Автореферат и диссертация по медицине (14.01.15) на тему:Применение биологических матриксов в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей

На правах рукописи

похитонов

Дмитрий Юрьевич

ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТРИКСОВ В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ С ТРАВМАТИЧЕСКИМИ ДЕФЕКТАМИ МЯГКИХ ТКАНЕЙ

(клинико-экспериментальное исследование)

14.01.15-травматология и ортопедия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

¿11 и

Москва-2014

005556960

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте скорой помощи им. Н. В. Склифосовского

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Бшгак Евгений Иосифович - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории ревмоортопедии и реабилитации ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой»

Склянчук Евгений Дмитриевич - доктор медицинских наук, профессор кафедры травматологии и ортопедии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « $» ( 201^ г. в // часов на

заседании диссертационного совета Д.208.040.11 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119991, г. Москва, ул. Большая Пироговская, д. 2, строение 3.

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (117998 г. Москва, Нахимовский проспект, дом 49) и на сайте организации www.mma.ru

Автореферат разослан « 6'» (¡£/£¿2 г \±£_ 2014 г.

доктор медицинских наук доктор медицинских наук

Филиппов Олег Петрович Боровкова Наталья Валерьевна

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Тельпухов Владимир Иванович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В современном мире число пациентов, получающих раны различной локализации и этиологии, остается неизменно высоким. Только в США около 300 ООО пациентов с подобными травмами нуждаются в стационарной помощи [71]. Уровень травматизма в России в период с 2007 по 2010 гг. оставался стабильно высоким и составил более 85 промилле [5].

Несмотря на достижения медицины, лечение обширных ран занимает значительное время и остается сложной задачей. В соответствии с российскими стандартами оказания медицинской помощи местное лечение, направленное на подготовку к пластической операции, заключается в ежедневных перевязках с лечебными препаратами, которые подбираются согласно фазе раневого процесса [20]. Для закрытия обширного раневого дефекта кожи чаще всего применяют наиболее доступный метод — свободную аутодермопластику (АДП) [40].

Современные атравматичные раневые покрытия получили широкое распространение при подготовке к АДП, так как способны обеспечивать механическую защиту, создавать оптимальную среду в ране и быть носителями лекарственных средств (антибиотиков, антисептиков или протеолитических ферментов) [6]. Однако и при их использовании подготовка раны к АДП занимает длительное время.

Одним из наиболее перспективных направлений в разработке новых раневых покрытий сегодня следует считать создание биологически активных повязок на основе живых клеток или природных и синтетических полимеров. Повязки на основе кожи человека, такие, как деэпителизированный аллотрансплантат Alloderm, описаны в иностранной литературе. Они положительно себя зарекомендовали в лечении ран и глубоких ожогов, поскольку также обеспечивают механическую защиту, формируют оптимальную среду, предотвращают контаминацию, обладают

абсорбирующим эффектом и могут обладать биосовместимостью [143]. В опубликованных работах отечественных авторов нами не найдено упоминания об использовании бесклеточных повязок на основе дермы человека для лечения ран. Также в литературных источниках имеются лишь единичные исследования о попытках комбинации подобных матриксов с аллогенными или аутологичными прогениторными клетками для стимуляции регенераторных процессов.

Цель исследования

Повысить эффективность комплексного лечения больных с травматическими дефектами мягких тканей путем использования в качестве раневого покрытия биологических матриксов.

Задачи исследования

1. Изучить влияние биологических матриксов (лиофилизированная кожа, дермальный матрикс) на течение раневого процесса в эксперименте.

2. В эксперименте оценить эффективность комбинации дермального матрикса и прогениторных клеток в лечении ран с дефектом мягких тканей.

3. Провести сравнительный анализ результатов лечения больных с травматическими ранами при использовании биологических матриксов и их комбинации с прогениторными клетками.

4. Разработать протокол подготовки раны с дефектом мягких тканей к аутодермопластике с использованием биологических матриксов.

Научная вовшна

Экспериментально установлено отсутствие реакции отторжения дермального матрикса при применении его в качестве раневого покрытия в лечении ран с дефектом мягких тканей.

Экспериментально обоснована возможность использования дермального матрикса в комбинации с прогениторными клетками.

Показано ускорение регенеративных процессов в ране при применении комбинации дермального матрикса и прогениторных клеток.

Впервые экспериментально доказана возможность использования утильных лоскутов кожи в качестве источника прогениторных клеток.

