Автореферат и диссертация по медицине (14.00.37) на тему:Клинико-экспериментальные аспекты использования ксеногенных гепатоцитов в лечении больных с острой печеночной недостаточностью

РГ8 ОД

г о мая «

На правах рукописи

Васина Надежда Владимировна

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЫ1ЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КСЕНОГЕННЫХ ГЕПАТОЦИТОВ В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ С ОСТРОЙ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ

14.00.37 - Анестезиология и реаниматология 14.00.27-Хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ни соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте скорой помощи им. Н.В. Склифосовского.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор И.И. Шиманко

доктор медицинских наук, профессор В.Г. Бруслик

доктор медицинских наук, профессор O.A. Долина

доктор медицинских наук, профессор П.А. Иванов

Ведущая организация:

НИИ трансплантологии и искусственных органов

Защита состоится "_"_1996 г. на заседании

диссертационного совета Д 155.02.01. в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского но адресу: Москва, Б. Сухаревская пл., д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиот еке института. Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

A.A. Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Высокая летальность при острой печеночной недостаточности (ОПН), достигающая 80 - 90%, частота возникновения данной патологии, в том числе в виде осложнений многих заболеваний и травм, требуют дальнейшей разработки способов коррекции этого состояния (Блюгер А.Ф. и др., 1984; Гальперин Э.И. и др., 1988; Лопухин Ю.М. и др., 1987; Шиманко И.И., Мусселиус С.Г. 1993; Rakela А., 1979).

Актуальность диагностики и лечения острой печеночной недостаточности связана и с тем, что результаты как консервативной терапии, так и лечения, включающего активные методы детокснкации, оказываются малоэффективными.

Применяемые методы перфузии крови и лимфы для непосредственного извлечения токсических веществ в определенной мере заменяют или дополняют детоксикационную функцию печени. (Гальперин Э.И. н др., 1972, Остапенко В.А., 1981, Еереснев В.И. и др., 1984, Бруслик В.Г., 1990).

Один из подходов к данной проблеме связан с применением средств, основанных на использовании биосубстратов донорской печени, в час тности, конгломератов, гомогенатов, взвеси гепатоцитов или всей печени.

Наиболее перспективным направлением лечения ОПН является применение аллогенных и ксеногенных гепатоцитов, применение которых приводит к снижению летальности у этой тяжелой категории больных (Островерхов Г.Е. и др., 1982; Берелавичус В.Ю., 1975, 1983; Антнпова Г.В. и др., 1981; Ерухимов Е.А., 1985; Шумаков В.И. и др., 1985; Бруслик В.Г., 1987,1990,1995; Wolf D., 1980).

Для получения взвеси изолированных гепатоцитов в нашей стране и за рубежом используют как человеческую печень, так и печень животных - свиньн, собаки (Бруслик В.Г. Берелавичус В.Ю., 1975, 1985, 1990; Островерхов Г.Е. 1980; Шиманко И.И. и др., 1988; Alexander J., 1991; Bach F.M., 1991).

Непродолжительное хранение ксеногенных гепатоцитов при ги-потермнческих температурах (0 + 4°С) ограничивает их широкое применение в лечении острой печеночной недостаточности. В связи с чем идет поиск методик длительного хранения изолированных клеток (криоконсервация, хранение при гнпотермических температурах с субстратами). Одним из способов консервации является лиофилизация, которая позволяет сохранять основные функционально-метаболические свойства изолированных клеток (Гладских Л.В., Токаев Э.С., Мусселиус С.Г., Бруслик В.Г. 1992-95гг.).

В связи с имеющимся дефицитом аллогенных гепатоцитов потенциальным источником клеточного материала могут служить жн-

вотные (Sugita Y., 1989; Alexander J., 1991; Bach F.M., 1991).

Таким образом, дальнейшая разработка методов лечения больных с остром печеночной недостаточностью ксеногенными гепатоци-тами, в частности, лиофнлизированными, является актуальной проблемой.

Цель исследования

Разработать методику клинического использования "клеточного" диализа с ксеногенными гепатоцитами, хранящимися при температуре О + 4°С, и лиофнлизированными гепатоцитами в лечении острой печеночной недостаточности токсической этиологии.

Задачи исследования

1. Определить морфологическую сохранность и функциональную активность выделенных гепатоцитов животного происхождения;

2. Экспериментально доказать терапевтическую эффективность применения ксеногетшых гепатоцитов, хранящихся при температуре О + 4°С и лиофилизированных гепатоцитов для лечения больных с ОПН методом "клеточного" диализа;

3. Изучить влияние ксеногенных гепатоцитов на метаболические процессы, гемодинамику печени, восстановление ее функциональной активности у больных с ОПН;

4. Сравнить эффективность клинического применения ксеногсп-ных гепатоцитов, хранящихся при температуре 0 +■ 4°С с эффективностью лиофилизированных гепатоцитов у больных с ОПН, леченных методом "клеточного" диализа;

5. Сравнить эффективность использования ксеногениых и алло-генных гепатоцитов при лечении больных с ОПН.

Научная новизна

Впервые представлены обоснование и методика применения ксеногениых лиофилизированных гепатоцитов и гепатоцитов, хранящихся при температуре 0 + 4°С в качестве компонента биологических экстракорпоральных диализных систем, в комплексном лечении больных с остром печеночной недостаточностью.

Впервые изучены экспериментальные н клинические результаты лечения ОПН ксеногенными лиофилизированнымп гепатоцитами методом клеточного диализа.

Впервые проведена сравнительная оценка эффективности применения ксеногениых и аллогенных гепатоцитов, хранящихся при температуре 0 + 4°С, при лечении больных с острой печеночной недостаточностью.

Практическая ценность работы

Простота, доступность метода заготовки ксеногенных гепатоци-тон, относительно низкая стоимость этой технологии, хорошая терапевтическая эффективность данного биосубстрата, позволяют рекомендовать его в широкую медицинскую практику.

