Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Применение коллаген-хитозановых раневых покрытий и дермального эквивалента кожи в местном лечении термических ожогов

На правах рукописи

Власов Алексей Александрович

ПРИМЕНЕНИЕ КОЛЛАГЕН-ХИТОЗАНОВЫХ РАНЕВЫХ ПОКРЫТИЙ И ДЕРМАЛЬНОГО ЭКВИВАЛЕНТА КОЖИ В МЕСТНОМ ЛЕЧЕНИИ ТЕРМИЧЕСКИХ ОЖОГОВ

(экспериментальное исследование)

14.01.17-хирургия

14.03.02 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 б ЛЕН 2010

Красноярск 2010

004618526

Работа выполнена на кафедрах оперативной хирургии с топографической анатомией и патологической анатомии им. проф. П.Г. Подзолкова и в лаборатории клеточных технологий ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Большаков Игорь Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Кириченко Андрей Константинович

доктор медицинских наук, профессор Черданцев Дмитрий Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Надеев Александр Петрович

ФГУ Институт хирургии им. А.В. Вишневского Росмедтехнологий

Защита диссертации состоится у> 2(И? г. в ^-"¿^часов на

заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.037.02 при Красноярском государственном медицинском университете им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (660022, Красноярск, ул.Партизана Железняка, Д.1).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (660022, Красноярск, ул.Партизана Железняка, д.1).

Автореферат разослан « 2010 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, к.м.н., доцент

Кочетова Л.В.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

ДМЕМ среда Игла в модификации Дульбекко

ИГХ иммуногистохимический

ПЯЛ полиморфно-ядерный лейкоцит

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

ЭТС эмбриональная телячья сыворотка

ПТС флюорохром флюоресцеинизотиоционат

ММР матриксная металлопротеиназа

СБ68 кластер дифференцировки макрофагов

Кл-67 маркер пролиферации клеток

ТвР трансформирующий фактор роста

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема восстановления обширных раневых дефектов, полученных в результате ожога, была и остается одной из самых актуальных в современной медицине. В настоящее время по данным Федеральной службы государственной статистики число обожженных пациентов за год составляет по РФ в среднем 120000 человек. Гибель кожных покровов значительной площади в результате ожогов или «взятие» кожи для аутотрансплантации сопровождаются развитием инфекции и суперинфекции, потерей белков, электролитов, воды, плазмы, патологической регенерацией. Известно, что при ожогах необходимо как можно раньше восстанавливать непроницаемый кожный барьер (Арьев Т.Я., 1962; Атясов Н.И., 1972). Стандартная методика аутопересадки получила применение только при ограниченных размерах ожога. В силу высокой стоимости и частого отторжения аллографты не обеспечивают эффективного покрытия. Поскольку лечение обширных ожогов требует использования кожи или ее искусственных эквивалентов, в последние годы были проведены многочисленные исследования их применения и разработки (Алексеев A.A., 1998; Расулов М.Ф. и соавт., 2005; Калмыкова Н.В. и соавт., 2007; Спичкина О.Г., 2008; Швед Ю.А., 2008; Дешпанде М.Ш. и соавт., 2009; Ивашкин А.Н., 2009; Sprung et al., 1998; Bhushan В., 2000; Hunt Т.К. et al., 2000; Badiavas et al., 2002; Brem et al., 2003; Dvorankova B. et al., 2003; Ehrlich H.P., 2004). Каждый из предложенных способов имеет определенные преимущества. Однако до сих пор не создан универсальный носитель клеточных структур, который бы обладал биосовместимостью, абсорбционной способностью в отношении раневого экссудата, предотвращал инфицирование, создавал оптимальную микросреду для регенерации раны, был проницаемым для воды и воздуха, но не высушивал дна раны, был эластичным, моделировал поверхность со сложным рельефом. Определенный прогресс в данной области достигнут в создании способов и средств, ускоряющих сроки заживления ран благодаря управляемым процессам самосборки основного компонента соединительной ткани - коллагена (Risbud M. et al., 2000; Denuziere A. et al., 2000; Jarrahi M., 2008; Chu Y. et al., 2008). В настоящее время стало очевидным, что наилучшие результаты в оптимизации процессов реорганизации тканевых дефектов позволяет получить использование природных полимеров, способных осуществлять контроль синтеза и ориентации волокнистых структур (Leahy P.J., Lawrence W.T., 2007; Wang W. et al., 2008). Впервые покрытия на основе биодеградирующих биополимеров были разработаны и получены в Институте хирургии им. A.B. Вишневского Росмедтехнологий (Адамян A.A. и соавт., 1995, 1997, 1998, 2000, 2004). Комбинация таких полимеров с мукополисахаридами и факторами роста позволяет контролировать образование грануляций, ускорять эпителизацию кожных дефектов, получать соединительную ткань, мало отличающуюся от окружающей здоровой кожи.

Исходя из вышеизложенного, представляется возможным считать, что разработка способа лечения ожогов раневыми покрытиями на основе биосовместимых полимеров одновременно с использованием клеточных технологий является необходимой и перспективной.

4

Цель исследования. Экспериментально обосновать применение коллаген-хитозановых раневых покрытий с использованием клеточных технологий в местном лечении термических ожогов.

Задачи исследования:

1. Разработать в эксперименте дермальный эквивалент кожи на основе коллаген-хитозанового покрытия «Коллахит-Бол» и оценить степень цитотоксического потенциала данного покрытия при контакте с эмбриональными фибробластами животных.

2. Получить способ лечения ожога кожи Ш-Б степени в эксперименте с применением разработанного дермального эквивалента кожи.

3. Изучить с применением морфологического и морфометрического методов динамику заживления ожоговых ран Ш-А и Ш-Б степеней в эксперименте при местном лечении коллаген-хитозановыми раневыми покрытиями.

4. Провести иммуногистохимический анализ молекулярных маркеров процессов репарации клеточного и межуточного компонентов раневой поверхности при местном лечении термического ожога кожи Ш-Б степени коллаген-хитозановыми покрытиями в эксперименте.

Научная новизна исследования. Впервые получен способ лечения глубокого ожога кожи с использованием модифицированных гликозаминогликанами коллаген-хитозановых покрытий с

трансплантированными эмбриональными аллогенными фибробластами. Биополимерное покрытие в комбинации с гликозаминогликанами и сывороточным фактором роста «адгелон» позволяет контролировать образование грануляций, создавать благоприятные условия для дифференцировки и пролиферации клеток, обеспечивающих процесс заживления ожоговых дефектов с восстановлением утраченной кожи. Применение данных покрытий существенно ускоряет заживление кожных дефектов за счет создания условий для активной пролиферации трансплантированных фибробластов. При количественном анализе результатов иммуногистохимических реакций на маркеры заживления ожоговой поверхности кожи получены новые сведения, дополняющие научные знания о репаративных свойствах коллаген-хитозановой матрицы.

Практическая значимость работы. Выявлена наилучшая комбинация способа культивирования аллогенных фибробластов на раневом покрытии. Полученный метод найдет применение в решении задач современной комбустиологии. Использование эмбриональных фибробластов, обладающих неограниченной способностью роста, на основе рассасывающегося биосовместимого коллаген-хитозанового комплекса создает возможности восстановления утраченной кожи после ожога Ш-Б степени по сравнению с существующими методами местного лечения. Применение коллаген-хитозанового комплекса, содержащего гликозаминогликаны и сывороточный фактор роста «адгелон» для местного лечения ожоговых ран в виде аппликации, сокращает время заживления ожогов Ш-А и Ш-Б степеней у крыс. Таким образом, настоящее исследование позволяет рекомендовать к использованию полученный дермальный эквивалент, коллаген-хитозановое

5

раневое покрытие «Коллахит-Бол» в хирургии, комбустиологии для закрытия ожоговых дефектов Ш-А и Ш-Б степеней и восстановления кожного покрова.

Внедрение результатов исследования в практическое здравоохранение. Раневое покрытие «Коллахит-Бол» внедрено в работу Красноярского краевого консультативно-лечебного ожогового центра для детей и взрослых с целью клинических испытаний в формате вСР для России и протокола Росздравнадзора, санитарно-гигиенической сертификации изделия медицинского назначения.

Интеллектуальная собственность в виде патентов РФ и приоритетных справок на изобретения передана трем малым предприятиям «Коллахит» и «Медакс» (г.Железногорск, 2006г.) и стартовавшему предприятию «Биоимплант» (г.Красноярск, 2009г.) в форме простых лицензий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Раневые покрытия на основе коллаген-хитозанового комплекса, содержащие гликозаминогликаны (хондроитинсерная кислота, гиалуроновая кислота, гепарин) и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота «адгелон» создают благоприятные условия для пролиферации фибробластов в процессе раневого заживления термических ожоговых дефектов.

2. Дермальный эквивалент кожи, содержащий эмбриональные фибробласты экспериментального животного, ускоряет восстановление утраченного слоя кожи после ожога Ш-Б степени на 25,5%.