Разработан способ лечения ран с дефектом мягких тканей с использованием комбинированного трансплантата дермального матрикса с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками.

Практическая значимость

Применение дермального матрикса в качестве временного раневого покрытия позволяет предотвратить инфицирование раневой поверхности и значительно снизить риск инфекционных осложнений у пациентов с травматическими дефектами мягких тканей конечностей. Дермальный матрикс способствует росту грануляционной ткани и краевого эпителия.

Использование разработанного протокола применения комбинации дермального матрикса и мультипотентных мезенхималышх стромальных клеток позволяет значительно сократить срок подготовки к аутодермопластике ран с дефектом мягких тканей.

Положения, выносимые на защиту

1. Для подготовки к аутодермопластике пациентов с травматическими дефектами мягких тканей целесообразно применять дермальный матрикс, изготовлепный из кожи доноров.

2. С целью достижения эффективной стимуляции регенерации кожи дермальный матрикс следует комбинировать с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками.

3. В комбинации с дермальным матриксом для подготовки ран к аутодермопластике можно применять как аутологичные клетки, полученные из гомогенизированных утильных лоскутов, так и аллогенные - из костного мозга доноров.

Внедрение результатов работы

Методика использования комбинации дермального матрикса и суспензии прогениторных клеток, разработанная в ходе данного исследования, внедрена в клиническую практику отделения неотложной

травматологии и ортопедии опорно-двигательного аппарата НИИ СП им. Н. В. Склифосовского.

Материалы диссертации доложены на 2-м съезде врачей неотложной медицины в 2013 г., 1-м национальном конгрессе по регенеративной медицине в 2013 г., международной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» в 2014 г.

Личный вклад соискателя Автор непосредственно участвовал в процессе обследования и лечения пациентов, в планировании и проведении всех этапов эксперимента, выборе методов исследования, систематизации и интерпретации полученных клинических и экспериментальных данных, их анализе. Аналитический обзор литературы также выполнен автором.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании проблемно-плановой комиссии № 4 НИИ СП им. Н. В. Склифосовского 16.04.2014 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них в журналах, рецензируемых ВАК РФ, - 2.

Получено 2 патента РФ: патент 2 526 813 С 1 «Комбинированный трансплантат дермалыюго матрикса с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками, способ его получения и способ лечения ран с его использованием» от 16.04.2013 г.; патент 2 526 814 С1 «Способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными ранами с дефектом мягких тканей (варианты)» от 17.06.2013 г.

Соответствие паспорт}' научной специальности

Диссертация соответствует шифру специальности: 14.01.15.

Формуле специальности: травматология и ортопедия - область науки, занимающаяся методами диагностики, лечения и профилактики

повреждений, их последствий, врожденных и приобретенных заболеваний опорно-двигательной системы (позвоночника, грудной клетки и конечностей). Совершенствование методов профилактики, диагностики и лечения заболеваний и повреждений опорно-двигательной системы будет способствовать сохранению здоровья населения, восстановлению трудоспособности, сокращению продолжительности лечения и улучшению его качества.

Область исследований согласно п.4 о экспериментальной и клинической разработка методов лечения заболеваний и повреждений опорно-двигательной системы и внедрение их в клиническую практику.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы.

Текст диссертации изложен на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирован 4 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель включает 186 источников, из них 42— отечественных и 144 -зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Диссертация содержит экспериментальный и клинический разделы. В работе использованы клинический, бактериологический, морфологический и статистический методы исследования.

Экспериментальное исследование по оценке влияния матриксов на течение раневого процесса выполнено на базе лаборатории экспериментальной патологии НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского (руководитель - д. м. н., проф. Т. С. Попова). Эксперимент проведен на 54 беспородных белых мышах.

Под наркозом сбривали шерсть со спинки мыши на площади 4 см2. Животное фиксировали за четыре конечности на операционном столике. После обработки операционного поля йодопироном три раза на свободном от шерсти участке спинки при помощи ножниц производили иссечение участка кожи до фасции диаметром 10 мм, получая кожный лоскут. На рис. 1 представлена схема модели экспериментальной раны в поперечном разрезе. Площадь раневого дефекта составляла 2 % поверхности тела. Одним из важных механизмов закрытия ран является их контракция, ее в эксперименте предотвращали за счет подшивания полихлорвинилового (ПВХ) кольца диаметром 12 мм к краю раны.

