Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Применение капиллярного электрофореза при исследовании бупивакаина в биологических объектах

Смирнова Анна Владимировна

ПРИМЕНЕНИЕ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ БУПИВАКАИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

7 АВГ 2014

Москва-2014

005551562

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Фомин Анатолий Николаевич - доктор фармацевтических наук, доцент Официальные оппонешы:

Берляцц Александр Семенович - доктор фармацевтаческих наук, профессор, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного медико-сгомаггалогического университета им. АЛ Евдокимова

Чистяков Виктор Владимирович - доктор фармацевтических наук, директор Цетра доклинических и клинических исследований Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский цешр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « £>£ТЯ£г/?2014 г. в ^ часов на заседании .Д иссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени ИМ. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д.13

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. ИМ Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49 и на сайге ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. ИМ Сеченова МрЛ ту\у.гттши.

Автореферат разослан « 2%у> сиеи^е- 2014 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д208.040.09 доктор фармацевтических наук, ^

профессор ¿фг ^ "'1 Демина Наталья Борисовна

Смирнова Анна Владимировна

ПРИМЕНЕНИЕ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ БУПИВАКАИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2014

Диссертационная работа выполнена в ГЪОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Фомин Анатолий Николаевич - докшр фармацевтических наук, доцент Официальные оппоненты:

Берлявд Александр Семенович - доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного медико-стоматалогического университета им. АЛ Евдокимова

Чистяков Виктор Владимирович - доктор фармацетических наук, директор Центра доклинических и клинических исследований Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский цешр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « ¿У» с с. т^гег/я 2014 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.040.09 при ГЪОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени ИМ. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д.13

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГЪОУ ВПО Первый МГМУ им. ИМ Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49 и на сайге ГЪОУ ВПО Первого МГМУ им. ИМ. Сеченова ЬйртУ www.rnma.ru.

Автореферат разослан «¿^» 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д208.040.09 доктор фармацевтических наук,

профессор

Демина Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Бупивакаина щдрохлорцд является одним из наиболее активных и длительно действующих местных анестетиков амцдного типа, характеризующийся длительностью латетного периода, высокой диффузионной способностью (Rusu М, Фесенко B.C.). В анестезиологии применяется для проведения региональной, каудальной, эпвдуральной анестезии, включая местную инфильтравдонную, а также другие виды блокад. При однотфатном эпвдуральном введении длительность эффекта составляет 2-5 часов, при периферической блокаде нервов - до 12 ч (Калви T.I Г., Уильяме НЕ, Харкевич ДА и др.).

При определённых условиях (передозировка, индивидуальная непереносимость, патология внутренних органов и др.) бупивакаин, как и другие местные анестетики, оказывает токсическое действие на организм человека, в том числе с летальным исходом (Малрой М, Калви TJI., Джеймс П. Рафмел и др.).

Для выяснения смерти лиц, принимавших анестетик, решающее значение приобретают результаты судебно-химического исследования. При определении токсических веществ в биологических объектах целесообразно использование высокочувствительных и селекшвных методов, позволяющих сочетать разделение, идентификацию и количественное определение при исследовании одной и той же пробы. Одним нз них является капиллярный электрофорез (КЭ), характеризующийся простым аппаратурным оформлением, доступными расходными материалами, высокой эффективностью, сочетанием разделения веществ с последующей их вденшфикацией в УФ-области спеюра непосредственно в кварцевом капилляре (Комарова ИВ., Каменцев Я.С. и др.).

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время метод капиллярного эпейрофореза имеет хорошие результаты практического применения в пищевой промышленности (Якуба Ю.Ф. и др.), ветеринарии, криминалистике (Будников ВЦ), фармации при анализе субстанций, лекарственных форм (Гремяков АЛ, Шпак AJ3, Богачук МЛ, Сенченко СЛ и др.), разделении энаншомеров (Комарова ИВ, Буданова НЮ.); в биофармацевлических исследованиях (Ananz AJ, Chik Z, Vaigas G.), химико-токсикологической и клиническо-лабораторной прогонке (Джурко ЮА, Бигкин ИА). Однако данные литературы содержат только отдельные методики анализа бупивакаина с использованием этого метода. При

этом возможности КЭ применительно к химико-токсикологическому (судебно-химическому) исследованию анестетика в биологических объектах не изучены, а также отсутствует схема химико-токсикологического анализа бупивакаина

В связи с вышеизложенным, цель работы - изучение возможности применения капиллярного эпейрофореза как метода, удовлетворяющего требованиям аналитической токсикологии, для анализа бупивакаина в биологических объектах.

Задачи, решаемые для достижения поставленной цели:

1. Установить оптимальные условия анализа бупивакаина с использованием отечественной системы капиллярного электрофореза «Капель -105».

2. Изучить возможность обнаружения и идентификации бупивакаина по алеюрофорегаческим спектрам (ЭФС-вденшфикация).