3. Применение коллаген-хитозановых покрытий «Коллахит-Бол» при местном лечении ожогов Ш-А и Ш-Б степени обеспечивает направленную стимуляцию репаративных процессов, создавая благоприятные условия для готовности раны после глубокого ожога к пластике полноценным кожным лоскутом или дермально-эпидермальным эквивалентом кожи.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: X Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». - г.Нижний Новгород, 2010 г.; IX Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». - г.Ставрополь, 2008 г.; Международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники». - г.Шарм-эль-шейх (Египет), 2008 г.; ежегодных итоговых научных конференциях Красноярского государственного медицинского университета, 2006-2009 гг.; общегородских форумах и ассамблеях «Красноярск. Технологии будущего», «Красноярск - город инноваций, партнерства и согласия». - г.Красноярск, 2008-2009 гг.; молодежном проекте-форуме с международным участием «ТИМ Бирюса 2009». - г.Красноярск, 2009 г.; финале регионального этапа в Сибири международного конкурса «Бизнес инновационных технологий 2010». - г. Красноярск, 2010 г.; финале IX всероссийского «Конкурса русских инноваций». - г.Москва, 2010 г.; финале «Окружного инновационного молодежного конвента» Сибирского федерального округа. - г.Новосибирск, 2010 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 - в журналах, рекомендованных ВАК. Получены 2 патента РФ на изобретения.

Личный вклад автора. Работа является самостоятельным трудом соискателя. Автором лично проведены: информационный поиск, моделирование термической травмы в эксперименте, регистрация и анализ динамики заживления ран с помощью известных методов наблюдения, морфометрический анализ, статистическая обработка полученных данных и интерпретация результатов исследования, написание диссертации.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста (основного текста 135 страниц) и включает 49 рисунков и 24 таблицы. Список литературы состоит из 249 отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основу собственного исследования составляет экспериментальный подход, заключающийся в изучении процессов репарации на модельной ожоговой ране животных с помощью известных методов регистрации динамики заживления. Исследование осуществлялось в несколько этапов: получение фетальных фибробластов, их культивирование, трансплантация фибробластов на раневое покрытие «Коллахит-Бол», оценка цитотоксического действия покрытия на клетки, аппликация полученного дермального эквивалента кожи и покрытия «Коллахит-Бол» на раневую поверхность в опытных группах животных, покрытий «Коллахит-Бол» с кондиционированной средой, «Коллахит-Г» и марлевых салфеток (без лечения) на раневую поверхность в контрольных группах, наблюдение и анализ изучаемых параметров в соответствии с основными направлениями исследования (табл. 1).

Таблица 1

Распределение животных по группам

Этапы Степень ожога Методы Применяемое средство кол-во крыс

1 Ш-Б Визуальная оценка, планиметрия Коллахит-Бол с фибробластами 12

Ш-Б Коллахит-Бол с кондиционированной средой 12

Ш-Б марлевая салфетка (без лечения) 12

2 Ш-Б Визуальная оценка, планиметрия Коллахит-Бол 5

Ш-Б марлевая салфетка (без лечения) 5

3 ' III-A Визуальная оценка, планиметрия, гистологический Коллахит-Бол 15

III-A Коллахит-Г 15

Ш-Б Коллахит-Бол 15

Ш-Б Коллахит-Г 15

4 Ш-Б Гистологический, иммуногисто-химический Коллахит-Бол 9

Ш-Б Коллахит-Г 9

Итого 124

Опытные партии раневых покрытий «Коллахит-Г» и «Коллахит-Бол» произведены в ООО «Коллахит» г.Железногорска Красноярского края (ген. директор предприятия А.Н.Сапожников). Технология получения контрольных и опытных коллаген-хитозановых покрытий (доли и характер смешивания с коллагеном, добавление поверхностно-активных веществ и сшивающего агента, глубокое замораживание и лиофилизация, электронно-лучевая стерилизация) производились идентично. В опытное коллаген-хитозановое покрытие «Коллахит-Бол» встроены следующие вещества: аскорбиновая, хондроитинсерная, гиалуроновая кислоты, ростовый фактор в виде сывороточного фактора роста крупного рогатого скота «адгелон», гепарин. Контрольное коллаген-хитозановое покрытие «Коллахит-Г» не содержит вышеперечисленных добавок

Для получения эмбриональных фибробластов использованы фетусы крыс популяции Wistar (7-10 день беременности). Выделенные фетусы помещали в фосфатно-солевой буфер Дульбекко (рН 7,4), содержащий антибиотики пенициллин+стрептомицин (100 мкг/мл), трижды отмывали. Затем переносили в среду ДМЕМ, где проводили отсечение кожных лоскутов. Далее материал переносили в раствор, содержащий трипсин и ЭДТА на фосфатно-солевом растворе, измельчали и инкубировали 30 минут в термостате при +37°С. После инкубации пробы центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин. Осадок переносили в среду ДМЕМ, содержащую 10% ЭТС (эмбриональную телячью сыворотку), L-глутамин (1мМ), стрептомицин+пенициллин (100 мкг/мл), незаменимые аминокислоты (1мМ), смесь витаминов (1%) и пересаживали в культуральные матрасы (HyClone). Для опытов использовалась культура 2-3-го пассажа. Клетки снимались раствором Версена, по 4 мл взвеси рассевались на коллаген-хитозановые матрицы (1 мл суспензии содержал 6х104 клеток), предварительно забуференные бикарбонатом со слабощелочной реакцией. Полученный дермальный эквивалент использовался для трансплантации экспериментальным крысам. В экспериментах по исследованию влияния кондиционированной среды на пролиферативную активность клеток проводился сбор среды каждые третьи сутки культивирования фибробластов, достигших 60-80% конфлуентности (степени смыкания монослоя клеток). Эта кондиционированная среда фильтровалась через фильтр 0,22 мкм, затем переносилась во флакон с биоматрицей «Коллахит-Бол». Для оценки степени цитотоксического потенциала исследуемых раневых покрытий осуществляли регистрацию программированной клеточной гибели фибробластов после культивирования на матрице. Для этого часть крысиных фибробластов снимали с флаконов 0,25% трипсином на фосфатном буфере Дульбекко (рН 7,4) и через 24, 48, 72 часа, а также через более длительный срок в клетках определяли признаки апоптоза с помощью методов микроскопической визуализации блеббинга (маркер нарушения мембран-цитоскелегных взаимодействий при действии повреждающих факторов, обусловленный преимущественно окислительным повреждением белков цитоскелета) на микроскопе "ЛЮМАМ" с использованием фазово-контрастной насадки с увеличением 400 и системы annexin V-FITC, согласно, протоколу фирмы-производителя (Caltag Laboratories, USA) на микроскопе Olympus ВХ51 с х450 (Изюмов Д.С., 2005).

8

Выявление апоптотичееких клеток осуществляется благодаря связыванию между аннексином V и фосфатидилсерином мембраны фибробластов (Bandorowicz-Pikula J., ed., 2003). Исследования проведены в лаборатории клеточных технологий ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого МЗ и CP РФ (заведующий - к.б.н. A.B. Еремеев).

Термический ожог кожи моделировался на 124 крысах самцах популяции Wistar массой 180-220 г. В основу настоящего исследования положена экспериментальная модель, разработанная литовскими учеными (Клебановас Ю. с соавт., 2005) при изучении влияния препарата на процесс заживления глубокого ожога кожи крыс. Животным после удаления волосяного покрова в ларавертебральной области спины на уровне ее середины под эфирным наркозом создавался контактный термический ожог медной пластинкой с силой в 1,3 ньютон, нагретой до 220°С. Время экспозиции пластины составило 10 и 14 секунд, соответственно с глубиной ожога III-A и Ш-Б степени. Предварительно составлялся временной ряд экспозиций термического контакта с кожей животных от 7 до 18 секунд. Начальная глубина ожогового поражения определялась путем морфологического исследования препаратов раны через 24 часа после травмы на гистологических срезах ткани кожи. При частичном сохранении сосочкового слоя кожи ставилась III-A степень ожога, при полном разрушении сосочкового слоя кожи констатировалась Ш-Б степень ожога. Для вычисления процентного соотношения ожоговой поверхности к общей площади тела у крыс использовалась формула, предложенная Lee (1929), в модификации формулы Мее — Рубнера: S =К х W0'60, где S — поверхность тела в квадратных сантиметрах, К — коэффициент, равный 12,54, W — вес животного в граммах. Площадь ожоговой раны III-A и Ш-Б степеней составляла 26 см2 (9-10% от общей поверхности кожи крысы). День нанесения ран животным считался нулевым. На 2-ой день в условиях асептики после механического удаления струпа (Евтеев A.A., 1995) и стандартного туалета ожоговых ран с использованием растворов антисептиков с помощью исследуемого средства (табл. 1) закрывались ожоговые поверхности, соответственно их размеру и форме. Контрольные и опытные покрытия фиксировали к коже с помощью шовного материала, марлевого бинта и пластыря. Последующие перевязки производились каждые 3-е сутки по мере необходимости. Лечение проводилось во время всего периода наблюдения. Исследования проведены на кафедре оперативной хирургии с топографической анатомией ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого МЗ и CP РФ (заведующий - д.м.н., проф. П.А. Самотесов).

Оценка результатов производилась на основе динамического визуального, планиметрического, гистологического, иммуногистохимического анализа состояния ожоговой поверхности. Сроки анализа репарации ожоговой поверхности составляли 5,7,10,13,15,16,20,26 и 30 суток с момента травмы. Раневые покрытия обновлялись по мере их биодеградации. Для расчета суточного уменьшения заживления площади раны использовали формулу, предложенную JLH. Поповой (1942): S=(S-Sn)xl00/Sxt, где S-величина площади раны при предшествующем измерении, Sn-величина площади раны в

момент очередного контроля, 1-число дней между первым и последующим измерением.