В зависимости от использованного раневого покрытия все мыши были разделены на 6 групп по 9 особей в каждой (табл. 1). Вывод животных из эксперимента осуществляли в соответствии с фазами течения раневого процесса на 3, 7, 14-е сутки по три особи. Оценку динамики течения раневого процесса и эффективности лечения ран в эксперименте производили гистологическим методом.

Таблица 1.

Раневые покрытия, использованные в экспериментальном исследовании

Номер группы Раневое покрытие

1 Марлевый тампон, смоченный 3 % водным раствором хлоргексидина (контрольная группа)

2 Аутологичная кожа (кожа экспериментального животного)

3 Лиофилизированная кожа человека (ксенокожа)

4 Бесклеточный дермальный матрикс (ДМ)

5 ДМ, в перфорации которого вносили аутологичную измельченную кожу

6 ДМ + инъекции суспензии аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальцых клеток

Дермальный матрикс (ДМ) как для эксперимента, так и для последующего использования в клинике изготавливали из расщепленной кадаверной кожи в лаборатории трансплантации клеток и иммунотипирования НИИ СП им. Н. В. Склифосовского. В готовом виде ДМ представлял собой пластину белого или светло-бежевого цвета, толщиной до 1 мм, состоявшую из коллагеновых и эластиновых волокон без клеток и клеточных структур.

Задачей первой части эксперимента являлась оценка иммуногенности дермального матрикса и его влияния на процесс регенерации. Для её решения проведено сравнительное макро- и микроскопическое изучение динамики заживления ран в четырех группах экспериментальных животных-№ 1, 2, 3 и 4.

Во второй части эксперимента проведено сравнительное исследование влияния ДМ и комбинации ДМ с мультипотентными мезенхималышми стромальными клетками (ММСК) из различных источников на процесс регенерации раны. Для этого в группах № 5 и 6 в качестве источника

ММСК использовали соответственно аутологичную измельченную кожу и инъекции суспензии аллогенных прогениторных клеток. Введение ММСК в рану производили однократно в виде суспензии с концентрацией ММСК 1 млн/мл, из расчета 1 мл суспензии на 5 см2 площади раны. Введение выполняли в дно раны и окружающие мягкие ткапи при помощи инъекций на глубину 0,1-0,3 см с частотой 3 инъекции на 1 см2.

В эксперименте получены положительные данные о влиянии ДМ и комбинированных (ДМ+ММСК) раневых покрытий на течение раневого процесса, что послужило основанием для проведения ограниченного клинического исследования, одобренного Комитетом по биомедицинской этике и Ученым советом государственного бюджетного учреждения здравоохранения города Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н. В. Склифосовского» Департамента здравоохранения г. Москвы (Протоколы № 6-13).

Проанализированы результаты лечения 45 пациентов - 23 мужчин (51,1 %) и 22 женщины (48,9 %), находившихся на лечении в отделении неотложной травматологии опорно-двигательного аппарата НИИ СП им. Н. В. Склифосовского по поводу ран конечностей с дефектами мягких тканей различной этиологии и локализации в период с 2009 по 2014 гг.

В зависимости от способа подготовки раны к АДП пациентов разделили на 2 группы. Основную группу составили 25 пациентов, в лечении которых использовали различные биологические матриксы. В группе сравнения 20 пострадавшим мы проводили лечение с использованием влажно-высыхающих и мазевых марлевых повязок. В обеих группах пациенты сопоставимы по полу, возрасту и механизму травмы (рис. 2, табл. 2).

15-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-78 71-450

Иосной^ая ^Сравнения

Рисунок 2. Распределение пациентов основной группы и группы сравнения по возрасту

Таблица 2.

Распределение пациентов основной группы и группы сравнения по механизму травмы

Механизм травмы Количество обследованных пациентов

Основная группа Группа сравнения

Укушенные раны 14 (56,0 %) 13 (65 %)

Рвано-ушибленные раны 9 (36,0 %) 7 (35 %)

Огнестрельные раны 2 (8,0 %) -

Всего: 25 (100 %) 20(100%)

Механизм нанесения укушенной раны предполагает мозаичность глубины раны. Поэтому в одной ране дно может быть представлено как глубокими структурами - фасцией или мышцами, так и подкожно-жировой клетчаткой. Среди пациентов основной группы и группы сравнения такие

раны имелись у 14 и 13 пациентов соответственно. Площадь ран колебалась от 0,5 до 1,5 % поверхности тела (п. т.).