3. Разработать методики количественного определения бупивакаина, пригодные для целей химико-токсикологического и клинического лабораторного анализа.

4. Разработать методики вьщеления и аналитической детекции бупивакаина в биологических объектах.

5. Провести изучение распределения бупивакаина в органах и биологических средах экспериментальных животных.

6. Изучить сохраняемость бупивакаина в гнилостно измененном материале методом капиллярного электрофореза

Научная новизна исследования

• Впервые на базе отечественной системы капиллярного электрофореза «Капепь-105» разработаны высокочувствительные, экономичные, доступные и простые в выполнении методики:

- ЭФС-иденшфикации бупивакаина в водных растворах и в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, ткань печени). Электрофорешческий спектр по исправленному времени миграции (ЭФС по ^ позволил рассчитать консташы ионизации (рКа) и установить стадии депрогонирования молекулы анестетика в зависимости от рН среды;

- количественного определения бупивакаина в водном растворе и в модельных биологических объектах.

• Предложенные методики ЭФС-идентификации и количественного определения бупивакаина апробированы на лабораторных животных при введении им максимальных терапевтических доз.

• Впервые изучена сохраняемость бупивакаина в тканях трупной печени со сроком хранения 1,2 и 4 недели.

Теоретическая значимость работы заключается в обобщении данных о методах анализа местного анестетика - бупивакаина, обосновании методик его изолирования, идентификации и количественного определения в биологических объектах. Результаты исследования могут использоваться кафедрами высших медицинских учебных заведений при изучении дисциплин «Фармацевтическая химия» и «Токсикологическая химия».

Практическая значимость работы заключается в разработке экономичных, доступных и экспрессных в выполнении методик изолирования, ЭФС-идентификации и количественного определения бупивакаина в биологических объектах на базе современного физико-химического метода - капиллярного электрофореза Методики обладают высокой воспроизводимостью, чувствительностью и требуют минимума исследуемого вещества и реактивов.

По материалам исследования составлен проект информационного письма «Химико-токсикологический анализ бупивакаина в моче капиллярным электрофорезом», предназначенного для использования химико-токсикологическими лабораториями и Бюро судебно-медицинских экспертиз РФ.

Полученные акты внедрения подтверждают использование разработанных методик изолирования, идентификации и количественного определения бупивакаина в биологических объектах судебно-химическим отделением ГБУЗВО «Владимирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт внедрения от 24.06201Зг), судебно-химическим отделением ГУЗ ЯО «Ярославское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (2 акта внедрения от 03.062013г), судебно-химическим отделением ГЪУЗ ЯО «Ярославская областная клиническая наркологическая больница» (акт внедрения от 18.062013г).

Методология и методы исследования. Теоретическую основу исследования составили труды отечественных (Комарова НИ, Каменцев Я.С. и др.) и зарубежных (Йоргенсон, Лукас и др.) исследователей, развивающие практическое применение капиллярного электрофореза, а

также публикации в области фармакологических и аналитических исследований бупивакаина; международная и российская нормативная документация по метрологии и валвдации методик анализа Методология заключалась в изучении поведения бупивакаина в растворах электролитов, выборе огггамальных условий экстракции для последующего исследования модельных биологических объектов (в том числе гнилостно измененных) и биологических образцов, полученных от лабораторных животных, а также в обобщениях, заключениях и рекомендациях по практическому применению.

При выполнении работы было проведено комплексное физико-химическое и биологическое исследование бупивакаина в водных растворах и биологических объектах.

Основные положения, выносимые на защиту. На защиту диссертационной работы выносятся следующие результаты исследования:

■ обоснование и выбор условий идентификации бупивакаина по элекгрофоретическим спектрам с использованием отечественной системы капиллярного электрофореза «Капель-105»;

■ доказательства возможности ЭФС-иденгификации бупивакаина в присутствии соэксгракгивных веществ в модельных биологических объектах, биологических средах и внутренних органах лабораторных животных, а также в гнилостно измененном трупном материале;

■ выбор условий экстракции бупивакаина из водных растворов с учетом влияния следующих факторов: природы органического растворителя, рН среды, объема эксграгента, кратности экстрагирования;

■ результаты количественного определения бупивакаина в биологических объектах, разработанные применительно к целям и задачам химико-токсикологической (судебно-химической) и клинической лабораторной практики;

■ обнаружение и определение бупивакаина в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных (крысах);

■ результаты изучения сохраняемости бупивакаина в тканях трупной печени со сроком хранения 1,2 и 4 недели.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждена статистической обработкой полученных результатов. Научные положения и

выводы основываются на обширном экспериментальном материале и логически вытекают из результатов исследования.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на научно-пршпической конференции с международным участием, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Ярославской государственной медицинской академии, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 65-летию 010 ЯГМА, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной 70-летию профессора АА Чумакова, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-леппо фармацевтического факультета Ярославской государственной медицинской академии «Инновационные процессы в лекарствоведении», Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Аюуальные вопросы медицинской науки», посвященной 85-легаю профессора ЕН. Дормидгапова (г. Ярославль, 2007 —2012 гг.).

