнеспособностью 86,4 (85,0-88,4) %.

При гистологическом исследовании установлено, что в зоне КТ НГ клетки частично выживают к 11-м сут. после введения, ни в одном наблюдении не было выявлено лейкоцитарной инфильтрации трансплантата.

В дальнейшем была разработана технология получения, культивирования и криоконсервирования неонатальных клеток селезенки (ККС). Для получения изолированных клеток селезенки нами адаптирована методика комбинированной дезагрегации ткани по Berry, которая позволила получать клетки селезенки с жизнеспособностью 99,4 %, увеличением количества клеток, выделенных из 1 г ткани селезенки, до 6,15 (5,86-6,40) х 107. Клеточный состав был представлен изолированными лимфоцитами, макрофагами, моноцитами и ретикулярными клетками. Выделенные клетки большей частью располагались группами по 2-А штуки.

В анализированной литературе мы не встретили информации о сроках и результатах культивирования клеток селезенки. В связи с этим мы ориентировались на наши данные, полученные при культивировании клеток печени. Взвесь клеток селезенки после культивирования состояла преимущественно из лимфоцитов, с содержанием 4,6 (4,1-4,8) х ю7 клеток в 1 мл взвеси и удельным весом жизнеспособных клеток 99,3 (98,9-99,4) %. Исходный показатель рН среды для культивирования с учетом закономерного закисления среды должен составлять 7,6.

Для определения пролиферативной активности культивированных клеток селезенки рассчитывали митотический индекс, который достигал максимума на 5-е сутки (табл. 3).

Таблица 3

Динамика митотического индекса в культуре клеток селезенки

МИ 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 120 ч 144 ч

Индекс пролиферативной активности 0,001 (0,001-0,001) (1 = 6) 0,02* (0,01-0,03) (п = 6) 0,1* (0,1-0,1) (Л = 6) 0,24* (0,1-0,28) (п = 6) 0,4* (0,3-0,5) </. = 6) 0,1 (0-0,1) (/1 = 6)

Примечание: * - pw < 0,05 по сравнению с МИ на 24 ч.

При оценке количества HGF выявлена его низкая концентрация в среде после центрифугирования выделенных клеток селезенки - 16,8 (11,2-43,8) нг/мл. К 5-м сут. исследования выявлено достоверное увеличение до 4300 (3892-4770) нг/мл (ри.= 0.00001).

Если во взвеси выделенных из селезенки клеток их наибольшее количество было изолированным друг от друга - 95,0 (90-99) %, то после культивирования преобладали клеточные группы, а изолированных клеток было 45,0 (40-55) % (pw = 0,015). Поскольку мы сохранили клеточную кооперацию, результаты по фактору роста были ожидаемыми. Таким образом, разработанная технология

позволяет получать культуру клеток селезенки, состоящую преимущественно из лимфоцитов, с содержанием 4,6 (4,1—4,8) * Ю7 клеток в 1 мл взвеси и удельным весом жизнеспособных клеток 99,3 (98,9-99,4) %, и продуцирующую фактор роста гепатоцитов с максимальными значениями на 5-е сут., когда концентрация в среде культивирования увеличивалась в 255 раз.

Разработан способ криоконсервирования ККС с использованием оригинальной среды («Среда для консервации клеток селезенки», патент№ 2194753 от 08.0! .2001 г.), содержащей в качестве криопротектора поливинилпирролидон, а из жизнеобеспечивающих компонентов - питательную среду ЯРМ1-1640, сыворотку эмбриональную телячью категории № К055 и липиды бобов сои без холестерина, калия оротат для предотвращения потери калия клетками при заморозке, дексаметазон. Уровень рН среды доводили до 7,6. Цитологическое исследование деконсервироваииой взвеси клеток выявило сохранность мембран и внутриклеточных структур.

Были выявлены существенные различия, по сравнению с контролем (среда по Ю.М. Зарецкой с соавт., 1978): в режиме «заморозка - оттаивание» жизнеспособность составила 98,9 (98,7-99,0) % против 70,7 (70,4-70,9) % (рц < 0,05).

При цитологическом исследовании деконсервированной суспензии клеток установлено, что клетки селезенки представлены группами лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, ретикулоцитов с четкими контурами относительно светлых ядер, четко определяемым ядрышком. У части малых и средних лимфоцитов просматривались ядерные отростки. Встречались отдельные сегментоядерные лейкоциты и апоптозные тела. Разработанный способ позволил получить ККС с сохранностью мембран и внутриклеточных структур и высокой степенью жизнеспособности -98,2 (97,8-98,5) % после длительной (6 мес.) криоконсервации.

При световой микроскопии установлено, что регенерация ККС в ранние сроки не сопровождается реакцией отторжения, клетки частично выживают к 6-м сут. после введения (рис. 3). Краевую зону пролиферации с наличием фибробластов, макрофагов и лимфоцитов расценивали как начало формирования «селезеночного тельца».

V2

> \ 1 л Щ К I»-5"

Л-- -

Рис. 3. Структура трансплантата у крыс через 6 сут. после введения ККС: 1 - сохранившиеся фрагменты трансплантата; 2 - новообразованные капилляры; 3 - фрагменты ткани со структурой красной пульпы селезенки; 4 - зона некроза ткани трансплантата; 5 - формирующаяся капсула. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 100 (А) и х 140 (Б).

Структура трансплантата соответствует классическим описаниям перенесенной ткани при свободной алло- и аутотрансплантации. На 14-е сут. в зоне трансплантации ККС определяется формирующееся «селезеночное тельце» - образование овальной формы, имеющее тонкую капсулу, построенную из коллагеновых волокон и проходящих через нее сосудов. Внутри образования имеются ретикулярные клетки, сосуды, диффузно или небольшими группами очагово-расположенные лимфоциты. Сидерофаги или гранулы гемосидерина расположены одиночно или группами. К 21-м сут. на месте «селезеночного тельца» формируется лимфоузел с участками пролиферации ретикулярных клеток синусов и субкапсулярно расположенные зоны скопления плазмобластов и в меньшей степени плазмоцитов. Принципиально важно, что ни в одном наблюдении нам не встретилось морфологических признаков реакции «трансплантат против хозяина» и «хозяин против трансплантата», что свидетельствует о низкой иммуногенности подготовленного материала.

Полученные сведения позволили сформулировать гипотезу о роли фактора роста гепатоцитов в саногенезе острой печеночной недостаточности при остром токсическом повреждении, обширной резекции и воспалительных повреждениях на фоне аспленизации.

Следующим этапом в нашей работе стало изучение саногенетических эффектов на моделях острой печеночной недостаточности различного генеза, корригированной ксенотрансплантацией клеток, полученных по разработанной технологии. Проверка эффективности разработанных клеточных технологий и гипотезы, согласно которой одним из ведущих саногенетических механизмов печеночной недостаточности при КТ ККП является продукция перенесенным материалом фактора роста гепатоцитов, проведена нами в трех сериях экспериментов с использованием крыс породы Ай^аг.

Результаты исследования механизмов саногенеза ОПН при ОТП под влиянием ксенотрансплантации клеток печени

В первой серии исследований использовали известную летальную модель острого токсического повреждения печени четыреххлористым углеродом. Длительность исследования (6 сут.) определялась классическими данными об ожидаемой летальности при отсутствии лечебного воздействия.

Выявленной закономерностью явилось снижение уровня летальности (рис. 4А) под влиянием КТ ККП с 3-х сут., статистически значимое с 4-х сут эксперимента. При этом в группах контроля этот показатель приближался к 100 %, а в основной группе составил 36,7 %. Обнаруженный отсроченный саногенный эффект не противоречит исходной гипотезе и свидетельствует о необходимости экспозиции перенесенного материала в условиях острого токсического повреждения печени.

100 О 11 ........ .¿>.....-о

а 12 *

80 о-13

л. 14 ф

60 Ф-15

40

20 м-

0 А

1 сутки 2 сутки 3 с/тки 4 сутки 5 сутки 6 сутки

1 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки 5 сутки 6 сутки

Рис. 4. Летальность (%) в первой серии экспериментов: А - основные группы; Б - дополнительные группы первой серии экспериментов.

Каковы же саногенные механизмы? Протекторные или регенераторные (эффекты НОР) механизмы оказываются доминирующими? Для ответа на эти вопросы проведена лабораторная оценка некоторых показателей гомеостаза, закономерно изменяющихся при ОПН.

Результаты сравнительной оценки синтетической функции поврежденной печени на фоне коррекции исследованы представлены на рис. 5. Документировано улучшение белково-синтетической функции печени под влиянием КТ ККП с отсроченными максимальными показателями (4-е и 6-е сут. эксперимента) на фоне угнетения этих процессов в контроле, ю

75 70 66 60 55 60 45 40

Рис. 5. Показатели синтетической функции печени животных в первой серии экспериментов: А - количество общего белка (г/л); Б - количество альбумина (г/л).

Трансплантация некультивированных ГЦ предупреждала угнетение синтетической функции печени на начальных сроках эксперимента и утрачивала свое протекторное действие с 4-х сут. Защитное воздействие КТ ККП на липидный обмен проявляется к 4-м сут после введения ККП; в дальнейшем этот эффект исчезает.

сутки эксперимента

сутки экспЕриленга

сутки эксперимента

Рис. 6. Конъюгационная функция гепатоцитов в первой серии экспериментов: динамика уровня общего (А) (мкмоль/л) и прямого билирубина (Б) (мкмоль/л) в сыворотке крови животных.

При исследовании пигментного обмена (рис. 6) на 2-е сут. эксперимента во всех группах отмечена выраженная гипербилирубинемия (р < 0,004, по сравнению с нормой) без существенных межгрупповых различий. К 4-м сут. уровень общего билирубина существенно снижался в основной группе 1.1 по сравнению с предыдущими показателями (pw = 0,001) и уже значимо не отличался от нормальных величин до окончания эксперимента.

Пигментный обмен приближался к нормальным величинам, начиная с 4-х сут. после КТ ККП. В то же время в контроле на протяжении 4 сут. сохранялись выраженные нарушения глюкуронизации билирубина и угнетение клиренса билирубина из крови. К 4-м сут. уровень глюкозы нормализовался в основной группе, тогда как в контроле показатель был существенно ниже нормы, что свидетельствует о нарушениях синтеза гликогена и уменьшении печеночного депо углеводов в контроле.

Исследование уровня активности маркерных ферментов цитолиза показало обратно-направленные, по сравнению с показателями синтетической функции, процессы, что также укладывалось в исходную гипотезу.