Рвано-ушибленные раны больные получали в результате высокоэнергетического воздействия. Дном ран являлась фасция у 5 пациентов основной группы и 5 пациентов группы сравнения, площадь ран варьировала от 1 до 1,5 % п. т. Еще у 4 и 2 пациентов основной группы и группы сравнения соответственно дно раны было представлено мышцами, а площадь ран варьировала от 0,8 до 1,4 % п. т.

У двух пациентов раны с травматическими дефектами мягких тканей получены в результате огнестрельного ранения. Площадь их составила 1 % и 0,5 % п. т. соответственно. Дном этих ран являлась поверхностная фасция.

Всем пациентам в соответствии с действующими на момент оказания медицинской помощи стандартами, утвержденными приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, проводили комплексное лечение. При поступлении осуществляли вакцинопрофилактику столбняка, а пострадавшим от укусов животных — дополнительно антирабическую вакцинацию. При визуальном осмотре оценивали наличие признаков повреждений сосудисто-нервных пучков, сухожилий, костей. Для определения площади раны на этапе поступления использовали «правило ладони», площадь которой приравнивается к 0,7 % поверхности тела больного. Для более точного определения площади раны в дальнейшем применяли планиметрический метод.

После осмотра пациенты направлялись в операционную для проведения первичной хирургической обработки (ПХО).

Рану, нанесенную животным, промывали мыльным раствором, а иссечения краев раны не производили (Приказ МЗ РФ №297 от 7 октября 1997 г.). После оперативного вмешательства раны укрывали салфетками, смоченными 3 % водным раствором хлоргексидина. У всех

пациентов па 1 и 7-е сутки после травмы из раны брали посев на наличие микрофлоры и её чувствительность к антибиотикам. Всем пациентам после заполнения раны яркими мелкозернистыми грануляциями выполняли аутодермопластику.

В группе сравнения местное лечение и подготовка раны к АДП заключалась в ежедневных перевязках с лечебными препаратами, которые подбирали согласно фазе раневого процесса. В раннем послеоперационном периоде для лечения использовали влажные повязки с водным раствором хлоргексидина. В случае появления отложений фибрина на дне раны применяли протеолитические ферменты - трипсин или химотрипсин. После появления островков грануляционной ткани использовали мази на водорастворимой основе (Левомеколь, Диоксиколь).

В основной группе в зависимости от местного лечения пациентов разделили на три подгруппы.

В первой подгруппе (8 человек) для подготовки раны к АДП применяли перфорированный дермальный матрикс (ДМ), который накладывали на первые-третьи сутки с момента травмы. При отсутствии признаков воспаления ДМ удаляли только после появления грануляционной ткани в перфорациях и выраженного роста краевого эпителиального пласта под матрикс.

Пациентам второй подгруппы (10 человек) на первые сутки после травмы накладывали биологическую повязку на основе коллагена I типа человека с аллофибробластами, положительно зарекомендовавшую себя при лечении пограничных ожогов, также заранее изготовленную в лаборатории трансплантации клеток и иммунотипирования НИИ СП им. Н. В. Склифосовского. После чего производили ежедневные смены повязок. Всего на курс лечения требовалось от 13 до 20 коллагеновых повязок.

В третьей подгруппе (7 человек) применяли комбинацию ДМ и ММСК с целью сложения эффектов от ДМ, который обеспечивал

механическую защиту, и стимулирующего действия факторов, вырабатываемых ММСК. Этим пациентам введение ММСК производили однократно на первые сутки с момента ПХО в виде суспензии с концентрацией ММСК 1 млн/мл, из расчета 1 мл суспензии на 5 см2 площади раны. Инъекции суспензии выполняли в дно раны и окружающие ткани на глубину до 0,3 см, после чего на рану накладывали перфорированный ДМ.

При отсутствии признаков воспаления ДМ удаляли только после появления грануляционной ткани в перфорациях и выраженного роста краевого эпителиального пласта под матрикс.

Оценку эффективности лечения пациентов проводили по срокам заполнения дна раны грануляционной тканью, срокам появления краевой эпителизации и времени подготовки к АДП. Для статистической обработки полученных результатов использовали программы SPSS Statistics vl9 (SPSS, Inc.). Вычисляли средние арифметические значения (М), среднеквадратичные отклонения (<т). Различия значений считали достоверными при уровне вероятности более 95 % (р < 0,05), используя t-критерий Стьюдента.