Использование данного метода в комплексной терапии больных с ОНИ значительно снижает летальность у пациентов этой группы: с 50,2% в 1989г. до 25% в 1995г.

Основные положения, выносимые на защиту

Морфологическая и функциональная сохранность ксеногенных гепатоцитов, натнвных и лиофилизированных, позволяет эффективно их использовать в лечении экспериментальной модели ОПП у животных.

Высокая терапевтическая эффективность лиофнлизпрованпых гепатоцитов и гепатоцитов, хранящихся при температуре 0 4°С, используемых в качестве компонента биологических диализных систем в лечении больных с ОПН,.

Ксеногепные гепатоциты функционально активны и оказывают положительное влияние на метаболические процессы пораженной печени, ее гемодинамику, в связи с чем могут успешно использоваться в лечении ОПН методом "клеточного" диализа.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены:

-на заседаниях проблемно-плановых комиссий НИИ скорой помощи им.11.В. Склифосовского (1993, 1994, 1995 гг.);

- на XY1II, XX, XXI, XXII научных сессиях ЦНИИ гастроэнтерологии с участием зарубежных ученых (1990, 1992, 1993, 1994 гг.);

- на 2-й Международной конференции "Успехи современной криобиологии", Харьков, 1992;

- на заседании "Холелигназ и его осложнения" 1-х Международных хирургических дней молодых ученых, Киев, 1993;

- на научно-практической конференции НИИ скорой помощи им.Н.В. Склифосовского "Новое в экспериментальной и клинической патологии неотложных состояний", Москва, 1993;

- на 1-м Международном конгрессе "Эндогенные интоксикации" Санкт-Петербург, 1994;

- на заседании "Клеточная терапия" 1-го съезда криобиологов Украины, Харьков, 1995;

- на 1-м Московском Международном конгрессе хирургов, Москва, 1995.

Внедрение в практику

Полученные результаты внедрены в практику НИИ скорой помощи им.Н.В. Склифосовского, ЦНИИ гастроэнтерологии, в реанимационном отделении клинической больницы г.Омска, в реанимационном отделении клинической больницы г.Воронежа.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ в российских изданиях, СНГ, за рубежом: Англия, ФРГ, Австрия, Греция.

Объем и структура работы

Диссертация содержит 148 страниц машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 17 таблицами, 9 рисунками, 5 фотографиями. Библиография включает 237 источников: из них 147 отечественых, 90 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы нсследоиаиия

Экспериментальная часть работы была выполнена в ЦНИИ гас-тролггерологии (руководитель группы интенсивной печеночной терапии - профессор В.Г. Бруслик).

Опыты выполнялись у 19 животных, которые были разделены на три группы. Первую группу составили интактные животные - 4 собаки, которым проводились лабораторные и клинические исследования (первая контрольная группа). Вторую контрольную группу составили 5 собак с моделью ОПН, которым проводились только консервативная терапия, клинические и биохимические исследования. В третьей группе наблюдалось 10 собак с моделью ОПН, в лечении которых применялись "клеточные" диализы с гепагоцитами. Эта группа была разделена па 2 подгруппы: у 5 собак 1-ой подгруппы было проведено 16 клеточных диализов с консервированными при 10 + 4°С ге-патоцптами, а у других 5 собак (2-я подгруппа) - с лиофилизированны-ми гепагоцитами - 14 клеточных диализов.

Для получения взвеси изолированных ксеногенных гепатоцитов в качестве доноров были использованы 12 щенков беспородных собак обоего пола в возрасте 5-6 месяцев и 10 свиней в возрасте до 6 месяцев. Перед забором печени проводили клиническое обследование животных. Исследовали состояние кожи, измеряли температуру тела, пульс, частоту дыхания, поведение животных. В день операции животных не кормили в течение 12 часов, затем проводили премеди-кацию.

Забор органа проводили в операционной. Вскрывали брюшную полость и с соблюдением асептики и антисептики извлекали печень. Определяли ее размеры, состояние глиссоновой капсулы, пальпировали орган на наличие уплотненных участков. Затем проводили срочное морфологическое исследование. Дальнейшее выделение и хранение изолированных гепатоцитов проводилось в стерильных условиях с постоянным микроскопическим и бактериологичекнм контролем. Для получения аллогенных гепатоцитов донорами были скоропостижно умершие, при сроке тепловой ишемии 2 - 2,5 часа.

Взвесь ксеногенных гепатоцитов получали комбнированным методом Берри-Фриенд в модификации А.И. Арчакова.

Выделенные гепатоциты помещали в питательную среду 199 и хранили при 10 + 4°С до 5 суток. С 1992 года применяли лнофилизи-ронанные ксеногеллые гепатоциты, полученные методом сублимационной или распылительной сушки на аппарате типа СГ-2 - ФРГ (Л.В. Гладских, В.Г. Бруслик, 1990).

Выделенные гепатоциты подвергались всестороннему изучению

с целью определения степени их интактности и функциональной активности.

Степень морфологической сохранности полученных геиатоцитоп оценивали методом световой и фазово-контрастной микроскопии. Световая микроскопия проводилось по методу Д.М. Насонова, И.Т. Суздальской (1960) и Hovard (1968) с предварительной окраской витальным красителем - 0,2% трипановым синим.

Оценку функциональной активности изолированных клеток проводили по биохимическим тестам: изучали мочевино-синтетическую функцию изолированных гепатоцитов, определяли эндогенное дыхание на полярографе-7. Дезинтоксикационные свойства гепатоцитов исследовали спектрофотометрически с бромсульфалеиновой пробой. По нашим данным, процент жизнеспособных выделенных ксеноген-ных гепатоцитов составил 80 - 85%, а аллогенных - 60-65%. Жизнеспособность аллогенных гепатоцитов при выделении была на 15 - 20% ниже, чем у ксеногенных, что объясняется более продолжительным сроком тепловой ишемии - до 2,5 часов. Процент жизнеспособных выделенных ксеногенных и аллогенных гепатоцитов в условиях хранения их при гипотермических температурах к исходу 7 суток хранения снижается до 20 - 22%. Поэтому в экспериментальной и в клинической работе мы использовали гепатоциты со сроком хранения при t 0 + 4 С не более 5 суток. Жизнеспособность лиофилизи-рованных клеток составила 45 - 50%.