При исследовании уровней активности AJ1T и ACT (рис. 7) в сыворотке крови на 2-е сут. выявлено существенное повышение во всех группах (pD < 0,004, по сравнению с нормой). В дальнейшем уровень выбранных маркеров цитолиза в основной группе 1.1 отчетливо снижался (pw < 0,0001, по сравнению с определением на 2-е сут.), оставаясь существенно выше нормы к четвертым суткам (рп = 0,001) и достигая нормальных величин к шестым суткам (pD = 1). При трансплантации НГ в динамике отмечается значимое снижение показателей цитолиза с 4-х сут. исследования, хотя при сравнении с основной группой 1.1 и нормальными величинами эти показатели существенно повышены (pw < 0,01; pD = 0,00008; р( . = 0,0001). Представленные факты позволили нам сделать заключение о более эффективном ограничении повреждения печени под воздействием ККП, чем при

трансплантации НГ. При этом КТ ККП лимитирует цитолиз, вызванный ОТП, и активирует синтетическую функцию ГЦ, что характеризует саногенетическое влияние ККП и соответствует исходной гипотезе.

сутки экспер*№га

сутки эксперимента

Рис. 7. Динамика уровня активности АЛТ (А) и гамма-глютамилтранспептидазы (Б) в сыворотке крови животных в первой серии экспериментов (МЕ/л).

Поскольку системным эффектом РЮР, описанным в литературе, является противовоспалительное действие, остановимся на результатах оценки системной воспалительной реакции и гемостаза. КТ ККП не только не сопровождается увеличением воспалительной реакции, но и приводит к уменьшению воспалительного ответа, вызванного ОТП, что соответствует эффектам НОК Также выявлены сохранность неспецифической резистентности и отсутствие сенсибилизации при ОТП под воздействием КТ ККП, что выражается в нормализации показателей лейкоцитоза, фагоцитоза, циркулирующих иммунных комплексов к б-м сут. эксперимента. В группах контроля наблюдали прогрессирующие расстройства, характерные для ОПН, вызванной гепатотропным ядом.

Рассмотрим теперь результаты оценки свертывающей системы крови, основываясь на известных сведениях литературы о прокоагуляционных эффектах НОР, Введение ККП предотвращало характерные для ОТП депрессию функциональной активности тромбоцитов, снижение уровня гематокрита и фибриногена. Исследованные показатели системы гемостаза (за исключением гематокрита) в группе с КТ ККП нормализовались к 6-м сут. исследования.

Рассмотрим морфологические эквиваленты саногенного влияния КТ ККП. В подтверждение исследуемой гипотезы установлено увеличение площади ядра, сохранность гранулярного эндоплазматического ретикулума, увеличение объемной доли и количества митохондрий, уменьшение липидных включений со снижением площади цитоплазмы ГЦ при ОТП под воздействием КТ ККП. Выявлено существенное увеличение количества ГЦ с октаплоидными ядрами с одновременным снижением количества диплоидных и нормализацией уровня тетраплоидных ядер. Выявленные закономерности подтверждают исходную гипотезу об активации синтеза ДНК, присущего фактору роста гепатоцитов.

Для подтверждения гипотезы о роли динамических изменений НОР при ОТП, а также как ведущего саногенетического фактора ОПН, обеспечивающего положительный эффект КТ ККП, проведена оценка количества НОР в динамике исследования (табл. 4).

Таблица 4

Концентрация фактора роста гепатоцитов (нг/мл) в сыворотке крови, определенная методом иммуноферментного анализа

Показатель Норма (л = 6) № группы 2-е сутки 4-е сутки 6-е сутки

НвР 13(11-22) 1.1 799* (529-844) 1809*' (1557-1967) 24* (15-30)

1.3 100** (92-121) 18" (16-25) -

Примечание: * - значимые различия по критерию Даннета 0,05);' - значимые различия по сравнению с группой 1.1 {ри < 0,05);' - значимые различия по сравнению с предыдущим показателем {рт< 0,05).

Количественный анализ НОР с помощью двух независимых методов продемонстрировал закономерность, а именно: существенное повышение уровня этого пептида под влиянием ККП на 2-е сут. - в 61 раз, прогрессивный рост на 4-е сут. - в 139 раз с тенденцией к снижению (или нормализацией) к 6-м сут. Полученные результаты подтверждают гипотезу о выработке НОР трансплантированными клетками.

Для уточнения механизмов воздействия экзогенного НОР при ОТП проведена оценка эффективности его однократного введения, а также анализ эффективности введения других клеточных продуцентов НвР, в качестве которых выбрана культура клеток селезенки. Полученные результаты выявили положительное влияние экзогенного НОР на ОТП: к 6-м сут. уровень летальности в этой группе составил 46,7 % и не имел достоверных различий с основной группой, где выполняли КТ ККП (рис. 4Б). Таким образом, в подтверждение выдвинутой гипотезы мы получили совпадение эффектов КТ ККП и экзогенного фактора роста. Следует отметить меньшую эффективность ксенотрансплантации ККС при ОТП, приводящую к повышению уровня летальности до 60 %. Установлено, что выключение из метаболизма НОР с помощью введенных антител к нему сопровождается достоверным увеличением летальности.

Для уточнения механизмов воздействия экзогенного НОР при ОТП проведено изучение некоторых показателей гомеостаза и структурных закономерностей изменения ткани печени у крыс. Установлена сохранность белково-синтетической функции печени на 2-е сут. после введения экзогенного и НОР и КТ ККС - с угнетением на 4-е сут. (рис. 8).

Ъг -о- 1.1 □ 1.3 •*' 17 У --норма - ...--а........

§*....................................*

сутки жсперлленга

Рис. 8. Количество общего белка (г/л) в сыворотке крови.

Отмечали некоторое усиление белково-синтетической функции печени животных с введением экзогенного НОР к б-м сут. на фоне угнетения этих процессов в группе с КТ ККС. Защитное воздействие НОР и ККС на липидный обмен проявлялось к 6-м сут. после введения.

Подтверждением саногенного эффекта экзогенного ЬЮР послужил уровень общего билирубина, на 2-е сут. он был наименьшим среди всех групп, однако в дальнейшем эффект исчезал с монотонным повышением общего билирубина к 6-м сут. Отметим подобную динамику и в группе с КТ ККС (рис. 9).

МО 120 103 80 60 40 20 О

-О- 1.1 □ 13 --» 1.8 -И- 1.7 — нсрлэ

I.............

сутки эксперимента

1230 1000 830 600 <юо 200 О

■О 1.1

Р •О 1.3

1.6

/ 1.7

/ — нсриа

-

1 ...........

'"—-Л . С

с/тки эксперьмента

Рис. 9. Уровень общего билирубина (А) (мкмоль/л) и активности АЛТ (Б) (МЕ/л).

Установлено, что введение НОР ограничивает цитолитические процессы в печени, однако при сравнении с основной группой выявлены достоверные отличия на 4-е и 6-е сут., где показатели цитолиза были существенно меньше.

Оцененные показатели гемостаза оставались в норме под влиянием экзогенного НОР на 2-е сут., однако уже к 4-м сут. отмечали снижение гематокрита, вязкости крови, уровня фибриногена и депрессию агрегации тромбоцитов. Противоположная картина была отмечена в группе с КТ ККП, где отмечали увеличение гематокрита, фибриногена. Установлено что однократное введение НОР по лечебному воздей-

ствию на 2-е сутки превосходит эффект ККП. К 4-м сут. ситуация становится обратной: эффективность КТ ККП превосходит эффективность экзогенного НОР.

Введение НСР и КТ ККС приводят к уменьшению воспалительной реакции при ОТП, что подтверждается нормализацией количества лейкоцитов к 6-м сут., однако сохраняется повышенный уровень количества лимфоцитов.

Выявленная закономерность свидетельствует, по нашему мнению, о недостаточности однократного введения НОР, что не позволяет в полной мере корригировать ОТП, а перенесенные клетки, постоянно продуцирующие НОР, оказываются более эффективными.

При морфологическом исследовании установлено, что однократное введение экзогенного НвР и клеток селезенки, продуцирующих НОР в большом количестве, приводит к стимуляции митогенной активности гепатоцитов на 2-е сут. (рис. 10). На фоне высокой митотической активности функция клеток снижается, как отмечено выше. На 4-е сут. выявляли повреждения, характерные для ОТП. После введения ККП к 6-м сут. эксперимента происходило восстановление структуры печени. Выявленные закономерности показали значительно более выраженное протективное действие КТ ККП в сравнении с экзогенным НОР и КТ ККС на структуру печени при токсическом повреждении.

Эффективность раннего воздействия НОР и отсутствие его эффектов в отдаленном периоде, очевидно, связано с тем, что введенный НОР уже потреблен, а новая доза отсутствует. КТ клеток печени решает эту задачу, поскольку перенесенные клетки постоянно продуцируют НОР в зависимости от потребности, так как при нормализации структуры печени к 6-м сут, снижается и уровень НОР в сыворотке крови. Отрицательным моментом влияния экзогенного НОР явилась кратковременность его эффекта и неконтролируемая митотическая активность, которая реализуется в поздние сроки повреждением гепатоцита.

¿,^¿>4 ж* * 'V*« • - •

I

: у

т

о

Л' -ЛГ^Ч 4 % г

С * V гф*.

щг- ••" ' > г »-

8Г &" • * Г- .? | •; ы^ ; • \ V

Рис. 10. Структура печени при ОТП. 2-е сутки эксперимента, световая микроскопия.

Митозы в гепатоцитах: А - дополнительная группа 1.6; Б - дополнительная группа 1.7. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 200.

Основным фактором, позволяющим объяснить лечебный механизм комплексного воздействия КТ ККП на все звенья индуцированной СС14 ОПН, может быть НОЯ 28

Нами показано, что при КТ ККП на 2-е и 4-е сут. концентрация НОР в сыворотке многократно возрастает, останавливается процесс некроза ГЦ и наблюдается разрешение токсического внутрипеченочного холестаза, активизируется белково-синтетическая функция печени, стимулируется пролиферация ГЦ и замещение новыми, активно функционирующими клетками некротизированных и апопти-рованных, что способствует восстановлению архитектоники балочных структур. К 6-м сут. структура печени содержит минимальные признаки ОТП. Результатом выявленных саногененных эффектов ксенотрансплантации культуры клеток печени явилось достоверное снижение летальности в сравнении с группами контроля.

Представленные данные послужили основанием для создания концептуальной схемы саногенеза ОТП при КТ ККП, продуцирующей НСР (рис. 11). Сущность концепции заключается в том, что ведущим саногенетическим звеном является НОР, вырабатываемый трансплантированными клетками и непосредственно участвующий в инактивации СС14 и тем самым защищающий клетки от внешнего повреждения, а также способствующий внутриклеточной регенерации и активации функции печени. Кроме того, он является мощным митогеном для гепатоцитов, что способствует восстановлению структуры печени. Таким образом, трансплантация ККП позволяет создать в подкожной клетчатке уникальную фабрику, вырабатывающую НОР и временно замещающую функцию поврежденных клеток печени реципиента.