Основные результаты исследования и их обсуждение

Исследование влияния биологических матриксов на раневой процесс выявило различия динамики заживления ран в экспериментальных группах животных.

В группе мышей № 1 на 14-е сутки микроскопически продолжался процесс эпителизации. Дно ран было заполнено незрелой грануляционной тканью с преобладанием в ней полиморфно-ядерных лейкоцитов, макрофагов и тонкостенных сосудов.

В группе мышей № 2, где использовали аутологичную кожу, на 14-е сутки в одном из трех случаев наблюдалась полная эпителизация дефекта. Эпидерме бил утолщен, сформированы все слои клеток, микрорельеф ьтз

визуализировался, что свидетельствовало о продолжении этапа ремоделировапия. В двух остальных случаях эпителизация раневой поверхности неполная, дно раны заполнено грануляционной тканью. В инфильтрате преобладали гистиоциты и фибробласты.

В группе мышей № 3, которых лечили с использованием ксенокожи, гистологическая картина на 3-й, 7-е сутки характеризовалась выраженной лимфоцитарной инфильтрацией трансплантата и подлежащих тканей. На 14-е сутки эпителизация раневой поверхности не была завершена, грануляционная ткань незрелая с преобладанием воспалительных клеточных элементов.

В группе мышей № 4, где использован ДМ, на 14-е сутки отмечался выраженный рост эпителиального пласта, в грануляционной ткани сохранялось большое количество тонкостенных сосудов, в инфильтрате преобладали фибробласты.

В группе мышей № 5, где использована комбинация ДМ и аутологичной кожи в качестве источника ММСК, уже на 7-е сутки наблюдали полную эпителизацию раневого дефекта. К 14-м суткам отмечено формирование микрорельефа эпидермиса и большое количество придатков кожи — волосяных фолликулов и сальных желез.

В группе мышей № 6, где использована комбинация ДМ и суспензии ММСК, также уже на 7-е сутки наблюдали полную эпителизацию дефекта. На 14-е сутки отмечено формирование микрорельефа, но без формирования придатков кожи.

Таким образом, сравнение динамики заживления ран в первых четырех экспериментальных группах животных показало, что при применении аутотрансплантата и дермального матрикса в качестве раневого покрытия характер инфильтрата сходен и свидетельствует о нормальной смене фаз раневого процесса. При закрытии раны ксенокожей выявлена реакция отторжения трансплантата. Поскольку ДМ изготавливается из кожи человека, то он также является ксеногенным

материалом по отношению к экспериментальным животным. Преимущество ДМ перед лиофилизированной кожей заключается в том, что из него удалены клетки, которые являются носителями антигенов, вызывающих иммунный ответ. При применении ДМ в качестве раневого покрытия отмечены более высокие темпы регенерации в сравнении с контрольной группой.

При сравнительной оценке влияния ДМ и его комбинации с прогениторными клетками на регенерацию в эксперименте наиболее перспективные результаты получены в группах № 5 и 6, где использована комбинация ДМ и ММСК. Ускорение темпов эпителизации подтвердило стимулирующее воздействие прогениторных клеток на процесс регенерации и продемонстрировало возможность их совместного использования с ДМ.

Следует отметить, что использование в качестве источника прогениторных клеток аутологичной измельченной кожи дало наилучшие результаты заживления ран. Однако сравнительные результаты использования комбинации ДМ с аллогенными или с аутологичными клетками не показали значимой разницы в сроках заживления ран.

Таким образом, именно комбинация ДМ и прогениторных клеток наиболее перспективна для клинического применения. Для комбинации можно использовать как аутологичные, так и аллогенные клетки.

В клиническом разделе работы представлен сравнительный анализ результатов традиционного местного лечения ран и их лечения с использованием биологических матриксов у больных с травматическими дефектами мягких тканей.

У всех 20 пациентов группы сравнения, получавших традиционное местное лечение, результаты посевов на 7-е сутки выявили рост смешанной микрофлоры. В ходе подготовки к АДП при снятии повязок отмечалось кровотечение из новообразованных сосудов, что говорило

о травмировании грануляционной ткани. Срок подготовки раны к АДП в этой группе составил 27,3 ±2,1 суток.