В эксперименте у 15 собак модель ОПН создавалась введением в желчный проток СС14 , в дозе 0,3 мл на 100 г веса животного с наложением провизорной лигатуры на 45 мин.

Животным с моделью ОПН в лечении применяли "клеточные" диализы с использованием диализаторов пластинчатых "ДИП-02-02" и капиллярных со средней проницаемостью (GFE-11, F-1,2) и роликового насоса "Гамбро", с оксигенацией клеточной взвеси при 0,2 атм. 100 мм рг. ст. Доза гепатоцитов 30 - 40 мл. Длительность процедуры 1-2 часа, количество диализов 4-5.

Оценивали клиническое состояние здоровых и больных животных по общепринятой методике. Определяли habitus, состояние кожи, измеряли температуру тела, частоту пульса и дыхания.

Диагноз ОПН и эффективность лечения подтверждали лабораторными исследованиями и ЭЭГ. Этапы исследования: до-, после диализа и на 14-е сутки, после 3 диализов.

При выполнении клинического раздела работы исследовали 42 больных в возрасте от 23 до 65 лет с острой печеночной недостаточностью токсической этиологии. Мужчин было 32, женщин - 10 человек. Причиной острого токсического гепатита у 19 больных был че-тыреххлористый углерод, у 16 - дихлорэтан, у одного больного - хлороформ, у 6 - ядовитые грибы.

В зависимости от вида используемых гепатоцитов, больные были разделены на три группы (таблица 1).

Таблица 1

"Клеточные" диализы с гепатоцитами у больных

с острой печеночной недостаточностью._

№ Виды гепатоцитов Кол-во Кол-во Кол-во Кол-во Летальность

группы больных диализов ВЫЖИВШИ) умерши) %

1 Ксеногеиные, +4°С 16 39 12 4 25

2 Лиофилизированньи 8 24 6 2 25

3 Аллогашые, +4°С 1 59 14 4 22

Всего 42 122 32 100 23,8

Комплексное лечение включало хирургические методы детокси-кации: гемоднафильтрацию, плазмаферез, лнмфосорбцшо, бужирова-ние и катетеризацию пуночной вены, дренирование грудного лимфатического протока. По количеству проводимых операций более 50% составили "клеточные" диализы с гепатоцитами.

Степень нарушений функции лечени оценивалась по классификации гепатопатий, разработанной в НИИ СП им.Н.В. Склифосовского для больных с острыми экзогенными отравлениями (Е.А. Лужников и др., 1980).

Методика проведения "клеточного" диализа с ксеногенными гепатоцитами у больных с ОПН.

"Клеточные" диализы проводились с использованием капиллярных диализаторов типа F-6 средней и высокой проницаемости и роликового насоса фирмы "Fresenius" со скоростью кровотока 60

- 100 мл/мин. Подключение к кровеносной системе больного осуществляли с помощью артерио-венозного шунта или пункции кубиталь-ных вен. По диализирующему контуру использовали взвесь ксеноген-ных гепатоцитов в растворе Хенкса с добавлением глюкозы 40% -

- 20 мл. Доза взвеси гепатоцитов - 40 мл, концентрация клеток составляла 20 млн в 1 мл. 2 л раствора помещали в оксигенатор-перфу-затор, магистрали помещали в термостат при t 37°С. Раствор Хенкса со взвесью гепатоцитов поступал со скоростью 60 капель в мин. в диализатор. "Клеточный" диализ проводился в режиме оксигенации со скоростью подачи кислорода - 4 л/мин. Количество "клеточных" диализов - от 2 до 6, время проведения диализа - 2 часа. В зависимости от показателей свертывающей системы крови и продолжительности операции доза гепарина составляла 10 - 30 тысяч ED.

"Клеточный" диализ с лиофилизированными гепатоцитами проводился по аналогичной методике. Доза лиофилизированных гепатоцитов составляла 30 мг/кг массы больного. Масса сухого остатка в 1 мл клеточной взвеси гепатоцитов составляет 30 мг. Перед процедурой лиофилизированные гепатоциты помещали в среду 199, инкубировали в течение 30 минут при 137°С.

Для обработки данных использовали метод вариационной статис-

тики с определением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической ( т), а также степени достоверности различий при помощи теста 'Ч" по Стьюденту.

Результаты экспериментальных исследований

С целью внедрения в клииическую практику лечения больных с ОПН ксеногеиными гепатоцитами, консервированными при I О + 4°С, и лиофилизированными гепатоцитами, были проведены экспериментальные исследования по изучению их морфологической сохранности и функционально-метаболической активности.

При световой микроскопии (окраска 0,2% раствором трипаново-го синего) свежевыделенные клетки - округлой формы со светлой, непрокрашенной цитоплазмой. Ядра дифференцированы, отмечался феномен вторичной адгезии с образованием агрегатов по 3 - 4 клетки. Целостность клеточной мембраны нативных клеток подчеркивалась непрерывностью ореола при фазовоконтрастном исследовании. Жизнеспособность нативных ксеногенных гепатоцитов составила 80 -85%.

На основании результатов микроскопии получили подтверждение, что 50% клеток после сублимационной сушки в основе своей сохраняют первоначальную структуру: форма клетки округлая, с четкой клеточной мембраной, цитоплазма негомогенная. Остальные клетки были лизированы, клеточная оболочка частично нарушена. Жизнеспособность лиофилизироанных клеток составила 45 - 50%.

Морфологические исследования были дополнены биохимическими, что позволило достоверно оценить жизнеспособность свежевы-деленных и лиофилизированных ксеногенных гепатоцитов.