1»ЯЯ

Эндогенный Нвр }••

гептрзл

>

Жировая инфильтрация гепатоцитов Дефрагментация ГЭР Дефрагментация ЭР

"I Экзогенный Нвр"} 4 1

Липидный Белковый Пигментный Углеводный

_обмен обмен обмен обмен

1 1 [

-| КТ нг |---

-| КТ ККП |---1

кткксН — -I

Митотическая активность _гепатоиита

— —— стимулирующий эффект ........ ослабляющий эффект

— — - новые механизмы сано- и патогенеза

Рис. 11. Концептуальная схема пато- и саногенетических механизмов острого токсического повреждения печени при ксенотрансплантации клеток-продуцентов Н6Р и его однократном введении.

На модели СС14, индуцированной ОПН, где механизм нарушения работы печени связан с токсическим повреждением органа, нами доказано, что одним из ведущих механизмов саногенеза при трансплантации ККП является выработка экзогенного НОР. Но насколько универсален выявленный механизм? Для ответа на этот вопрос дальнейший раздел работы мы посвятили исследованию эффективности разработанной технологии и саногенетических механизмов ППН в условиях КТ клеток печени и селезенки, продуцирующих НОЕ Использована модель, где причиной развития острой печеночной недостаточности является одномоментная потеря большей части органа.

Результаты исследования саногенетических механизмов пострезекционной ОПН под воздействием ксенотрансплантации клеток

При анализе летальности на модели ППН, корригированной КТ ККП и НГ, выявлены существенные различия со 2-х суток эксперимента, достигающие максимума к 5-м суткам (рис. 12). В группах контроля этот показатель приближался к 60 %, а в группе с КТ ККП составил 16,6 %. Ксенотрансплантация некультивированных ГЦ приводила к существенному снижению летальности, по сравнению с группами контроля, и составила 7,1 %, но при сравнении с основной группой различий не выявлено. Введение экзогенного НОР приводило к существенному снижению летальности до 23,3 %. ео

50 40

ээ 20 10 о

Рис, 12. Летальность (%) во второй серии экспериментов: А - основные группы;

Б - дополнительные группы второй серии экспериментов.

Выявленной закономерностью стало улучшение выживаемости животных с ППН, корригированной подкожной КТ клеток печени, независимо от способа подготовки клеточного материала, а также при введении экзогенного НОГ Однако в группе с введением ККС уровень летальности был высоким, близким по показателям к контролю, что объясняется стимуляцией митотической активности (в 1-й серии исследований показана митотическая активация при КТ ККС). ГЦ, вступая в процесс митоза, не выполняют свои функции. Обширная резекция печени в этой ситуации приводит к гибели животных при отсутствии временного протезирования функции органа пересаженными органоспецифическими клетками.

При оценке синтетической функции печени выявлено снижение уровня сывороточной ХЭ и альбумина на 2-е сутки во всех группах. Введение экзогенного НОР поддерживало на нормальном уровне показатели белково-синтетической функции 30

100 л ж

■

ЕО /

ет -- о

40 / г

20

♦ 2.8

у ->2.9

0 -»• 2.10

О сутки 1 сутки 2 сутки 3 сутки 5 сутки 11 сутхи

печени в ранние послеоперационные сроки. В дальнейшем эффект исчезал, тогда как КТ КПП и НГ сопровождалась восстановлением белково-синтетической функции печени с отсроченным максимальным эффектом на 5-е и 11-е сут. (рис. 13).

80 75 70 66 ез

55 50 45 40 35

Рис. 13. Показатели синтетической функции печени во второй серии экспериментов.

Исходно высокая активность цитолитических процессов снижалась уже на 5-е сутки после операции, а к 11-м суткам происходила нормализация показателей аминотрансфераз. Отметим, что трансплантация ГЦ не смогла предотвратить гипербилирубинемию, более выраженную в контроле, что является проявлением холестаза после обширной резекции печени.

Наиболее показательными в системе гемостаза были уровень фибриногена, время свертывания крови, агрегация тромбоцитов. Под влиянием КТ ККП и НГ в целом отмечалась нормализация этих показателей к 11 -м сут. с явлениями гипокоа-гуляции. КТ клеток печени приводит к уменьшению воспалительного ответа, вызванного ППН, что подтверждается нормализацией к 11-м сут. уровней лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов. Выявлено повышение фагоцитоза в группе с введением НГ. Однократное введение НОР приводило к ограничению цитолиза и сохранности белково-синтетической функции печени в ранние сроки, к 11-м сут. эффекты исчезали.

При патоморфологическом исследовании в печени животных с КТ клеток печени к 11-м сут. отмечали умеренные гемодинамические нарушения в виде гидропической дистрофии единичных ГЦ и мононуклеарной инфильтрации этих участков, восстановление архитектоники балок. Введение экзогенного НОР не предотвращало развития массивных деструктивных изменений, характерных для ППН, что предположительно связано с пролонгированным эффектом КТ клеток печени и кратковременностью эффектов однократного введения НОР.

На светооптическом уровне установлено, что восстановление печеночной ткани после ее резекции под влиянием КТ клеток печени происходило за счет полиплоидии, амитотического деления двуядерных ГЦ и, в меньшей степени, -митотического деления одноядерных ГЦ (по фигурам митозов). Основная нагрузка приходилась на одноядерные ГЦ с размером ядра 9 мкм уже на 2-е и 5-е сутки, что свидетельствовало о стимуляции генетического аппарата клетки.

-О 21 -А. 22 О 23 -¥- 24 л. 26 - ....."'"......^Уь ■

— юрма ^ I

I .<•'.'

Тр

А

2 5 8 11

600 550 500 450 400 350 ЭСО 250 200 150 1С0

О 21

А- 22

О 23 24 »- 26

ь

г''

..¿К

сутки эксперимента

сутки эксперимента

Для уточнения механизмов пролиферации под влиянием КТ ККП, продуцирующей HGF, было проведено иммуноморфологическое исследование проли-ферирующих клеток с использованием моноклональных антител Ki-67 (маркер пролиферативной активности) и подсчитано количество апоптозных телец с использованием моноклонального антитела - проапоптотический фактор Вах (ингибитор bcl-2). Установлено, что КТ ККП сопровождается снижением количества апоптозных клеток и активацией пролиферируюших клеток в оставшейся печени с максимальным значением показателей пролиферации к 5-м сут.

Для детализации саногенных механизмов ППН были предприняты дальнейшие исследования на известной модели 90% резекции печени с фатальной ОПН (100% летальность в контроле). Подкожная КТ клеток печени сопровождалась достоверным снижением летальности до 11-х сут. эксперимента. Наилучший результат получен при трансплантации неонатальных некультивированных ГЦ со снижением летальности до 56,6 %.

К 11-м сут. после КТ, независимо от способа подготовки клеточного материала, белково-синтетическая функция печени не восстанавливалась. Динамика показателей цитолиза свидетельствовала о стабилизации у всех выживших животных. При КТ КПП активность цитолиза, а также уровень билирубинемии достоверно выше, чем при КТ НГ, что соответствует результатам анализа летальности.

Результаты морфологического исследования печени показывают, что КТ клеток печени стимулирует регенерацию оставшейся за счет митозов, полиплоидии, гипертрофии всех популяций ГЦ. При трансплантации ККП и введении экзогенного HGF максимальное количество митозов выявляли на 2-е сут. исследования, а при КТ НГ митотическая активность смещалась на 5-е сут. Выявленные различия объясняют более высокую цитолитическую активность и проявления холестаза в поздние сроки наблюдения и соответствуют результатам анализа летальности. Одним из факторов высокой летальности при КТ КПП в сравнении с КТ НГ после 90% резекции печени явилась ранняя митотическая активность оставшихся ГЦ, которая связана с воздействием экзогенного HGF, продуцируемого трансплантированными клетками. В более поздние сроки послеоперационного периода этот патогенетический механизм реализуется тяжелым течением ППН.

Представленные данные послужили основанием для создания концептуальной схемы саногенеза ППН под воздействием КТ ККП, продуцирующей HGF (рис. 14).

Ведущим звеном здесь является протективная функция перенесенных клеток печени, следующим -действие HGF, вырабатываемого перенесенными клетками. Экзогенный HGF, который непосредственно участвует в регенерации, также способствует внутриклеточной регенерации и активации функции печени и, кроме того, является мощным митогеном для ГЦ, что способствует восстановлению структуры печени. При КТ ККП, НГ и ККС, продуцирующих HGF, и введении экзогенного HGF улучшается выживаемость. Однако следует отметить, что в группе с введением неонатальных ГЦ, где HGF вырабатывается меньше всего, результаты сопоставимы с таковыми в группе с КТ ККП, а при 90% резекции они имеют тенденцию к снижению летальности при КТ НГ. 32

стимулирующий эффект ослабляющий эффект — — - новые механизмы сано- и патогенеза

Рис. 14. Концептуальная схема пато- и саногенетических механизмов пострезекционного повреждения печени при ксенотрансплантации клеток- продуцентов HGF и его однократном введении.

Таким образом, траисплаит временно замещает функцию поврежденных клеток печени реципиента и является продуцентом HGF. Саногенные эффекты КТ клеток печени при ОПН зависят от ее генеза, что подтверждено различиями в течении ОПН при токсическом повреждении и после обширной резекции печени.

Следующей моделью для исследования саногенетических механизмов ОПН под влиянием КТ явилась печеночная недостаточность на фоне индуцированного гипоспленизма.

При морфологическом исследовании печени аспленизированных животных выявлены грубые изменения в структуре печени: очаги коагуляцнонного некроза, лейкоцитарная инфильтрация зон некрозов и портальных трактов, купферовские клетки загружены гранулами гемосидерина. Морфометрическое исследование показало снижение количества гепатоцитов и увеличение непаренхиматозных клеток в 2 раза, а клеток Купфера с эритрофагоцитозом - до 12 при нулевой норме. Аспленизация животных приводит к угнетению белково-синтетической функции печени с наиболее низкими показателями на 7-е сут. Повышенная активность ACT и АЛТ прежде всего связана с инфильтрацией лейкоцитами участков с коагуляционным некрозом гепатоцитов и лизисом последних. Выявленная закономерность свидетельствует о воспалительном происхождении печеночной недостаточности при аспленизации животных. Этот генез ОПН не представлен в современной литературе.