В первой подгруппе основной группы при использовании ДМ в качестве раневого покрытия на 7-е сутки после его наложения у 7 из 8 пациентов результаты посевов из раны не выявили роста микрофлоры. При смене повязок ДМ оставался на дне раны, предохраняя растущую грануляционную ткань от механических повреждений. После снятия ДМ дно раны покрыто яркими мелкозернистыми грануляциями, что способствовало раннему выполнению АДП. Использование в качестве раневого покрытия ДМ позволило сократить сроки подготовки раны к АДП до 21,3 ±3,4 суток. Это можно объяснить созданием в ране оптимальных условий для заживления.

Во второй подгруппе в качестве раневого покрытия использовали комбинированную повязку на основе коллагена I типа с аллофибробластами. Эти двухкомпонентные повязки состоят из носителя, роль которого выполняет коллаген, и стимулирующего фактора, которым служат аллофибробласты. При применении повязок па основе коллагена при взятии посева из раны на 7-е сутки определялась смешанная флора у всех пациентов в подгруппе. При смене повязок отмечалось кровотечение из новообразованных сосудов, что говорило о травмировании грануляционной ткани. Срок подготовки раны к АДП сходен с таковым в группе сравнения и составил 27,3 ±2,1 суток.

Учитывая то, что применение ДМ в качестве раневого покрытия в клинике позволило сократить срок подготовки раны к АДП, а также подтвержденную в эксперименте эффективность комбинации ММСК и ДМ, у пациентов третьей подгруппы в качестве раневого покрытия использовали ДМ в комбинации с ММСК, суспензию которых инъекционно вводили в дно раны и окружающие мягкие ткани. Особенность метода заключалась в том, что при использовании ММСК в качестве стимулирующего фактора их комбинирование с ДМ выполняли

непосредственно в ране. Применяли комбинацию ДМ с аллогенными клетками, поскольку получение аутологичных ММСК из костного мозга занимает от 14 до 21 суток, а использовать утильную кожу в качестве источника прогениторных клеток удается редко (например, при укушенных ранах производить иссечение ее краев запрещено приказом МЗ РФ).

При использовании этого комбинированного раневого покрытия результаты посевов из раны на 7-е сутки после наложения матрикса роста микрофлоры не выявили у всех пациентов подгруппы. Помимо отсутствия вторичного инфицирования раны можно отметить те же положительные стороны такого способа лечения, что и в первой подгруппе. При смене повязок ДМ оставался на дне раны, предохраняя растущую грануляционную ткань от механических повреждений. Являясь эквивалентом кожи, ДМ обеспечивал оптимальную микросреду в ране. После снятия ДМ дно раны было покрыто яркими мелкозернистыми грануляциями, что способствовало раннему выполнению АДП. Срок подготовки раны к АДП в третьей подгруппе сократился до 13,7 ±3,4 суток. По нашему мнению, подобные результаты достигнуты за счет сложения эффектов ДМ, выполнявшего роль оптимального биосовместимого покрытия, и стимулирующего действия ММСК.

Таким образом, результаты клинического исследования подтвердили результаты эксперимента и показали эффективность использования комбинации ДМ и ММСК в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей.

По результатам работы разработан протокол подготовки раны с дефектом мягких тканей к аутодермопластике с использованием биологических матриксов, который заключается в следующем.

1 — подготовка раны. Первым этапом выполняют ПХО.

В случае отсроченного наложения матрикса предварительно выпольшпт повторную санацию раны, трехкратно обрабатывая

стерильными марлевыми тампонами с 3 % водным раствором хлоргексидина, промокают стерильным сухим марлевым тампоном. Кожу вокруг рапы трехкратно обрабатывают 0,5 % спиртовым раствором хлоргексидина, избегая его попадания в рану.

2 - введение ММСК. После обработки раны производят трансплантацию аллогенных ММСК в виде суспензии с концентрацией ММСК 1 млн/мл, из расчета 1 мл суспензии на 5 см2 площади раны, в дно раны и окружающие мягкие ткани при помощи инъекций на глубину 0,1— 0,3 см с частотой 3 инъекции на 1 см2.

3 - наложение ДМ. Для оттока раневого отделяемого размороженный ДМ в стерильном лотке перфорируют по всей поверхности скальпелем с частотой 1 перфорация 5 мм на 1 см2. Подготовленную рану укрывают ДМ, смоделированным по форме раны. После наложения матрикс фиксируют стерильной марлевой повязкой.