Дыхательная активность клеток печени является одним из важнейших показателей функциональной активности гепатоцитов, которая изменяется при нарушении плазматической мембраны клеток.

В таблице2 представлены результаты сравнения показателей дыхания свежевыделенных и высушенных гепатоцитов.

Таблиц!) 2

Показатели эндогенного дмхаиия ннтактпых и высушенных гепатоцитов

Виды гепатоцитов Скорость лыхания (нмоль/мин)

без стимуляции со стимуляцией НАДН

Интактные 1.70 ±0.003 1.75 ±0.02

Высушенные 0.9 ±0.08 1.65 ±0.09

Добавление раствора никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) незначительно изменило скорость дыхания интактных клеток, что

свидетельствовало о незначительном повреждении плазматической мембраны. У клеток, подвергшихся лиофилизации, отмечено снижение скорости эндогенного дыхания почти в 2 раза. При добавлении НАДН у высушенных гепатоцитов интенсивность дыхания увеличивается на 50% (р<0.001) по сравнению с исходным уровнем, что свидетельствует о разрушении некоторого количества клеток.

При оценке мочевиносинтетической функции нативных клеток в сравнении с лнофилизированными, выяснено, что способность к синтезу мочевины у высушенных клеток ниже - на 3,2%.

При исследовании детоксикационной способности нативных и высушенных гепатоцитов отмечено, что, как интактные, так и высушенные гелагоциты в течение 2 часов в равной степени поглощают бромсульфалеин из контрольной среды: у высушенных гепатоцитов способность к детоксикации на 8,8% ниже, чем у нативных (таблица 3).

Таблица 3

Изменение состава среды с бромсульфалеином в присутствии интактных и высушенных гепатоцитов_

Интервал Среда 199 с бромсульфалеином

исследований (мин) без гепатоцитов с интактными гепатоцитами с высушенными гепатоцитами

через 30 мин. 2.48 ±0.02 1.58 ±0.05 1.80 ±0.01

через 120 мин. 2.48 ±0.02 1.12 ±0.09 1.21 ±0.06

Полученные при тестировании взвеси гепатоцитов данные свидетельствуют, что клетки, как нативные, так и лиофилизированные, функционально сохранны и могут быть использованы для коррекции метаболических нарушений, возникающих при ОПН. Следует отметить, что весь объем исследований для определения жизнеспособности ксеногенных клеток требует 12 - 14 часов, в связи с этим рациональнее в повседневной практике пользоваться более доступной пробой - окраской витальными красителями. Проба выполняется в течение 10-15 мин, ее результаты коррелируют с вышеописанными тестами.

Сознание модели ОПН у животных В эксперименте, у 15 собак, которым была создана модель острой печеночной недостаточности, к исходу первых суток развивалась клиническая картина ОПН, проявлявшаяся вялостью, адинамичнос-тыо, отказом от пшцн. На вторые сутки развивалось сопорозное состояние, моча прибретала темный цвет, обесцвечивался кал. К концу вторых суток у животных развивалась клиника печеночной комы с нарушением дыхательной и сердечно-сосудистой деятельности и кли-нико-бнохимических показателей: билирубинемия и ферментемня в

крови животных в этот период превышала нормальные величины в 9 -10 раз.

Во второй контрольной группе - 5 собак - леченных только консервативно, на 4 - 5-е сутки заболевания все животные погибли. При исследовании печени выявлены цитолптический и холестатический синдромы. Проанализировав весь комплекс органных нарушений, можно утверждать, что гибель животных с отравлением четыреххло-ристым углеродом произошла вследствие полиорганной патологии с наличием вырженных изменений в печени.

Лечение животных с моделью ОПН метопом "клеточного"

диализа с использованием ксеногенных лиофилизированных гепатонитов и гепатоцитов. хранящихся при 10 + 4°С

При изучении данных, полученных в 3-й опытной группе из 10 животных и их сравнительной оценке в обеих подгруппах (в 1-й подгруппе применялись гепатоциты, хранящиеся при низкоположительных температурах, в 2-й подгруппе - лиофилизированные) отмечено, что уже после первого "клеточного" диализа улучшается общее состояние собак и улучшаются биохимические показатели крови. Однако, через 2-3 дня состояние животных и тесты контроля вновь ухудшались, что являлось показанием для повторного "клеточного" диализа.

Анализ результатов биохимических показателей крови у животных с острой печеночной недостаточностью при лечении взвесыо изолированных гепатоцитов показывает достоверную нормализацию ферментемии, билирубинемии. Так, например, концентрация билирубина в обеих подгруппах в процессе каждого "клеточного" диализа имеет выраженную тенденцию к уменьшению. После трех сеансов концентрация общего билирубина снижается на 70% (р<0.001) по отношению к исходному уровню за счет снижения обеих его фракций.

Биохимические изменения у животных с моделью ОПН в обеих подгруппах сравнивали с таковыми у здоровых животных. Это позволяло оценивать не только тяжесть поражения, но и эффективность проводимой терапии.

В процессе лечения с использованием лиофилизированных гепатоцитов, после трех "клеточных" диализов, уровень общего белка увеличивался на 1,0%. Исследование по фракциям выявило увеличение альбуминов на 8,4% и снижение количества глобулинов на 6,3%. Коррекция диспротенемии свидетельствовала о функциональной активности лиофилизированных гепатоцитов. У всех животных улучшалось общее состояние: исчезала адинамия, уменьшались признаки энцефалопатии, появлялся аппетит. Клинические и биохимические показатели крови соответствовали средней тяжести течения ОПН - ге-патонатия II степени.

Исследование ЭЭГ п это время свидетельствовало о восстановлении нормальной активности головного мозга.

Анализ результатов лечения ОПН в обеих подгруппах позволил сделать заключение, что использование диализов с ксеногенными ге-иатопитами привело к хорошему терапевтическому эффекту за счет коррекции нарушенных метаболических процессов. Летальность при этом в опытной группе составила 30% (по второй контрольной группе она достигала 100%).