Личный вклад автора. Личное участие автора выразилось в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки цели и залач работы, реализации эксперимента, апробации проведенных испытаний, интерпретации полученных результатов до их обобщения, систематизации и формулировке общих выводов. Автором проведен комплекс исследований то разработке методик изолирования, идентификации, количественного определения бупивакаина в биологических объектах.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения соответствуют формуле специальности 14.04.02 - «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют пунктам 3 и 4 области исследования специальности.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 14 научных работ, 4 из них в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (номер государственной регистрации 01201153123).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 161 странице печатного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 31 рисунком и 30 таблицами. Список литературы включает 179 источников, из них 95 на иностранных языках. В приложение включены акты внедрения и проект информационного письма «Химико-токсикологический анализ бупивакаина в моче капиллярным электрофорезом».

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, указаны научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы, методы и методология, личный вклад автора, а также положения, выносимые на защиту и публикации по теме диссертации.

В главе 1 (обзор литературы) приведена информация о физико-химических свойствах бупивакаина, его применении в медицинской практике, особенности фармакодинамики и фармакокинегики. Представлены данные о побочных эффектах, связанных с анестезией бупивакаином. Описаны аналитические методы исследования анестетика, в том числе в биологических объектах. Приведены методики определения ряда лекарственных веществ капиллярным электрофорезом (КЭ).

Во второй главе описаны использованные в работе объекты и методы исследования.

В третьей главе изложены результаты изучения условий идентификации и количественного определения бупивакаина в водных растворах методом капиллярного электрофореза

Четвертая глава содержит результаты: идентификации бупивакаина по элекгрофоретическим спектрам в присутствии соэкстракгавных веществ биологических объектов; изучения оптимальных условий экстрагирования бупивакаина из водных растворов; разработки методик количественного определения исследуемого анестетика в биологических объектах (моча, кровь, ткань печени) в условиях модельного эксперимента.

Пятая глава посвящена апробации разработанных методик ЭФС-иденгафикации и количественного определения бупивакаина на лабораторных животных (крысах) при введении им максимальной терапевтической дозы анестетика.

В шестой главе представлены результаты по изучению сохраняемости бупивакаина и ЭФС-идентификации анестетика в тканях трупной печени со сроком хранения 1,2 и 4 недели, а

также показана возможность применения метода эпейрофореза на бумаге для дополнительной очистки извлечений от продуктов гнилостного распада тканей.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

На основании проведенных исследований были определены оптимальные условия элеюрофореза бупивакаина в системе капиллярного электрофореза «Капель-105»:

^ Рабочие элеюролшы (РЭ) - 20 ммаи/л раствор фосфорной кислоты, рН 23 (РЭ -1) и буферный раствор Бриггона-Робинсона, рН 23 (РЭ-П);

^ Растворитель пробы (РП) — соответствующий РЭ, разбавленный в 10 раз водой очищенной;

^ Рабочий раствор бупивакаина в РП (5 мкг/мл);

Ввод пробы—давлением (30 мбар х 15 сек);

Напряжение: +20 кВ;

^ Детекшрование-200нм.

Выбранные условия позволили получить стабильные величины времени миграции, а наиболее воспроизводимые результаты были получены при использовании рабочего электролита

буферного раствора Бритгона-Робинсона, рН 23 (таблица 1).

Таблица 1 - Время миграции бупивакаина (^к) («Капель-105»)

Рабочий электролит Бупивакаин, мкг/мл Время миграции (tm Б) Метрологические характеристики

(РЭ-1) 5,0 11,14; 11,73; 11,07; 11,13; 11,81 х±Дх =11,38+0,45; СУ% = 3,16 £ = 3,95%

(РЭ-П) 14,48; 14,38; 14,78; 14,50; 14,66 х±Ах=14,56±0,19; СУ%= 1,09 £ = 1,30%

Одним из внешних факторов, определяющих скорость миграции веществ при прочих равных условиях, является рН электролита. При введении в эдекгрофоретический процесс маркеров элекгроосмогического потока (ЭОП), например, бензинового спирта (БС), можно рассчитать исправленное время миграции вещества—Ъ, по формуле:

Для идентификации бупивакаина по исправленному времени миграции проводили электрофорез в разработанных ранее условиях. Значения рН РЭ варьировали в пределах от 23 до 10,0. Рассчитанные значения исправленного времени миграции использовались для построения элекгрофоретических спектров (ЭФС), представляющих зависимость величины от рН электролита.

На ЭФС (рисунок 1) имеются два наклонных участка, характеризующие процессы депрогонирования, что соответствует теоретическим представлениям о наличии в составе молекулы бупивакаина двух основных центров.

! 1 Г Г 1......I С«1 CHj

\

/

\ 7 , 1 М>ЧгО

к 1 /

1 1 1 1 1 /

рКа2-8,1

Рисунок 1 - ЭФС по tH бупивакаина: 1 - РЭ — буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 23 -10,0; 2 - РЭ - смесь 20 ммоль/л раствора фосфорной кислоты и ОД моль/л раствора натрия гидроксвда, рН 23 -10,0 («Капель -105»)

На основании построенных элекгрофоретических спектров были рассчитаны константы ионизации (рКа) путем установления средней точки на кругом участке электрофорегаческого спектра Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Количественные характеристики ЭФС not,, бупивакаина

Рабочий электролит рКа

Смесь 20 ммольбт раствора фосфорной кислоты и ОД моль/л раствора натрия гидрокеида, рН 23 ^ 10,0 (РЭ—I) pKai=4,7 рК%=8,0

Буферный раствор Брипона-Робинсона, рН 23 10,0 (РЭ—П) рКа,=4,5 рК%=8,1

ЭФС по ^ позволяет установить стадии депротонирования молекулы анестетика в зависимости от рН среды и рассчитать его количественные характеристики — константы

ионизации. При этом в диапазоне рН 3,0 - 6,0 (РЭ-1), рН 4,0 - 5,7 (РЭ-П) наблюдается процесс депрогонирования амидной группы; в интервале рН 6,0 - 9,9 (РЭ-1, РЭ-П) - депротонирование гетероциклического атома азота; при рН больше 9,9 (РЭ-1, РЭ-П) молекула бупивакаина электронейтральна

При разработке методики количественного определения бупивакаина была установлена линейная зависимость величины фотометрического сигнала (тМРсек) в диапазоне концентраций 0,5 - 20,0 мкг/мл и на основе полученных данных рассчитано уравнение калибровочного графика: у = 1,085х - 0,055. Коэффициент корреляции составил 0,9997, что под тверждает линейность методики.

Для оценки методики количественного определения бупивакаина по критерию воспроизводимости проводили исследование анестетика с концентрацией 1,10 и 20 мкг/мл в приведенных выше условиях. Данные, представленные в таблице 3, показали, что воспроизводимость результатов находится в пределах критериев приемлемости, коэффициент вариации не превышает 0,86%, а относительная ошибка —1,08%.

Таблица 3 - Воспроизводимость методики количественного определения бупивакаина методом КЭ (РЭ—Буферный раствор Бригшна-Робинсона, рН 2,3; «Капель-105»)

Концентрация бупивакаина, мкг/мл Метрологические характеристики (п=5)

х% 8 СУ% Бх Ах £%

1,0 98,20 0,84 0,86 0,38 1,06 1,08

10,0 98,80 0,67 0,68 0,30 0,83 0,84

20,0 99,00 0,56 0,57 0,25 0,70 0,71

Идентификация и количественное определение бупивакаина в биологических объектах (модельных смесях) методом капиллярного электрофореза

Для идентификации бупивакаина по ЭФС и ^ в присутствии соэксграктивных веществ биологических объектов (моча, кровь, ткань печени) сухие остатки, полученные после жидкостной экстракции хлороформом при рН 10,0, растворяли в 1 мл РП. К растворам добавляли 0,1 мл 0,01% раствора анестетика и 0,1 мл 0,01% раствора бензилового спирта в этаноле и проводили анализ методом КЭ в разработанных ранее условиях. Полученные данные (рисунок 2) свидетельствуют о том, что ЭФС по ^ бупивакаина в присутствии соэксграктивных веществ мочи, крови и ткани печени идентичны ЭФС бупивакаина-сгандарга

Чувствительность методики ЭФС-идентификации для стандартного раствора анестетика составила 0,1 мкг, бупивакаина в присутствии соэкстрактивных веществ мочи, крови и ткани печени - ОД мкг вещества в пробе. Таким образом, идентификация бупивакаина по ЭФС и ^ является надёжным способом обнаружения исследуемого вещества и может быть использована при проведении химико-токсикологических экспертиз.

Рисунок 2 - ЭФС по <„ бупивакаина - стандарта (А) и бупивакаина в присутствии соэкстрактивных веществ мочи (Б), крови (В) и ткани печени (О

При разработке методик количественного определения бупивакаина в биологических объектах (модельных смесях) предварительно были изучены условия экстракции анестетика из водных растворов. Исследовано влияние рН буферного раствора (2,0 - 12,0), природы органического растворителя (хлороформ, смесь хлороформа с изобуганолом в соотношении 6:1), объема экстрагента и кратности экстрагирования.

Установлено, что наибольший процент экстракции наблюдается с использованием в качестве экстрагенш хлороформа при рН 10,0, соотношении водной и органической фаз 1:1, кратности экстрагирования равной трем и составляет 94,70%.

По результатам исследования была разработана методика изолирования бупивакаина из мочи, включающая трехкратную жидкостную экстракцию хлороформом при рН 10,0, с последующим упариванием хлороформных экстрактов и растворением сухого остатка в 1 мл РП.

а

2 3 4 5 в 7 8 9 10 11 рК.,-440 рК*,-3.10 рП

Методика апробирована на модельной смеси биологической жидкости с концентрацией анестетика 20,0; 1,0; 0,5; 0,1 мкг/мл. Результаты количественного определения бупивакаина и метрологическая оценка представлены на рисунке 3 и в таблице 5.

Бупивакаин

"1-!-!-1-1-1—!-1-Г"

Бупивакаин

"I I • 3 I ? I Г~

"1-1—!—I—I—I—!—I-Г

II м м

Рисунок 3 - Элекгрофореграммы (ЭФГ) модельной смеси мочи с концентрацией бупивакаина 20 мкг (1), 0,5 мкг (2), 0,1 мкг (3); контрольный опыт (4)

Таблица 5 - Количественное определение бупивакаина в моче («Капель-105»)

Бупивакаина в 1 мл мочи, мкг Метрологические характеристики (п=5)

х% Б СУ% Б* Дх £%

20,0 77,19 2,04 2,64 0,91 2,53 3,28

1,0 76,60 1,67 2,18 0,75 2,09 2,73

0,5 76,80 2,28 2,97 1,02 2,84 3,70

0,1 + - - - - -

Примечание: (+) - количество вещества ниже предела количественного определения.

Данная методика позволяет извлечь 76,60 - 77,19% бупивакаина из мочи. Граница определения анестетика составляет 0,5 мкг/мл, а граница обнаружения 0,1 мкг/мл.

При исследовании модельной смеси крови предварительно было изучено влияние осадигалей белковых веществ на степень экстракции бупивакаина. С этой целью использовали: растворы хлористоводородной и уксусной кислот, рН 2,0; 6% раствор трихлоруксусной кислоты, буферный раствор Брштона-Робинсона, рН 2,0; насыщенный раствор сульфата аммония; ацетон, подкисленный 0,5 моль/л раствором хлористоводородной кислоты; ацешнитрил, подкисленный концентрированной хлористоводородной кислотой, рН 1,0, а также проведено прямое экстрагирование основания бупивакаина хлороформом без добавления

осадителя. Установлено, что наибольший процент экстракции (65,60%) наблюдается при прямом экстрагировании анестетика хлороформом.

На основании проведенных исследований была разработана методика изолирования бупивакаина из крови с концентрацией 20,0; 1,0; 0,5 и 0,1 мкг вещества в 1 мл крови. Результаты исследования представлены в таблице 6 и рисунке 4.

Таблица 6 - Количественное определение бупивакаина в крови («Капель-105»)

Бупивакаина в 1 мл крови, мкг Метрологические характеристики (п=5)

х% Б СУ% Бх Ах £%

20,0 65,59 1,01 1,54 0,45 1,25 1,91

1,0 66,20 1,92 2,90 0,86 2,39 3,61

0,5 63,60 0,89 1,40 0,40 1,11 1,75

0,1 + - - - - -

Примечание: (+) - количество вещества ниже предела количественного определения. Предложенная методика позволяет извлечь в среднем около 65% бупивакаина из крови (относительная ошибка среднего результата не превышает 3,61%). Граница определения составила 0,5 мкг/мл, а граница обнаружения 0,1 мкг/ мл.

Бупивакаин

Бупивакаин

Бупивакаин

Рисунок 4-ЭФГ модельной смеси крови с концентрацией бупивакаина 20 мкг (IX 0,5 мкг (2), ОД мкг (3); контрольный опыт (4)

При разработке методики количественного определения бупивакаина в тканях печени была проведена сравнительная оценка методов изолирования анестетика, с использованием эксграгенгов: раствора щавелевой кислоты, рН 2,0, раствора уксусной кислоты, рН 2,0 и раствора трихлорукеуной кислоты, рН 1,0. Полученные извлечения подщелачивали до рН 10,0 (по

универсальной индикаторной бумаге) и подвергали экстракционной очистке, как и при

исследовании мочи. Установлено, что наибольшая степень извлечения (64,82%) наблюдается при

использовании раствора щавелевой кислоты, рН 2,0, а разработанная методика (рисунок 5,

таблица 7) позволяет выделил, в зависимости от концентрации 63 ДО - 66,04% бупивакаина из

ткани печени. Граница определения составила 0,5 мкг/г, а граница обнаружения 0,1 мкг/г.

Таблица 7 - Количественное определение бупивакаина в тканях трупной печени. (Эксграгеит- раствор щавелевой кислоты, рН 2,0)

Бупивакаина в 1г печени, мкг Метрологические характеристики (п=5)

х% Б СУ% Бх Ах £%

100,0 64,82 1,23 1,90 0,55 1,53 2,36

20,0 66,04 0,97 1,47 0,43 1,20 1,82

1,0 65,60 0,55 0,84 0,25 0,70 1,07

0,5 63,20 1,10 1,74 0,49 1,36 2,15

0,1 + - - - - -

Примечание: (+)—количество вещества ниже предела количественного определения.