4 — ведение раны после трансплантации ММСК и наложения матрикса. Первую перевязку после трансплантации клеток и наложения матрикса выполняют через сутки. ДМ обрабатывают йодопироном или другим антисептиком. В дальнейшем перевязки выполняют один раз в 48 часов.

5 — удаление матрикса. ДМ удаляют после того, как краевой эпителиальный пласт пророс под матрикс, приподнимая его края, а перфорации заполнены яркими мелкозернистыми грануляциями.

При заполнении раны мелкозернистой блестящей яркой сочной грануляционной тканью выполняют аутодермопластику.

Выводы

1. Дермальный матрикс при пластическом замещении экспериментального дефекта мягких тканей в отличие от лиофилизированной кожи не вызывает реакции отторжения трансплантата и способствует ускорению репаративных процессов.

2. Дермальный матрикс в комбинации с прогениторными клетками позволяет к 7-м суткам добиться полной эпителизации экспериментальной раны. В качестве источника аутологичных прогениторных клеток может бьггь использована утильная аутокожа.

3. Применение дермального матрикса в качестве раневого покрытия у пациентов с травматическими дефектами мягких тканей на первые сутки после травмы в 92,3 % случаев препятствует вторичному инфицированию раны и развитию гнойных осложнений.

4. Использование разработанного протокола применения комбинации дермального матрикса и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в лечении пациентов с травматическими дефектами мягких тканей позволяет сократить срок подготовки раны к аутодермопластике с 27,3 ± 2,1 суток до 13,7 ± 3,4 суток.

Рекомендации в практику

1. При лечении травматических дефектов мягких тканей в качестве раневого покрытия целесообразно использовать дермальный матрикс. Наложение дермального матрикса следует выполнить сразу после ПХО или не позднее первых-вторых суток после операции.

2. Дермальный матрикс следует накладывать на очищенную рану после тщательного промывания раны раствором антисептиков. Матрикс необходимо перфорировать для оттока раневого отделяемого и моделировать по размеру раны таким образом, чтобы он незначительно выступал за ее края. После наложения матрикс фиксируют стерильной марлевой повязкой.

3. Противопоказанием к наложению матрикса является наличие острого гнойно-воспалительного процесса в области раны или крупных сосудисто-нервных пучков и костей на дне раны.

4. Для стимуляции регенерации матрикс следует комбинировать с мультипотентными мезенхимальными прогениторными клетками. Для этого перед наложение;* мгп-«гесз в дно раны и окружающие мягкие ткани

выполняют инъекции суспензии мезенхимальных клеток из расчета 1 мл суспензии с концентрацией клеток 1 млн/мл на 5 см2.

5. Смену фиксирующих повязок необходимо проводить один раз в 4872 часа. При появлении грануляционной ткани в перфорациях матрикса и роста краевого эпителиального пласта под матрикс его следует удалить, рану укрыть повязкой с хлоргексидином и на следующие сутки выполнить аутодермопластику.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Первый опыт применения повязок на основе коллагена первого типа с аллофибробластами в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей конечностей / О. П. Филиппов, Д. Ю. Похитонов, И. Ю. Клюквин, Н. В. Боровкова, В. Б. Хватов // Современные аспекты хирургического лечения повреждений и заболеваний костей, суставов конечностей и таза: сборник тез. докл. науч,-практ. конф. (г.Москва, 11-12 окт. 2012г.). - М.: МОНИКИ, 2012. - С. 142-143.

2. Экспериментальное обоснование применения комбинации дермального матрикса и аутокожи для лечения травматических ран/ И. Ю. Клюквин, О. П. Филиппов, Н. В. Боровкова, Д. Ю. Похитонов, Ю. В. Андреев, С. В. Шугай // Актуальные вопросы травматологии. Достижения. Перспективы: сборник матер. 1-й науч.-практ. конф. (г. Москва, 25-26 февр. 2013 г.). - М. - С. 92.

3. Применение повязок на основе коллагена I типа и мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток в комплексном лечении больного с травматическим дефектом мягких тканей / И. Ю. Клюквин, О. П. Филиппов, Т. А. Васина, Д. Ю. Похитонов, Н. В. Боровкова, И. Н. Пономарев // Трудный пациент. - 2013. - № 5. - Т. 11. - С. 22-24.