Нее вышеприведенное послужило основанием для внедрения в клиническую практику разработанного метода лечения ОПН.

Результаты клинических исследований

Использование ксеногенных гепатонитов. консервированных при 10 + 4"С методом "клеточного" диализа у больных с острой печеночной недостаточностью

У 16 больных первой группы, в лечении ОПН токсической этиологии были использованы ксеногенные гепатоциты, консервированные при 10 + 4°С. Всего выполнено 39 "клеточных" диализов.

У 14 больных с пероралыгым отравлением и у 2 больных с ин-галляцнонным отравлением на 2 - 3-й сутки развивалась клиника острой печеночной церебральной недостаточности. Отмечалась выраженная энцефалопатия, больные становились вялыми, заторможенными, изо рта появлялся "печеночный запах". Отмечалась выраженная билирубннемия, ферментемня, появлялись признаки геморрагического синдрома, которые проявлялись п носовых кровотечениях, геморрагиях на коже.

13ысокие цифры билирубина и ампнотрансфераз свидетельствовали о выраженном цитолической синдроме и об острых дистрофических 1пме?1еннях п печени. Согласно классификации гепатопатнй эти клинические изменения соответствовали у 70% больных гепатоиатии II степени, а у 30% больных - генатопатия III степени, крайне тяжелое токсическое поражение печени. Эти данные подтверждены ультразвуковой допплерографией. Отсутствие положительных результатов комплексной терапии, а также отрицательная динамика клинических и биохимических показателей крови п течение первых трех суток у больных с гепагоиатией 1П степени являлись прогностически небла-гопрняптыми признаками.

Терапия острой печеночной недостаточности у больных, находящихся и критическом состоянии, была комплексной. Она предусматривала мероприятия и симптоматическую терапию, направленные на поддержание и восстановление жизненно важных функций организма, в частности, кровообращения, дыхания, коррекцию метаболизма. Наряду с этим, лечение включало коррекцию и замещение нарушенных основных функций печени, что требовало использования консер-

вативной тактики ц активных методов детоксикацмн.

Консервативная терапия была базисной н состояла in инфузиоп-ного режима, направленного на коррекцию валемических расстройств, кислотно-щелочного равновесия, водно-электролпгпых и осмотических нарушений, а также обеспечение парентерального питания. Неэффективность консервативной терапии, нарастание энцефалопатии, углубление комы, прогрессирующее ухудшение биохимических и клинических показателей крови требовало использования "клеточных" диализов. Противопоказания аналогичны методам экстракорпоральной перфузии крови: острые желудочно-кишечные кровотечения, нестабильная гемодинамика.

Анализ гемодннамических изменений в печени в зависимости от лечения "клеточными" диализами, их количества проводился в соответствии с классификацией гепагопагий. В исходе острой печеночной недостаточности уменьшается артериальный приток крови к печени, при этом увеличиваются размеры диаметра воротной вены, говорящие о нарастании синдрома портальной гипертеизии. При гепатона-тни II степени происходит увеличение OK на 56% (р<0,01) от нормы, Ri на 20,6% (р<0,05). При гепатонагии III степени, показатели увеличиваются на 41,3% и 81% соответственно. Результаты этих исследований представлены в таблице 4.

Тиблнца 4

Изменения ииуцшпечеиочмой гемодинамики

у больных с Iеиатоиатией Н и III сгепеии и исходе заболевания

Показатели внутрипеченочной гемодинамики Норма Степень геиатонатин

II III

Индекс резистентности 0,58 0,70 ±0,01 0,82 + 0,08*

Объемный кровоток, мл/мин 1100 1720,2 ±116,3 2000,3 ± 120,1*

Воротная вена, см 1.3 1.4 ±0.1 1.6 ±0.1*

* - р<0,05 достоверность относительно II степени.

После проведения трех диализов с ксеногениыми гснатоцнтами при динамическом наблюдении уменьшается отек паренхимы, улучшается мнкроциркуляцня в пей, увеличивается приток артериальной крови к печени, размеры диаметра воротной вены и ОК приближаются к норме.

При изучении печеночной гемодинамики отмечено, что у " терминальных" больных ОК снижается почти в 2 раза. Гемодинампческие изменения в динамике полностью коррелируют с остальными клннн-ко-биохимическими параметрами.

Полная взаимосвязь всех диагностических тестов отмечена и при радиоизотосшой сщштнграфин печени в ходе лечения диализами с ксеногениыми гепатоцнтами. В начале заболевания обращают внимание тяжелые функциональные нарушения, выраженные диффузные

изменения структуры органа. После трех операций отмечено улучшение накопления препарата, появляется четкое контурнрование печени и включение изотопа в се структуры.

При изучении результатов лечения ОПН "клеточными" диализами выявлена четкая закономерность волнообразного течения заболевания. Динамика биохимических показателей крови п процессе лечения ксеногеннымн гепагоцптамн, консервированными при температуре 0 + 4°С, представлены в таблицеб.

Улучшение в состоянии больных наступает уже после первой операции. А затем, через сутки, отмечается умеренное ухудшение клипико-бнохимических параметров. И так от диализа к диализу с тенденцией к постепенному снижению этих всплесков, вплоть до нормальных показателей. Обращает внимание транзиторное повышение бнлирубинемин перед 3-м диализом с гепатоцитамн (5 - 7-е сутки от начала лечения). Это явление может быть объяснено восстанавливающейся функциональной активностью клеток собственной печени больного, опережающей восстановление экскреторных функций всей печени н, как следствие, происходит выброс большого количества продуктов метаболизма в русло кропи. Концентрация общего билирубина снижается к концу сеанса "клеточного"диалнза на 21,3% (р< 0,05) от исходного уровня, а после второй процедуры на 43% (р< 0,01). Перед 3-м "клеточным" диализом ухудшается клиническое состояние больных, которое подтверждается биохимическими показателями крови, при этом уровень общего билирубина повышается на 86% от конца второй процедуры. Показатели цитолитических ферментов снижаются от диализа к диализу, без вышеописанных всплесков, что косвенно свидетельствует о прекращении процесса гибели собственных клеток и восстановлении паренхимы печени больного. После третьего сеанса "клеточного" диализа концентрация аланппо-вой трансамнназы снижается на 72% от исходного уровня. Транзиторное ухудшение клинического состояния больных и биохимических параметров крови на 5 - 7-е сутки (перед 3-м сеансом) от начала лечения "клеточными" диализами является последним и в дальнейшем, после третьей операции, отмечается стабильная нормализация всех параметров, в том числе и снижение билирубинемии, ферментемии.