Для проведения морфологического анализа животные, согласно сроку наблюдения, выводились из опыта. Для гистологического анализа забирался сектор ожоговой раны (с захватом центрального и периферического отделов) с последующей фиксацией препаратов в 10% нейтральном растворе забуференного формалина. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону. В микропрепаратах (при х40, хЮО и х400) оценивались линейные размеры таких параметров как толщина эпидермиса и его слоёв, толщина струпа и слоя грануляционной и волокнистой соединительной тканей. Некоторые морфологические параметры (пролиферация эпидермиса в крае раны, продуктивная гигантоклеточная реакция, отек мягких тканей, струп, микробизм, граница струпа, инфильтрация зоны поражения лимфоцитами, плазматическими клетками, полиморфно-ядерными лейкоцитами (ПЯЛ), слой незрелой грануляционной ткани в дне раны, слой зрелой грануляционной ткани в дне раны, слой молодой соединительной ткани в дне раны, ПЯЛ в грануляционной ткани, макрофагальная реакция, фиброзная граница в дне) исследуемого процесса репарации определялись полуколичественно по 3-х бальной системе (0, +, ++, +++). С помощью сетки со 130-ю равноудалёнными точками в дне раны, исключая струп, в процентах определялась удельная площадь, занимаемая ПЯЛ, лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками, фиброцитами, фибробластами, волокнистыми структурами, сосудами.

Иммуногистохимические реакции проводились по стандартному стрептавидин-биотин-пероксидазному методу с использованием моноклональных и поликлональных антител маркеров репарации ("МоуосазГга", Великобритания) (Клегпап 1А., 2008). Анализировались следующие маркеры:

1. Трансформирующий фактор роста ¡31 (ТСР-(31) для оценки фиброгенных факторов;

2. Кластер дифференцировки макрофагов (С068) для характеристики моноцитарно-макрофагальной популяции клеток воспалительного инфильтрата;

3. Ядерный белок (Кь67), присутствующий на всех стадиях цикла делящейся клетки, для оценки пролиферативной активности клеточных элементов ожоговой раны;

4. Матриксные металлопротеиназы (ММР-2, ММР-9) для оценки ремоделирования внеклеточного матрикса;

5. Коллаген IV типа, являющийся составным компонентом базальных мембран, для оценки ремоделирования внеклеточного матрикса.

При исследовании микропрепаратов анализ результатов иммуногистохимических реакций проводился отдельно в краях ожоговой раны и в зоне повреждения. При локализации продуктов реакций в клетках (маркеры СБ68 и Ю-67) количественная оценка результатов реакций включала определение доли (%) окрашенных клеток и интенсивности их окрашивания по 3-х бальной шкале. Интенсивность окраски: 0 - нет окрашивания, 1 балл -слабое окрашивание (+ слабая реакция), 2 балла - умеренное окрашивание (++

ю

умеренная реакция), 3 балла - интенсивное окрашивание (+++ выраженная реакция). Неокрашенные, слабо окрашенные, умеренно окрашенные и сильно окрашенные структуры в каждом случае подсчитывались в ядрах 100 стромальных или эпителиальных клеток в трёх различных полях зрения при увеличении 400. Интенсивность иммуногистохимической (ИГХ) реакции определялась по формуле: ИГХ-реакция = Е P(i)'I , где: i - интенсивность окрашивания в баллах от 1 до 3; P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Полученные цифровые данные оценивались следующим образом: от 1 до 100 - слабая реакция; от 101 до 200 - умеренная; от 201 до 300 - выраженная. Результаты иммуноморфологического исследования маркеров ММР-9, ММР-2, TGF-jSl, коллаген IV типа оценивались по степени выраженности окраски клеток и экстрацеллюлярного матрикса аналогично по 3-х бальной системе (0, +, ++, +++). В каждом гистологическом срезе исследовалось не менее 25 полей зрения при увеличении микроскопа х400. Морфометрия со статистической обработкой полученных данных производилась при помощи светового микроскопа "Leica DMLB" и анализатора изображения "Q550IW", снабжённого программой "Leica Qwin" для статистической обработки.

Морфологический и морфометрический анализ и анализ молекулярных маркеров по результатам иммуногистохимических реакций производился на базе кафедры патологической анатомии им проф. Подзолкова П.Г. ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития РФ (зав. кафедрой д.м.н., проф. Шестакова JI.A.).

Статистическая обработка полученных результатов выполнена с помощью программных средств Statistica v.7,0 (StatSoft, USA). Количественные признаки приведены в тексте в виде М±ш, где М - среднее, ш - ошибка средней. Достоверность различий оценивалась по критериям Манна-Уитни (U) и Стьюдента (t) (Гублер Е.В. и соавт., 1973; Гланц С., 1999). Критический уровень значимости принимался равным 0,05 или 0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты регистрации апоптоза клеток кожи при контакте с коллаген-хитозановыми покрытиями

При проведении фазово-контрастной микроскопии эмбриональных фибробластов выбраны оптимальные условия культивирования в результате регистрации более активного размножения фибробластов в кондиционированной среде ДМЕМ по сравнению с культивированием в свежей среде ДМЕМ.

При оценке характера клеточной гибели в популяции клеток, находившихся в условиях культивирования в контакте с коллаген-хитозановыми покрытиями «Коллахит-Бол», обнаружено, что культивирование клеток вызывало апоптоз фибробластов в культуре через 24 часа (52% апоптотических клеток). До обработки клеток в состоянии апоптоза было 16% (р<0,05). В дальнейшем происходило уменьшение числа апоптотических клеток через 48 часов до 36%, а через 72 часа - до 8% (р<0,05). Аналогичным образом, регистрировались достоверные отличия по срокам взаимодействия с

11

покрытиями в выраженности блеббинга плазматической мембраны клеток (3245% клеток с признаками суммарного (начального и терминального) блеббинга через 24 часа, через 48 часов - до 30%, через 72 часа - до 10% клеток (р<0,05)).

Пролиферация фибробластов возобновлялась и продолжалась в течение последующих 9 суток инкубации, количество клеток в состоянии апоптоза при этом уменьшалось практически до 0% (р<0,05). Доля клеток в состоянии некроза практически не менялась на протяжении всего эксперимента и составляла в среднем 10%. Большой процент клеток в состоянии апоптоза, вероятно, связан со стрессом при пересеве клеток из различных условий и воздействием процедуры обработки раствором Версена.

Результаты применения дермального эквивалента кожи в местном лечении термического ожога Ш-Б степени

Существенно ускорило заживление ожоговой раны Ш-Б степени применение коллаген-хитозанового раневого покрытия «Коллахит-Бол» с трансплантированными аллогенными эмбриональными фибробластами. Так, уже на 7-е сутки наблюдения рана полностью изолирована покрытием, которое стянуто к центру. Наблюдается эпителизация с краев в виде розовой полоски шириной 1-2 мм. Площадь раны составляет 20,3±0,36 см2. На 7-е сутки в контроле, где применялось пропитанное кондиционированной средой ДМЕМ биоматрица «Коллахит-Бол», ожоговую рану закрывает покрытие. Площадь раневого дефекта кожи, составляющая 22,9±0,39 см2, больше по сравнению с опытом (р<0,05). На 7-е сутки в другой контрольной группе животных без местного лечения площадь ожоговой раны превышает размеры ран других групп животных и составляет 24,7±0,2 см2. Струп на раневой поверхности не сформирован.

В ранах опытной группы животных на 13-е сутки наблюдается частичная биодеградация покрытия. В местах его полной резорбции наблюдаются грануляции. Выражена краевая эпителизация. Площадь раны сокращается до 17,1±0,52 см2. В контрольной группе животных на 13-е сутки, в которой применялось покрытие «Коллахит-Бол» с кондиционированной средой, всю раневую поверхность площадью 19,3±0,44 см2 закрывает покрытие с волнистым рельефом к центру за счет сокращения дефекта. В контрольной группе без лечения дно раны выстлано фибрином с гнойным налетом и участками единичных грануляций. Площадь ожогового дефекта составляет 23,3±0,28 см2.

На 26-е сутки в опытной группе животных рана значительно меньше по площади, чем рана предыдущего срока наблюдения, и составляет 6,8±0,46 см2 (р<0,05). Рана - в стадии реорганизации рубца. На 26-е сутки эксперимента в контрольной группе животных, где применялось покрытие «Коллахит-Бол» и кондиционированная среда, раневая поверхность на всем протяжении заполнена струпом. Заживление раны медленнее, чем в опыте, о чем констатирует величина ее площади, составляющая П,9±0,43 см2. В контрольной группе без лечения рана заполнена грануляциями с участками фибрина и гноя. Площадь раны без динамики по сравнению с ранами других групп животных - 20,7±0,55 см2 (р<0,05).

12

На 30-е сутки в опытной группе животных с применением дермального эквивалента наблюдается завершение реорганизации рубца. Раневая поверхность с площадью 3,7±0,45 см2 закрыта коркой. В контрольной группе в тот же срок наблюдения, где для местного лечения применялось покрытие «Коллахит-Бол» с кондиционированной средой культивирования фибробластов, площадь раны больше, чем в опытной и составляет 8,2±0,35 см2 (р<0,05). Заживление раны - под струпом, прочно адгезированном к раневой поверхности (результат практически полной резорбции губчатого покрытия). На 30-е сутки эксперимента в группе без местного лечения рана заполнена грануляциями до 5 мм. Площадь раны уменьшилась до значения 18,3±0,81 см2 (рис. 1).

сутки после нанесения ожога

Коллахит-Бол с фибробластами -♦-Безлечения (марлевая салфетка) Коллахит-Бол со средой

1 - достоверность различий площадей ожоговых ран после местного лечения покрытиями «Коллахит-Бол» с трансплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и «Коллахит-Бол» в кондиционированной эмбриональными фибробластами ДМЕМ (контроль 1) (р<0,05);

2 - достоверность различий площадей ожоговых ран после местного лечения покрытиями «Коллахит-Бол» с трансплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и без местного лечения (контроль 2) (р<0,05);

Рис.1. Динамика заживления ожоговых ран крыс с ожогом Ш-Б степени после применения покрытий «Коллахит-Бол» с эмбриональными фибробластами, средой их культивирования и без лечения.

Необходимо отметить, что в динамике заживления ран после ожога Ш-Б степени с применением покрытия «Коллахит-Бол» с кондиционированной средой ДМЕМ и покрытия «Коллахит-Бол» без кондиционированной среды достоверных различий не наблюдалось.

Результаты применения коллаген-хитозановых покрытий в местном лечении ран после нанесения ожога Ш-А степени

На 5-е сутки эксперимента местного лечения ожога Ш-А степени в обеих группах раневая поверхность закрыта от внешней среды коллаген-хитозановым

покрытием. Достоверной разницы в величине площадей ран не регистрируется. В ране преобладают острые альтеративные изменения с началом перифокального воспаления, репаративные процессы в виде продуктивной тканевой реакции не развиты. В связи с этим морфометрия ожоговой раны не проводилась. Сформированный струп под раневым покрытием в опыте со значением 214,73±3,32 мкм превосходит струп в контроле (р<0,01).

На 10-е сутки в обеих группах животных рану закрывает покрытие. Наблюдается эффект контракции краев раны. Величины площадей ран опытных и контрольных животных достоверно неразличимы. В ранах преобладает перифокальное воспаление, появляется грануляционная ткань, умеренно развитая в опытной - 407,2±4,45 мкм и слабо в контрольной -247,42±3,13 мкм группах животных (р<0,01). Краевая эпителизация более выражена в опыте за счет базального - 54,67±0,8 мкм и шиповатого - 68,7±1,2 мкм слоев эпидермиса (р<0,01). В ранах опытной группы животных после применения покрытия «Коллахит-Бол» толщина струпа меньше, чем в ранах с использованием контрольного покрытия «Коллахит-Г» (р<0,05).

На 15-е сутки заживление опытной и контрольной раневых поверхностей происходит под струпом. Произошла биодеградация раневого покрытия в виде сокращения его площади и внутреннего слоя, прилежащего к раневой поверхности. В участках резорбции покрытия наблюдаются грануляции. Средняя площадь ожоговых ран в контрольной группе больше, чем в опытной (р<0,05). При морфологическом исследовании в обеих группах сохраняется перифокальное воспаление. Слой накопленных погибших элементов, препятствующий заживлению раны, в опытной серии животных меньше -162,25±2,67 мкм, чем в контрольной - 226,24±3,13 мкм (р<0,05). В опыте сохраняется высокая активность краевой эпителизации, на что указывает большее значение толщины базального слоя эпидермиса, чем в контроле (р<0,05). Развитие грануляционной ткани достигает большего значения толщины в ранах опытной группы 573,36±4,46 мкм, чем в ранах контрольной -312,6±3,45 мкм. В ранах обеих серий животных появляются признаки продуктивных тканевых реакций - макрофагальной и гигантоклеточной вокруг погибших придатков кожи. В опыте значение толщины волокнистой соединительной ткани превосходит значение контроля (р<0,05) (табл. 2).

На 20-е сутки эксперимента в опытной группе животных на протяжении всей поверхности раны регистрируется плотно фиксированный струп с элементами эпителизации с краев и с центра. В контрольной группе крыс на всей поверхности раны сухой струп с участками грануляций на периферии до 4 мм в диаметре. При проведении планиметрии регистрируется разница в площадях опытной (10,б±0,4 см2) и контрольной (12,1±0,42 см2) ран (р<0,05). Микроскопически в ранах обеих групп продолжается краевая эпителизация, которая более интенсивна в опытной серии за счет участия базального слоя (37,27±0,66 мкм), чем в контроле (23,75±0,46 мкм) (р<0,01). Слой струпа почти в 2 раза тоньше в опыте, чем в контроле (р<0,05). В ранах опытной группы начинает преобладать продуктивная тканевая реакция. Это подтверждает большее значение толщины грануляционной и волокнистой соединительной тканей, чем в контроле (р<0,01).

Морфометрические данные ран крыс после ожога Ш-А степени на разных сроках заживления после применения раневых покрытий «Коллахит-Бол» (опыт) и «Коллахит-Г» (контроль)

Опыт 5 сутки Контроль 5 сутки Опыт 10 сутки Контроль 10 сутки Опыт 15 сутки Контроль 15 сутки Опыт 20 сутки Контроль 20 сутки Опыт 30 сутки Контроль 30 сутки

1 Толщина эпидермиса на его границе (мкм) 136,19±3,08 128,3&Ь7,29 158,97±1,54 ** 119,93±1,72 180,18±2,31 151,29±2,26 150,46±1,23 * 131,01±1,28 60,31±1,52 56,9±0,84

Базальный 38,25±1,26 34,36±1,47 54,67±0,83* * 43,85±0,25 43,75±1,17* 36,40±1,12 37,27±0,66* * 23,75±0,46 16,7±0,6 15,4±0,52

Шиповатый 64,36±1,74 59,35±2,49 68,70±1,2** 42,47±0,73 84,3±1,2 81,20±1,03 79,46±0,83* 68,63±0,42 31,32±0,75 24,56±0,34

Зернистый 7,23±0,41 7,56±0,48 21,60±0,6 18,40±1,1 28,4±0,52 31,73±0,26 24,34±0,64 25,43±0,63 8,87±0,52 9,53±0,4

Роговой 8,63±0,52 7,57±0,84 9,30±0,48 8,60±0,53 9,20±0,24 11,02±0,6 14,73±0,37 16,63±0,66 6,43±0,39 5,20±0,24

2 Толщина струпа (мкм) 214,73±3,32 ** 158,36±2,48 185,85±3,42 * 232,63±2,48 162,25±2,67 * 226,24*3,13 141,32±2,42 * 256,37±2,03 34,61±1,11* * 55,15±2,35

3 Толщина слоя грануляционной ткани (мкм) - - 407,20±4,45 ** 247,42±3,13 573,36±4,46 ** 312,60^3,45 584,36±3,21 Ф* 407,35±2,97 385,56±2,75 * 474,63±2,63

4 Толщина слоя волокнистой соединительной ткани (мкм) - - 427,58±3,54 401,39±3,95 503,63±2,68 * 461,30±2,12 424,57±3,13 ** 303,67±2,36 461,24±2,35 * 341,65±2,35

5 Дно раны (%)

ПЯЛ - - 16,15±0,47 15,38±0,68 2,16±0,34 2,31 ±0,4 1,54±0,44 3,08±0,33 1,54±0,23* б,15±0,5

Фиброциты и волокнистые структуры - - 20,41±0,75 15,38±0,44 33,85±2,24 26,15±0,79 39,23±0,78 35,38±0,74 52,31±0,65 ** 38,46±0,6

*- достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановыми покрытиями «Коллахит-Бол» (опыт) и «Коллахит-Г» (контроль) (Р<0,05);

**- достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановыми покрытиями «Коллахит-Бол» (опыт) и «Коллахит-Г» (контроль) (Р<0,01);

На 30-е сутки в обеих группах животных ожоговый дефект закрыт плотно прилежащим сухим струпом. В ранах контрольной группы при морфологическом исследовании наблюдается развитие грануляционной ткани с более высоким значением толщины - 474,63±2,63 мкм, чем в ранах опытной серии - 385,56±2,75 мкм. В опытной ране явно преобладает продуктивная тканевая реакция. Об этом свидетельствует более высокий удельный процент фиброцитов и волокнистых структур в ранах - 52,31±0,65%, чем в контроле -38,46±0,6% (р<0,05).

Результаты применения коллаген-хитозановых покрытий в местном лечении ран после нанесения ожога Ш-Б степени

В результате местного лечения ожога Ш-Б степени покрытиями «Коллахит-Бол» в опытной группе животных и «Коллахит-Г» в контрольной на 5-е и 7-е сутки раны полностью изолированы покрытием. Площади ран достоверно не различаются.

При морфологическом исследовании на 5-е сутки в ранах преобладают острые альтеративные изменения с началом перифокального воспаления, репаративные процессы в виде продуктивной тканевой реакции не развиты. В связи с этим морфометрия ожоговой раны проводилась только за границей и на границе ожога. Достоверные различия морфометрических размеров данных областей не подтвердились. Однако величина толщины струпа в опытной группе животных значительнее, чем в контрольной группе (р<0,01).

На 7-е сутки по-прежнему сохраняется большее значение толщины струпа в опыте - 292,32±2,54 мкм, чем в контроле - 255,07±2,08 мкм (р<0,05). Репарация раны опытной группы отличается большим развитием незрелой грануляционной 147,40±1,75 мкм (р<0,05) и вновь образованной волокнистой соединительной тканей в дне раны 607,14±3,5 мкм (р<0,01). В опытной ране преобладают плазматические клетки и макрофаги - 13,08±0,55%, против 5,38±0,63% в контрольной (р<0,05), Большее значение толщины эпидермиса на границе ожога в опыте, чем в контроле, в частности значения толщины базального и шиповатого слоев (38,58±0,36 мкм и 185,53^2,73 мкм, р<0,01) соответственно, указывают на выраженное формирование краевой эпителизации (табл. 3,4). На 7-е сутки в опытной группе достоверно большая, чем в группе сравнения регистрируется интенсивность иммунопероксидазной реакции на ТОР-/31 в макрофагах дна раны (табл. 5).

На 10-е сутки после нанесения ожога раны в обеих группах животных изолированы покрытием. Достоверных различий площадей ран нет. При микроскопическом исследовании в опыте на 10-е сутки после ожога наряду с перифокальным воспалением и развитием грануляционной ткани с толщиной 565,04±4,18 мкм появляется гигантоклеточная реакция вокруг погибших придатков кожи. В контрольной ране явно преобладает экссудативная тканевая реакция, развитие грануляционной ткани слабое и составляет 286,15±2,81 мкм (р<0,05). Большее значение толщины струпа в контроле по сравнению с опытом, составляющее 285,83±1,57 мкм против 212,10±б,04 (р<0,05), замедляет процесс заживления в ране.

Морфометрические данные ран крыс после ожога Ш-Б степени на разных сроках заживления после применения раневых покрытий «Коллахит-Бол» (опыт) и «Коллахит-Г» (контроль)

Опыт 5 сутки Контроль 5 сутки Опыт 10 сутки Контроль 10 сутки Опыт 15 сутки Контроль 15 сутки Опыт 20 сутки Контроль 20 сутки Опыт 30 сутки Контроль 30 сутки

1 Толщина эпидермиса на его границе (мкм) 136,19±3,08 128,36±7,29 175,01*2,89* 133,05*1,81 180,18*2,31 151,29±2,26 166,3±3,15 130,01±6,58 56,28±1,22 52,64±0,75

Базальный 34,53*1,22 33,87±1,95 69,62±0,32** 46,53±0,25 55,88*1,61* 28,95*1,62 45,23±1,02** 20,37*0,84 14,29*0,5 13,25*0,48

Шиповатый 72,б9±2,18 86,41*5,28 75,0й£1,08* 59,78*0,73 93,30*1,64 86,97*1,29 88,494:1,08* 74,9610,66 22,42*0,67 20,73*0,46

2 Толщина струпа (мкм) 259,11±4,5** 175,44±3,17 212,1*6,04* 285,83±1,57 152,75*2,91* 213,49*4,23 150,63*4,93* 227,71 ±4,03 65,61*3,11** 175,15*6,35

3 Толшина слоя грануляционной ткани (мкм) - - 565,04*15,18 ** 28б,15±2,81 631,77*11,89 ** 330,11412,52 664,41±17,08 * 423,55±10,79 412,37*4,25* 501,82*6,76

4 Толщина волокнистой соединительной ткани (мкм) - - 517,34*4,99 443,46*5,07 514,22*12,66 * 325,75±9,55 518,50*5,99* * 324,07±8,75 525,06*10,43* 367,95*8,12

5 Дно раны (%)

ПЯЛ - 16,15±0,47 15,38*0,68 2,16*0,34 2,31±0,4 1,54±0,44 3,08±0,33 1,54*0,23* 6,15*0,5

Фиброциты и волокнистые структуры - - 20,41*0,75 15,38*0,44 33,85±2,24 26,15±0,79 39,23±0,78 35,38±0,74 52,31*0,65* * 38,46±0,6

Таблица 4

Морфометрические данные ран крыс после ожога Ш-Б степени на разных сроках заживления после применения раневых покрытий «Коллахит-Бол» (опыт) и «Коллахит-Г» (контроль)

Опыт 7 сутки Контроль 7 сутки Опыт 13 сутки Контроль 13 сутки Опыт 16 сутки Контроль 16 сутки

1 Толщина эпидермиса на его границе (мкм) 259,91*5,22* 163,41*4,85 191,49^1,28** 157,99*2,32 175,85*2,90 143,07*2,48

Базальный 38,58*0,36** 23,13*0,95 50,43±1,15* 32,88*1,11 54,56*0,17* 41,45*0,96

Шиповатый 185,53±2,73** 105,63±1,41 97,92±1,7* 72,79±1,32 91,98*1,69* 65,30*1,27

2 Толшина струпа (мкм) 292,32*2,54* 255,07*2,08 327,23*1,21* 385,73*5,14 58,68*5,39* 193,26*8,83

3 Толщина слоя грануляционной ткани (мкм) 147,40±1,75* 96,25*3,16 406,01*6,78** 265,05*2,18 605,67*5,19" 357,03*2,31

4 Толщина волокнистой соединительной ткани (мкм) 607,14±4,5" 512,76±3,6 796,83±21,20** 397,68*13,96 699,86*15,59* 473,12*9,31

5 Дно раны (%)

Макрофаги, плазматические клетки 13,08*0,55* 5,38*0,63 5,38*0,42 11,54*0,7 15,38*0,6 15,38*0,68

Фиброциты и волокнистые структуры 17,69*0,71 16,26*0,66 32,31±0,96* 23,08*0,62 33,85*2,24 26,15*0,79

* - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановыми покрытиями «Коллахит-Бол» (опыт) и «Коллахит-Г» (контроль) (Р<0,05); **- достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановыми покрытиями «Коллахит-Бол» (опыт) и «Коллахит-Г» (контроль) (Р<0,01);

17

На 10-е сутки сохраняются достоверные различимые значения показателя активности краевой эпителизации - толщины эпидермиса в ранах опытной и контрольной групп (р<0,05). Плотность клеточных и структурных элементов дна раны в опытной группе животных, исходя из данных относительного объема, занимаемого межуточным пространством, выше, чем в контрольной серии животных - 28,46±0,53% против 21,54±0,56% (р<0,05).

Таблица 5

Интенсивность ИГХ-реакции маркеров ММР-2, ММР-9, ТСР-/?1 и коллагена IV в ранах обеих групп

Структурный элемент Интенсивность реакции (от 0 до 3 баллов)

на 7 сутки на 13 сутки на 16 сутки

Опыт | Контроль Опыт | Контроль Опыт | Контроль

ММР-2

Макрофаги в дне раны 1,7±0,07| 1,8±0,08 | 1,9±0,08 | 1,810,09 12,410,10*1 2,1±0,10

ММР-9

ПЯЛ под струпом (глубокий слой) 3,1+0,04 2,8±0,07 1,410,05* 2,4±0,1 1,710,08* 2,010,07

ТОР-/31

ПЯЛ под струпом (глубокий слой) 1,7±0,07 1,6±0,07 2,310,10** 2,410,08** 2,210,06* 1,210,06***

Макрофаги в дне раны 2,1±0,10* 1,7+0,08 2,410,10* * 2,610,10** 2,810,07* 2,310,07

Строма дна раны 0,9±0,04 0,810,03 0,910,04 1,110,05 0,8+0,04 0,910,04

Фибробласты в дне раны 1,б±0,07 1,210,05 2,310,10* * 2,110,09** 2,810,08* 2,310,08

Эндотелий в дне раны 0,8±0,04 0,710,03 1,710,09** 1,610,07** 2,710,08* 2,310,07***

коллаген IV

Строма дна раны 0,8±0,021 0,7±0,02 12,0+0,07* | 1,410,05** |2,8±0,08* | 2,5±0,07***

* достоверно различимые показатели в сравнении с контролем. ** достоверно различимые показатели в сравнении с 7-и сутками. *** достоверно различимые показатели в сравнении с 13-и сутками.

На 13-е сутки раны визуально не изменены. В контрольной группе животных в краях ожоговой раны с применением покрытия «Коллахит-Г» отмечается менее активная пролиферация клеток, подтверждающаяся значениями базального и шиповатого слоев. Однако значение рогового слоя наоборот больше, чем в ранах опытной серии животных (р<0,05). В струпе толщиной 385,73±5,14 мкм, содержащем коллаген-хитозановую губку, по-прежнему присутствуют микробы. Струп отграничен от подлежащих тканей мощным валом из ПЯЛ. Репарация отличается преобладанием зрелой грануляционной ткани в дне раны. Развита макрофагальная реакция, основная роль в которой принадлежит зрелым макрофагам, преобладающим в удельном объеме в ранах контрольной группы (11,54±0,7%) по сравнению с ранами опытной группы (5,38±0,42%). Сохраняется существенная инфильтрация раны ПЯЛ. В опытной группе животных в краях ожоговой раны с применением покрытия «Коллахит-Бол» отмечается не только активная пролиферация

эпидермиса, сопровождающаяся увеличением толщины до значения 191,49±1,28 мкм (р<0,01), преимущественно за счет увеличения базального и шиповатого слоев, но и более развитая, чем в контроле, эпидермизация раны. В струпе толщиной 327,20±1,21 мкм, меньшем, чем в ране контрольной группы (р<0,05), содержащем коллаген-хитозановую губку, присутствуют микробы. Ограничительный вал из ПЯЛ исчезает. Репарация отличается преобладанием в дне раны зрелой грануляционной ткани со значением 406,01±6,78 мкм (р<0,01) и волокнистой соединительной ткани со значением 796,83±21,20 мкм (р<0,01). В ранах опытной группы наблюдается и большее количество фиброцитов, волокнистых структур по сравнению с раной контрольной (р<0,05). Степень инфильтрации раны ПЯЛ меньшая. Развита макрофагальная реакция. Под струпом возникает слой из грубых соединительнотканных волокон. В целом в ране раньше, чем в контроле, начинают преобладать продуктивные тканевые изменения. В обеих группах отмечается повышение экспрессии Кл-67 в фибробластах, эндотелии капилляров, макрофагах и ПЯЛ дна раны. Более высокая пролиферативная активность регистрируется в непосредственной близости в краях раны в базальтом слое эпидермиса. Однако выше экспрессия И-67 в этой зоне в опытной группе, доказывающая более активную пролиферацию эпителия в базальном и частично в шиповатом слоях эпидермиса в крае раны, чем в контроле (р<0,05). Увеличение экспрессии СБ68 в моноцитарно-макрофагапьных клеточных элементах достигает высоких величин в обеих группах в дне раны, на границе струпа и в подлежащей грануляционной ткани. Однако по сравнению с контролем отмечается статистически достоверное повышение экспрессии СБ68 на границе струпа с подлежащими тканями и под струпом, в неглубоко расположенном слое грануляционной и вновь образованной соединительной ткани (р<0,05) (табл. 6).

Таблица 6

Структурный элемент 13-е сутки 16-е сутки

Итоговое значение Итоговое значение

Опыт Контроль Опыт Контроль

Кл-67

Макрофаги в дне раны 214,3* выражен. 185,0 умерен. 231,8* выражен. 211,8*** выражен.

Фибробласты в дне раны 137,8 умерен. 141,9 умерен. 192,5* умерен. 149 умерен.

Эндотелий сосудов в дне раны 177?,0* умерен. 131,5 умерен. 198,8* умерен. 160,1*** умерен.

СБ 68

СБ68+ - клетки на границе струпа с подлежащими тканями 195,6* умерен. 172,1** умерен. 136,5 умерен. 146,2 умерен.

С068+ - клетки под струпом (неглубокие слои) 189,7* умерен. 158,7** умерен. 178,6* умерен. 149,6 умерен.

* достоверно различимые показатели в сравнении с контролем. ** достоверно различимые показатели в сравнении с 7-и сутками. *** достоверно различимые показатели в сравнении с 13-и сутками.

На 13-е сутки в опытной группе регистрируется снижение экспрессии ММР-9 в лейкоцитарном вале под струпом, опережая таковое в контроле. В опыте нарастает в моноцитах, и макрофагах дна раны экспрессия фактора роста ТСР-/31 (р<0,05). Степень экспрессии коллагена IV в опыте выше, чем в контроле, что указывает на разную завершенность ремоделирования ткани в ранах.

На 15-е сутки эксперимента в опытной и контрольной группах животных поверхность ран представлена струпом с участками грануляций. Краевая эпителизация - в виде розовой полоски шириной 1-2 мм. Рана в опыте с площадью 18,6±0,48 см2 достоверно меньше раны в контроле - 20,6±0,28 см2 (р<0,05). При морфологическом исследовании в ране в результате местного лечения раневым покрытием «Коллахит-Бол» начинает преобладать продуктивная тканевая реакция. В контроле наряду с воспалительной инфильтрацией раны и массивным слоем скопления некротизированных клеток, детрита, лейкоцитов над поверхностью раны, о чем констатирует большее значение толщины струпа - 213,49±4,23 мкм, по сравнению с раной опытной группы - 152,75±2,91мкм (р<0,05), наблюдается развитие грануляционной ткани с исходом в склероз. Величины грануляционной и волокнистой соединительной тканей меньше, чем в ране опытной группы животных - 330,11±12,52 мкм и 325,75±9,55 мкм против 631,77±11,89 мкм (р<0,01) и 514,22±12,66 (р<0,05) соответственно.

На 16-е сутки в ранах обеих групп в струпе, содержащем коллаген-хитозановую губку, присутствуют микробы. Под струпом формируется слой из грубых соединительнотканных волокон. В ране преобладают продуктивные тканевые изменения. В контрольной ране наблюдается вал из ПЯЛ, ограничивающих струп от раневой поверхности. Значение толщины последнего больше, чем в ранах опытной серии - 193,26±8,83 мкм против 58,68±5,39 мкм (р<0,05).Имеет место инфильтрация раны ПЯЛ. Развита макрофагальная реакция. В краях ожоговой раны опытной серии животных с применением коллаген-хитозанового комплекса «Коллахит-Бол» отмечается активная пролиферация эпидермиса, что выражается в большей величине слоев базальных и шиповатых клеток эпидермиса - 54,56±0,17 мкм и 91,98±1,69 мкм против 41,45±0,96 мкм и 65,3±1,27 мкм в контроле соответственно (р<0,05). Ограничительный вал из ПЯЛ отсутствует. Репарация сопровождается более активным развитием в дне раны грануляционной и волокнистой соединительной тканей, о чем свидетельствует большее значение их толщины -605,67±5,19 мкм и 699,86±15,59 мкм по сравнению с контролем - 357,03±2,31 мкм (р<0,01) и 473,12±9,31 мкм (р<0,05) соответственно. Имеет место полиморфно-клеточная инфильтрация раны. На дне раневой поверхности отсутствует микробная флора. Хорошо развита макрофагальная реакция.

При иммуногистохимическом исследовании на 16-е сутки в обеих группах возрастает экспрессия Кь67 в макрофагах и эндотелии сосудов в дне раны, что обусловлено необходимостью фагоцитоза погибших тканевых компонентов, активацией иммунных реакций, развитием грануляционной и соединительной ткани. В опыте экспрессия Ю-67 фибробластами дна раны в этот срок выше, чем в контроле и составляет 2,8±0,08 баллов (р<0,05). Процесс

20

указывает на интенсивную реконструкцию основных волокнистых структур внеклеточного матрикса. В контроле же на 16-е сутки в фибробластах, фиброцитах реакция оценивается как умеренная, снижаясь до минимальной по направлению к центру раны, и составляет 2,3±0,08 баллов. На 16-е сутки в опыте происходит большее накопление маркера С-В68 во всех слоях ожоговой раны, опережающее контроль, что может означать ранний переход в продуктивную фазу воспалительного процесса (р<0,05). В опыте отмечается явное угнетение экспрессии ММР-9 в строме и фибробластах грануляционной ткани и соединительной ткани в дне раны. Выраженность экспрессии маркера ММР-2 и его локализация в обеих группах до 16-х суток не изменяется. Исключение составляет слой макрофагов в дне раны, граничащий с валом ПЯЛ, где экспрессия маркера достоверно выше, чем в контрольной 1руппе. В опыте в моноцитах и макрофагах дна раны экспрессия фактора роста ТСР-/31 выше, чем в контроле (р<0,05), дополняясь в опыте достоверно более высокой ИГХ-реакцией в глубоком слое лейкоцитарного вала, фибробластах, фиброцитах и эндотелии капилляров дна раны. Учитывая более высокую экспрессию коллагена IV в опыте, коллагенизация дна раны наступает раньше и осуществляется активнее. Раньше, чем в контроле, и в большем объёме формируются базальные мембраны микрососудов в созревающей грануляционной ткани, заполняющей дно раны.

На 20-е сутки эксперимента раны опытной и контрольной групп на всем протяжении покрывает струп с участками грануляций до 6 мм в диаметре. По всему периметру раны - розовая кайма шириной до 4 мм. Тем не менее, заживление ран в обеих группах различно, в результате которого значительно отличаются их площади, а именно, в опыте 14,8±0,28 см2 и 16,7±0,4 см2 в контроле (р<0,05). На 20-е сутки в ране после применения раневого покрытия «Коллахит-Бол» явно преобладает продуктивная тканевая реакция, развитие которой отражается на величине слоя грануляционной и волокнистой соединительной тканей (р<0,01). Активная пролиферация краев эпидермиса подтверждается более высоким значением как базального (45,23±1,02 мкм, р<0,01), так шиповатого слоев (88,49±1,08 мкм, р<0,05), по сравнению с контролем - 20,37±0,84 мкм и 74,96±0,66 мкм соответственно. Более быстрой смене фаз заживления способствует меньшее значение толщины струпа, величина которого составляет 150,63±4,93 мкм в отличие от раны в контроле -227,71±4,03 мкм (р<0,05). В контрольной ране наряду с воспалительной инфильтрацией наблюдается развитие грануляционной ткани с исходом в склероз, сопровождающееся меньшим значением ее толщины 423,55±10,79 мкм по сравнению с раной в опытной группе животных - 664,41±15,99 мкм (р<0,01).

На 30-е сутки в опытной группе животных рану площадью 8,1±0,49 см2, достоверно меньшую, чем в контрольной - 10,8±1,7 см2 (р<0,05) закрывает струп. По периметру ран обеих групп развитие краевой эпителизации - в виде розовой каймы шириной до 5 мм. В ранах опытной серии животных при морфологическом исследовании явно преобладает продуктивная тканевая реакция. Наблюдается большее значение толщины волокнистой соединительной ткани по сравнению с контролем - 525,06±10,43 мкм против 367,95±8,12 мкм (р<0,05). Напротив, значение грануляционной ткани в ранах

21

опытной серии (412,37±4,25 мкм) меньше, чем в ранах контрольной (501,82±6,76) (р<0,05). Наблюдается менее активное развитие волокнистой соединительной ткани, на что указывает большее значение удельного объема волокнистых структур и фиброцитов в опытных ранах, чем в контрольных (р<0,01). В контроле отмечается персистенция экссудативного воспаления, которое обусловливает увеличение удельного объема ПЯЛ до 6,15±0,5% по сравнению со значениями в опытной группе -1,54±0,23 (р<0,05).

ВЫВОДЫ

1. Разработан дермальный эквивалент кожи на основе биодеградируемого раневого покрытия «Коллахит-Бол» с низкой степенью цитотоксического потенциала.

2. Получен способ лечения ожога Ш-Б степени у животных в эксперименте на основе применения дермального эквивалента кожи, увеличивающий суточную скорость заживления по сравнению с бесклеточной полимерной матрицей на 25,5%.

3. Применение раневого покрытия на основе коллаген-хитозанового комплекса «Коллахит-Бол», содержащего гликозаминогликаны и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота «адгелон», по сравнению с использованием коллаген-хитозанового покрытия «Коллахит-Г» в местном лечении ожогов кожи Ш-А и Ш-Б степеней в эксперименте позволило увеличить суточную скорость заживления ран Ш-А степени на 8,4% и ран Ш-Б степени на 7,9%, ускорить образование на 7-е сутки грануляционной ткани при ожоге Ш-Б степени на 53,1%, волокнистой соединительной ткани в дне раны -на 18,4%, повысить пролиферативную реакцию эпидермиса края раны - на 59,1%.

4. Применение раневых покрытий «Коллахит-Бол» при местном лечении термического ожога инициирует высокую экспрессию маркеров кл-67, СБ68, т6р-/31 в моноцитах и макрофагах, продукцию коллагена iv в мембранах эпителия и сосудов, супрессию маркеров ММР-2 и ММР-9 в стромальном компартменте грануляционной и соединительной тканей, что свидетельствует о выраженной активности фибробластов и фиброцитов, укорочении фазы альтерации и экссудации, раннем переходе в продуктивную фазу воспалительного процесса с активацией фагоцитоза и васкулогенеза в созревающей грануляционной ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Губчатые коллаген-хитозановые раневые покрытия, содержащие эмбриональные аллогенные фибробласты, создают условия для высокотехнологичной репарации кожи при термических ожогах и могут служить основой для использования в практическом здравоохранении в ожоговых центрах.

2. Коллаген-хитозановые матрицы, модифицированные гликозаминогликанами и фактором роста клеток «адгелон», являются перспективной биополимерной конструкцией для разработки новых изделий медицинского назначения с использованием клеточных технологий.

22

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шнейдер, Е.К. Раневые покрытия при ожоговой травме / Е.К. Шнейдер,

A.A. Власов, A.B. Кустош // Сб. материалов 70-й итоговой студен, науч.-прак. конф. с международным участием. - Красноярск, 2006. - С.88-91.

2. Власов, A.A. Биодеградируемые раневые покрытия при ожоговой травме / A.A. Власов, A.B. Кустош, Е.К. Шнейдер // Сб. материалов 70-й итоговой студен, науч.-прак. конф. с международным участием. - Красноярск, 2006.-С. 86-88.

3. Власов, A.A. Применение раневых покрытий на основе коллаген-хитозановых комплексов для пластики ожоговой поверхности / A.A. Власов, С.Ж. Езекян // Сб. материалов 71-й итоговой студен, науч.-прак. конф. с международным участием, посвященной 130-летию со дня рождения проф.

B.Ф. Войно-Ясенецкого. - Красноярск, 2007. - С. 117-119.

4. Власов, A.A. Моделирование ожоговой поверхности в эксперименте / A.A. Власов, С.Ж. Езекян // Сб. материалов 71-й итоговой студен, науч.-прак. конф. с международным участием, посвященной 130-летию со дня рождения проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого. - Красноярск, 2007. - С.119-122.

5. Еремеев, A.B. Функции плюрипотентных клеток и фибробластов дермально-эпидермального слоя животных в условиях их культивирования на коллаген-хитозановых покрытиях / A.B. Еремеев, A.B. Светлаков, И.Н. Большаков, A.A. Власов, С.Ж. Езекян, В.А. Арапова // Материалы IX межд. науч. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» -Ставрополь, 2008. - С. 169-172.

6. Большаков, И.Н. Дермальный эквивалент кожи на основе коллаген-хитозанового раневого покрытия для реконструкции глубоких ожогов / И.Н. Большаков, А.К. Кириченко, A.B. Еремеев, A.A. Власов // Общегородская ассамблея «Красноярск». Технологии будущего: Сб. материалов городской науч.-практ. конф. - Красноярск, 2008. - С. 144-147.

7. Большаков, И.Н. Применение коллаген-хитозанового раневого покрытия с культурой эмбриональных фибробластов при местном лечении глубоких ожогов / И.Н. Большаков, А.К. Кириченко, A.B. Еремеев, A.A. Власов // Фундаментальные исследования. - Москва, 2008. - №10.- С.59-60.

8. Еремеев, A.B. Функции плюрипотентных клеток и фибробластов дермально-эпидермального слоя животных в условиях их культивирования на коллаген-хитозановых покрытиях / A.B. Еремеев, A.C. Замай, Н.В. Зотова, A.A. Власов, С.Ж. Езекян, В.А. Арапова // Цитология. - Москва, 2008. - Т.9. - С.804-807.

9. Еремеев, A.B. Жизнеспособность и функции плюрипотентных клеток и фибробластов дермально-эпидермального слоя животных в условиях их культивирования на коллаген-хитозановых покрытиях / A.B. Еремеев, A.B. Светлаков, И.Н. Большаков, A.A. Власов, В.А. Арапова // Сибирское медицинское обозрение. - Красноярск, 2008. - №6. - С.24-27.

10. Большаков, И.Н. Морфологическое обоснование местного лечения ожоговой травмы коллаген-хитозановым раневым покрытием / И.Н. Большаков, А.К. Кириченко, A.A. Власов, В.А. Арапова // «Клиническая анатомия и

экспериментальная хирургия» - Тр. Всероссийской науч. конф. в составе журнала «Морфологические ведомости». - Москва-Оренбург, 2009. - №3. -С.170-171.

11. Еремеев, A.B. Функции культивируемых эмбриональных клеток на коллаген-хитозановой матрице /A.B. Еремеев, A.B. Светлаков, И.Н. Большаков, A.A. Власов, В.А. Арапова // Клет. транспл. ткан. инж. - Москва, 2009. -T.IV(2). - С.55-62.

12. Власов, A.A. Применение коллаген-хитозанового раневого покрытия с культурой имплантированных эмбриональных фибробластов для местного лечения ожоговой травмы / A.A. Власов, A.B. Еремеев // Материалы конференции молодых ученых и специалистов, посвящ. имени академика Б.С. Гракова «Актуальные вопросы медицины и новые технологии - 2009». -Красноярск, 2009.- С.55-60.

13. Власов, A.A. Использование искусственных эквивалентов кожи в лечении ожоговой травмы / A.A. Власов // Материалы конференции молодых ученых и специалистов, посвящ. имени академика Б.С. Гракова «Актуальные вопросы медицины и новые технологии - 2009».- Красноярск, 2009.- С.61-65.

14. Кириченко, А.К. Анализ молекулярных клеточных и внеклеточных маркеров ожоговой поверхности при использовании раневых покрытий на основе коллаген-хитозановых биополимеров / А.К. Кириченко, И.Н. Большаков, A.A. Власов // Материалы X межд. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Н. Новгород, 2010. - С. 195199.

15. Большаков, И.Н. Жизнеспособность и функции плюрипотентных клеток и фибробластов дермально-эпидермального слоя животных в условиях их культивирования на коллаген-хитозановых покрытиях / И.Н. Большаков, A.B. Еремеев, A.B. Светлаков, A.A. Власов // Материалы X межд. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Н. Новгород, 2010.-С.166-169.

ПАТЕНТЫ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Власов A.A., Еремеев A.B., Большаков И.Н., Кириченко А.К. Патент РФ №2372922 «Способ лечения глубокого ожога кожи». Приоритет № 2008124928/14 (030201) от 18.06.2008 А61 L15/28, 15/32, 27/60. БИПМ №32 от 20.11.2009.

2. Еремеев A.B., Зотова Н.В., Власов A.A., Большаков И.Н., Светлаков A.B. Патент РФ №2391399 «Способ получения клеточной матрицы кожи». Приоритет №2008131742/15 (039611) от 31.07.2008 А61 К35/32, А61 К35/12, А61 К35/28, С12 N5/08. БИПМ №16 от 10.06.2010.

Заказ № /£//& Тираж /0Р экз.

Отпечатано ООО «Новые компьютерные технологии» 660049 г. Красноярск, ул. К. Маркса, 62; офис 120; тел.: (391)226-31-31,226-31-11.

Актуальность проблемы. Проблема восстановления обширных раневых дефектов, полученных в результате ожога, была и остается одной из самых актуальных в современной медицине. В настоящее время по данным Федеральной службы государственной статистики число обожженных пациентов за год составляет по РФ в среднем 120000 человек. Гибель кожных покровов значительной площади в результате ожогов или «взятие» кожи для аутотрансплантации сопровождаются развитием инфекции и суперинфекции, потерей белков, электролитов, воды, плазмы, патологической регенерацией. Известно, что при ожогах необходимо как можно раньше восстанавливать непроницаемый кожный барьер (Арьев Т.Я., 1962; Атясов Н.И., 1972). Стандартная методика аутопересадки получила применение только при ограниченных размерах ожога. В силу высокой стоимости и частого отторжения аллографты не обеспечивают эффективного покрытия. Поскольку лечение обширных ожогов требует использования кожи или ее искусственных эквивалентов, в последние годы были проведены многочисленные исследования по их применению и разработке (Расулов М.Ф. и соавт., 2005; Калмыкова Н.В. и соавт., 2007; Дорожкина Е.Б., 2008; Спичкина О.Г., 2008; Швед Ю.А., 2008; Дешпанде М.Ш. и соавт., 2009; Ивашкин А.Н., 2009; Metcalfe A.D. et al., 2007; Trottier V. et al., 2008; Altman A.M. et ah, 2009; Auxenfans C. et al., 2009). Каждый из предложенных способов имеет определенные преимущества. Однако до сих пор не создан универсальный носитель клеточных структур, который обладал бы биосовместимостью, абсорбционной способностью в отношении раневого экссудата, предотвращал инфицирование, создавал оптимальную микросреду для регенерации раны, был проницаемым для воды и воздуха, но не высушивал дна раны, был эластичным, моделировал поверхность со сложным рельефом. Определенный прогресс в данной области достигнут созданием способов и средств, ускоряющих сроки заживления ран благодаря управляемым процессам самосборки основного компонента соединительной ткани — коллагена (Risbud M. et al., 2000; Denuziere A. et al., 2000; Jarrahi M., 2008; Chu Y. et al., 2008). В настоящее время стало очевидным, что наилучшие результаты в оптимизации процессов реорганизации тканевых дефектов позволяет получить использование природных полимеров, способных осуществлять контроль синтеза и ориентации волокнистых структур (Leahy P.J., Lawrence W.T., 2007; Wang W. et al., 2008). Впервые покрытия на основе биодеградирующих биополимеров были разработаны и получены в Институте хирургии им. A.B. Вишневского Росмедтехнологий (Адамян A.A. и соавт., 1995, 1997, 1998, 2000, 2004). Комбинация таких полимеров с мукополисахаридами и факторами роста позволяет контролировать образование грануляций, ускорять эпителизацию кожных дефектов, получать соединительную ткань, мало отличающуюся от окружающей здоровой кожи.

Исходя из вышеизложенного, представляется возможным считать, что разработка способа лечения ожогов раневыми, покрытиями- на: основе биосовместимых полимеров одновременно с использованием клеточных технологий является необходимой и перспективной (Alsarra I.A. et al., 2009).

Цель исследования. Экспериментально обосновать применение коллаген-хитозановых раневых покрытий с использованием клеточных технологий в местном лечении термических ожогов.

Задачи исследования:

1. Разработать в эксперименте дермальный эквивалент кожи на.основе коллаген-хитозанового покрытия «Коллахит-Бол» и оценить степень цитотоксического потенциала данного покрытия при контакте с эмбриональными фибробластами животных.

2. Оценить способ лечения ожога кожи Ш-Б степени в эксперименте с применением разработанного дермального эквивалента кожи.

3. Изучить с помощью морфологического и морфометрического методов динамику заживления ожоговых ран III-A и Ш-Б степеней в эксперименте при местном лечении коллаген-хитозановыми раневыми покрытиями.

4. Провести иммуногистохимический анализ молекулярных маркеров процессов репарации клеточного и межуточного компонентов раневой поверхности при местном лечении термического ожога кожи Ш-Б степени коллаген-хитозановыми покрытиями в эксперименте.

Научная новизна исследования. Впервые получен способ лечения глубокого ожога кожи с использованием модифицированных гликозаминогликанами коллаген-хитозановых покрытий с трансплантированными эмбриональными аллогенными фибробластами. Биополимерное покрытие в комбинации с гликозаминогликанами и сывороточным фактором роста «адгелон» позволяет контролировать образование грануляций, создавать благоприятные условия для дифференцировки и- пролиферации клеток, обеспечивающих процесс заживления ожоговых дефектов с восстановлением утраченной кожи. Применение таких покрытий существенно ускоряет заживление кожных дефектов за счет создания условий для активной пролиферации трансплантированных фибробластов. При количественном анализе результатов иммуногистохимических реакций на маркеры заживления ожоговой поверхности кожи получены новые сведения, дополняющие научные знания о репаративных свойствах коллаген-хитозановой матрицы.

Практическая значимость работы. Выявлена оптимальная комбинация способов культивирования аллогенных фибробластов на раневом покрытии. Использование эмбриональных фибробластов, обладающих неограниченной способностью роста, на основе рассасывающегося биосовместимого коллаген-хитозанового комплекса создает более реальную возможность восстановления утраченной кожи после ожога Ш-Б степени по сравнению с существующими методами местного лечения. Применение коллаген-хитозанового комплекса, содержащего гликозаминогликаны и сывороточный фактор роста адгелон», для местного лечения ожоговых ран в виде аппликации сокращает время заживления ожогов Ш-А и Ш-Б степеней у крыс. Таким образом, настоящее исследование позволяет рекомендовать к использованию полученный дермальный эквивалент, коллаген-хитозановое раневое покрытие «Коллахит-Бол» в хирургии, комбустиологии для закрытия ожоговых дефектов Ш-А и Ш-Б степеней и восстановления кожного покрова.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: X Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». - г.Нижний Новгород, 2010 г.; IX Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». - г.Ставрополь, 2008 г.; Международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники». - г.Шарм-эль-шейх (Египет), 2008 г.; ежегодных итоговых научных конференциях Красноярского государственного медицинского университета, 2006-2009 гг.; общегородских форумах и ассамблеях «Красноярск. Технологии будущего», «Красноярск - город инноваций, партнерства и согласия». -г.Красноярск, 2008-2009 гг.; молодежном проекте-форуме с международным участием. «ТИУЬ Бирюса 2009». - г.Красноярск, 2009 г.; финале регионального этапа в Сибири международного конкурса «Бизнес инновационных технологий 2010». - г. Красноярск, 2010 г.; финале IX всероссийского «Конкурса русских инноваций». - г.Москва, 2010 г.; финале «Окружного инновационного молодежного конвента» Сибирского федерального округа. - г.Новосибирск, 2010 г.

Лубликации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 - в журналах, рекомендованных ВАК. Получены 2 патента РФ на изобретения.

134 ВЫВОДЫ

1. Разработан дермальный эквивалент кожи на основе биодеградируемого раневого покрытия «Коллахит-Бол» с низкой степенью цитотоксического потенциала, который увеличивает суточную скорость заживления по сравнению с бесклеточной полимерной матрицей на 25,5%.

2. Применение раневого покрытия на основе коллаген-хитозанового комплекса «Коллахит-Бол», содержащего гликозаминогликаны и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота «адгелон», по сравнению с использованием коллаген-хитозанового покрытия «Коллахит-Г» в местном лечении ожогов кожи Ш-А и Ш-Б степеней в эксперименте позволило увеличить суточную скорость заживления ран Ш-А степени на 8,4% и ран Ш-Б степени на 7,9%, ускорить образование на 7-е сутки грануляционной ткани при ожоге Ш-Б степени на 53,1%, волокнистой соединительной ткани в дне раны - на 18,4%), повысить пролиферативную реакцию эпидермиса края раны - на 59,1%.

3. Применение раневых покрытий «Коллахит-Бол» при местном лечении термического ожога инициирует высокую экспрессию маркеров Кь 67, СБ68, ТОР-(31, ММР-2 в моноцитах и макрофагах, фибробластах, эндотелии в дне раны, продукцию коллагена IV в мембранах эпителия и сосудов, супрессию маркера ММР-9 в стромальном компартменте грануляционной и соединительной тканей, что свидетельствует о выраженной активности фибробластов и фиброцитов, укорочении фазы альтерации и экссудации, раннем переходе в продуктивную фазу воспалительного процесса с активацией фагоцитоза и васкулогенеза в созревающей грануляционной ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Губчатые коллаген-хитозановые раневые покрытия, содержащие эмбриональные аллогенные фибробласты, создают условия для высокотехнологичной репарации кожи при термических ожогах и могут служить основой для использования в практическом здравоохранении в ожоговых центрах.

2. Коллаген-хитозановые матрицы, модифицированные гликозаминогликанами и фактором роста клеток «адгелон», являются перспективной биополимерной конструкцией для разработки новых изделий медицинского назначения с использованием клеточных технологий.