Методом статической гамма-сцинтиграфии было установлено, что спленэкто-мия способствует бактериальной транслокации (накопление меченых бактерий из кишечной трубки в области печени). Полученные результаты свидетельствуют о поражении печени, источником которого является бактериальна я транслокация.

33

Таким образом, в условиях аспленизации развивается воспалительное повреждение печени с развитием ОПН, которая манифестирует повышением цитолити-ческих ферментов и угнетением белково-синтетической функции поврежденной печени и реализуется гибелью животных. Патогенез связан, с одной стороны, с транслокацией микрофлоры в систему воротной вены: первичная локализация некротически-воспалительных процессов при морфологическом исследовании выявляется преимущественно в зоне портальных трактов. Вторым патогенетическим звеном ВПП является усиленный фагоцитоз эритроцитов клетками Купфера.

На этой модели изучена эффективность разработанной клеточной технологии и саногенеза ВПП в условиях КТ и введения экзогенного НОР. При анализе летальности (рис. 15) установлено, что приводит к гибели 100 % животных на 7-9-е сут. КТ ККП снижает уровень летальности животных до 33,3 %, а КТ ККС - до 23,3 %. В контрольных группах уровень летальности был выше. Так при КТ НКС он составил 43,3 %, а при введении экзогенного НвР - 50 %.

100 80 60 40

20 0

Рис. 15. Летальность (%) в третьей серии экспериментов.

Вьивленной закономерностью стало улучшение выживаемости животных с ВПП, корригированным подкожной КТ клеток печени и селезенки, а также при введении экзогенного HGF. При морфологическом исследовании установлено, что ксенотрансплантация ККС и ККП оказывает выраженный саногенный эффект, включающий в себя сохранность балочной структуры печени, отсутствие очагов коагуляционного некроза и гидропической дистрофии, увеличение количества ГЦ и непаренхиматозных клеток печени, снижение инфильтрации портальных трактов.

КТ ККС и ККП предотвращает развитие цитолитических процессов в печени, в то время как после КТ НКС и введения HGF уровень ACT был существенно выше нормы с постепенным снижением к 21-м сут., более выраженным у животных с HGF. Изначально высокий уровень AJIT нормализовался к 21 -м суткам в группах с КТ ККС и ККП и, напротив, повышался в контрольной группе с КТ НКС. Отметим существенное снижение с 14-х на 21-е сут. уровня AJ1T у животных с введением HGF, по сравнению с другими группами. Уровень ЛАП (показатель повреждения эпителия билиарного тракта) на вторые сутки был пониженным в основных группах

5 сутки бсутки 7 сутки 8 сутки 9 сут» Юсутхи 13 сутки 14 сутки 15 сутки 21 сутки

и существенно повышенным в контроле, кроме группы с введением ПОР, где изучаемый показатель не отличался от нормального. Начиная с 7-х и до 21 -х сут. уровень ЛАП нормализовался при КТ ККП и ККС. В целом при оценке цитолитических процессов в печени установлено мощное протекторное действие ККС и ККП.

Сравнительный анализ показателей белково-синтетической функции печени выявил стимулирующий эффект КТ ККС и ККП, по сравнению с другими вариантами коррекции. Это выражалось в повышении уровней сывороточной ХЭ, общего белка и альбумина на 14-2 ] -е сут. эксперимента. Введение экзогенного НОР поддерживало синтетическую функцию печени и нормальный уровень активности цитолитических ферментов в сыворотке крови на 2-е сут., в дальнейшем эффект исчезал. Выявленная закономерность не противоречит гипотезе, а свидетельствует о низкой эффективности однократного введения экзогенного НвР на выбранной модели.

При оценке системной воспалительной реакции оказалось, что ее максимальные проявления наблюдались у аспленизированных животных, а КТ ККС, ККП и НОР снижали уровень лейкоцитов более эффективно, чем НКС. Следовательно, КТ клеток селезенки и печени купирует проявления системной воспалительной реакции. Уровень сегментоядерных нейтрофилов под влиянием КТ ККС, ККП, НОР приходит к норме на 21-е сут., а КТ НКС приводила к снижению этого показателя, по сравнению с нормой. В то же время количество моноцитов в мазке крови нормализуется при КТ ККС и введении НОР на 21-е сут. исследования, в то время как у животных с КТ НКС показатели повышены, а при КТ ККП — понижены.

Также установлено, что КТ клеток селезенки и печени способствует нормализации неспецифической резистентности организма, при этом не сопровождается иммунной реакцией. Это выражается в нормализации показателей лейкоцитоза, фагоцитоза, циркулирующих иммунных комплексов у животных основных групп с КТ ККС и ККП к 21-м сут. эксперимента. В контроле и при введении НОР (2-7-е сутки) наблюдали депресссию фагоцитоза.

Для подтверждения гипотезы о роли экзогенного НОР, вырабатываемого перенесенными клетками селезенки и печени, как ведущего саногенетического звена при ВПП в условиях аспленизации проведена динамическая оценка количества НОР в крови (табл. 5).

Таблица 5

Количество фактора роста гепатоцитов сыворотки крови в третьей серии экспериментов, определенное методам иммунофермемпного

анализа

Показатель Норма (л = 6) № группы 5-е сутки 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки

нюг 12 (11-22) 3.2 392* (378-412) 874*' (843-982) 137" (111-163) 173* (154-189)

3.3 31* (11-78) 79*' (66-131) 62*' (59-111) 64** (50-91)

3.4 4" (3-5) 8* (0,6-19) - -

Примечание: * - значимые различия по критерию Даннета;" - значимые различия по сравнению с группой 3.2 (ри < 0,05);' - значимые различия по сравнению с предыдущим показателем в той же группе {рш<0,05).

Количество НвР возрастало в основной группе с КТ ККС в 30 раз и в 2 раза-в группе с КТ НКС, тогда как в группе аспленизаации уровень НвР на 5-е сут. уменьшался в 2 раза, по сравнению с нормой; это значение было существенно ниже, чем в группах с КТ. Пик концентрации ЬЮР у животных основной группы был отмечен нами на 7-е сутки эксперимента - в 67 раз больше нормального значения - и оставался многократно повышенным до 21-х суток эксперимента.

Представленные данные послужили основанием для создания концептуальной схемы пато- и саногенеза печеночной недостаточности при аспленизации в условиях КТ культуры клеток продуцентов НвР (рис. 16).

аспленизация

бактериальная транслокация

—Н Эндогенный НОР |

фагоцитоз клетками Купфера эритроцитов

Воспалительное повреждение печени

♦ .. Т г

| Экзогенный НСР (-п ^ —-.

Уменьшение количества гепатоиитов

Вакуолизация цит. гепатоиитов

Нарушение балочнор стр-ры

Лейкоцитарная инсЬипьтпаиия

Липидный Белковый Пигментный Углеводный

обмен обмен обмен обмен

стимулирующий эффект ослабляющий эффект — — - новые механизмы сано- и патогенеза

Рис. 16. Концептуальная схема пато- и саногенетических механизмов воспалительного повреждения печени вследствие аспленизации при ксенотрансплан-тации клеток- продуцентов НОЯ и его однократном введении.

Ведущим саногенетическим звеном ВПП является НОР, продуцируемый перенесенными клетками. На выбранной модели НвР способствует внутриклеточной регенерации и активации функции печени, кроме того, является мощным мито-геном для ГЦ, что стимулирует восстановление структуры печени. Введенные в организм реципиента клетки достоверно улучшают состояние всех видов обмена, контролируемых печеночными клетками.

Результаты исследования, проведенного нами с применением методов экспериментальной хирургии и патологической физиологии, в комплексе с данными литературы позволили сформулировать алгоритм коррекции ОПН различного 36

генеза в зависимости от преобладающего саиогеиетического механизма клеточной трансплантации (рис. 17).

Рис. 17. Концептуальная схема пато- и саногенетических механизмов ОПН различного генеза при KT клеток печени или селезенки.

Осмысление результатов исследования позволяет выделить три уровня сано-генного воздействия клеток при ксенотрансплантации:

1. Воздействие биологически активных веществ эмбриональных клеток. Патогенетическое обоснование клеточной терапии было проведено в Научном центре реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН группой профессора A.A. Руновича. На модели коронарного атеросклероза и адреналинового повреждения миокарда убедительно доказано, что продукты клеточного распада и компоненты трансплантата обладают широким спектром саногенных эффектов, в том числе на печеночную дисфункцию. Наша постановка задачи не предполагала оценки мошности этого механизма воздействия.

2. Непосредственное воздействие органоспецифических клеток, по определению S. Gupta, «метаболическая поддержка», широко представлено в литературе и воспроизведено в представленной работе трансплантацией некультивированных (выделенных) ГЦ и клеток селезенки. Саногенные эффекты второго уровня особенно ярко проявлялись на модели ППН, когда пусковым механизмом является критическое снижение массы функционирующих ГЦ.

3. Наконец, высшим уровнем влияния характеризуется трансплантация ку-льуры клеток, которая дополняет первые два механизма новым - воздействием продуктов жизнедеятельности клеточной кооперации, а именно, внеклеточных

регуляторных пептидов. Выработка этих веществ требует взаимодействия ГЦ с непаренхиматозными клетками, компонентами внеклеточного матрикса и т.д., что изменяет свойства клеточного материала за счет оптимизации условий для выживания, дифференцировки и пролиферации.

Если изолированные ГЦ не выживали при пересадке под кожу или в мышцу, то мы наблюдали морфогенетические трансформации ксенотрасплантата, присущие пересадке алло- или аутогенной ткани, на протяжении по крайней мере 21 суток - в период развития ОПН.

Совпадение вектора эффектов КТ культуры клеток печени и селезенки с вектором воздействия ЬЮР убеждает в целесообразности применения ксеногенной культуры клеток как продуцента этого регуляторного пептида.

Безусловно, эффекты «третьего уровня» невозможны без саногенетической индукции предыдущих уровней. Свидетельством этому является меньшая (пусть и отчетливая по сравнению с контролем) эффективность применения культуры клеток селезенки при ОТП и наоборот - на модели аспленизации с ВПП культура клеток селезенки оказывается более саногенной, чем культура клеток печени. Это, с нашей точки зрения, является следствием органоспецифичности фактора роста, а возможно - продукцией его изомеров. Безусловно, НОР - далеко не единственный регуляторный пептид, вырабатываемый метаболически активными эмбриональными и неонатальными клетками печени и селезенки с низкой иммуногенностью.

Мы лишь постарались раскрыть саногенетическую значимость этого эффекта трансплантации культуры клеток- пожизненной продукции пептидных регуляторов морфогенеза, одним из которых является выбранный НОР.

Разработанные клеточные технологии позволяют создавать тканевой банк, достаточно долго сохраняя жизнеспособную культуру эмбриональных или неона-тальных клеток для быстрого приготовления к использованию.

В этой связи представляется целесообразным, комбинируя названные эффекты трансплантации органоспецифических клеточных культур, продолжить поиск путей частичной замены жизненно важных органов, утративших свою функцию.

Таким образом, обобщенные результаты проведенного исследования расширяют современные представления о саногенетических механизмах ОПН различного генеза при КТ клеток печени и селезенки.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология выделения, культивирования и криоконсервации неонатальных клеток селезенки свиньи, позволяющая получать ассоциированную культуру ретикулоцитов и лимфоцитов с содержанием 4,6 (4,1-4,8) х 107 клеток в 1 мл взвеси и показателем жизнеспособности 98,2 (97,8-98,5) % после 6-месячной криоконсервации. Применение предложенной технологии для печени свиньи позволяет получать ассоциированную культуру гепатоцитов и непаренхиматозных клеток с выходом 2,9 (2,4-3,1) ж 107 клеток в 1 мл взвеси и высоким показателем жизнеспособности - 86,9 (83,8-89,0) % после длительной криоконсервации.

2. В процессе культивирования эмбриональных и неонатальных клеток печени или селезенки свиньи происходит закономерное увеличение концентрации фактора роста гепатоцитов в среде культивирования, достигающее максимума на 5-е сут. При этом содержание НОР в культуре клеток печени увеличивается в 3,5 раза, а в культуре клеток селезенки - в 225 раз. Повышение уровня фактора роста гепатоцитов в процессе культивировании клеточной ассоциации служит показателем пригодности материала для трансплантации.

3. На модели ОПН, вызванной: а) ОТП, б) обширной резекцией или в) ВПП вследствие аспленизации, установлено, что криоконсервированная культура клеток печени и селезенки свиньи, пересаженная под кожу крысе, частично выживает к б-м, 11-м и 21-м сут. после трансплантации соответственно. Лейкоцитарная инфильтрация зон ксенотрансплантации отсутствует, а структура трансплантата соответствует классическим описаниям перенесенной ткани при свободной алло- и аутотрансплантации. Это свидетельствует о высокой жизнеспособности и минимальной иммуногенности клеточного материала, полученного с применением разработанных технологий.

4. КТ культуры клеток печени и селезенки при печеночной недостаточности на фоне ОТП является эффективным методом снижения летальности и ограничения цитолитического и холестатического синдромов, системной воспалительной реакции, расстройств белково-синтетической функции. Морфологическим эквивалентом выявленных эффектов ксенотрансплантацин оказывается восстановление и сохранность балочной структуры с преобладанием неповрежденных гепатоцитов, уменьшение жировых включений, увеличение количества непаренхиматозных клеток печени. Применение культуры клеток печени более эффективно, чем культуры клеток селезенки, но оба метода существенно улучшают течение печеночной недостаточности по сравнению с контролем и однократной инъекцией фактора роста гепатоцитов. Введение антител к фактору роста гепатоцитов приводит к необратимому развитию печеночной недостаточности.

5. При обширных резекциях печени КТ НГ оказывается наиболее эффективным методом коррекции печеночной недостаточности за счет протективной функции пересаженных клеток. Избыток НОР, продуцируемого культурой клеток при КТ, обусловливает негативный эффект за счет неконтролируемой стимуляции мито-тической активности уцелевших гепатоцитов реципиента.

6. Патогенетические механизмы формирования ОПН, вызванной асплениза-цией, включают бактериальную транслокацию микрофлоры из кишечной трубки в портальную систему и воспалительное повреждение печени вследствие чрезмерного эритрофагоцитоза клетками Купфера с лейкоцитарной инфильтрацией и некрозами паренхимы. В этих условиях ксенотрансплантация культуры клеток селезенки или печени обеспечивает выраженный саногенный эффект, который заключается в снижении летальности, профилактике нарушения гомеостаза и сопровождается многократным (до 67 раз выше нормы) повышением концентрации НОР в сыворотке крови.

7. Особенностью саногенеза ОПН в условиях КТ криоконсервированной культуры клеток печени или селезенки является пролонгированный эффект повышенных концентраций НОР, вырабатываемого перенесенным материалом. Результатом оказывается ограничение воспалительного и токсического повреждения паренхимы печени, стимуляция регенераторных процессов и, в частности, пролиферативной активности гепатоцитов, что дополняет протективную функцию пересаженных органоспецифических клеток, а при пострезекционной печеночной недостаточности, напротив, нивелирует ее.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Технология получения ассоциированной культуры клеток печени или селезенки свиньи с высоким показателем жизнеспособности после длительной крио-консервации предусматривает последовательное выполнение обработки печени или селезенки свиньи коллагеназой с целью микрофрагментации. Дезагрегацию клеток печени для последующего культивирования следует проводить до получения ассоциаций гепатоцитов и непаренхиматозных клеток, содержащих не более 10 клеточных элементов. Для клеток селезенки - получение взвеси изолированных клеток, содержащих не более 5 % микрофрагментов по 2-4 клетки.

2. Оптимальная величина рН среды для культивирования клеток селезенки является 7,6.

3. Для оценки жизнеспособности клеток печени следует оценивать уровень НОР методом иммунофермеитного анализа.

4. Снижение уровня НОР (НОР < (4) позволяет прогнозировать сниженную биорегуляторную активность ККП.

5. Криоконсервации следует подвергать 5-суточную культуру неонатальных клеток селезенки.

6. Для криоконсервации культуры эмбриональных клеток печени или культуры неонатальных клеток селезенки свиньи следует применять среду, приготовленную по разработанной нами рецептуре. Элиминации криоконсерванта из приготовленного для трансплантации препарата, содержащего клетки печени или селезенки, не требуется.

7. Для коррекции острой печеночной недостаточности токсического генеза необходимо использовать криоконсервированную культуру ассоциатов эмбриональных клеток свиной печени продуцирующих фактор роста гепатоцитов.

8. Для коррекции острой печеночной недостаточности пострезекционного генеза целесообразно использование неонатальных гепатоцитов в предоперационном периоде (за 2-е суток).

9. Для коррекции воспалительного повреждения печени целесообразно применение ассоциатов культуры криоконсервированных клеток селезенки свиньи, продуцирующих фактор роста гепатоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лепехова С.А., Гольдберг O.A., Прокопьев М.В., Апарцин К.А. Морфологическая оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки свиньи // Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии : матер. 2-й межрегион, науч.-практ. конф. - Омск, 2000. - С. 40-41.

2. Лепехова С.А., Прокопьев М.В. Клеточный состав печени при острой печеночной недостаточности, корригированной трансплантацией культуры клеток печени // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: матер, молодежной научн. конф. СО РАМН. - Новосибирск, 2000. - С. 65.

3. Лепехова С.А., Прокопьев М.В., ШехинаН.И. Сравнительное исследование некоторых биохимических показателей при острой печеночной недостаточности, корригированной ксенотрансплантацией // Актуальные вопросы современной клинической медицины в условиях ОМС: сб. статей науч.-практ. конф. - Иркутск, 2000. - С. 226-227.

4. Попов М.В., Галеев Ю.М., Апарцин К.А., Аюшинова Н.И., Лепехова С.А. и др. Радионуклидная оценка функциональной активности и фильтрационной функции красной пульпы селезенки после органосохраняющих операций // Актуальные вопросы современной клинической медицины в условиях ОМС: сб. статей науч.-практ. конф. - Иркутск, 2000. - С. 481-483.

5. Апарцин К.А., Гольдберг O.A., Лепехова С.А., Прокопьев М.В. Строение эктопированной ткани селезенки при ауто- и ксенотрансплантации // Органосох-раняющая хирургия селезенки. - Новосибирск: Наука, 2001. - С. 84-103.

6. Апарцин К.А., Прокопьев М.В., Аюшинова Н.И., Лепехова С.А. Механизмы развития постспленэктомических расстройств гомеостаза // Органосохраняющая хирургия селезенки. - Новосибирск : Наука, 2001. - С. 121-140.

7. Аюшинова Н.И., Гольдберг O.A., Прокопьев М.В., Лепехова С.А. и др. Хирургическая профилактика синдрома гипоспленизма в эксперименте // Бюл. СО РАМН. - 2001. - № 2. - С. 66-69.

8. Лепехова С.А. Изменение поведения крыс при остром токсическом повреждении печени // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2001. - Т. 2, № 3 (17). -С. 99-100.

9. Прокопьев М.В., Лепехова С.А., Зарицкая Л.В., Постовая О.Н., Апарцин К.А. Оценка функционального состояния клеток селезенки после криоконсервации //Бюл. ВСНЦ СО РАМН.-2001.-Т. 2, №3 (17).-С. 100.

10. Апарцин К.А., Гольдберг O.A., Лепехова С.А. и др. Морфологическая и биохимическая оценка ксенотрансплантации клеток селезенки в раннем постгран-сплантационном периоде // Бюл. СО РАМН. -2002.-№2,- С. 152-154.

11. Лепехова С.А., Апарцин К.А., Гольдберг O.A. и др. Новые возможности коррекции острой печеночной недостаточности // Бюл. СО РАМН. - 2002. - № 3. -С. 48-54.

12. Лепехова С.А., Гольдберг O.A., Апарцин К.А. Ультраструктура гепатоци-тов при остром токсическом повреждении печени, корригированном ксенотран-

41

сплантацией культуры эмбриональных клеток печени П Проблемы морфологии (теоретические и клинические аспекты): тез. докл. общерос. конф. с междунар. участ.-М, 2002.-С. 40.

13. Лепехова С.А., Гольдберг O.A., Прокопьев М.В. Коррекция острой печеночной недостаточности // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - № 2. - С. 54-59.

14. Лепехова С.А., Зуева О.О. Способы клеточной метаболической поддержки в коррекции печеночной недостаточности (обзор литературы) // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - № 2. - С. 64-70.

15. Плеханов А.Н., Лепехова С.А., Товаршинов А.И., Ежикеева С.Д. Применение изолированных ксеногенных клеток печени при моделированной острой печеночной недостаточности, вызванной обширной резекцией печени в эксперименте // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - № 2. - С. 62-64.

16. Плеханов А.Н., Товаршинов А.И., Гольдберг O.A., Лепехова С.А. Экспериментальное обоснование эффективности использования криоконсервированных ксеногепатоцитов при печеночной недостаточности /У Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2002.-Т. 1,№ 5.-С. 104-107.

17. Плеханов А.Н., Товаршинов А.И., Лепехова С.А., Ежикеева С.Д. Функциональный статус печени в процессе ее регенерации // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2002.-№2.-С. 51-53.

18. Плеханов А.Н., Товаршинов А.И., Лепехова С.А. и др. Ксенотрансплан-тация в коррекции пострезекционной печеночной недостаточности // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - Т. 1, № 5. _ с. 107-114.

19. Прокопьев М.В., Лепехова С.А., Апарцин К.А. Ксенотрансплантация клеток селезенки для коррекции постспленэкгомического гипоспленизма // Орга-носохраняющая хирургия селезенки. - Новосибирск : Наука, 2001. - С. 369-380.

20. Прокопьев М.В., Лепехова С. А., Гольдберг O.A. и др. Морфологическая и биохимическая оценка ксенотрансплантации клеток селезенки в раннем посттрансплантационном периоде//Бюл. ВСНЦ СО РАМН.-2002.-Т. 1,№5.-С. 126-129.

21. Чикотеев С.П., Плеханов А.Н., Гольдберг O.A., Лепехова С.А. и др. Печеночная недостаточность. — Иркутск, 2002. — (Очерки хирургии печени и поджелудочной железы; Т. III). - 260 с.

22. Лепехова С.А. Прокопьев М.В., Кравченко A.B. Перспективы клеточной хирургии // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - № 3. - С. 49-52.

23. Чикотеев С.П., Плеханов А.Н., Товаршинов А.И., Лепехова С.А. Современное состояние проблемы трансплантации изолированных гепатоцитов при печеночной недостаточности // Клиническая медицина. - 2003. - Т. 81, № 4. — С. 11-15.

24. Апарцин К.А., Лепехова С.А., Плеханов А.Н., Товаршинов А.И. Использование трансплантационных методов в лечении печёночной недостаточности // Восстановительные и органосохраняющие технологии - главный путь развития хирургии XXI века: матер, науч. конф. - М., 2004. - С. 86.

25. Апарцин К.А., Лепехова С.А., Прокопьев М.В. Трансплантационные способы коррекции постспленэкгомического гипоспленизма // Дизрегуляционная паго-

логия органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология): тез. докл. III Рос. конгр. по патофизиологии с междунар. участ. - М., 2004. - С. 219.

26. Лепехова С.А. Поиск новых способов коррекции острой печёночной недостаточности: результаты совместной работы НЦ PBX ВСНЦ СО РАМН и исследователей Республиканской больницы Республики Бурятия // Бюл. ВСНЦ СО РАМН.-2004,-№6.-С. 134-137.

27. Лепехова С.А., Апарцин К.А., Гольдберг O.A. и др. Эффективность метаболической клеточной коррекции острой печёночной недостаточности // Науки о человеке : матер. V Междунар. конгр. молодых учёных и специалистов. - Томск, 2004. - С. 298-299.

28. Лепехова С.А., Гольдберг O.A., Апарцин К.А. Регенерация печени при клеточной коррекции острой печёночной недостаточности // Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология : тез. докл. III Рос. конгр. по патофизиологии с междунар. участ. — М., 2004. -С. 231-232.

29. Лепехова С.А. Гольдберг O.A., Зарицкая Л.В. Лечение печёночной недостаточности // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: матер. V молодёж. науч. конф. - Новосибирск, 2004. - С. 131-132.

30. Лепехова С.А., Марченко В.И., Прокопьев М.В. и др. Влияние ксенотран-сплантации изолированных и культивированных клеток печени на показатели системы гемостаза при острой печёночной недостаточности // Восстановительные и органосохраняющие технологии - главный путь развития хирургии XXJ века : матер, науч. конф. - М., 2004. - С. 85-86.

31. Лепехова С.А., Плеханов А.Н., Товаршинов А.И., Прокопьев М.В. Ксе-нотрансплантация ксеногенных клеток печени при моделированной острой печёночной недостаточности, вызванной обширной резекцией печени в эксперименте П Сиб. журн. гастроэнтерол. гепатол. - 2004. - № 18 (сент.). - С. 107-109.

32. Плеханов А.Н., Товаршинов А.И., Лепехова С.А. и др. Морфо-функциональная оценка эффективности ксенотрансплантации гепатоцитов в коррекции пострезекционной печеночной недостаточности в эксперименте // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - № 4. - С. 30-36.

33. Апарцин К. А., Лепехова С. А., Прокопьев М.В. и др. Технология криоконсерва-ции ксеногенного клеточного материала // Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий : сб. тез. науч-практ. конф. - Новосибирск, 2005.-С. 6.

34. Корнилов Н.Г. Лепехова С.А., Прокопьев М.В. Регенерация печени и топографо-анатомические перемещения элементов гепато- дуоденальной связки после анатомических резекций // Альманах института хирургии им. Вишневского. - 2006. - № 1. Высокотехнологические методы диагностики и лечения в абдоминальной хирургии - проблемы визуализации : матер, первой науч.-практ, конф. - М., 2006. - С. 75-77.

35. Корнилов Н.Г., Прокопьев М.В., Лепехова С.А. Регенерация печени в раннем послеоперационном периоде и топографо-анатомические перемещения

элементов гепатодуоденальной связки после анатомических резекций печени И Анналы хирургической гепатологии. - 2005. - Т. 10, № 2. - С. 164.

36. Корнилов Н.Г., Прокопьев М.В., Лепехова С.А., Рой Т.А. Регенерация печени в раннем послеоперационном периоде в эксперименте // Бюл. сибирской медицины. - 2005. - Т. 4, прил. 1. Тез. докл. V Сибирского физиологического съезда. - Томск, 2005. - С. 175-176.

37. Лепехова С.А. Экспериментальное исследование эффектов ксенотран-сплантации клеток печени и селезенки при органной недостаточности // Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий: сб. тез. науч-практ. конф. - Новосибирск, 2005. - С. 4.

38. Лепехова С.А., Апарцин К.А., Прокопьев М.В., Гольдберг O.A. Сано-генные эффекты ксенотрансплантации клеток печени при остром токсическом повреждении печени // Анналы хирургической гепатологии. - 2005. - Т. 10, № 2. -С. 203-204.

39. Лепехова С.А., Гольдберг O.A., Апарцин К.А., Прокопьев М.В. Защитный и регенераторный процессы при остром токсическом повреждении печени, корригированном ксенотрансплантацией культуры эмбриональных клеток печени // Матер, выездного пленума Проблемной комиссии «Неотложная хирургия» и науч.-практ. конф., посвящ. 60-летию научного хирургического общества на Кавказских Минеральных Водах. - М., 2005. - С. 274-275.

40. Прокопьев М.В., Каргин А.Г., Лепехова С.А. Получение клеток селезенки для нужд трансплантационных методов лечения // Матер, конф. молодых ученых, посвящ. 60-летию Института хирургии им. A.B. Вишневского. - М., 2005. — С. 442-443.

41. Прокопьев М.В., Лепехова С.А., Гольдберг O.A. и др. Влияние ксенотрансплантации клеток селезёнки на белково-синтетическую функцию печени у аспленизированных крыс // Науки о человеке: матер. VI междунар. конгр. молодых учёных и специалистов. - Томск, 2005. - С. 52.

42. Чикотеев С.П., Корнилов Н.Г., Плеханов А.Н., Прокопьев М.В., Лепехова С.А. Интраоперационная профилактика печеночной недостаточности при обширных резекциях печени//Достижения современной гастроэнтерологии: мат. XIII науч.-практ. конф. - Томск, 2005. - С. 170-173.

43. Лепехова С.А., Апарцин К.А., Прокопьев М.В., Гольдберг O.A. Экспериментальное исследование эффектов ксенотрансплантации клеток печени // Анналы хирургической гепатологии. - 2006. - Т. 11, № 3. - С. 49.

44. Лепехова С.А., Гольдберг O.A., Апарцин К.А. Исследование саногенных механизмов клеточной коррекции острой печеночной недостаточности // Междун. медицинская науч. конф. между Автономной Республикой Внутренней Монголией КНР и Республикой Бурятия РФ : сб. науч. ст. - Маньчжурия (Китай), 2007. -С. 273.

45. Прокопьев М.В., Лепехова С.А., Плеханов А.Н., Корнилов Н.Г. Регенерация печени после анатомических резекций /// Междун. медицинская науч. конф. между

Автономной Республикой Внутренней Монголией КНР и Республикой Бурятия РФ : сб. науч. ст. - Маньчжурия (Китай), 2007. - С. 242-243.

46. Корнилов Н.Г., Чикотеев С.П., Прокопьев М.В., Лепехова С.А. Обширные резекции печени (экспериментальное обоснование и клинический опыт) // Анналы хирургической гепатологии. — 2008. — Т. 13, № 1. - С. 47-50.

47. Лепехова С.А., Апарцин К.А., Прокопьев М.В. Воспалительное повреждение печени после аспленизации // Инфекции в хирургии. - 2008. - Т. 6 (прил. 1).-С. 40-41.

48. Каргин А.Г., Рой Т.А., Лепехова С.А. и др. Развитие иммунодефицита вследствие аспленизации // Сибирский мед, журнал. - 2009. - № 7. - С. 100-101.

49. Лепехова С.А., Апарцин К.А., Гольдберг O.A. Воспалительное повреждение печени в раннем послеоперационном периоде на фоне аспленизации животных //Вестн. Бурятской гос. сельскохозяйств. акад. - 2009. - № 1 (14). - С. 6-11.

50. Лепехова С. А., Апарцин К. А., Зарицкая Л.В. Влияние ксенотрансплантации культуры клеток печени на изменения неспецифической резистентности организма при остром токсическом повреждении печени // Сибирский мед. журнал. - 2009. -№7.-С. 101-104.

Патенты

1. Среда для криоконсервации клеток селезенки [Текст]: пат. 2194753 Рос. Федерация: МКИ 7 С 12 N 5/00,5/08,1/04 / Лепехова С.А., Прокопьев М.В., Апарцин К.А., Гольдберг O.A.; заявитель и патентообладатель ГУ Научный центр рекон. и восстан. хирургии ВСНЦ СО РАМН. ~№ 2001101802/13; заявл. 18.01.2001; опубл. 20.12.2002, Бюл. № 33.- 1 с.

2. Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте [Текст]: пат. 2232550 Рос. Федерация: МПК 7А61 В 17/00, А61 К 35/407 / Чикотеев С.П., Товаршинов А.И., Гольдберг O.A., Лепехова С.А., Корнилов Н.Г.; заявитель ГУ Научный центр рекон. и восстан. хирургии ВСНЦ СО РАМН, патентообладатели Плеханов А.Н., Товаршинов А.И. - 2002119986/14; заявл. 22.07.2002; опубл. 20.02.2004, Бюл. №5.-1 с.

3. Способ приготовления бактериального радиофармпрепарата [Текст]: пат. 2255748 Рос. Федерация; МПК7 А 61 К 35/74 51/00 / Кувшинов А.Г., Ильичева Е.А., Лепехова С.А., Шамеев А.Ю., Чикотеев С.П., Коваль Е.В., Фадеева Т.В., Максиков Д.И., Галеев Ю.М., Попов М.В.; заявитель ГУ Научный центр рекон. и восстан. хирургии ВСНЦ СО РАМН, патентообладатели Кувшинов А.Г., Ильичева Е.А., Лепехова С.А., Шамеев А.Ю., Чикотеев С.П., Коваль Е.В., Фадеева Т.В., Максиков Д.И., Галеев Ю.М., Попов М.В. - 2003115590/15; заявл. 26.05.2003; опубл. 10.02.2005, Бюл. № 19,- 1 с.

4. Способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфических исследований: [Текст]: пат. 2290643 Рос. Федерация: МПК7 G 01 N 33/60; G 12 N 1/20 / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В., Коваль Е.В., Лепехова С.А., Фадеева Т.В.; заявитель и патентообладатель ГУ Научный центр

рекон. и восстан. хирургии ВСНЦ СО РАМН. - 2005122078/13; заявл. 12.07.05; опубл. 27.12.06, Бюл. №36. - 1 с.

5. Способ оценки жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени: [Текст]: пат. 2366704 Рос. Федерация: МПК7 С 12 N 5/00 5/06 5/08 / Лепехова С.А., Апарцин К.А., Прокопьев М.В., Гольдберг O.A., Кравченко A.A., Каргин А.Г., Боровский Г.Б., Никифоров С.Б.; заявитель и патентообладатель ГУ Научный центр рекон. и восстан. хирургии ВСНЦ СО РАМН. - 2007145007/13; заявл. 03.12.2007; опубл. 10.09.2009, Бюл. № 24. - 1 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминотрансфераза

ACT - аспартатаминотрансфераза

ВПП - воспалительное повреждение печени

ГГТП - гаммаглутамилтранспептодаза

ГЦ -гепатоцит

ГЭР - гранулярный эндоллазматический ретикулум

иг - изолированные гепатоциты

кк - клетки Купфера

ккп - культура эмбриональных криоконсервированных клеток печени

ккс - культура неонатальных криоконсервированных клеток селезенки

KT - ксенотрансппантация

ЛАП - лейцинаминопептидаза

лдг - лактатдегидрогеназа

нг - криоконсервированные изолированные неонатальные гепатоциты

нкс - криоконсервированные неонатальные клетки селезенки

ОАК - общий анализ крови

опн - острая печеночная недостаточность

отп - острое токсическое повреждение печени

ПН - печеночная недостаточность

ппн - пострезекционная острая печеночная недостаточность

CK - стволовые клетки

сэ - сппензктомия

хэ - холинэстераза

э - эндотелиоциты

ЭР - эндоллазматический ретикулум

HGF - фактор роста гепатоцитов

Подписано в печать 28.05.2010. Бумага офсетная. Формат 60x84'/,

Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 2,0 _ _ Тираж 100 экз. Заказ № 223-10._

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmall.com)

Проблема лечения острой печеночной недостаточности по-прежнему остается актуальной проблемой медицины, так как, несмотря на совершенствование методов лечения, летальность при возникновении тяжелых форм достигает 70-90 % и сохраняется высокий риск хронизации патологических процессов в печени [91, 268, 502].

Методы, используемые при лечении острой печеночной недостаточности, чрезвычайно разнообразны: это и медикаментозное лечение, и применение различных методов детоксикации, и мероприятия, направленные на стимуляцию регенерации гепа-тоцитов, и, конечно же, трансплантация - как органная, так и клеточная [4, 268, 289].

Имеются доказательства, что наиболее активно способствуют восстановлению поврежденной печени биотехнологические методы, связанные с использованием свиных тканей, в том числе биоискусственные системы при различных вариантах печеночной недостаточности [80,112]. Предлагается использовать ксенотрансплантацию нативных гепатоцитов в качестве временной меры перед аллотрансплантацией печени [216, 268, 289, 327], а также ксеноселезенки для лечения больных не только с иммунными нарушениями и в условиях хирургической инфекции [131], но и при печеночной недостаточности [46, 67, 87, 113], причем лечебное воздействие используемых клеток объясняется эффектами биологически активных веществ и контактным воздействием живых клеток. Известны также корригирующие эффекты воздействия ксенотрансплантации культуры клеток селезенки при постспленэкгомическом гипоспленизме [7].

Данные литературы свидетельствуют о том, что клетки, выделенные из органа, сохраняют функциональные свойства и характерную цитологическую структуру [31, 170, 181].

До настоящего времени разрабатываются технологии выделения [106, 170, 440], культивирования и криоконсервации [53, 64, 472] клеток печени и селезенки, дискутируются оптимальные способы их введения в организм реципиента [59, 74, 502, 506].

Известно, что трансплантированные изолированные гепатоциты не столько увеличивают функционирующую массу печени, сколько изменяют гуморальные и молекулярные механизмы, отвечающие за активацию функций оставшихся гепатоцитов реципиента и регенерацию, путем выработки регуляторных пептидов, среди которых ведущая роль принадлежит факторам роста [178, 474].

Среди известных факторов роста выделяют один, обладающий наиболее выра1 женным митогенным эффектом на гепатоциты - фактор роста гепатоцитов. Ответственными за выработку этого фактора являются клетки ито. а также эндотелиальные и купферовские клетки печени, ретикулярные клетки селезенки. Эмбриональная ткань печени содержит большое количество фактора роста гепатоцитов и его рецепторов; гепатоциты зародыша в первом триместре развития активно отвечают на стимуляцию фактором роста гепатоцитов [148, 436].

Спектр эффектов фактора» роста гепатоцитов многообразен. Прежде всего, это модулятор митогенеза гепатоцитов; показана стимуляция' активности» других эпителиальных клеток, эндотелия. Воздействие этого фактора обеспечивает рост и регенерацию не только печени, но других органов — почек, легких, кожи. Существуют прямые указания на протекторное воздействие фактора роста гепатоцитов на клетки печени при остром токсическом повреждении, индуцированном четыреххлористым углеродом (ЧХУ), а также улучшение конъюгации, билирубина и транспорта желчи [488, 503]. Кроме стимуляции митогенеза, он способен вызывать миграцию эпителиальных клеток, стимулировать морфогенез [160, 452].

Таким образом, выяснение механизмов саногенеза представляется ключевым для понимания эффектов трансплантации клеток.

Цель работы: определить закономерности развития и саногенетические механизмы острой печеночной недостаточности под влиянием ксенотрансплантации культуры клеток печени и селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов.

Задачи:

1. Разработать технологию получения ассоциированной, культуры клеток печени, или селезенки свиньи с высоким показателем жизнеспособности после длительной криоконсервации:

2. Исследовать закономерности продукции фактора роста гепатоцитов эмбриональными и неонатальными клетками печени или селезенки свиньи в динамике культивирования.

3. Оценить жизнеспособность и иммуногенность криоконсервированной культуры клеток печени и селезенки свиньи при подкожной трансплантации крысе на модели острой печеночной недостаточности, вызванной острым токсическим повреждением, обширной резекцией или воспалительным повреждением вследствие аспленизации.

4. Исследовать эффекты ксенотрансплантации культуры клеток печени или селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов на течение печеночной недостаточности, вызванной острым токсическим повреждением.

5. Раскрыть механизмы саногенеза и стимуляции митогенной активности гепатоцитов под воздействием ксенотрансплантации клеток печени или селезенки в условиях острой пострезекционной печеночной недостаточности.

6. Раскрыть патогенетические механизмы формирования печеночной недостаточности вследствие воспалительного повреждения печени, индуцированного асплени-зацией и на этой модели оценить эффективность ксенотрансплантации клеток печени или селезенки.

7. Существенно расширить концепцию саногенеза острой печеночной недостаточности под воздействием ксенотрансплантации клеток печени или селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов.

Научная новизна

Установлена высокая эффективность разработанной технологии выделения, культивирования и криоконсервации эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки свиньи, обеспечивающая высокую жизнеспособность полученного материала после длительного (до 6 месяцев) хранения.

Приготовление клеточных ассоциатов в процессе культивирования позволяет воссоздать микроэкологию печени in vitro и повышает функционирование ассоциатов после трансплантации реципиенту.

Впервые выявлена продукция фактора роста гепатоцитов в процессе культивирования ассоциированных клеток печени или селезенки. Динамика концентрации фактора роста гепатоцитов в культуральной среде положена в основу способа оценки жизнеспособности клеточного материала. Доказано; что уровень фактора роста гепатоцитов в культуре клеток селезенки выше, чем в культуре клеток печени.

В эксперименте на крысах породы Вистар описана острая печеночная недостаточность на фоне воспалительного »повреждения печени, вызванного аспленизацией, и на этой модели выявлена эффективность коррекции с помощью ксенотранспланта-ции культуры клеток печени, а также культуры клеток селезенки.

Получено подтверждение гипотезы, согласно которой эффекты ксенотранс-плантации клеток печени и селезенки совпадают с эффектами фактора роста гепато-цитов при острой печеночной недостаточности. В рамках этой гипотезы экспериментально установлена эффективность коррекции печеночной недостаточности токсического и воспалительного генеза с помощью ксенотрансплантации культуры клеток-селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов.

Разработана концепция саногенеза острой печеночной недостаточности под воздействием ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток печени и селезенки - продуцентов, фактора роста гепатоцитов. Установлена саногенетиче-ская роль-воздействия повышенных концентраций фактора роста» гепатоцитов, вырабатываемого перенесенным материалом, что дополняет метаболическую активность пересаженных органоспецифических клеток при печеночной недостаточности па-фоне острого токсического или воспалительного поврежденияшечени.

Выявленные закономерности положены в основу алгоритма коррекции) острой печеночной недостаточности клетками печени и селезенки в зависимости от ее генеза.

Практическая значимость»

Разработана технология» забора, выделения и культивирования эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки, позволяющая получать криоконсервиро- -ванный материал с высокой степенью жизнеспособности и продукцией. ЕЮР после подготовки к трансплантации.

Предложены оригинальные среды для криоконсервации культур эмбриональных клеток, печени'и селезенки («Среда для консервации клеток печени» патент РФ № 2161'198'от 15.01.2001; «Среда для криоконсервации клеток селезенки» патент РФ № 2194753-от 08.01.2001). Разработан оригинальный подход в оценке жизнеспособности культивируемого материала («Способ оценки жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени», патент РФ № 2366704 от 10.09.2009).

Показана целесообразность использования при лечении острой печеночной недостаточности клеточных ассоциатов, обладающих выраженной биорегуляторной активностью.

Для изучения роли бактериальной транслокации методом динамической и статической сцинтиграфии в патогенезе повреждения »печени после апленизации, разработан способ маркировки бактерии Е. coli 99mTc («Способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфических исследований» патент РФ № 2290643 от 27.12.2006).

Новая концепция печеночной недостаточности при постспленэктомическом ги-поспленизме позволила разработать патогенетически обоснованный метод коррекции в эксперименте.

Предложен оригинальный способ коррекции пострезекционной "печеночной недостаточности («Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте», патент РФ № 2232550 от 20.07.2004).

Разработанные технологии позволили снизить летальность при острой печеночной« недостаточности (ОПН) различного генеза в эксперименте. При 90 % резекции печени уровень летальности снижен со 100 % до 56,6 %, при токсическом повреждении-до 36,7 %, при.постспленэктомической ОПН со 100 % до 23,3 %.

Дано экспериментальное обоснование и доказана эффективность ксенотранс-плантации. криоконсервированной культуры клеток селезенки, криоконсервирован-ной культуры эмбриональных клеток печени и неонатальных гепатоцитов свиньи при острой печеночной недостаточности в зависимости от ее генеза.

Внедрение в практику

Разработанные технологии забора, выделения, культивирования*и криоконсер-вации эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки, позволяющие получать клеточный материал с высокой степенью жизнеспособности после подготовки к трансплантации, внедрены в научном отделе экспериментальной хирургии с виварием НЦРВХ СО РАМН.

Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургии с курсом онкологии Иркутского государственного медицинского университета и кафедры физиологии и психофизиологии биолого-почвенного факультета Иркутского государственного университета; а также при обучении аспирантов и клинических ординаторов Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Продукция фактора роста гепатоцитов в среду культивации является критерием эффективности выделения и культивирования эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки свиньи, позволяющих получить высоко жизнеспособный криоконсервированный материал для ксенотрансплантации.

2. Аспленизация животных сопровождается развитием острой печеночной недостаточности воспалительного генеза.

3. Ксенотрансплантация криоконсервированной культуры клеток, продуцирующих фактор роста гепатоцитов в организме донора — эффективный метод коррекции острой печеночной недостаточности токсического и воспалительного генеза.

4. Саногенетические механизмы воздействия ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток печени и селезенки, зависят от генеза печеночной недостаточности и связаны с одной стороны - с уровнем продукции перенесенными клетками фактора роста гепатоцитов, с другой - их протективной функцией.

Апробация основных положений работы

Материалы исследования были представлены на Всероссийской Межвузовской научнойконференции студентов и молодых исследователей (Москва, 1999); Всероссийской конференции «Реконструкция — основа современной хирургии» (Москва, 1999); Международной' конференции молодых ученых и студентов^ «Актуальные проблемы современной медицины» (Минск, 1999); Международном съезде гастроэнтерологов» «GASTRO-99» (Vancouver, Canada, 1999); 9-м Международном конгрессе гастрохирургов. (Nagasaki, Japan, 1999); Всероссийской, конференции «Новые направления в клинической'медицине» (Ленинск-Кузнецкий, 2000); Межрегиональной научно-практической конференции «Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии» (Омск, 2000); Международном симпозиуме «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии» (Новосибирск, 2000); Общероссийской конференции с международным участием «Проблемы морфологии: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2002); V Международном конгрессе молодых учёных и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); XII Всероссийской научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2004); Всероссийской научной конференции «Восстановительные и органосохраняющие технологии - главный путь развития хирургии XXI века» (Москва,

2004); III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая-патофизиология)» (Москва, 2004); VI Международном конгрессе «Науки о человеке» (Томск, 2005), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); XIII научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск,

2005); научно-практической конференции» «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005); XII Международной конференции хирургов-гепатологов стран CHF и X научно-практической конференции «Вахидовские чтения — 2005» «Актуальные проблемы хирургической гепатологии» (Ташкент, 2005); Научно-практической конференции «Высокотехнологические методы диагностики и лечения в абдоминальной хирургии — проблемы визуализации» (Москва; 2006); XIII< Международной-конференции хирургов-гепатологов стран СНГ (Алматы, Казахстан, 2006); Международной медицинской научной конференции между Автономной Республикой Внутренней Монголией КНР и Республикой Бурятия РФ: (Маньчжурия, Китай, 2007); VII Всероссийской научно-практической; конференции РАСХИ (Москва, 2008).

Основные положения«диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета НЦРВХ СО РАМН (сентябрь, 2006). По материалам диссертационного исследования опубликовано 55 работ, в том числе 24 статьи в рецензируемых журналах, 2 монографии (в соавторстве), получено 5 патентов на изобретения Российской Федерации.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах. исследования, четырех глав' собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы.

231 ВЫВОДЫ

1. Разработана технология выделения, культивирования и криоконсервации неона-тальных клеток селезенки свиньи, позволяющая получать ассоциированную культуру ретикулоцитов и лимфоцитов с содержанием 4,6 (4,1-4,8) х Ю7 клеток в 1 мл взвеси и показателем жизнеспособности 98,2 (97,8-98,5) % после 6-хмесячной криоконсервации. Применение предложенной технологии для печени свиньи позволяет получать ассоциированную культуру гепатоцитов и непаренхиматозных клеток с выходом 2,9 (2,4-3,1) х 107 клеток в 1 мл взвеси и высоким показателем жизнеспособности — 86,9 (83,8-89,0) % после длительной криоконсервации.

2. В процессе культивирования эмбриональных и неонатальных клеток печени или селезенки свиньи происходит закономерное увеличение концентрации фактора, роста гепатоцитов в среде культивирования, достигающее максимума на 5-е сут. При этом содержание НОР в культуре клеток печени увеличивается в 3,5 раза, а в культуре клеток селезенки - в 225'раз. Повышение уровня фактора роста гепатоцитов в процессе культивировании клеточной ассоциации служит показателем^ пригодности материала для трансплантации.

3. На модели ОПН, вызванной а) ОТП; б) обширной резекцией или в) ВПП вследствие аспленизации установлено, что криоконсервированная культура клеток печени и селезенки свиньи, пересаженная под кожу крысе, частично выживает к 6-м, 11-м и 21-м сут после трансплантации соответственно. Лейкоцитарная инфильтрация зон ксенотрансплантации отсутствует, а структура трансплантата соответствует классическим огшсаниям перенесспной ткани при свободной алло- и ауто-трансплантации. Это свидетельствует о высокой жизнеспособности и минимальной иммуногенности клеточного материала, полученного с применением разработанных технологий.

4. КТ культуры клеток печени и селезенки при печеночной недостаточности на фоне ОТП является эффективным методом снижения летальности и ограничения цитолитического и холе статического синдромов, системной воспалительной реакции, расстройств белково-синтетической функции. Морфологическим эквивалентом выявленных эффектов ксенотрансплантации оказывается восстановление и сохранность балочной структуры с преобладанием неповрежденных гепатоцитов, уменьшение жировых включений, увеличение количества непаренхиматозных клеток печени. Применение культуры клеток печени более эффективно, чем культуры клеток селезенки, но оба метода существенно улучшают течение печеночной недостаточности по сравнению с контролем и однократной инъекцией фактора роста гепатоцитов. Введение антител к фактору роста гепатоцитов приводит к необратимому развитию печеночной-недостаточности.

5. При обширных резекциях печени КТ НГ оказывается наиболее эффективным методом коррекции печеночной недостаточности за счет протективной-функции пересаженных клеток. Избыток НСБ, продуцируемого культурой клеток при КТ, обусловливает негативный эффект за счет неконтролируемой, стимуляции мито-тической активности уцелевшнх гепатоцитов реципиента.

6. Патогенетические механизмы формирования ОПН, вызванной' аспленизацией, включают бактериальную транслокацию микрофлоры из кишечной трубки в портальную систему и воспалительное повреждение печени вследствие чрезмерного эритрофагоцитоза клетками купфера с лейкоцитарной инфильтрацией и некрозами паренхимы. В этих условиях ксенотрансплантация культуры клеток селезенки или печени обеспечивает выраженный саногенный эффект, который заключается^ в снижении'летальности, профилактике нарушения гомеостаза и сопровождается многократным (до* 67 раз выше нормы) повышением концентрации НвР в сыворотке крови.

7. Особенностью саногенеза ОПН в условиях КТ криоконсервированной культуры клеток печени или селезенки является пролонгированный эффект повышенных концентраций НОР, вырабатываемого перенесенным материалом. Результатом оказывается ограничение воспалительного и токсического- повреждения паренхимы печени, стимуляция регенераторных процессов и, в частности, пролифера-тивной активности гепатоцитов, что дополняет протективную функцию пересаженных органоспецифических клеток, а при пострезекционной печеночной недостаточности, напротив, нивелирует ее.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Технология получения ассоциированной культуры клеток печени или селезенки свиньи с высоким показателем жизнеспособности после длительной криоконсер-вации предусматривает последовательное выполнение обработки печени или селезенки свиньи коллагеназой с целью микрофрагментации. Дезагрегацию клеток печени для последующего культивирования следует проводить до получения ассоциаций гепатоцитов и непаренхиматозных клеток, содержащих не более 10 клеточных элементов. Для клеток селезенки - получение взвеси изолированных клеток, содержащих не более 5 % микрофрагментов по 2-4 клетки.

2. Оптимальная величина рН среды для культивирования клеток селезенки является 7,6.

3. Для оценки жизнеспособности клеток печени следует оценивать уровень НвР методом иммуноферментного анализа.

4. Снижение уровня НвБ (РЮР < 14) позволяет прогнозировать сниженную биоре-гуляторную активность ККП.

5. Криоконсервации следует подвергать 5-суточную культуру неонатальных клеток селезенки.

6. Для криоконсервации культуры эмбриональных клеток печени или культуры неонатальных клеток селезенки свиньи следует применять среду, приготовленную по разработанной нами рецептуре. Элиминации криоконсерванта из приготовленного для,трансплантации препарата, содержащего клетки печени или селезенки, не требуется.

7. Для коррекции острой печеночной недостаточности токсического генеза необходимо использовать криоконсервированную культуру ассоциатов эмбриональных клеток свиной печени продуцирующих фактор роста гепатоцитов.

8. Для коррекции острой печеночной недостаточности пострезекционного генеза целесообразно использование неонатальных гепатоцитов в предоперационном периоде (за 2-е суток).

9. Для коррекции воспалительного повреждения печени целесообразно применение ассоциатов культуры криоконсервированных клеток селезенки свиньи, продуцирующих фактор роста гепатоцитов.