Бупивакаин | тли 2

Бупивакаин

Бупивакаин

Рисунок 5 — ЭФГ модельной биологической смеси ткани печени с концешрацией бупивакаина 20 мкг (IX 0,5 мкг (2), 0,1 мкг (3); контрольный опыт (4)

Обнаружение и определение бупивакаина в органах и тканях экспериментальных животных

Разработанные методики выделения, обнаружения и количественного определения бупивакаина были апробированы на лабораторных животных (крысах). Эксперименты проводились в соответствии с правилами существующих нормативных документов.

Группе опыгаых животных (п = 5) массой 160 — 350 г, внутримышечно вводили 0,5% раствор бупивакаина максимальной терапевтической дозы, а через 3 часа биологические объекты исследовали. В качестве контроля использовали биологические объекты группы крыс (п=5), которые содержались в тех же условиях, что и опьпные животные.

Выделение анестетика из биообъектов и последующее элекгрофорегическое исследование осуществляли согласно разработанным" методикам. Полученные данные, представленные в таблице 8 и на рисунках 6 — 8, показали, что наибольшее количество анестетика содержится в плазме крови, моче и мышечной ткани с места введения. В печени, сердце и легком отмечается присутствие бупивакаина ниже предела количественного определения данного метода. Следовательно, выше перечисленные обьеюы могут быть рекомендованы для судебно-химической экспертной практики при интоксикации бупивакаином.

Таблица 8 - Распределение бупивакаина в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных через 3 часа после внутримышечного введения анестетика (доза 2,72 мг/кг)

Объект исследования Определено бупивакаина, мкг/мл или г (х + Дх; п=5) Метрологические характеристики

Плазма 1,85±0,31 СУ = 13,51% Эх = 0,11

Моча 0,72 ±0,11 СУ = 13,88% 8х = 0,04

Мышечная ткань с места введения 0,67+0,11 СУ = 14,24% Б* = 0,04

Печень + -

Легкое + -

Сердце + -

Примечание: (+) - количество вещества нижнего предела количественного определения

Рисунок 6 - ЭФГ бупивакаина, выделенного из плазмы (1) и контрольного образца плазмы лабораторных животных (2)

•ЗтАи |

1 сщм Бупнвакаин

J

>—3—!—1—1—1—{ 5Г~

Рисунок 7 - ЭФГ бупивакаина, выделенного ш мочи (1) и контрольного образца мочи лабораторных животных (2)

1 I I ■ ■ ! I Г

— ""Н—1—Г"

Лл,

—I—1—I-

Рисунок 8 — ЭФГ бупивакаина, вьщелешюго из мышечной ткани с места введения (1) и контрольного образца мышечной ткани с места введения лабораторных животных (2)

Реэкстракты, полученные после исследования крови и ткани печени лабораторных животных, также использовали для идентификации бупивакаина по ЭФС и ^

Результаты, представленные на рисунке 9, показали, что характеры элекгрофоретических спектров бупивакаина, выделенного из крови и ткани печени экспериментальных животных, аналогичны профилю ЭФС бупивакаина-сгацдарта.

рК1а,—«.ГО РКя,-«,1Ф ри

Рисунок 9 - ЭФС по ^ бупивакаина-сгздщарта (А) и бупивакаина, вьщеленного из ткани печени (Б) и крови (В) экспериментальных животных

Для подтверждения результатов электрофоретическога исследования бупивакаина, выделенного из биообъектов лабораторных животных, был проведен анализ методом газовой хроматографии в сочетании с масоспектромегрией на газовом хроматографе Agilent Technologies 6850 с масс-селективным детектором 5973 в следующих условиях: температура испарителя - 280°С, колонка - HP-5MS (диметилполисилоксан с 5% фенильных групп), газ носитель - гелий (1 мл/мин), температура термостата колонки-с 50°С(1 мин)до300°С(10мин), 25°С/мин, ионизация под действием электронного удара при 70 эВ.

По результатам исследования на всех хромагограммах был идентифицирован пик фрагмента исследуемого анестетика с m/z = 140. При этом хроматограммы, полученные при исследовании печени, сердца и легкого подтверждают наши данные о наличии бупивакаина в этих тканях (рисунок 10).

Рисунок 10 - Хроматограммы бупивакаина, выделенною из печени (1), сердца (2) и легкого (3) лабораторных животных

Сохраняемость бупивакаина в трупном материале

При работе с гнилостно измененным материалом необходимо использовать дополнительные методы очистки вытяжек от примесей белковых веществ и продуктов их

разложения. С этой целью был применен метод электрофореза на бумаге, а по результатам исследований установлены условия электрофоретической очистки: ^ прибор ПВЭФ-1;

хромагографическая бумага марки «С»; ^ электролот-буфсрш.ш раствор Брштша-Робинсона, рН 23; ^ время электрофореза-60 мин; ^ напряжение-400 В;

^ детектор - реактив Драга щорфа, модифицирова! п п>ш по Муиье. Для приготовления модельньгх смесей к 5г мелкоизмельченной ткани печени добавляли 1 мл 0,01% рабочего раствора бупивакаина, содержащего 100 мкг вещества, перемешивали и подвергали гнилостному изменению в течение 1,2 и 4 недель. Выделение анестетика проводили раствором щавелевой кислоты, рН 2,0 с последующим экстрагированием хлороформом при рН 10,0 и упариванием экстрактов. Сухие остатки растворяли в 10 мл хлороформа и проводили дополнительную очистку методом электрофореза на бумаге в приведенных выше условиях. Элюирование исследуемого анестетика из ЭФГ осуществляли хлороформом в щелочной среде (рН 10,0). Полученные элюаты упаривали, сухие остатки растворяли в РП и использовали для электрофорешческого исследования в системе КЭ «Капель-105».

Результаты исследований, представленные в таблице 10, показали, что методом КЭ можно определить бупивакаин в трупном материале, подвергнувшемуся хранению в течи ше 1 недели- 35,48%, 2-х недель-34 Д)% и 4-х-12,33% в 5 г ткани печени.

Таблица 10 - Сохраняемость бупивакаина в трупном материале

Бупивакаина в 5г печени, мкг Срок хранения Метрологические характеристик^ п=5 )

х% Б СУ% Бх Дх £%

100,0 1 неделя 35,48 0,89 2,51 0,40 1,11 3,13

2 недели 34,50 0,825 2,39 0,37 1,03 2,99

4 недели 12,33 0,32 2,60 0,14 0,39 3,16

При этом электрофорез на бумаге позволяет эффективно провести очистку извлечений от продуктов гнилостного распада (рисунок 11)

Рисунок 13- ЭФГ бупивакаина, тонированного из гнилостно измененного материала со сроком хранения в течение 1 недели (1); 2-х недель (2); 3-х недель (3)

Полученные реэкетракгы были использованы для идентификации бупивакаина по ЭФС и Результаты показали (рисунок 14), что характеры электрофоретических спектров бупивакаина, изолированного из гнилостного материала со сроком хранения от 1 до 4-х недель совпадают с соответствующими характеристиками бупивакаина-стандарга.

2 '„■¿.-Д..* '„¿,-Л.« ^

Рисунок 14 - ЭФС по ^ бупивакаина-стандарга (А) и бупивакаина, выделенного из пшлосгно измененного материала со сроком хранения 1 неделя (Б), 2 недели (В), 4 недели (П

На основании проведенных эксперимента льных исследований предложена схема химико-токсикологического анализа бупивакаина (рисунок 13) в биологических объектах, в основе которой лежат разработанные условия пробоподгоговки с последующей идентификацией и количественным определением на базе отечественной системы капиллярного электрофореза «Капель-105».

Рисунок 13 — Схема хтппангоксиколошческого исследования бупивакаина в биологических объектах с использованием элекгромиграционных методов («Капель-105»)

ВЫВОДЫ

1. Установлены оптимальные условия эпейрофореза бупивакаина для системы КЭ «Капель-105»: рабочий электролит - буферный раствор Бриггона-Робинсона, рН 23, напряжение: +20 кВ; детектирование при длине волны 200 нм.

2. Пред ложена методика идентификации бупивакаина по ЭФС и которая позволяет установить стадии депротонирования анестетика в зависимости от рН среды и рассчитать количественные характеристики — константы ионизации (рКа). Показано, что соэкстрактивные вещества биологических объектов (моча, кровь, ткань печени) не оказывают существенного влияния на характер элеюрофоретического спектра исследуемого препарата.

3. Разработана методика количественного определения бупивакаина, которая является доступной, экспрессной и облапает высокой чувствительностью. Установлены валвдационные характеристики предложенной методики: специфичность, чувствительность и воспроизводимость полученных результатов.

4. Установлены ошимальные условия экстракции бупивакаина из водных растворов. Разработаны методики изолирования бупивакаина из модельных проб мочи, крови, ткани печени. Получена удовлетворительная повторяемость результатов на трех уровнях концентраций в пределах рекомендуемых аналитических областей. Граница определения составила 0,5 мкг, а граница обнаружения 0,1 мкг вещества в пробе.

5. Изучено распределение бупивакаина в биологических жидкостях и внутренних органах экспериментальных животных (крыс). Наибольшее количество анестетика наблюдается в плазме крови, моче и мышечной ткани с места введения. В печени, сердце и легком наблюдается присутствие препарата ниже предела количественного определения данного метода. Полученные результаты позволяют рекомендовать вышеперечисленные объекты на химико-токсикологическое исследование, при отравлении бупивакаином.

6. Изучена сохраняемость бупивакаина в шилостно измененном трупном материале. Показано, что эдеюрофорез на бумаге позволяет эффективно провести очистку извлечений от продуктов гнилостного распада; разработанная методика может быть использована в судебно-химической (химико-токсикологической) практике при анализе бупивакаина в биологическом материале, подвергнутом хранению в течение 4-х недель.

7. Предложена схема химико-токсикологического анализа бупивакаина в биологических объектах с использованием капиллярного электрофореза Разработанные методики внедрены в практику химико-токсикологических лабораторий Бюро судебно-медицинских экепершз и наркологических больниц городов Ярославля, Владимира, в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Ярославской государственной медицинской академии» МЗ РФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Фомин АН, Смирнова АД, Лебедева А.В., Джурко ЮА К изучению возможностей анализа ряда местных анестетиков методом капиллярного электрофореза // Матер. X съезда медицинских и фармацевтических работников Ярославской обл. (часть П). - 2003. - С. 350 - 353.

2. Смирнова АЛ. Количественное определение бупивакаина методом капиллярного электрофореза // Сборник научных работ студентов и молодых ученых, Ярославль, ЯГМА -2005.-С. 90-91.

3. Смирнова А.В, Малинина TJ3. К применению электрофореза на бумаге для обнаружения бупивакаина и лццокаина // Сборник научных работ студентов и молодых ученых, Ярославль, ЯГМА.— 2005.-С.91-92.

4. Фомин АЛ, Ларичев А.Б., Джурко ЮА, Кузьмин B.C., Смирнова А.В, Абляев Э.В. Аналитическая верификация анестетиков у больных сахарным диабетом, оперированных по поводу хирургической инфекции // Морфологические ведомости. - 2005. - № 1-2. - С. 244 -245.

5. Смирнова АД, Фомин АЛ Идентификация бупивакаина методом капиллярного электрофореза // Современные вопросы теории и практики лекарствоведения: Сборн. материалов,Ярославль,ЯГМА. - 2007,- С.301 -305.

6. Фомин А.Н., Смирнова А.В, Семёнов МБ. Разработка условий скринингового обнаружения ряда местных анестетиков методом электрофореза на бумаге // Современные вопросы теории и практики лекарствоведения: Сборн материалов, Ярославль, ЯГМА. - 2007. -С. 348-352.

7. Фомин АН, Шпак АВ, Джурко Ю А, Смирнова Л.В. Идентификация аргакаина и бупивакаина методом капиллярного электрофореза // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - № 7. - С. 68 - 72.

8. Фомин АН, Смирнова АВ, Семёнов МБ, Смирнова ЕВ. Идентификация ряда азотсодержащих соединений основного характера в присутствии соэкстрактивных веществ мочи и крови методом капиллярного электрофореза // Химико-фармацевтический журнал. — 2010. -№9.-С. 46-48.

9. Смирнова А.В, Федорова HJ3. Идентификация бупивакаина в крови методом капиллярного электрофореза по электрофорегическим спектрам // Актуальные вопросы медицинской науки. Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 65-летию СЕЮ ЯГМА.-2011.-С. 291.

10. Смирнова АВ., Варнакова ЮА, Овчинникова ОБ. Количественное определение бупивакаина в моче методом капиллярного элегарофореза //Актуальные вопросы медицинской науки. Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 65-лстию СНО ЯГМА -2011.-С. 299.

11. Фомин АЛ, Смирнова Л.В-, Семёнов МБ. Крючков ВБ., Мерзлякова ЮА Изучение условий скринингового обнаружения ряда азотсодержащих соединений основного характера методом электрофореза на бумаге // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011. - № 11. - С. 32 - 38.

12. Смирнова АВ, Овчинникова ОВ. Изучение влияния осадигелей белковых веществ на степень экстракции бупивакаина из крови // Актуальные вопросы медицинской науки. Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной 70-летию профессора АА Чумакова, Ярославль, ЯГМА - 2012. - С. 345.

13. Смирнова АВ., Фомин АН. К изучению сохраняемости бупивакаина в биологическом материале методом капиллярного элегарофореза // Инновационные процессы в лекарствоведении. Всероссийская научно-практическая конференция, с международным участием, посвященная 30-летию фармацевтического факультета Ярославской государственной медицинской академии «Инновационные процессы в лекарствоведении»: Сборник материалов (18-19 декабря 2012 года) / Под ред. НС. Фурсы. - Ярославль, 2012. - С. 294 -298.

14. Смирнова АВ, Овчинникова ОВ. Количественное определение бупивакаина в крови методом капиллярного электрофореза // Актуальные вопросы медицинской науки: Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной 85-лстию профессора ЕЛ Дормццонгова, Ярославль, ЯГМА - 2013. - С. 227 -228.

Смирнова Анна Владимировна

ПРИМЕНЕНИЕ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ БУПИВАКАИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать 15.07.14. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Заказ № 1019.

Отпечатано в типографии ООО «Филигрань» г. Ярославль, ул. Свободы, 91, тел. (4852) 98-27-05, pechataet@bk.ru