Анализ динамики биохимических показателей крови позволил выделить вторую закономерность: после каждого "клеточного" диализа отмечается подъем аспарагиновой трансамнназы на 7% и снижение показателей АлАт на 16% (р<0.05). Этн данные косвенно подтверждают воздействие взвеси ксепогенных геиатоцитов непосредственно на функцию клеток пораженной печени, тем самым стимулируя ее функциональную активность и регенераторные свойства. Подтверждает этот факт возрастание протромбина па фоне снижения ферментемии. Кроме того, это подтверждает жизнеспособность,

Таблица 5

Динамика биохимических показателей у больных с токсическими гепатитами, 0\ в лечении которых применялись ксеногеиные гепатоциты, хранящиеся при 10 + 4°С

Показатели Этапы исследования Билирубин общий мкмоль/л Билирубин Прямой мкмоль/л Билирубин непрямой мкмоль/л Общий белок г/л АсАТ мкмоль/ ч мл АлАТ мкмоль /ч мл

Перед 1-м диализом После 1-го диализа Через сутки 211.4 ± 16.4 166.2 + 13.7* 163.9 ±15.3* 159.1 ± 14.8 130.5 + 11.9* 114.6 + 12.1* 60.7 ±7.4 28.6 ± 4.8** 50.7 ± 6.9* 53.7 ± 4.6 54.8 + 4.6 63.4 ± 4.5* 2.5 ± 0.13 2.7 + 0.18 1.7 ±0.10* 7.9 + 0.6 6.6 ± 0.7* 6.3 + 0.6*

Перед 2-м диализом После 2-го диализа Через сутки 149.1 + 16.1* 120.6 +13.8*** 144.8 ±14.2* 106.6 ± 11.4* 85.4 +10.2*** 114.0 ±11.1* 32.9 + 4.1*** 23.1 ± 4.4* 63.7 ±5.7 49.5 + 4.3* 48.3 + 4.2* 55.0 ± 4.7 2.0 + 0.10* 2.7 + 0.16* 0.9 ± 0.06** 5.8 + 0.6* 5.4 + 0.5* 3.7 + 0.4

Перед 3-м диализом После 3-го диализа Через супги 224.4 ± 19.7 201.9 ± 17.3 151 0 +1Т9* 138.0 ± 14.6 128.8 +13.3* 1Г> 8 + 11.8* 101.8 ±8.9* 81.5 ± 6.3** 44.1 +4.6*** 53.7 ± 4.8 51.0 + 4.7 53,6 + 4,7 1.3 ± 0.08*** 1.4 + 0.08*** 1.1 + 0.09** 3.1 ±0.4** 2.2 + 0.2** 24 + 0.?**

Продолжение таблицы 5

Показатели ЛДГ ЩФ гамма-ГТП Холестерин бета-лииопротеиды, Протромбин

Этапы исследования мкмоль/с л мккат/л мкмоль кат/л ммоль/л г/л %

Перед 1-м диализом 26.1+2.1 5.2±0.7 6.2±0.8 6.24±0.8 2.9±0.3 55.6+4.5

После 1-го диализа 27.2±1.8 4.9+0.7* 5.1+0.7* 7.2+0.8* 2.6+0.3 54.2+4.5

Через сутки 20.8±1.6* — - 8.5±0.9** 3.8±0.3** 65.6±4.7*

Перед 2-м диализом 18.8±1.4* 4.2±0.6* 3.1±0.5*** 7.2±0.8* 3.0±0.2 68.1±4.7*

После 2-го диализа 12.0+1.2** 4.6±0.6* 2.9+0.5** 7.7+0.8* 3.1±0.2* 70.0+4.7*

Через сутки 13.5+0.9*** - - 5.3±0.7 3.6+0.2* 74.3±4.9*

¡Перед 3-м диализом 14.2±0.9** 3.5±0.6* 4.0±0.3* 6.5±0.7 3.0±0.2 66.2+4.6*

После 3-го диализа 16.1±1.1** 4.1±0.6* 2.7±0.2** 4.4±0.6* 1.7+0.2** 66.8+4.6*

Через сутки 8.6±0.8** - - 5.6±0.6* 3.2±0.3 78.2±4.8*

* - р<0.05 - достоверность, относительно исходного уровня

** - р<0.01

*** - р<0.001

функциональную полноценность используемых нами ксеногенных ге-иатоцнтоп, хранившихся при температуре 0 + 4°С.

Использование ксеногенных лиофилизированных гепатонитов метолом "клеточного" пиализа в лечении больных ОПН

Ксеногенные лиофилизнрованные гепатоциты применялись аналогичным методом в лечении 8 больных (2-я группа) с токсическим поражением печени. Больным в комплексном лечении было проведено 24 "клеточных" диализа. Исходные клинико-биохимнческие параметры практически соответствуют первой группе. У 6 больных клиника заболевания протекала как гепатопатия III степени.

При лечении но той же схеме у больных происходит волнообразное улучшение клинико-биохимических показателен крови.

Так же, как и в 1-й группе, происходит нормализация гемодинамики пораженной печени, се морфологической структуры. На рисунке 1 представлены результаты биохимических исследований крови, проводимые в процессе лечения ОПН в сравнении между 1-й и 2-й группой.

После 2-х "клеточных" диализов с лиофилнзнрованнымн гепато-цнтами концентрация общего билирубина снизилась с 237,7 ± 17,5 до 141,2 ± 12,7 мкмоль/л, т.е. на 41 + 4,2% (р<0.01). Аналогичное снижение концентрации общего билирубина (на 42 ±4,3% от исходных цифр) происходит и в 1-й группе. Уровень трансаминаз к исходу 3-й операции снижается в 2 раза, хотя концентрация общего билирубина и его фракций возрастает почти до исходного уровня.

Терапевтическая эффективность лиофилизированных гепатоци-тов аналогична таковой у больных, где использовались гепатоциты, хранящиеся при температуре 0 + 4°С. Пребывание в стационаре в первой группе составилоЗб.З ± 5,2 к/дня, а во второй - 32,1 ± 4,8 к/дня. Летальность у больных, леченных лиофилизировапными гепа-тоцитами составила 25%, а в группе, где применялись "клеточные" диализы с гепатоци гами гипотермпческого хранения - 22%.

Сравнительная характеристика результатов применения ксеногенных и аллогенных гепатоиитов.

Для подтверждения эффективности и правомочности использования ксеногенных гепатоцитоп в лечении ОП11, памп проанализированы результаты лечения больных третьей группы из 18 человек, с токсическим поражением печени, леченных диализами с использованием аллогенных генатоцитов, хранящихся при температуре 0 +■ 4°С. Выбор этот не случаен, так как терапевтическая эффективность человеческих гепатоцитоп, используемых в различных системах (интра-корноральных и экстакорпоральных) доказана в эксперименте и в клинике многими авторами (Маргулис М.С. 1975;, Блго-

билирубин общий, mkmiwjl/ji

250 200 1 so 100 so

fj

Исход После Исход После Через 2КД ЗКД ЗКД 10 суток

билирубин прямой, мкм»ль/л гоог"

too о

АлАТ, MKMiuii./'L мл ю *"*

а

Исход После Исход После Через

2КД ЗКД ЗКД К)суток

dfl

f-Щ..

Исход После Исход После Через

2 КД 3 КД 3 КД 10 суток

ГГГП, mkku'i/л А

г

о

ш

Исход После Исход После Через 2 КД ЗКД ЗКД 10 суток ■I - пшотермическне, при t 0 - 4°С [¿л] - лиофшшзпроианпые i ешиоциты

Рис.1 Динамики некоторых биохимических показателей кропи н процессе лечении О IUI лиофилнзцроиаиными геиитоцнтими и геиагоцнтамн конссриироишшыми мри температуре 0 + 4°С

герА.Ф. 1978; Осгроверхов Г.Е. 1983; Берелавичуе В.10. 1983). Клинические, лабораторные и инструментальные данные, полученные в этой группе, сравнивались с результатами и первой группе больных, леченных ксеногеннымн гепатоцитамн, хранящимися при температуре 0 + 4°С. Результаты инструментальных исследований практически не имели отличий.

Тяжесть заболевания у 76% больных соответствовала гепатопа-тии II степени и у 23% - гепатонатии III степени. У 18 больных было проведено 59 клеточных диализов с аллогеннымп гепатоци тамн, консервированными при температуре 0 4°С. Сравнивалась динамика биохимических показателен в зависимости от лечения "клеточными" диализами н обеих группах: уже после первого "клеточного" диализа в группе больных, где применялись ксеногенные гепатоцнты, концентрация общего билирубина уменьшилась па 19%, а и группе, где применялись аллогенные генатоциты - на 22%(р<0,05).

Отмечается волнообразность в динамике биохимических показателей крови. Достоверное снижение концентрации общею билирубина и его фракций через сутки после второго кле точного диализа с ал-

логсннымн генлтоцнтамн на 42% (р<0,01), а у больных с ксепогснны-мн гепатоцптами - на 31,5% (р<0,()1), сменяется транзнторным ухудшением. Через сутки после третьем операции п обеих группах отмечается очередное снижение показателей общего билирубина и его фракции, соотпетстненно, па 40% н па 33% от уропия перед первым "клеточным" диализом.

Результаты этих исследований представлены на рис. 2.

билиру(1ш| общий, икмолг,/л _

ШШЙГага

0 До I Через До 2 Через ДоЗ Через Через КД сутки КД сугки КД сутки 5 суток

До 1 Через До 2 Через До 3 Через Через КД сутки КД сутки КД сутки 5 суток ЛлЛТ. мкмоль ч/л

До 1 Через До 2 Через ДоЗ Через Через КД сутки КД сутки КД сутки 5 суток

КД сутки КД сутки КД сутки 5 суток Щ - кссиогспиме - аллогениме

Рис. 2. Динамики биохимических показателей кропи у больных с применением диялиюп с криогенными п аллогеппмми гепатоцптами.

Более выраженное транзиторпое повышение концентрации общего билирубина и его фракции перец 3-м "клеточным" диализом в группе больных, где применялись кееногенпые гепатоцпты, не коррелируют с показателями траисаминаз. Концентрация АлА'Г продолжает снижаться, и через сутки после 3-го диализа ее показатели уменьшаются и 4 раза по сравнению с исходным уровнем.

В обеих группах показатели траисаминаз снижаются от диализа к диализу, независимо от колебаний концентрации билирубина. Отмечается улучшение лннидного обмена. Снижение нротромбиноного индекса коррелирует с увеличением холестаза и концентрации общего билирубина и его фракций.

У больных с токсическим поражением печени, в лечении которых использовались аллогенные гепатоциты, пребывание в стационаре составило в среднем 37,7 ±4,5 койко/дия, летальность равнялась 22%. У больных, в лечении которых применялись ксепогеппые гепатоциты, нахождение в стационаре составляло 32,1 ± 3,4 койко/дпя, летальность 25%.

Анализируя полученные данные, можно сказать, что использование "клеточного" диализа с ксеногенными гепатоцитами в лечении ОПН, существенно не отличается от результатов, полученных н группе больных с применением аллотенных гепатоцп гон. Мы пришли к выводу, что использование ксеногепных геиатоцитов у больных с острым токсическим поражением печени в период критического состояния является временным замещением метаболической функции собственной печени.

Лечебный эффект при применении печеночных клеток животного происхождения методом "клеточного" диализа у больных с острой печеночной недостаточностью является достоверным. Преимуществом использования ксеногепных геиатоцитов является: возможность получения донорского органа в любое время суток с минимальной тепловой ишемией, исключение инфицирования ВИЧ, гепатитом, отсутствие каких-либо побочных эффектов.

пыводм

1. Ксеногснпые гспатоцнты, как нативные, так и лнофнлнзиро-ваниые, сохраняют свои метаболические и функциональные свойства, что подтверждено морфологическими и биохимическими исследованиями.

2. Использование ксеногенных генатоцитоп в лечении экспериментальной модели ОПН у животных методом "клеточного" диализа позволяет снизить летальность до 30%, но сравнению с контрольной группой, где легальность составила 100%.

3. Ксеногенные гспатоцнты при применении их в клинике положительно влияют на функциональную и метаболическую активность пораженной печени п с тимулируют се восстановление. Благодаря их использованию удастся снизить летальность у больных ОПН токсической этиологии до 25%.

4. Сравнительная оценка результатов лечения больных с ОПН ксеногепными лиофшшзированнымн гепатоцитамн и гепатоцитамн, хранящимися при I 0 +4°С, свидетельствует, что оба способа обладают хорошим терапевтическим эффектом, безопасны и могут быть использованы в широкой клинической практике.

5. Использование ксеногенных и аллогенных гепатоцитов в клинике подтвердило аналогичность их действия и эффективность в лечении острой печеночной недостаточности. Преимуществом использования ксеногенных гепатоцитов являются доступность донорского материала, сокращение сроков тепловой ишемии, исключение риска ПИЧ-ппфицнроваиия и других инфекционных заболеваний, отсутствие юридического фактора.

6. Метод использования лиофнлнзированных ксеногенных гепатоцитов обладает преимуществами по сравнению с гепатоцитамн, хранящимися при температуре 0 + 4°С: длительностью хранения (до 3 лет), возможностью транспортировки на различные расстояния. Недостаток лиофнлизацин заключается в более низком выходе функционально активных клеток.

ПРАКТИЧЕСКИ ГС РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проведенное исследование позволяет рекомендовать в клиническую практику взвесь гепатоцитов животного происхождения (свиньи, собаки) в комплексном лечении ОПН токсической этиологии методом "клеточного" диализа.

2. Эффективность проводимого лечения ксеногепными гепатоцитамн, а также степень тяжести острого поражения печени, можно оценивать на основании данных клииико-биохимических методов в сочетании с доиплерографпческимн и радиопзотопнымп исследованиями пнутрппечепочной гемодинамики.

3. Как альтернативный метод консервации может быть использована лиофнлизация гепатоцитов.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ IlO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Эффективность использования криоконсервированных генатоцитов у больных с острой и хронической почечно-исчсночной недостаточностью. В сборнике "Успехи современной криобиологии", 1992г., с.204, Харьков, (с соант.: Шнмаико И.И., Лебедева Ю.П.).

2. Применение изолированных клеток печени у хирургических больных с печеночной недостаточностью. В сборнике "Холелптиаз и его осложнения", Тезисы материалов, Киев, 1993г. с.30, (с соант.: Лебедева Ю.Н.).

3. Применение клеточного диализа в лечении больных эндоток-сикозом. Тезисы Междунар. симпозиума "Эндогенные интоксикации" С.-Петербург, 1994г., с.130, (с соант.: Лебедева Ю.И., Шиман-коИ.И.).

4. Применение клеточного препарата из печени свнией для 'терапии печеночной недостаточности. Тезисы Междунар. конференции "Новые фармакологи'!, средства"., С.-Петербург, 1995г., с. 175, (с соавт.: Гладскнх A.B., Токаев Э.С.).

5. Применение генатоцитов при токсическом поражении печени. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологни, колопроктоло-гин", №3, 1995, с. 157, (с соант.. Мусселиус С.Г., Александрова И.В.).

6. "Клеточный" диализ с использованием криоконсервироианных генатоцитов, как метод лечения печеночной недостаточности. В кн.: "Тезисы Московской конференции по гемаферезу", Москва, 1995г., с.73, (с соавт.: Суббота Н.П., Мнтнн A.C.).

7. Возможности использования лпофнлизнрованных клеток не-ченн в лечении печеночной недостаточности. В кн.: "Тезисы Московской конференции по гемаферезу", Москва, 19951'., с.79, (с соавт.: Гладскнх Л.В., Лебедева Ю.Н.).

8. Использование генатоцитов в лечении больных с механической желтухой в пред- и послеоперационном периодах. В кн.: Сборник трудов I Международного конгресса хирургов. Москва, 1995г., с.335 - 336, (с соавт.: Лебедева 10.11., Бруслнк В.Г.).

9. Применение изолированных клеток нечепн с целью лечения больных с печеночной недостаточностью различного геиеза. Журнал "Проблемы криобиологии", статья, Харьков, 1995г., № 2, с.49 - 52, (с соавт.: Шнмаико И.И..Суббота II.П.).

10. Способы применении изолированных генатоцитов для лечения острой печеночной недостаточности. Статья. Журнал: "Вестник Академии Наук", 1994г., № 4, с. 8 - 14, (с соавт.: Бруслик В.Г.).

11. Использование клеток печени при синдроме печеночной недостаточности. В кн.: Тезисы Юбилейной конференции Ветеран, института, Белая Церковь, 1995г., с.39., (с соавт.: Токаев Э.С., Гладскнх Л.В.).