4. Дермальный матрикс в лечении пациентов с глубокими ожогами и ранами с дефицитом кожи / Д. Ю. Похитонов, О. П. Филиппов, И. Н. Пономарев, Е. А, Жиркова, С. В. Смирнов, И. Ю. Клюквин, А. С. Миронов, В. Б. Хватов, Н. В. Боровкова // 2-й съезд врачей неотложной медицины. - М. - 2013. - С. 83.

5. Применение комбинации ММСК и дермального матрикса для стимуляции регенерации в эксперименте / М. Ш. Хубутия, Д. Ю. Похитонов, Н. В. Боровкова, О. П. Филиппов, И. Ю. Клюквин, И. Н. Пономарев, С. В. Шугай, Ю. В. Андреев // 1-й национальный конгресс по регенеративной медицине : материалы конгресса (г. Москва, 4-6 декабря, 2013). - С. 261.

6. М. Ш. Хубутия, Д. Ю. Похитонов, Н. В. Боровкова, О. П. Филиппов, И. Ю. Клюквин, В. Б. Хватов, И. Н. Пономарев, С. В. Шугай, Ю. В. Андреев // Применение комбинации дермального матрикса с аллогенными клетками для лечения обширных травматических ран / Российский медико-биологический вестник имени академика И. П. Павлова. - 2014. -№ 1. - С. 107-112.

7. Экспериментальное исследование влияния комбинации дермального матрикса с прогениторными клетками на регенерацию кожи / Д. Ю. Похитонов, Н. В. Боровкова, О. П. Филиппов // меяздунар. науч. конф. «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии»: материалы конференции (г. Москва 17 апреля 2014 г.). -М. - С. 236-238.

8. Д. Ю. Похитонов, Н. В. Боровкова, О. П. Филиппов, И. Ю. Клюквин, В. Б. Хватов, И. Н. Пономарёв, С. В. Шугай, Ю. В. Андреев, С. В. Смирнов, Е. А. Жиркова // Экспериментальное обоснование и клиническое применение комбинации дермального матрикса с аллогенными или аутологичными клетками для лечения обширных травматических ран/ Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2014. - № 2. - С. 127-133.

9. Комбинированный трансплантат дермального матрикса с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками, способ его получения и способ лечения ран с его использованием : пат. 2 526 813 С 1 Рос. Федерация: МПК А61К 35/36, С12Ы 5/0775, А61Р 17/02 / Хубутия М. Ш., Боровкова Н. В., Филиппов О. П., Похитонов Д. Ю., Клюквин И. Ю., Хватов В. Б., Пономарёв И. Н., Жиркова Е. А., Шугай С. В., Андреев Ю. В.; гос. бюдж. учр-е г. Москвы науч.-исслед. ин-т скорой помощи им. Н. В. Склифосовского Департамента

здравоохранения г. Москвы. -№2013117290/15 ; заявл. 16.04.2013 ; опубл. 27.08.2014, Бюл. № 24. - 9 с.

10. Способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными ранами с дефектом мягких тканей (варианты): пат. 2 526 814 С 1 Рос. Федерация: МПК А61В 17/00, А61К 35/12, А61К 35/36, А61Р 17/02/ ХубутияМ. Ш., БоровковаН. В., Хватов В. Б., Филиппов О. П., Клюквин И. Ю., Похитонов Д. Ю., Пономарёв И. Н., Андреев Ю. В., Миронов А. С., Котошко О. И.; заявитель и патентообладатель гос. бюдж. учр-е г. Москвы науч.-исслед. ин-т скорой помощи им. Н. В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы. -№ 2013127322/15 ; заявл. 17.06.2013 ; опубл. 27.08.2014, Бюл. № 24. -9 с.

Сокращения, используемые в диссертации

АДП - аутодермопластика ВКМ — внеклеточный матрикс ДМ - дермальный матрикс КВЧ - крайне высокая частота

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

ПТ - поверхность тела

ПХО — первичная хирургическая обработка

ПЯЛ — полиморфно-ядерные лейкоциты

УФО — ультрафиолетовое облучение

ЭКП — эндотелиальные клетки-предшественники

FGF — fibroblast growth factor; фактор роста фибробластов

IGF — insulin-like growth foctors; инсулиноподобный фактор роста

PDGF - platelet-derived growth factor; тромбоцитарный фактор роста

TGF - transforming growth factor, трансформирующий фактор роста

VEGF - vascular endothelial growth factor; сосудистый эндотелиальный

фактор роста

% п. т. - процент поверхности тела

Подписано в печать: 05.11.2014

Заказ № 10347 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru