Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследования по применению электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза при анализе азотсодержащих соединений основного характера в биoлогических объектах

ДИССЕРТАЦИЯ
Исследования по применению электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза при анализе азотсодержащих соединений основного характера в биoлогических объектах - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Исследования по применению электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза при анализе азотсодержащих соединений основного характера в биoлогических объектах - тема автореферата по медицине
Фомин, Анатолий Николаевич Пермь 2012 г.
Ученая степень
доктора фармацевтических наук
ВАК РФ
14.04.02
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Исследования по применению электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза при анализе азотсодержащих соединений основного характера в биoлогических объектах

На правах рукописи

04

Фомин Анатолий Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ И КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПРИ АНАЛИЗЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

із ден ті

Пермь-2012

005057378

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант: доктор фармацевтических наук, профессор Хомов Юрий Александрович

Официальные оппоненты:

Ярыгина Татьяна Ивановна, доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармацевтической химии факультета очного обучения ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Нохрин Дмитрий Фокеевич, доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической химии ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Гейн Людмила Федоровна, доктор фармацевтических наук, доцент, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «25» декабря 2012 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.nl, «24» сентября 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации http:www.pfa.ru «24» сентября 2012 г.

• Автореферат разослан ноября 2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208.068.01, кандидат фармацевтических наук, доцент

И. А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Азотсодержащие соединения основного характера (АССОХ), как вещества, обладающие сильным физиологическим действием, находят широкое применение в современной медицинской практике.

Вместе с тем, во многих развитых странах отмечается резкое увеличение количества острых и хронических отравлений, возникновение аллергических состояний при определённых условиях под воздействием лекарственных препаратов, в том числе АССОХ. В нашей стране эта проблема является также, актуальной. Диагностика отравлений представляет большие трудности, так как клиническая, патологоанатомическая и гистологическая картина при интоксикации АССОХ, как правило, не характерны. Поэтому основным доказательством причины интоксикации являются результаты химико-токсикологического исследования.

В клинической хирургической практике в ряде случаев также возникает потребность в проведении лабораторного анализа АССОХ в биологических средах.

Несмотря на значительное число работ, посвященных анализу АССОХ, до настоящего времени продолжают оставаться актуальными вопросы исследования в области разработки новых и дальнейшего совершенствования существующих методик их химико-токсикологического анализа. Эта проблема может быть успешно реализована при применении различных скрининговых систем и широком использовании современных физико-химических методов анализа на базе отечественного приборного обеспечения.

В анализе АССОХ в биологическом материале широко используются скрининговые программы, с применением метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Вместе с тем, применение ТСХ-скрининга в химико-токсикологических лабораториях может быть затруднено из-за отсутствия набора дефицитных общих и частных систем растворителей, модифицированных хроматографических пластин.

В последние десятилетия пристальное внимание уделяется электромиграционным методам анализа веществ.

Электрофорез на бумаге является эффективным и родственным ТСХ (планарным) методом очистки органических соединений, сочетающимся с последующим обнаружением и идентификацией их на электрофореграмме (ЭФГ), при исследовании биологических объектов.

Метод отличается, также, простым аппаратурным оформлением, доступными расходными реактивами и материалами, длительной сохранностью проявленных ЭФГ.

В тоже время, он не изучен в варианте электрофореза-скрининга с целью проведения ненаправленного химико-токсикологического (судебно-химического) исследования биологического материала на неизвестный яд, а также при анализе фальсифицированных лекарственных средств.

Одним из современных и перспективных подтверждающих электромиграционных методов является капиллярный электрофорез, характеризующийся высокой эффективностью (превышающий ВЭЖХ в сотни тысяч раз), сочетанием разделения веществ ионогенной и нейтральной природы, с последующей их детекцией в УФ-области спектра непосредственно в кварцевом капилляре.

Однако, необходимо отметить, что его возможности, применительно к системному химико-токсикологическому (судебно-химическому) и лабораторному клиническому исследованию АССОХ, не изучены.

Цель и задачи исследования. Теоретическое и экспериментальное обоснование аспектов применения электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза, с целью расширения их возможностей как аналитических методов при системном анализе азотсодержащих соединений основного характера в биологических объектах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Теоретически обосновать и экспериментально подтвердить оптимальные условия предварительного (скринингового) обнаружения АССОХ методом электрофореза на бумаге.

2. Разработать условия идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методом капиллярного электрофореза.

3. Изучить ионный состав АССОХ в зависимости от рН среды методом капиллярного электрофореза.

4. Обосновать возможность идентификации по электрофоретическим спектрам (ЭФС) и определения величин рКа АССОХ методом капиллярного электрофореза.

5. Изучить влияние соэкстрактивных веществ в составе биологических объектов (мочи, крови, ткани печени) на условия предварительного (скринингового) обнаружения и идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методами электрофореза.

6. Разработать на базе электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза экспрессные и чувствительные методики количественного определения АССОХ в биологических объектах.

7. Привести схему системного анализа АССОХ в биологических объектах, с использованием на 1 этапе электрофореза-скрининга (на базе электрофореза на бумаге) и подтверждающего исследования (на базе капиллярного электрофореза).

8. Изучить пригодность разработанных методик предварительного обнаружения, идентификации (подтверждающего исследования) и -количественного определения АССОХ методами электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза для химико-токсикологической практики и клинической лабораторной диагностики.

Научная новизна. Впервые теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность системного анализа, на базе

электромиграционньтх методов (электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза) лекарственных веществ, выделенных из биологических объектов.

При этом предложена методика электрофореза-скрининга изучаемых АССОХ, как в виде субстанций, так и выделенных из биологических объектов, для применения в системном ходе анализа лекарственных веществ.

В результате проведённых исследований по сравнительному электрофоретическому разделению АССОХ предложены оригинальные системы электролитов и показаны возможности использования их для скрининг-анализа.

Установлены условия идентификации (подтверждающих исследований) АССОХ с помощью электрофоретических спектров (ЭФС) на базе капиллярного электрофореза.

Показана эффективность предлагаемого маркера электроосмотического потока (ЭОП) - бензилового спирта при изучении исправленного времени миграции аналитов (1„), построения ЭФС по 1И и расчёта на их основе рКа величин АССОХ.

Изучено ионное состояние АССОХ в зависимости от рН среды, с использованием капиллярного электрофореза.

Предложен способ количественной характеристики ЭФС АССОХ, выделенных из биологических объектов , рКа).

Показана возможность ЭФС - идентификации АССОХ в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных, в экспертном материале, с использованием электрофоретических методов.

Разработаны экспрессные и чувствительные методики количественного определения ряда АССОХ в биологических объектах на основе капиллярного электрофореза.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования

В рамках общего совершенствования химико-токсикологического анализа на основе принципов комплексного использования электромиграционных методов (электрофореза на бумаге, капиллярного электрофореза) разработаны методики системного (ненаправленного) анализа АССОХ в биологических объектах, позволяющих сократить время проведения экспертиз, и обеспечивающих универсальность и более эффективное решение судебно-химических задач.

С помощью разработанных методик может проводиться определение АССОХ в биологических субстратах в условиях клиники, с целью оптимизации режима дозирования препаратов.

Результаты проведённых исследований рекомендованы для внедрения и используются в судебно-медицинской практике, в химико-токсикологических лабораториях медико-профилактических и наркологических центров.

Материалы исследования вошли в монографию «Электрофорез в анализе лекарственных азотсодержащих веществ основного характера» (124

е.); методическое пособие «Комплексное лечение острой хирургической инфекции мягких тканей с синдромом системной реакции на воспаление» (36 е.).

Отдельные фрагменты диссертационной работы внедрены в практику бюро судебно-медицинской экспертизы, химико-токсикологических лабораторий наркологических больниц городов Ярославля, Перми, Йошкар-Ола, в учебный процесс фармацевтических факультетов медицинских ВУЗов городов Ярославля, Тюмени.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на съездах, конференциях, совещаниях с опубликованием материалов: на Третьей Всесоюзной конференции по фармакокинетике «Современное состояние и перспективы развития фармакокинетики», Москва, 1991 г.; на VII Научно-практической конференции хирургов Федерального управления «Медбиоэкстрем», Саратов, 2004 г.; на конференции хирургов России, посвященной 100-летию со дня рождения профессора B.C. Семёнова, Тверь, 2004 г.; на X съезде медицинских и фармацевтических работников Ярославской области, Ярославль, 2003 г.; на межвузовской научно-практической конференции с международным участием, Ярославль, 2004 г.; на межрегиональной научно-практической конференции, Ярославль, 2005 г.; на научных конференциях Ярославской государственной медицинской академии, 1994-2012 г.г.

В полном объёме результаты диссертационного исследования доложены на межкафедральной конференции фармацевтического факультета Ярославской государственной медицинской академии, 2012 г.

Личный вклад автора. Для получения результатов, изложенных в диссертации, автор лично изучил электрофоретические свойства 48 АССОХ методом электрофореза.

Предложил на этой основе схему системного анализа исследуемых оснований, включающую: разработанные автором методики предварительного (скринингового) обнаружения методом электрофореза на бумаге и идентификации (подтверждающего исследования) методом капиллярного электрофореза, как стандартных образцов, так и в присутствии соэкстрактивных веществ биологических объектов; методики количественного определения ряда АССОХ с использованием электрофорезо-спектрофотометрии, капиллярного электрофореза в растворах стандартных образцов, биологических объектах, экспертном материале и выполнил валидацию предложенных методик; провел лабораторные исследования доксициклина, артикаина с помощью разработанных электрофоретических методик идентификации и определения в биологических средах организма в условиях клиники при хирургических вмешательствах под местной анестезией и при антибиотикотерапии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них 12 - в журналах Перечня ВАК РФ.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО ЯГМА Минздравсоцразвития (номер государственной регистрации 01201052735).

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 330 страницах машинописного текста, содержит 102 таблицы, 67 рисунков. Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы, включающего 316 источников, из них 223 на иностранных языках и приложения. В приложении представлены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований: акты внедрения, монография, информационное письмо, методическое пособие.

Основные положения, выносимые на защиту. На защиту диссертационной работы выносятся следующие результаты теоретических и экспериментальных исследований:

- результаты исследований по разработке ненаправленного (системного) метода анализа лекарственных веществ из группы АССОХ в биологических объектах, с использованием электромиграционных методов (электрофореза на бумаге, капиллярного электрофореза);

- теоретическое изучение и экспериментальное подтверждение по сравнительной характеристике разделительной способности электролитов при проведении электрофореза-скрининга и внутригрупповой ЭФС -идентификации АССОХ методом электрофореза на бумаге;

результаты исследований по возможности идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методом капиллярного электрофореза по ЭФС 1и и их количественным характеристикам (рКа, Р1 -внутреннему коэффициенту);

- методологическое обоснование и результаты по изучению влияния соэкстрактивных веществ, в составе биологических объектов, на условия скринингового обнаружения и идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методами электрофореза (в модельных биологических смесях, жидких средах и внутренних органов экспериментальных животных);

- электрофоретические методики количественного определения ряда АССОХ («ПВЭФ-1», «Капель-105»), разработанные применительно к целям и задачам химико-токсикологической (судебно-химической) и клинической лабораторной практики;

-результаты исследований по объективной оценке концентраций ряда АССОХ в клинических биологических субстратах методом электрофореза на бумаге и капиллярным электрофорезом.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

Обобщены литературные данные о применении электрофоретических методов анализа органических веществ.

Отмечено большое распространение электрофореза на бумаге, характеризующегося высокой степенью очистки экзогенных АССОХ от компонентов биологических субстратов и продуктов биодеградации тканей.

Показано, что электрофорез на бумаге в камерах с оптимальным испарением может быть использован для изучения ионного состояния веществ, установления их электрофоретических спектров (графической зависимости наблюдаемой электрофоретической подвижности вещества от рН электролита).

Описаны методики определения АССОХ на базе нового, современного и перспективного электрофоретического метода — капиллярного электрофореза (КЭ), обладающего экспрессностью и высокой эффективностью.

2. Объекты и методы исследования

В эксперименте были использованы объекты исследования:

- рабочие стандартные образцы азотсодержащих соединений основного характера (48 представителей), отвечающие требованиям НД;

- модельные смеси биоматериалов;

- внутренние органы и биологические жидкости лабораторных животных (моча, кровь, печень, почки, легкое, желудок, тонкий кишечник кроликов);

- клинические биологические субстраты (кровь, моча, мышечная ткань);

- экспертный биологический материал.

Оборудование и средства измерений

Для разработки методики электрофореза-скрининга группы АССОХ использовали электрофорез на бумаге: прибор «ПВЭФ-1», с камерой для горизонтального электрофореза, без охлаждения полос бумаги; носитель -хроматографическая бумага марки «С», «ФН-15».

Для проведения измерений методом капиллярного электрофореза использовали приборы:

«Капель-105», встроенный спектрофотометрический детектор («Люмекс», г. Санкт-Петербург), программа записи и обработка данных «МультиХром для Windows» (ЗАО «Амперсенд», Россия), методика программа «База Данных - 2003», аттестованная Государственным комитетом РФ по стандартизации и метрологии в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 и ГОСТ Р ИСО 5725-2002;

«Нанофор-01», спектрофотометрический детектор (Санкт-Петербургский институт аналитического приборостроения РАН),

зарегистрирован в Государственном реестре средств измерений (№ 2282802).

Для проведения измерений методом ГХ-МС использовали газовый хроматограф Agilent 7890 А с масс-селективным детектором (Agilent Technologies (USA)), программно-аппаратный комплекс включает в себя базу данных NIST®2005.

3. Предварительное (скрининговое) обнаружение и идентификация (подтверждающее исследование) АССОХ методами электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза

В настоящее время, вопросы связанные с разработкой новых эффективных методов очистки токсических веществ, в сочетании с предварительным (скрининговым) обнаружением их при ненаправленном химико-токсикологическом (судебно-химическом) исследовании биологического материала, являются актуальными.

Одним из эффективных методов очистки извлечений из биологического материала и последующего обнаружения токсикантов непосредственно на электрофореграмме (ЭФГ) является электрофорез на бумаге. Однако он не изучен в варианте электрофореза-скрининга.

В качестве подтверждающего метода, при системном химико-токсикологическом доказательстве ряда АССОХ, нами предложен интенсивно развивающийся в последние годы новый вариант разделения сложных смесей с высокой эффективностью — капиллярный электрофорез.

Условия предварительного (скринпнгового) обнаружения АССОХ методом электрофореза на бумаге. Разработаны оптимальные условия предварительного этапа электрофореза-скрининга АССОХ, с использованием электрофореза на бумаге: «ПВЭФ-1», носитель — хроматографическая бумага марки «С»; напряжение - 400 В, время электрофореза — 1 час; детектор -реактив Драгендорфа, модифицированный по Мунье.

На примере ряда АССОХ - 12 представителей, содержащих первичные-, вторичные-, третичные аминогруппы, в том числе и атомы азота в составе гетероциклических структур установлено, что наблюдаемые электрофоретические подвижности исследуемых соединений характеризуются достаточно широким диапазоном величин ДПФ см, позволившим выделить (с интервалом в 2 см) пять электрофоретических групп, при использовании в качестве электролита как 5% раствора уксусной кислоты, так и буферного раствора Бриттона-Робинсона, pH 2,3 (табл. 1,2).

Установлено, что при использовании электролита 5% раствора уксусной кислоты, анализируемые соединения делятся на более равномерные электрофоретические группы и характеризуются меньшими величинами коэффициентов вариации их ДПФ см.

Электролит 5% раствор уксусной кислоты имеет также преимущество в доступности и простоте приготовления в лабораторных условиях. В связи с этим, для последующего расширенного электрофореза-скрининга АССОХ

(48 лекарственных соединений) нами был использован в качестве электролита - 5% раствор уксусной кислоты (табл. 3).

Таблица 1 - Электрофоретические группы ряда АССОХ. Электролит - 5%

раствор уксусной кислоты (п = 5)

Исследуемые АССОХ, 30 мкг/проба ДПФСМ (х±Ах; У%) Группа (интервал по ДПФсм)

Допегит Феназепам 3,38±0,12 (0,20) 4,90±0,06 (0,10) 1(3,0-5,0)

Артикаин Бупивакаин Дроперидол Лидокаин 5,14±0,14 (2,22) 5,48±0,09 (1,45) 6,50±0,18 (0,20) 6,66±0,14 (1,95) 2(5,0-7,0)

Дикаин Галоперидол 7,52±0,05 (0,53) 8,10±0,20 (0,35) 3(7,0-9,0)

Новокаин Азалептин 9,46±0,06 (0,80) 10,40±0,15 (0,10) 4(9,0-11,0)

Дикарбин Пахикарпин 12,52±0,12 (0,54) 12,56±0,10 (0,20) 5(11,0-13,0)

Таблица 2 - Электрофоретические группы ряда АССОХ. Электролит -буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 2,3 (п = 5)

Исследуемые АССОХ, 30 мкг/проба ДПФсм(х±Д*; У%) Группа (интервал по ДПФсм)

Допегит 4,50±0,15 (0,40) 1(3,0-5,0)

Дроперидол Феназепам 6,80±0,11 (0,35) 6,70±0,05 (0,14) 2(5,0-7,0)

Бупивакаин Артикаин Дикаин Лидокаин Галоперидол 7,40±0,26 (2,70) 7,68±0,22 (2,32) 7,82±0,40 (1,39) 8,02±0,25(2,55) 8,26±0,10 (0,52) 3(7,0-9,0)

Новокаин 9,72±0,16 (1,34) 4(9,0-11,0)

Азалептин Дикарбин Пахикарпин 12,14±0,40 (0,12) 12,50±0,13 (0,60) 12,70±0,50 (0,35) 5(11,0-13,0)

Таблица 3 - Электрофоретичсские группы 48 АССОХ. Электролит - 5%

раствор уксусной кислоты (п = 5)

ДПФеи Группа ДПФсм Группа

АССОХ (*±Дх; (интервал АССОХ (х± д*; (интервал

30 мкг/проба У%) по 30 мкг/проба У%) по

ДПФСМ) ДПФсм)

Допегит 3,38±0,12 Кордиамин 7,14±0,10

Ганглерон 4,38±0,10 1 Галидор 7,26±0,12

Антипирин 4,42±0,15 (3,0 - 5,0) Циклодол 7,29±0,08

Интенкордин 4,86±0,11 Анальгин 7,34±0,10

Феназепам 4,90±0,06 Кломипрамин 7,38±0,24

Артикаин 5,14±0,14 Дикаин 7,82±0,40

Кордарон 5,30±0,15 Оксилидин 7,92±0,15

Фенкарол 5,34±0,10 Фепранон 8,01±0,12 3

Бупивакаин 5,48±0,09 Галоперидол 8,10±0,20 (7,0-9,0)

Корданум 5,50±0,16 Мидантан 8,04±0,06

Дибазол 5,52±0,10 Этаперазин 8,15±0,20

Платифиллин 5,70±0,08 Прозерин 8,16±0,05

Папаверин 5,72±0,10 Тримекаин 8,20±0,14

Димедрол 5,76±0,15 2 Атропин 8,52±0,08

Анаприлин 5,84±0,12 (5,0-7,0) Клофелин 8,80±0,10

Аминазин 5,90±0,16 Карбамазепин 9,18±0,08

Реланиум 6,10±0,14 Хинин 9,40±0,12

Элениум 6,34±0,11 Новокаин 9,46±0,06 4

Дроперидол 6,50±0,18 Апрессин 9,64±0,18 (9,0-11,0)

Но-шпа 6,52±0,08 Азафен 10,24±0,10

Мелипрамин 6,53±0,11 Азалептин 10,40±0,15

Этмозин 6,58±0,10 5

Амитриптилин 6,64±0,09 Дикарбин 12,52±0,12 (11,0-

Лидокаин 6,66±0,14 Пахикарпин 12,56±0,10 13,0)

Трифтазин 6,79±0,09

При этом, чувствительность обнаружения исследуемых АССОХ на ЭФГ (детектор - реактив Драгендорфа, модифицированный по Мунье), находится в пределах 0,5 — 3,0 мкг вещества в пробах.

Внутригрупповая идентификация АССОХ методом электрофореза-скрининга с помощью ЭФС и их количественных параметров. На втором этапе электрофореза-скрининга предложена методика внутригрупповой ЭФС-идентификации ряда АССОХ, относящихся как к одним, так и разным электрофоретическим группам (ЭГ), с использованием электрофореза на бумаге (ПВЭФ-1, 400 В, 1 ч, электролит - буферный раствор Бриттона-Робинсона с рН: 1,8; 2,3; 4,0; 6,0; 8,0). Результаты исследования показали, что профили ЭФС (графической зависимости ДПФ см от рН электролита) исследуемых соединений (как внутри, так и в составе других ЭГ) индивидуальны, не совпадают по форме и высоте, и могут быть использованы для идентификации АССОХ, после группового разделения их электрофорезом-скринингом (рис. 1).

Надежность ЭФС-идентификации исследуемых АССОХ значительно увеличивается с использованием их количественных характеристик (ДПФмакс, ДПФмин, Р; - внутренний коэффициент) и позволяет получить дополнительную индивидуальную информацию о наблюдаемой электрофоретической подвижности соединений в зависимости от рН электролита (табл. 4).

Таблица 4 - Количественные характеристики ЭФС по ДПФСМ ряда АССОХ

(ПВЭФ-1)

Вещество ЭГ Количественные характеристики ЭФС (х± Дх; п=5)

ДПФмакс ДПФМИ„ Р,

Артикаин Бупивакаин Дроперидол Лидокаин 2 11,14±0,31 (рН 1,8) 10,09±0,18 (рН 6,0) 8,18±0,32(рН 1,8) 10,76±0,23 (рН 8,0) 9,02±0,16 (рН 2,3) 7,35±0,17 (рН4,0) 4,94±0,14 (рН 8,0) 8,38±0,31 (рН 4,0) 8,10±0,66 7,28±0,73 6,04±0,32 7,79±0,17

Дикаин Галоперидол 3 12,06±0,07 (рН 1,8) 9,24±0,06 (рН 1,8) 7,52±0,07 (рН 4,0) 6,78±0,06 (рН 4,0) 6,24±0,11 7,34±0,06

Новокаин Азалептин 4 14,60±0,26 (рН 1,8) 12,42±0,10 (рН 1,8) 9,92±0,33 (рН 4,0) 6,31±0,04 (рН 8,0) 6,79±0,19 5,08±0,18

Дикарбин 5 15,34±0,19(рН 1,8) 9,04±0,06 (рН 8,0) 5,89±0,24

9

Рисунок 1 - ЭФС по ДПФСМ АССОХ: артикаина (1), бупивакаина (2), дроперидола (3), лидокаина (4), дикаина (5), галоперидола (6), новокаина (7), азалептина (8), дикарбина (9)

Условия идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методом капиллярного электрофореза

При ненаправленном химико-токсикологическом анализе веществ, наряду со скрининговой программой, необходимо использовать подтверждающие (независимые) методы, обладающие высокими селективными свойствами.

Для проведения электрофореза АССОХ использовалась отечественная система капиллярного электрофореза «Капель-105» («Люмекс», г. Санкт-Петербург), содержащая капилляр с внутренним диаметром 75 мкм и длиной 60 см, и программное обеспечение «МультиХром для Windows».

С целью выбора условий электрофореза АССОХ (на примере артикаина и бупивакаина) в катионной (протонированной) форме, нами проведена сравнительная характеристика рабочих электролитов: 20 мМ раствора фосфорной кислоты (РЭ I) и буферного раствора Бриттона-Робинсона, рН 2,3 (РЭ II). При этом ввод пробы в капилляр осуществляли под давлением 30 мбар в течение 15 сек, при использовании положительного электрода со стороны введения рабочего электролита: +20кВ; детектирование компонентов проводили с помощью встроенного УФ-спектрофотометрического детектора, 270 нм (артикаин), 200 нм (бупивакаин).

При анализе исследуемых АССОХ проводили концентрирование пробы на приборе в начальной стадии электрофоретического процесса с использованием «прямого стекинга», основанного на том, что проба вводится в капилляр в буферном растворе, имеющим электропроводность в 10 раз меньше, чем рабочий электролит (за счет понижения ионной силы).

На электрофореграмме (ЭФГ) с помощью программы «МультиХром для Windows» рассчитывали качественный электрофоретический параметр исследуемого иона - общее наблюдаемое время миграции, в минутах (tM).

Наиболее воспроизводимые результаты были получены при использовании в качестве рабочего электролита буферного раствора Бриттона-Робинсона, рН 2,3 (РЭ И).

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Время миграции (1М) артикаина и бупивакаина («Капель-105»)

№ АССОХ, 20 мМ раствор фосфорной Буферный раствор

п/п мкг/мл кислоты Бриттона-Робинсона,

рН 2,3

Зс ± ДЗс У% х±Ах

Артикаин

1. 5,0 8,44 12,86

2. 5,0 8,48 12,76

3. 5,0 8,66 8,57±0,12 1,40 12,68 12,76±0,08 0,53

4. 5,0 8,61 12,78

5. 5,0 8,64 12,72

Бупивакаин

1. 5,0 11,14 14,48

2. 5,0 11,73 14,38

3. 5,0 11,07 11,38±0,45 3,10 14,78 14,56±0,19 1,09

4. 5,0 11,13 14,50

5. 5,0 11.81 14,66

Общее наблюдаемое время миграции исследуемого иона в капиллярном электрофорезе (1:м) зависит от электрофоретической подвижности самого иона, а также - от подвижности электроосмотического потока (ЭОП). Введение в электрофорез маркера ЭОП - бензилового спирта, позволяет рассчитать исправленное время миграции вещества на электроосмос ((:„).

Нами была изучена возможность идентификации АССОХ по электрофоретическим спектрам (ЭФС), представляющим собой графическую зависимость величин 1И от рН электролита. На рисунках 2 и 3 представлены ЭФС артикаина, полученные при использовании в качестве электролитов -РЭ-1 и РЭ-П в диапазоне рН от 2,3 до 10,0, с рассчитанными значениями констант ионизации (рКа^ рКа2), которые определяли посредством установления средних точек на крутых участках ЭФС, соответствующих определенным значениям рН электролита. На рисунках 4 и 5 представлены ЭФС бупивакаина и установлены соответствующие количественные характеристики исследуемого соединения, с использованием РЭ-1 и РЭ-П (рН 2,3 - 10,0).

Рисунок

23456789 10 рКа,=з4 рК.а 2=7,6 р(-|

2 - ЭФС по артикаина (РЭ - смесь 20 мМ раствора фосфорной кислоты и 0,2 н. раствора натрия гидроксида, рН 2,3 н-10,0)

Рисунок 3 - ЭФС по артикаина (РЭ - буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 2,3 - 10,0)

Рисунок 4 - ЭФС по 1„ бупивакаина (РЭ - смесь 20 мМ раствора

фосфорной кислоты и 0,2 н. раствора натрия гидроксида, рН 2,3-10,0)

Рисунок 5 - ЭФС по 1:„ бупивакаина (РЭ - буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 2,3 -н 10,0)

Проведенные исследования показывают, что ЭФС по (;„ позволяет получить информацию об ионном состоянии исследуемых АССОХ и их количественные характеристики (рКа^ рКа2). При этом, данные величины, полученные при использовании в качестве рабочего электролита РЭ I — буферного раствора Бриттона-Робинсона (рН 2,3 -=- 10,0), обладают наименьшей погрешностью (табл. 6).

Таблица 6 - Количественные характеристики ЭФС по 1:и артикаина и бупивакаина (концентрация компонентов в пробах по 10 мкг/мл)

№ АССОХ Электролит ЭФС по 1и

п/п рКа

1. Артикаин РЭ-1 рКа,=3,9; рКа2=7,8

РЭ-П рКаі=3,4; рКа2=7,6

2. Бупивакаин РЭ-1 рКа!=4,5; рКа2=8,1

РЭ-И рКа,=4,7; рКа2=8,0

Примечание: Количественные характеристики рассчитаны на ЭФС по 1И с использованием средних выборок результатов 5 параллельных электрофоретических исследований каждого из анестетиков при соответствующих величинах рН РЭ

4. Изучение влияния соэкстрактивных веществ в составе биологических объектов на условия скрииингового обнаружения и идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методами

электрофореза

На электрофоретическую подвижность ионизированных частиц оказывает влияние не только внутреннее строение вещества, но и ряд внешних факторов (рН и температура электролита, напряжение, природа извлекателей и характер биологического материала).

Электрофорез-скрининг АССОХ в модельных биологических

смесях

Для изучения возможности электрофореза-скрининга представителей группы АССОХ в присутствии веществ, соэкстрагируемых из биологического материала (печени), ставились опыты на модельных смесях. При этом, представляет интерес применение варианта электрофореза-скрининга АССОХ (на примере - новокаина, лидокаина, азалептина), с использованием наиболее широко известных извлекателей в химико-токсикологической практике - растворов органических кислот: щавелевой (рН 2,0), уксусной (рН 2,0), трихлоруксусной (рН 1,0) и ацетона. Полученные извлечения подвергали экстракционной очистке из щелочной среды (рН 10,0), с последующим реэкстрагированием буферным раствором Бриттона-Робинсона (рН 2,3), разбавленным водой в 10 раз. К полученным реэкстрактам добавляли стандартные образцы АССОХ, с концентрацией исследуемых компонентов в пробе по 30 мкг/мл.

Полученные модельные биологические смеси (МБС) использовали для предварительного обнаружения исследуемых АССОХ в соответствии с описанными выше этапами электрофореза-скрининга АССОХ-стандартов.

Нами было установлено, что независимо от природы извлекателей ряда АССОХ из печени, исследуемые соединения в составе МБС располагаются по электрофоретическим группам, соответствующим расположению АССОХ-стандартов в разработанных условиях (табл. 7).

Исследования по идентификации ряда АССОХ в составе МБС на втором этапе электрофореза-скрининга методом электрофореза на бумаге («ПВЭФ-1») показали, что профили ЭФС соединений индивидуальны и аналогичны соответсвующим АССОХ-стандартов, независимо от природы извлекателя из биологического материала, а количественные характеристики ЭФС (ДПФмакс, ДПФМИН, Р,) исследуемых оснований в составе МБС совпадают с количественными характеристиками ЭФС соответствующих АССОХ-стандартов, и позволяют в сочетании с профилями их ЭФС надежно осуществлять их идентификацию в присутствии соэкстрактивных веществ ткани печени.

Таблица 7 - Электрофоретические группы АССОХ в составе модельных

биологических смесей (МБС). Электролит - 5% раствор уксусной кислоты

№ п/п Печень (5 г), извлекатель _ ДПФСМ (дг±Ад:;п=5) Электрофоретическая группа

АССОХ-МБС АССОХ-стандарт

Новокаин, модельная смесь (30 мкг/проба)

1. Щавелевая кислота, рН 2,0 9,32±0,06 4 4

2. Уксусная кислота, рН 2,0 9,42±0,06 4 4

3. Трихлоруксусная кислота, рН 1,0 9,26±0,06 4 4

4. Ацетон 9,28±0,07 4 4

Лидокаин, модельная смесь (30 мкг/проба)

1. Щавелевая кислота, рН 2,0 6,62±0,14 2 2

2. Уксусная кислота, рН 2,0 6,60±0,14 2 2

3. Трихлоруксусная кислота, рН 1,0 6,50±0,14 2 2

4. Ацетон 6,26±0,15 2 2

Азалептин, модельная смесь (30 мкг/проба)

1. Щавелевая кислота, рН 2,0 10,35±0,15 4 4

2. Уксусная кислота, рН 2,0 10,36±0,15 4 4

3. Трихлоруксусная кислота, рН 1,0 10,32±0,15 4 4

4. Ацетон 10,30±0,16 4 4

ЭФС-идентнфикация доксициклина (представителя амфотерных АССОХ) в составе МБС мочи, крови методом электрофореза на бумаге

С целью изучения влияния соэкстрактивных вехцеств биологических жидкостей на ЭФС-ядентификацию амфотерного соединения (доксициклина), готовили МБС, используя хлороформные извлечения (рН 7,0) образцов мочи и крови.

Электрофорез МБС проводили в приборе «ПВЭФ-1» в присутствии индикатора электроосмоса и реофореза - 1,3,5-тринитробензола (ТНБ) в условиях: носитель - хроматографическая бумага марки «С»; напряжение -400 В; время — 1,5 ч; электролит - буферный раствор Бриттона-Робинсона, в диапазоне рН 1,8 - 10,0; детектор доксициклина - УФ свет при 365 нм, ТНБ -пары аммиака.

На ЭФГ рассчитывали:

- наблюдаемые электрофоретические подвижности исследуемого вещества и ТНБ в абсолютных величинах (ДПФСЫ);

- исправленную электрофоретическую подвижность антибиотика (Исм) на электросмос и реофорез по формуле:

Нем ДПФСМ антибиотика ДПФ см ТНБ

Значения Исм использовали для построения ЭФС Исм доксициклина в составе МБС (мочи, крови) и доксициклина-стандарта.

Полученные результаты исследований показали:

- конфигурации ЭФС по Исм доксициклина-стандарта и доксициклина в составе МБС (моча, кровь) аналогичны (рис. 6 и 7);

количественные характеристики ЭФС по Исм позволяют идентифицировать доксициклин в присутствии биокомпонентов мочи и крови. При этом величины рКа и Р; исследуемого соединения, полученные в составе МБС (моча, кровь), совпадают с соответствующими величинами доксициклина-стандарта (табл. 8).

Рисунок 6 - ЭФСИ см по Исм доксициклина гидрохлорида (1), доксициклина в составе модельной смеси — мочи

Рисунок 7 - ЭФСисм по Исм доксициклина гидрохлорида (1), доксициклина в составе модельной смеси - крови

Таблица 8 - Идентификация доксициклина в биологической жидкости по ЭФСИ см (количественные характеристики)

ЭФСисм

Доксициклин (стандарт) доксициклин в составе модельной смеси (мочи) доксициклин в составе модельной смеси (крови)

рКа Рі(х±Дх) рКа Рі(х±Дх) рКа ?\{х±Ах)

рКаі=3,4 рКа2=7,4 рКа3=9,5 3,5±0,12 рКаі=3,5 рКа2=7,4 рКа3=9,5 3,5±0,12 рКа,=3,4 рКа2=7,4 рКа3=9,5 3,6±0,12

Примечание: Количественные характеристики рассчитаны на ЭФС по И см с использованием средних выборок результатов 3-х параллельных электрофоретических исследований антибиотика при соответствующих величинах рН электролита

Применение электрофореза на бумаге для ЭФС-идентификации

тримекаина и мезидина в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных

Нами изучена возможность применения электрофореза на бумаге для ЭФС-идентификации тримекаина и его метаболита - мезидина в жидких средах и внутренних органов экспериментальных животных (кроликов).

Электрофорез воднокислых остатков проводили в соответствии с разработанной нами методикой ЭФС-идентификации АССОХ на этапе электрофореза-скрининга (прибор - «ПВЭФ-1», 400 В, 1ч; носитель -хроматографическая бумага марки «РК-15»; электролит - буферный раствор Бриттона-Робинсона в диапазоне рН 1,8 - 10,0; детектор - реактив Драгендорфа, модифицированный по Мунье).

Средние арифметические значения ДПФ(.М исследуемых оснований в пяти повторностях, при соответствующих значениях рН электролита, использовали для построения ЭФС. Результаты исследований свидетельствуют о том, что ЭФС по ДПФСМ тримекаина и его метаболита -мезидина индивидуальны, при этом, профили ЭФС по ДПФСМ тримекаина гидрохлорида и его основания, выделенного из печени, крови и места введения кролику, совпадают (рис. 8).

В свою очередь профили ЭФС по ДПФСМ мезидина гидрохлорида и его основания, выделенного из желудка и крови кролика, также совпадают (рис.9).

Таким образом, опыты с введением тримекаина и мезидина экспериментальным животным показали, что способ установления ЭФС по ДПФ см может быть использован для идентификации исследуемых веществ, выделенных из жидких сред и внутренних органов животных.

Рисунок 8 - ЭФС по ДПФсм тримекаина гидрохлорида (1) и его снования, выделенного из печени (2), крови (3) и места введения (4) кролику

5

12315 Ь Г 8 9Ю рН

Рисунок 9 - ЭФС по ДПФ см мезидина гидрохлорида (1) и его основания, выделенного из желудка (2) и крови (3) кролика

Идентификация ряда АССОХ в присутствии соэкстрактивных веществ мочи и крови методом капиллярного электрофореза

В доступной нам литературе крайне редко встречаются данные по применению электрофоретических спектров (ЭФС) для идентификации лекарственных веществ в биологических объектах методом капиллярного электрофореза.

На общее наблюдаемое время миграции (1;м) иона может оказывать существенное влияние ряд факторов: время миграции ЭОП, рН электролита, присутствие в пробе соэкстрактивных веществ биосубстратов.

Нами изучена возможность ЭФС-идентификации ряда АССОХ (бупивакаина, лидокаина, азалептина) методом капиллярного электрофореза в присутствии соэкстрактивных веществ биологических объектов в составе МБС мочи и крови.

Приготовление МБС осуществляли, путем двухкратной экстракции аликвоты мочи и крови хлороформом (в соотношении 1:1) из щелочной среды (рН 10,0), с последующим реэкстрагированием буферным раствором Бриттона-Робинсона, рН 2,3, разбавленным водой в 10 раз (в соотношении с хлороформом 1:1). К полученным реэкстрактам добавляли стандартные образцы АССОХ и маркер ЭОП — бензиловый спирт (БС), с концентрацией исследуемых компонентов в пробе - 10 мкг/мл. Электрофоретическое исследование реэкстрактов проводили на приборе «Капель-105», в разработанных выше условиях. Детектирование осуществляли в УФ-области спектра: 200 нм (бупивакаин, лидокаин), 245 нм (азалептин).

На ЭФГ рассчитывали исправленное время миграции исследуемых соединений по БС на ЭОП (1:и) и использовали для построения ЭФС, с помощью которых рассчитывали константы ионизации (рКа) АССОХ.

Результаты исследований показали, что профили ЭФС по исследуемых АССОХ, их количественные характеристики (рКа1<2) в присутствии соэкстрактивных веществ практически совпадают с соответствующими профилями и характеристиками ЭФС АССОХ-стандартов (рис. 10-12, табл. 9).

Рисунок 10 - ЭФС по лидокаина — стандарта (А), и лидокаина в присутствии соэкстрактивных веществ мочи (Б) и крови (В)

Рисунок 11 - ЭФС по 1;и бупивакаина - стандарта (А), и бупивакаина в присутствии соэкстрактивных веществ мочи (Б) и крови (В)

Рисунок 12 - ЭФС по ^ азалептина - стандарта (А), и азалептина в присутствии соэкстрактивных веществ мочи (Б) и крови (В)

Таблица 9 - Количественные характеристики ЭФС по 1:и сы АССОХ -стандартов и АССОХ в присутствии соэкстрактивных веществ мочи и крови

№ АССОХ ЭФС по и ЭФС по 1и

п/п (стандарт) Моча Кровь

1. Бупивакаин рКа,= 4,50 рКа2= 8,10 рКа,= 4,50 рКа2= 8,05 рКа,= 4,50 рКа2= 8,05

2. Лидокаин рКа,= 4,40 рКа2= 7,70 рКа,= 4,30 рКа2= 7,60 рКа,= 4,50 рКа2= 7,80

3. Азалептин рКаі= 4,30 рКа2= 7,60 рКаі= 4,30 рКа2= 7,70 рКаі= 4,30 рКа2= 7,60

Примечание: Количественные характеристики рассчитаны на ЭФС по 1« с использованием средних выборок результатов 5 параллельных электрофоретических исследований каждого из АССОХ при

соответствующих величинах рН РЭ

Таким образом, разработана методика ЭФС-идентификации ряда АССОХ (лидокаина, бупивакаина, азалептина) в составе МБС мочи, крови с использованием системы капиллярного электрофореза («Капель-105») и установлено, что на количественные характеристики ЭФС по АССОХ не оказывают существенное влияние соэкстрактивные компоненты мочи и крови.

5. Количественное определение АССОХ в биологических объектах методами электрофореза на бумаге и капиллярным электрофорезом Для определения микроколичеств веществ в биологических субстратах наиболее целесообразно использование методов, позволяющих сочетать очистку, обнаружение, идентификацию и количественное определение искомых веществ. Такими возможностями обладают электромиграционные методы (электрофорез на бумаге, капиллярный электрофорез).

Определение доксициклина методом электрофореза на бумаге Предложена экспрессная методика планиметрического определения доксициклина на ЭФГ, позволяющая проводить предварительную оценку содержания исследуемого соединения на этапе электрофореза-скрининга методом электрофореза на бумаге в приборе «ПВЭФ-1», в выбранных выше условиях. Электролит - буферный раствор Бриттона-Робинсона (рН 2,3).

При этом, площади детектируемых зон доксициклина пропорциональны содержанию вещества в наносимых пробах в диапазоне от 2 до 10 мкг, а калибровочный график носит выраженный линейный характер.

Погрешность количественного определения доксициклина методом электрофореза на бумаге составила 4,62%.

Электрофорезо-спектрофотометрическое определение доксициклина в моче Электрофорез на бумаге как эффективный метод очистки успешно сочетается с другими инструментальными методами. Одним из широко распространенных и доступных инструментальных методов является УФ-спектрофотометрический метод, который применяется при исследовании лекарственных веществ в биологических жидкостях и субстратах; используется и для скрининга на этапе подтверждающего анализа, после ТСХ выделения исследуемых веществ.

Нами разработана электрофорезо-спектрофотометрическая методика определения доксициклина в моче. Изолирование доксициклина из мочи проводили прямой экстракцией хлороформом (рН 7,0). Сухие остатки, после упаривания органического растворителя растворяли в 30% растворе уксусной кислоты. Для отделения от метаболитов и устранения влияния эндогенных балластных веществ проводили электрофоретическое выделение доксициклина на приборе «ПВЭФ-1», в приведенных выше условиях электрофореза исследуемого антибиотика, с последующим его спектрофотометическим определением в элюате (0,01 М раствор хлористоводородной кислоты, длина волны — 268 нм; у = 0,00713 • х + 0,00823, Я2 =0,9998).

Предложенная методика валидна по показателю специфичности (отсутствие пятен доксициклина на ЭФГ образцов плацебо, совпадающих по расположению с пятном доксициклина).

При статистической обработке данных, полученных в ходе количественного определения доксициклина, в модельных пробах мочи, на трех уровнях концентраций (табл.10), отражается вполне удовлетворительная

повторяемость результатов в пределах рекомендуемой аналитической области (от 2 до 18 мкг/мл). Рассчитанное стандартное отклонение среднего результата (критерий воспроизводимости результатов измерений) находится в пределах критерия приемлемости (менее 2%).

Таблица 10 - Количественное определение доксициклина в моче

Концентрация доксициклина в модельной смеси, мкг/мл Определено доксициклина Метрологические характеристики

мкг/мл %

10,0 7,9 79,0 8= 2,08 Бх=1,20 Ад; =5,16 Е=6,59

7,6 76,0

8,0 80,0

л: =7,83 х= 78,3

50,0 41,2 82,4 8=1,41 8Х=0,82 Дх=3,53 Е=4,29

41,8 83,6

40,9 80,8

х = 44,3 х= 82,3

100,0 82,0 82,0 • 8=0,95 8Х=0,55 Ах =2,37 Е=2,86

83,9 83,9

83,1 83,1

х= 83,0 х = 83,0

Предел обнаружения доксициклина на ЭФГ - 0,1 мкг вещества в пробе. Предел определения методом УФ-спектрофотометрии после электрофоретического выделения составил для доксициклина 1 мкг/мл.

Экспрессный метод определения доксициклина в моче капиллярным электрофорезом («Нанофор-01») Нами предложена экспрессная методика анализа доксициклина в моче, с использованием отечественного прибора «Нанофор-01».

При проведении электрофореза доксициклина (рабочий электролит — боратный буферный раствор, рН 10,2; растворитель пробы — боратный буферный раствор, рН 8,0; ввод пробы - давлением (0,5 атм х 200 сек); напряжение: 15 кВ, нормальная полярность; диаметр капилляра - 30 мкм), проводили концентрирование пробы непосредственно в капилляре прибора в начальной стадии электрофоретического анализа, используя метод стекинга. Метод основан на том, что проба вводится в капилляр в буферном растворе, имеющем электропроводность в десять раз меньше, чем в рабочем электролите (за счет пониженной ионной силы). В таком растворителе как электрофоретическая, так и электроосмотическая подвижности увеличиваются, и зона анализируемого вещества сужается и обостряется. Для усиления этого эффекта использовали также понижение значения рН рабочего электролита. Удаление буфера - растворителя пробы проводится электрокинетически при обратной полярности рабочих электродов. Окончание процесса концентрирования, т.е. формирование узкой зоны на

входе капилляра, фиксируется по току: прекращается возрастание силы тока, и его значение выходит на плато. В дальнейшем, полярность электродов меняется на стандартную, т.е. катод находится на стороне «окна детектора», и проводится электрофорез.

Для построения калибровочного графика количественного определения доксициюшна была выбрана длина волны детекции 346 нм, как более селективная и удовлетворяющая по уровню чувствительности. Линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентрации 10 - 500 мкг/мл.

Изолирование доксициклина из биологической жидкости (без экстракционного концентрирования) осуществляли с использованием самопроточной мини-колонки с бисерным полиакриламидным гелем «Акрилекс Р-10», в которую вносили аликвоту мочи, с последующим промыванием растворителем пробы - боратным буферным раствором, рН 8,0. Дальнейший ход анализа доксициклина в элюате включает концентрирование пробы в капилляре прибора методом стекинга и электрофорез в разработанных условиях. Электрофореграмма мочи с содержанием доксициклина 5 мкг/мл приведена на рисунке 13.

о.оо1 Н

O.OOIOH

I. I » 1 4 * 6 7

Retention мин 16.92

10 11 11 13 14 15 16 17 18

1

- ■ .Не light

AU AU*COK О. О О 1 О7 0.01692

Area : , % ioo.oo

Рисунок 13 - Анализ доксициклина в моче (5 мкг/мл) капилярным электрофорезом («Нанофор-01»).

Таким образом, за счет пробоподготовки и селективного детектирования удается полностью устранить наложение мешающих определению доксициклина низкомолекулярных компонентов мочи, а за счет обогащения пробы стекингом, удается обеспечить такую концентрационную чувствительность, при которой доксициклин надежно определяется при концентрациях меньше 5 мкг/мл, что значительно ниже терапевтического уровня.

Определение артикаина в биологических объектах методом капиллярного электрофореза («Капель-105»)

Важными вопросами при количественном определении лекарственных веществ в биологических жидкостях и субстратах методом капиллярного электрофореза являются вопросы пробоподготовки (изолирование из объектов и концентрирование исследуемых соединений). В биообъектах возможно присутствие различных эндогенных компонентов, на фоне которых затрудняется детектирование искомых соединений в микрограммовых количествах. Кроме того, фотометрическое детектирование различных компонентов происходит непосредственно в капилляре, вследствие этого чувствительность детекции ограничена малой длиной оптического пути, равного внутреннему диаметру капилляра.

При разработке методики количественного определения АССОХ (на примере артикаина) в моче, крови, ткани печени на базе капиллярного электрофореза («Капель-105») эти осложняющие проблемы решали тем, что на этапе пробоподготовки для получения в достаточной степени очищенной и сконцентрированной пробы использовали жидкость-жидкостную экстракцию хлороформом (рН 9,0) образцов мочи, крови и воднокислых вытяжек из печени (раствор хлористоводородной кислоты, рН 2,0), с последующим реэкстрагированием исследуемых компонентов в рабочий электролит, разбавленный водой в 10 раз и проведением электрофореза пробы в разработанных нами условиях с целью идентификации артикаина. При этом, перевод исследуемых компонентов в рабочий электролит, разбавленный водой в 10 раз, позволяет в процессе электрофореза в кварцевом капилляре дополнительно осуществить концентрирование пробы за счет стекинга (аналиты внутри зоны образца движутся с более высокой локальной скоростью, и, замедляясь на границе с зоной ведущего электролита, концентрируются).

Концентрацию исследуемого вещества в реэкстракте рассчитывали по калибровочному графику, предварительно построенному при электрофоретическом исследовании стандартных растворов артикаина в интервале концентраций от 1 до 20 мкг/мл (у = 0,4798 • х - 0,0368; Я2 = 0,9999).

Показано, что в соответствии с разработанными методиками пробоподготовки, балластные вещества мочи, крови, печени не мешают фотометрическому определению артикаина, а применение процесса стекинга непосредственно в капилляре при проведении электрофореза, позволяет дополнительно сконцентрировать исследуемое вещество в пробе и тем самым проводить определение микрограммовых количеств анестетика в селективных условиях.

Нами проведена валидация разработанных методик определения АССОХ в биологических объектах методами электрофореза на бумаге и капиллярным электрофорезом, рассчитаны метрологические характеристики определения исследуемых соединений для трех концентраций и в трех

повторностях в различных биологических объектах (моча, кровь, печень). Проведенная валидационная оценка показала, что методики отличаются специфичностью, чувствительностью, правильностью, повторяемостью, линейной зависимостью, внутрилабораторной прецезионностью полученных результатов.

6. К объективной оценке уровня концентрации доксициклина и артикаина в клинических объектах методами электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза

Разработанные электрофоретические методики анализа доксициклина, артикаина в биологических объектах, были применены для изучения объективной оценки уровня концентрации исследуемых соединений в клинических объектах.

Исследование особенностей фармакокинетики доксициклина при лечении острой гнойной хирургической инфекции

Электрофорезо-спектрофотометрическая методика определения доксициклина в биологической жидкости была применена для решения вопросов, связанных с изучением новых методов лечения острой гнойной хирургической инфекции в сочетании с традиционной химиотерапией. Исследования проводились на базе клинической больницы им.Н.А.Семашко г.Ярославля совместно с сотрудниками кафедры общей хирургии Ярославской государственной медицинской академии. В качестве основного фармакокинетического параметра нами было выбрано значение концентрации доксициклина в моче, как величина, характеризующая почечный клиренс и скорость элиминации вещества. В исследовании приняли участие 130 пациентов с хирургической инфекцией мягких тканей, без нарушений функции мочевыводящей системы, желудочно-кишечного тракта и печени. В основную группу вошло 26 пациентов, лечившихся с применением вакуум-терапии; 104 человека составили контрольную группу с применением традиционных мероприятий. Концентрацию доксициклина определяли электрофорезо-спектрофотометрическим методом по разработанной ранее методике после изолирования его жидкостно-жидкостной экстракцией.

Результаты исследований представлены в таблице 11 и на рисунке 14.

Таблица 11 - Изменения концентрации доксициклина в моче в основной и

контрольной группах_

№ п/п Группа Концентрация доксициклина, мкг/мл

2-й день 5-й день 7-й день

1 Основная 114,0±3,5 96,0±4,1 126,0±2,9

2 Контрольная 106,0±3,7 132,5±2,8 146,7±3,1

2 5 7

И Основная ■ Контрольная

Рисунок 14 - Динамика изменения концентрации доксициклина в моче

Установлено, что при применении вакуум-терапии, скорость экскреции доксициклина с мочой ниже, чем при традиционном лечении гнойной хирургической инфекции, и её изменения носят волнообразный характер, что возможно объясняется повышенным привлечением препарата в ткани очага воспаления, вследствие локального увеличения уровня микроциркуляции и более быстрого роста грануляций.

В свою очередь, клинические данные свидетельствуют, что сочетанное применение вакуум-терапии и доксициклина в лечении острой гнойной хирургической инфекции оказывает выраженное позитивное влияние, наблюдаемое в быстрой ликвидации признаков интоксикации и в оптимизации местных регенеративных реакций.

Таким образом, разработанную электрофорезо-спектрофото-метрическую методику определения содержания доксициклина предлагается использовать в качестве объективного критерия, косвенно позволяющего подтвердить синергизм взаимодействия антибиотикотерапии и других средств антисептики, в том числе позитивное действие вакуум-терапии на течение локальных воспалительных реакций в комплексном лечении гнойной хирургической инфекции мягких тканей.

Аналитическое обоснование объективного контроля уровня концентрации артикаина в биологических средах организма при хирургических вмешательствах под местной анестезией

Разработанные методики определения артикаина в биологических объектах с использованием отечественной системы для капиллярного электрофореза («Капель-105») были применены в клинике общей хирургии Ярославской государственной медицинской академии, при проведении лабораторных анализов биологических жидкостей - мочи и крови, взятых от оперируемых больных под местной (артикаиновой) анестезией, а также - в стоматологической практике на кафедре стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ЯГМА, при определении артикаина в тканях операционного поля.

Было проведено изучение скорости элиминации артикаина из крови у больных печёночной дисфункцией (механическая желтуха) - уровень

билирубина в крови от 200 до 300 мкМ/л. В контрольную группу вошли пациенты с нормальными показателями состояния печени (8-25 мкМ/л).

Исследование проводилось на пациентах, которым была сделана подкожная анестезия (2 мл 4% раствора ультракаина, т.е. 80 мг артикаина гидрохлорида) при введении катетера для внутривенных инфузий в подключичную вену. Полученные результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12 - Элиминация артикаина из крови пациентов с механической __желтухой (п=5; р<0,0001,а=0,05) _

Кровь 0,5 часа (нг/мл) 1 час (нг/мл) 2 часа (нг/мл)

Норма 224,6±9,963 8=22,28 У=9,92% 112,6±9,212 8=20,60 У= 18,29 25,2±1,855 8=4,147 У= 16,46%

Желтуха 227,6±6,185 8=13,83 У=6,08% 188,4±8,801 8=19,68 У=10,45% 126,0±4,889 8=10,93 У=8,67%

+1,34%* 0,256* +67,32% 5,949 +400% 19,281

Примечание: ""-статистически недостоверное измерение

Была проведена сравнительная оценка уровней концентрации артикаина в крови при различных способах введения анестетика. Полученные данные, представленные в таблице 13, характеризуют динамику выведения исследуемого препарата при внутримышечном и подкожном способам введения.

Таблица 13 - Элиминация артикаина из крови при внутримышечном и _подкожном способам введения (п=5, р<0,0001, а=0,05)_

Кровь 0,5 часа (нг/мл) 1 час (нг/мл) 2 часа і нг/мл)

п/к 224,6+9,963 8=22,28 У=9,92% 112,6+9,212 8=20,60 У=18,29 25,2+1,855 8=4,147 У= 16,46%

в/м 510,2+27,69 8=61,92 У=12,14% 291,6+26,08 8=58,31 У=19,99% 141,0+13,1 8=29,28 У=20,76%

У +127,16% 9,705 +158,97% 6,472 +459,52% 8,756

Таким образом, функциональное состояние печени оказывает существенное влияние на метаболизм артикаина, а применение ряда последовательных местных анестезий, необходимых при некоторых видах хирургических вмешательств, у пациентов с острой дисфункцией печени требует коррекции дозировки препарата. Кроме того, установлено, что концентрация анестетика, в системном кровотоке при внутримышечном способе введения выше, чем при подкожном, а кривая элиминации имеет несколько иной характер, что необходимо учитывать при индивидуальном подборе дозы препарата.

Во всех случаях, при анализе мочи был обнаружен артикаин в диапазоне концентраций от 300 до 500 нг/мл, что подтверждает возможность использования данного объекта с целью установления факта приёма исследуемого препарата.

Было проведено изучение распределения артикаина в тканях ротовой полости при проведении местной иифильтрационной анестезии. В исследовании участвовали пациенты с двумя типами диагнозов: «хронический одонтогенный гайморит» и «киста челюсти», от которых забирался операционный материал (фрагменты десны, гайморовой пазухи и кисты весом от 0,01 до 0,1 г), через 10 мин после иифильтрационной анестезии 2 мл 4% раствора ультракаина (80 мг артикаина гидрохлорида).

Образцы тканей подвергались анализу методом капиллярного электрофореза («Капель-105») по разработанной методике, с поправкой на вес объектов. Результаты исследований представлены в таблице 14.

Таблица 14 - Распределение артикаина в тканях операционного поля (п=5)

Тип ткани Содержание артикаина (мкг/г ткани) Метрологические характеристики

Десна 30,58±1,362 8=3,045 СУ=9,96%

Гайморова пазуха 13,39±0,776 8=1,735 СУ= 12,96%

Киста 3,637±0,186 8=0,416 СУ= 11,43

Электрофореграммы клинических объектов (моча, кровь, ткани) представлены на рисунках 15-17.

•1.05 и АО' 1 еж

ш —■V...........„.,.-—А—— IV * ''

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13- мин

Рисунок 17 - Электрофореграмма артикаина (клинический объект - десна)

Для подтверждения объективности разработанных методик определения артикаина методом капиллярного электрофореза в клинических объектах (моча, кровь, ткани) был проведён хромато-масс-спектральный анализ. В результате испытаний установлено, что предел обнаружения артикаина, с идентификацией по полному масс-спектру (библиотека: №8Т 98) на уровне достоверности не менее 72%, составляет 50 нг/мл, по характерным ионам т 1ъ 86,171, 44 - 10 нг/мл.

На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований предложена схема системного химико-токсикологического анализа АССОХ в биологических объектах с использованием электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза.

Схема

системного химико-токсикологического анализа АССОХ в биологических объектах с использованием электромиграционных методов

Жидкость-жидкостная экстр акциярН 7-10, хлороформ; Реэкстрагированне, рН 2,3

Из олир ова ние р аств ор а &о I органических киса от (щавелевой, рН 2,0; уксусной, рН 2,0: трихлоруксушой,рН 1,0)

--— ч (Г __ Стадия дополнительной очистки и пр едвартельного обнаружения Электрофорез на бумаге«ПВЭФ-1»

Групповое обнаружение (по ЭГ) Внутригрупповое обнаружение (по ЭФ С)

\ /

Ста днявдентификацин (подтверждающего исследования) Капиллярный ал стар офорез «Капель-105»,«Нанофор-01»

ЭФСпо^ (рКа)

Стадия количественного определенна

Электрофорез на бумаге («ПВЭФ-1») Капиллярный электрофорез («Капель-105». «Нанофор-01»)

Планиметрия (предварительное определение) Электр офорезо-спектр офотометрия

выводы

1. Изучены оптимальные условия электрофореза-скрининга ряда АССОХ методом электрофореза на бумаге («ПВЭФ-1»),

Показано, что на этапе группового обнаружения, наиболее воспроизводимые величины ДПФСМ исследуемых соединений и более равномерная частота распределения их на ЭФГ по электрофоретическим группам получены при использовании в качестве электролита 5% раствора уксусной кислоты.

На втором этапе электрофореза-скрининга АССОХ предложена методика внутригрупповой идентификации («ПВЭФ-1», электролит -буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 1,8 н- 8,0. Показано, что подлинность ЭФС-идентификации исследуемых соединений значительно увеличивается с использованием их количественных характеристик (ДПФмакс, ДПФМИН, РГ).

2. Установлена возможность идентификации (подтверждающего исследования) ряда АССОХ с использованием новой отечественной системы для капиллярного электрофореза - «Капель-105». Разработанные условия электрофореза показали, что наибольшая воспроизводимость качественного параметра (1:м) исследуемых соединений, получены при использовании буферного раствора Бриттона-Робинсона, рН 2,3.

3. Предложена методика ЭФС-идентификации АССОХ по 1:и (маркер электроосмотического потока — бензиловый спирт), с применением капиллярного электрофореза («Капель-105»). Установлено с помощью ЭФС по \.и ионное состояние исследуемых соединений в зависимости от рН среды, рассчитаны их рКа.

4. Результаты исследований по предварительному (групповому) обнаружению АССОХ в присутствии соэкстрактивных веществ печени (извлекатели — водные растворы щавелевой, рН 2,0; уксусной, рН 2,0; трихлоруксусной, рН 1,0 кислот и ацетона) методом электрофореза на бумаге («ПВЭФ-1») показали, что независимо от природы извлекателей исследуемые соединения располагаются в электрофоретические группы, соответствующие расположению АССОХ - стандартов при электрофорезе-скрининге в разработанных условиях.

Количественные характеристики ЭФС (ДПФмакс, ДПФМИН) Р1) исследуемых оснований (в присутствии соэкстрактивных веществ, при использовании выше приведённых извлекателей), практически совпадают с количественными характеристиками ЭФС соответствующих АССОХ-стандартов, и позволяют в сочетании с ЭФС - профилями надёжно осуществлять их внутригрупповую идентификацию в модельных биологических смесях.

5. Проведённые исследования на экспериментальных животных (кроликах) показали, что способ установления ЭФС («ПВЭФ-1») может быть использован для идентификации АССОХ на примере тримекаина и его

метаболита — мезидина), изолированных из жидких сред (крови, мочи) и внутренних органов животных (желудка, печени) и мышечной ткани с места введения анестетика. Специфичность доказательства их по ЭФС повышается с применением наряду ДПФСМ, также и относительных электрофоретических величин (ДПФкодх ю, ДПФХИ11Х10).

6. Впервые установлена возможность ЭФС-идентификации (подтверждающего исследования) ряда АССОХ (лидокаина, бупивакаина, азалептина) методом капиллярного электрофореза («Капель-105») в присутствии соэкстрактивных веществ биологических объектов (мочи, крови). Профили ЭФС по I:,, АССОХ, их количественные характеристики (рКа)і2) в присутствии соэкстрактивных веществ практически совпадают с соответствующими профилями и характеристиками ЭФС АССОХ-стандартов.

7. Изучена возможность экспрессного количественного определения ряда АССОХ с использованием скринингового метода - электрофореза на бумаге («ПВЭФ-1») и подтверждающего электрофоретического метода -капиллярного электрофореза («Капель-105», «Нанофор-01»),

Установлены валидационные характеристики предложенных методик анализа по показателям: специфичность, чувствительность, правильность, линейность, сходимость и внутрилабораторная прецизионность полученных результатов.

8. Продемонстрирована возможность использования разработанных методик для определения ряда АССОХ в биологических объектах при химико-токсикологических исследованиях.

Предложена схема системного химико-токсикологического анализа АССОХ в биологических объектах, с использованием электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза

9. Разработанные электрофоретические методики идентификации и количественного определения ряда АССОХ в моче, крови и тканях применены в условиях клиники с целью экспрессного контроля уровня препаратов в биологических средах организма при хирургических вмешательствах под местной анестезией и при антибиотикотерапии.

Объективность полученных результатов («Капель-105») подтверждено хромато-масс-спектральным анализом.

10. Разработанные методики внедрены в практику химико-токсикологических лабораторий Бюро судебно-химических экспертиз и наркологических больниц городов Ярославля, Перми, Йошкар-Ола, в учебный процесс фармацевтических факультетов медицинских ВУЗов городов Ярославля, Тюмени.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фомин, А.Н. Электрофорезо-спектрометрическое определение хлоргексидина в моче и крови / А.Н. Фомин, А.Х. Лайпанов, Н.В. Балыкова// Современное состояние и перспектива развития фармакокинетики: Третья Всесоюзн. конфер. по фармакокинетике. - М., 1991. - С. 38.

2. Фомин, А.Н. Электрофоретическое исследование клофелина в моче / А.Н. Фомин, А.Х. Лайпанов, А.Н. Белозёров // Современное состояние и перспективы развития фармакокинетики: Третья Всесоюзн. конфер. по фармакокинетике. - М., 1991. - С. 53.

3. Лайпанов, А.Х. К определению клофелина в моче при химико-токсикологических исследованиях / А.Х. Лайпанов, А.Н. Фомин, Л.Ю. Тихомирова // Сб. науч. трудов Ярослав, госуд. мед. академии. - Ярославль, 1996.-Вып. 2-С. 34.

4. Фомин, А.Н. К применению электрофореза на бумаге при химико-токсикологических исследованиях клофелина в биологическом материале / А.Н. Фомин, Н.В.Кошечкина // Сб. науч. трудов Ярослав, госуд. мед. академии. — Ярославль, 1996. — Вып. 2 - С. 35.

5. Фомин, А.Н. Сравнительная оценка методов изолирования клофелина из биологического материала / А.Н. Фомин, С.Ю. Лихачева // Матер, науч.-практ. конф. Ярослав, госуд. мед. академии. - Ярославль, 1997. -С. 97.

6. Фомин, А.Н. Изучение вопросов выделения азотсодержащих соединений основного характера из биологического материала // Матер, науч.-практ. конф. Ярослав, госуд. мед. академии. - Ярославль, 1997. - С. 98.

7. Фомин, А.Н. Электрофорезо-спектрометрия доксициклина как объективный метод оценки эффективности вакуум-терапии в комплексном лечении острой хирургической инфекции мягких тканей / А.Н. Фомин, А.Б. Ларичев, И.А. Биткин [и др.] //Буковинский медичный в1сник. - Чершвщ, 2001.-№3.-С. 153-155.

8. Ларичев, А.Б. Патогенетические аспекты эффективной вакуум-терапии в комплексном лечении острой инфекции мягких тканей / А.Б. Ларичев, А.Н. Фомин, И.А. Биткин [и др.] // Буковинский медичный вкник. - Чершвщ, 2001. - №3. - С. 124-126.

9. Фомин, А.Н. К электрофорезо-денситометрическому определению отдельных лекарственных средств в моче и в составе лекарственных форм / А.Н. Фомин, М.Б. Ершов, И.А. Биткин [и др.] // Количественная ВТХ. Проблемы и их решения: 2-я школа-семинар. — Санкт-Петербург, 2002. С. 26.

10. Ларичев, А.Б. Комплексное лечение острой хирургической инфекции мягких тканей с синдромом системной реакции на воспаление / А.Б. Ларичев, А.Н. Фомин, B.C. Кузьмин // Методическое пособие для врачей. — Ярославль, 2002. — 36 с..

11. Фомин, А.Н. Применение капиллярного электрофореза в анализе цефалоспоринового антибиотика - цефобида / А.Н. Фомин, Ю.А. Джурко, Л.В. Каджоян, Л.А. Каменецкая // Матер. X съезда медицинских и

фармацевтических работников Ярославской обл. (часть II). - Ярославль, 2003.-С. 301-304.

12. Фомин, А.Н. К изучению возможностей анализа ряда местных анестетиков методом капиллярного электрофореза / А.Н. Фомин, A.B. Смирнова, A.B. Лебедева, Ю.А. Джурко // Матер. X съезда медицинских и фармацевтических работников Ярославской обл. (часть II). - Ярославль, 2003.-С. 350-353.

13. Фомин, А.Н. Количественное определение новокаинамида в биологических жидкостях капиллярным электрофорезом / А.Н. Фомин, JI.B. Иващенко, Ю.А. Джурко // Современные вопросы фармакогнозии: Сборн. материалов. - Ярославль, 2004. - С. 304-307.

14. Фомин, А.Н. Капиллярный электрофорез как метод объективной оценки концентрации артикаина при проводниковой анестезии у больных с хирургической инфекцией / А.Н. Фомин, А.Б. Ларичев, Ю.А. Джурко, B.C. Кузьмин // Матер. VII научно-практической конференции хирургов Федерального управления «Медбиоэктрем». - Саров, 2004. - С. 178-179.

15. Фомин, А.Н. Объективная оценка концентрации артикаина методом капиллярного электрофореза у хирургических больных / А.Н. Фомин, А.Б. Ларичев, Ю.А. Джурко, B.C. Кузьмин // Достижения и проблемы клинической и экспериментальной хирургии: Матер, конференц. Хирургов России, посвященной 100-летию со дня рождения проф. B.C. Семёнова. -Тверь, 2004. - С. 58-60.

16. Фомин, А.Н. Изучение особенностей фармакокинетики артикаина у пациентов с острой печёночной дисфункцией для целей лекарственного мониторинга / А.Н. Фомин, М.Б. Ершов, Ю.А. Джурко, B.C. Кузьмин [и др.] // Актуальные вопросы клинической лабораторной диагностики: Сборн. материалов. - Ярославль, 2005. - С. 48-50.

17. Фомин, А.Н. Аналитическая верификация анестетиков у больных сахарным диабетом, оперированных по поводу хирургической инфекции / А.Н. Фомин, А.Б. Ларичев, Ю.А. Джурко, B.C. Кузьмин, A.B. Смирнова, Э.В. Абляев // Морфологические ведомости. - М., 2005. - №1-2. С. 217.

18. Ларичев, А.Б. Патогенетические аспекты лечения хирургической инфекции у больных сахарным диабетом / А.Б. Ларичев, А.Н. Фомин, B.C. Кузьмин, A.B. Антонюк // Морфологические ведомости. - М., 2005. - №1-2 -С. 245.

19. Фомин, А.Н. Количественное определение цефопиразона методом капиллярного электрофореза / А.Н. Фомин, М.Ю. Смирнов, Д.В. Кочетков, Н.В. Корельская // Современные вопросы теории и практики лекарствоведения: Сборн. материалов. - Ярославль, 2007. - С. 301-305.

20. Фомин, А.Н. Идентификация бупивакаина методом капиллярного электрофореза / А.Н. Фомин, A.B. Смирнова // Современные вопросы теории и практики лекарствоведения: Сборн. материалов. - Ярославль, 2007. -С. 345-348.

21. Фомин, А.Н. Сравнительная оценка степени извлечения цефоперазона из водных растворов в зависимости от pH среды и природы органического растворителя / А.Н. Фомин, М.Ю. Смирнов, Д.В. Кочетков, Н.В. Корельская // Современные вопросы теории и практики лекарствоведения: Сборн. материалов. - Ярославль, 2007. - С. 345-348.

22. Фомин, А.Н. Разработка условий скринингового обнаружения ряда местных анестетиков методом электрофореза на бумаге / А.Н. Фомин, A.B. Смирнова, М.Б. Семёнов // Современные вопросы теории и практики лекарствоведения: Сборн. материалов. - Ярославль, 2007. - С. 348-352.

23. Фомин, А.Н. Изучение влияния соэкстрактивных веществ (мочи) на идентификацию ряда азотсодержащих соединений основного характера методом капиллярного электрофореза / А.Н. Фомин, A.B. Смирнова, М.Б. Семёнов, Е.В. Смирнова // Актуальные вопросы медицинской науки: Сборн. научн. работ, посвящённый 65-летию ЯГМА. - Ярославль, 2009. - С. 97-98.

24. Фомин, А.Н. Идентификация артикаина и бупивакаина методом капиллярного электрофореза / А.Н. Фомин, A.B. Шпак, A.B. Смирнова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - М., 2010,-№7. -С. 68-72.

25. Фомин, А.Н. Идентификация ряда азотсодержащих соединений основного характера в присутствии соэкстрактивных веществ мочи и крови методом капиллярного электрофореза / А.Н. Фомин, A.B. Смирнова, М.Б. Семёнов, Е.В. Смирнова // Химико-фармацевтический журнал. - М., 2010. - №9. - С. 46-48.

26. Фомин, А.Н. Изучение условий скринингового обнаружения ряда азотсодержащих соединений основного характера методом электрофореза на бумаге / А.Н. Фомин, A.B. Смирнова, М.Б. Семёнов, В.Б. Крючков, Ю.А. Мерзлякова // Вопросы . биологической, медицинской и фармацевтической химии. - М., 2011. - №11. - С. 32-39.

27. Фомин, А.Н. Валйдационная оценка методики определения доксициклина в моче спектрофотометрическим методом после электрофоретического выделения / А.Н. Фомин, Ю.А. Хомов [Электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования: электронный научный журнал. - 2012. - № 3. - Режим доступа: http://www.science-education.ru / 103-6159.

28. Фомин, А.Н. Экспрессный вариант определения доксициклина в моче методом капиллярного электрофореза / А.Н. Фомин, Ю.А. Хомов [Электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования: электронный научный журнал. - 2012. - № 4. - Режим доступа: http:// www.science-education.ru /104 — 6464.

29. Фомин, А.Н. К объективной оценке уровня концентрации доксициклина и артикаина в клинических объектах методом электрофореза / А.Н. Фомин [и др.] [Электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования: электронный научный журнал. — 2012. - № 4. - Режим доступа: http://www.science-education.ru / 104 - 6545.

30. Фомин, А.Н. Разработка и валидация методики определения артикаина в моче капиллярным электрофорезом («Капель-105») / А.Н. Фомин, Ю.А. Хомов, Ю.А. Джурко [Электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования: электронный научный журнал. - 2012. - № 5. - Режим доступа: ЬПр:// www.science-education.ru / 105 - 6757.

31. Хомов, Ю.А. Капиллярный электрофорез как высокоэффективный аналитический метод (обзор литературы) / Ю.А. Хомов, А.Н. Фомин [Электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования: электронный научный журнал. - 2012. - № 5. - Режим доступа: http://www.science-education.ru / 105 - 6775.

32. Хомов, Ю.А. Электрофорез в анализе лекарственных азотсодержащих соединений основного характера / Ю.А. Хомов, А.Н. Фомин: Монография, - Пермь: ГБОУ ВПО Росздрава, 2012. - 124 е.; ил. 17.

Фомин Анатолий Николаевич (Россия)

Исследование по применению электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза при анализе азотсодержащих соединений основного характера в биологических объектах

Работа посвящена теоретическому и экспериментальному обоснованию аспектов применения электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза, с целью расширения их возможностей как аналитических методов при анализе азотсодержащих соединений основного характера (АССОХ) в биологических объектах. Предложена схема системного анализа АССОХ в биологических объектах на базе электромиграционных методов, включающая предварительный (групповой) этап обнаружения 48 АССОХ методом электрофореза на бумаге («ПВЭФ-1») и последующий этап подтверждающего исследования (внутригрупповой идентификации), в сочетании с количественным определением новым высокоэффективным методом капиллярным электрофорезом («Капель-105», «Нанофор-01»). Разработанные электрофоретические методики анализа ряда АССОХ применены в экспертной химико-токсикологической практике, а также в клинической хирургической практике с целью контроля уровня их концентраций в биологических средах оперируемых больных.

Fomin Anatoly Nikolaevich (Russia)

Research on the application of paper electrophoresis and capillary electrophoresis to analysis the basic nature of nitrogen-containing compounds in biological systems.

The work is devoted to theoretical and experimental basis for aspects of paper electrophoresis and capillary electrophoresis, in order to increase their capacity as analytical methods for the analysis of general nitrogen-containing compounds (AGNCC) in biological systems. There is a scheme of the system analysis AGNCC in biological systems based on electromigration methods, including pre- (group) phase of detection 48 AGNCC by the paper electrophoresis (ПВЭФ-1) and the next stage confirmatory research (intra-identification), in conjunction with the quantification of the new high-performance capillary electrophoresis method («Capel-105», «Nanofor-01»). Developed electrophoretic methods of analysis such as AGNCC used in chemical-toxicological expert practice, as well as in clinical surgical practice, in order to control the level of their concentrations in biological fluids of patients undergoing surgery.

Подписано в печать 18.09.2012 Формат 60*84/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Усл. печ. л 2,69 Заказ № 146/2012.

Отпечатано на ризографе в типографии ГБОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел. (342) 282-57-92

 
 

Текст научной работы по медицине, диссертация 2012 года, Фомин, Анатолий Николаевич

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

АС О Л4 7 С ЛО ОI УЗІ,'/ І і ¿иьи«

На правах рукописи

ФОМИН АНАТОЛИЙ НИКОЛАЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ И КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПРИ АНАЛИЗЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

14.04.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

Научный консультант

доктор фармацевтических наук,

профессор Хомов Юрий Александрович

Ярославль - 2012

АССОХ

вэжх гжх гх/мс жжэ

КДА

кзэ кэ

кэ/мс мэкх нд

СХА

тех

ТФЭ ХТА

хтл эоп

ЭФГ ЭФС

СПИСОК ТЕРМИНОЛОГИЧЕСКИХ СОКРАЩЕНИЙ

- азотсодержащие соединения основного характера

- высокоэффективная жидкостная хроматография

- газожидкостная хроматография

- газовая хроматография/масс-спектроскопия

- жидкость - жидкостная экстракция

- клинико-диагностический анализ

- капиллярный зонный электрофорез

- капиллярный электрофорез

- капиллярный электрофорез/масс-спектроскопия

- мицеллярная электрокинетическая хроматография

- нормативная документация

- судебно-химический анализ

- тонкослойная хроматография

- твердофазная экстракция

- химико-токсикологический анализ

- химико-токсикологическая лаборатория

- электроосмотический поток

- электрофореграмма

- электрофоретический спектр

ОГЛАВЛЕНИЕ..............................................................................3

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................10

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................18

ГЛАВА 1. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА БУМАГЕ И КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ КАК ЭЛЕКТРОМИГРАЦИОННЫЕ МЕТОДЫ В АНАЛИЗЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА...............................................................................18

1.1. Электрофорез на бумаге...............................................18

1.1.1. Бумага для электрофореза.............................................19

1.1.2. Электролиты..............................................................20

1.1.3. Электрофорез.............................................................22

1.1.4. Определение констант ионизации соединений электрофорезом на бумаге............................................................................23

1.1.5. Применение электрофореза на бумаге для очистки и определения веществ при химико-токсикологических анализах......26

1.2. Характеристика метода капиллярного электрофореза.........32

1.2.1. Применение метода КЭ при аналитических исследованиях.. .38

1.2.1.1. Неводный КЭ..................................................................40

1.2.1.2. Показатель ионизации........................................................42

1.2.1.3. Прямое введение без пробоподготовки..............................43

1.2.1.4. Приём стекинга................................................................44

1.2.1.5. Фармацевтические препараты...........................................45

1.2.1.6. Примеси..........................................................................48

1.2.1.7. Биологические жидкости.................................................48

1.2.1.8. Энантиомеры.................................................................51

1.2.1.9. Скрининг.....................................................................54

1.2.1.10. Сравнение методов исследования........................................55

1.2.1.11. Развитие и совершенствование метода КЭ............................56

Заключение по главе 1............................................................57

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................59

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................59

2.1. Объекты исследования.................................................59

2.2. Методы исследования АССОХ.....................................63

2.2.1. Условия проведения исследования АССОХ методом электрофореза на бумаге..........................................................63

2.2.1.1. Пропитывание полосок бумаги электролитом..................63

2.2.1.2. Выбор рабочих стандартов............................................64

2.2.1.3. Нанесение исследуемых образцов и метчиков......................64

2.2.1.4. Подготовка прибора и проведение электрофореза................65

2.2.1.5. Обнаружение зон АССОХ на ЭФГ.....................................65

2.2.2. Условия проведения исследования АССОХ методом капиллярного электрофореза.....................................................66

2.2.2.1. Общая характеристика системы капиллярного электрофореза «Капель - 105».......................................................................66

2.2.2.2. Выбор рабочих стандартов.............................................66

2.2.2.3. Подготовка капилляра...................................................67

2.2.2.3.1. Условия подготовки нового капилляра............................67

2.2.2.3.2. Условия подготовки капилляра между анализами..............68

2.2.2.4. Рабочий электролит......................................................68

2.2.3. Статистическая обработка результатов исследований..............72

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО (СКРИНИНГОВОГО) ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ (ПОДТВЕРЖДАЮЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ) АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА (АССОХ) МЕТОДАМИ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ И КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА..........................................................................74

3.1. Условия предварительного (скринингового) обнаружения АССОХ

методом электрофореза на бумаге................................................75

3.1.1. Прибор и режим работы...................................................75

3.1.2. Носитель......................................................................75

3.1.3. Электролиты...............................................................75

3.1.4. Сравнительная характеристика разделительной способности электролитов при проведении электрофореза-скрининга группы АССОХ................................................................................76

3.1.5. Внутригрупповая идентификация АССОХ методом электрофореза-скрининга с помощью ЭФС и их количественных

параметров............................................................................84

3.2. Условия идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методом капиллярного электрофореза...............................89

3.2.1. Условия исследования АССОХ методом капиллярного электрофореза........................................................................92

3.2.2. Идентификация представителей группы АССОХ методом капиллярного электрофореза с использованием ЭФС по tH................94

3.2.3. Изучение ионного состояния АССОХ по ЭФС tH..................100

3.2.4. Количественные характеристики ЭФС tH АССОХ...............101

Заключение по главе 3...........................................................103

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СО ЭКСТРАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В СОСТАВЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ НА УСЛОВИЯ СКРИНИНГОВОГО ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ (ПОДТВЕРЖДАЮЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ) АССОХ МЕТОДАМИ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА........................................................................105

4.1. Электрофорез-скрининг АССОХ в модельных биологических смесях................................................................................105

4.1.1. Исследование печени растворами органических кислот.........106

4.1.2. Исследование печени ацетоном.......................................106

4.1.3. Приготовление модельных биологических смесей АССОХ.....107

4.1.4. Предварительное (групповое) обнаружение АССОХ в составе модельных биологических смесей методом электрофореза на бумаге................................................................................107

4.1.5. Внутригрупповая ЭФС-идентификация (второй этап электрофореза-скрининга) АССОХ в составе модельных биологических смесей методом электрофореза на бумаге...............109

4.2. ЭФС - идентификация доксициклина (представителя амфотерных АССОХ) в составе модельных биологических смесей (мочи и крови)..............................................................................113

4.2.1. Исследование мочи.....................................................114

4.2.2. Исследование крови...................................................114

4.2.3. Приготовление модельных смесей..................................114

4.2.4. Разработка условий идентификации доксициклина, метациклина и тетрациклина электрофорезом на бумаге по ЭФС.....................115

4.2.4.1. Идентификация антибиотиков по ЭФСсм..........................119

4.2.4.2. Идентификация антибиотиков по ЭФСисм и Исм.................119

4.2.4.3. Изучение ионного состояния исследуемых соединений по ЭФСисм.........................................................................................119

4.2.4.4. Количественные характеристики ЭФСИ см исследуемых соединений..........................................................................120

4.2.5. Влияние соэкстрактивных веществ на идентификацию доксциклина по ЭФС в составе модельных биологических смесей.........................................................................................................121

4.3. Применение электрофореза на бумаге для ЭФС - идентификации тримекаина и его метаболита - мезидина в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных.......................126

4.3.1. ЭФС- идентификация тримекаина в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных......................................127

4.3.2. ЭФС - идентификация мезидина в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных......................................134

4.4. Идентификация ряда азотсодержащих соединений основного характера в присутствии соэкстрактивных веществ мочи и крови методом капиллярного электрофореза....................................................141

4.4.1. Приготовление модельных биологических смесей.....................142

4.4.2.Электрофоретическое исследование АССОХ в составе модельных биологических смесей (мочи, крови) методом капиллярного

электрофореза............................................................................................142

Заключение по главе 4...........................................................148

ГЛАВА 5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АССОХ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ МЕТОДАМИ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ И КАПИЛЛЯРНЫМ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ.....................................................................150

5.1. Определение доксициклина в биологических жидкостях методом электрофореза на бумаге и электрофорезо-спектрофотометрическим методом.........................................................................................151

5.1.1. Изучение условий количественного определения доксициклина методом электрофореза на бумаге.............................................151

5.1.1.1. Установление зависимости между количеством нанесённого вещества и площадью пятна после проведения электрофореза.........151

5.1.1.2. Погрешность определения доксициклина методом электрофореза на бумаге........................................................153

5.1.2. Изучение условий спектрофотометрического определения доксициклина.......................................................................154

5.1.2.1. Изучение УФ-спектра доксициклина...............................154

5.1.2.2. Построение калибровочного графика..............................155

5.1.2.3. Определение удельного коэффициента поглощения............157

5.1.2.4.Погрешность спектрофотометрического определения доксициклина.......................................................................158

5.1.3. Влияние рН среды и природы органического растворителя на степень экстракции доксициклина из водных растворов.................161

5.1.4. Влияние кратности экстригирования на степень извлечения доксициклина из водных растворов..........................................163

5.1.5. Изучение потерь доксициклина при элюировании из хроматографической бумаги...................................................164

5.1.6. Определение доксициклина в моче....................................165

5.1.6.1. Количественное планиметрическое определение доксициклина в моче методом электрофореза на бумаге...................................166

5.1.6.2. Электрофорезо - спектрофотометрическое определение доксициклина в моче.............................................................167

5.1.7. Количественное определение доксициклина в крови электрофорезо-спектрофотометрическим методом........................169

5.2. Экспрессный метод определения доксициклина в моче капиллярным электрофорезом с использованием прибора «Нанофор-01».....................................................................170

5.2.1. Приготовление буферных растворов.................................172

5.2.2. Подготовка капилляра и условия проведения капиллярного электрофореза доксициклина гидрохлорида.................................172

5.2.3. Построение калибровочного графика, аналитические параметры метода................................................................................176

5.2.4. Изучение возможности определения доксициклина в моче капиллярным электрофорезом («Нанофор - 01»)..........................180

5.2.4.1. Условия пробоподготовки объекта.................................180

5.2.4.2. Определение чувствительности метода при анализе доксициклина.......................................................................181

5.3. Определение артикаина в биологических объектах методом капиллярного электрофореза («Капель-105»)..............................182

5.3.1. Построение калибровочного графика.................................184

5.3.2. Погрешность количественного определения артикаина методом капиллярного электрофореза...................................................189

5.3.3. Влияние рН среды и природы органического растворителя на степень экстракции артикаина из водных растворов......................190

5.3.4. Влияние кратности экстрагирования и объёма экстрагента на степень экстракции артикаина из водных растворов......................190

5.3.5. Количественное определение артикаина в моче....................193

5.3.6. Количественное определение артикаина в крови..................196

Заключение по главе 5...........................................................203

ГЛАВА 6. К ОБЪЕКТИВНОЙ ОЦЕНКЕ УРОВНЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ДОКСИЦИКЛИНА И АРТИКАИНА В КЛИНИЧЕСКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ И КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА.....................................................................205

6.1. Исследование особенностей фармакокинетики доксициклина при лечении острой гнойной хирургической инфекции.......................205

6.2. Аналитическое обоснование объективного контроля уровня концентрации артикаина в биологических средах организма при хирургических вмешательствах под местной анестезией.................208

Заключение по главе 6...........................................................214

ВЫВОДЫ.................................................................................217

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................220

ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................................259

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Азотсодержащие соединения основного характера (АССОХ), как вещества обладающие сильным физиологическим действием, находят широкое применение в современной медицинской практике.

Вместе с тем, во многих развитых странах отмечается резкое увеличение количества острых и хронических отравлений, возникновение аллергических состояний при определённых условиях под воздействием лекарственных препаратов, в том числе АССОХ. В нашей стране эта проблема является также, актуальной- Диагностика отравлений представляет большие трудности, так как клиническая, патологоанатомическая и гистологическая картина при интоксикации АССОХ, как правило, не характерны. Поэтому основным доказательством причины интоксикации являются результаты химико-токсикологического исследования.

В то же время, в клинической хирургической практике в ряде случаев возникает потребность в проведении лабораторного анализа АССОХ в биологических средах.

Несмотря на значительное число работ, посвященных анализу АССОХ, до настоящего времени продолжают оставаться актуальными вопросы исследования в области разработки новых и дальнейшего совершенствования существующих методик их химико-токсикологического анализа. Эта проблема может быть успешно реализована при применении различных скрининговых систем и широком использовании современных физико-

и

химических методов анализа на базе отечественного приборного обеспечения.

В анализе АССОХ в биологическом материале широко используются скрининговые программы, с применением метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Вместе с тем, применение ТСХ-скрининга в химико-токсикологических лабораториях может быть затруднено из-за отсутствия набора дефицитных общих и частных систем растворителей, модифицированных хроматографических пластин.

В последние десятилетия пристальное внимание уделяется электромиграционным методам анализа веществ.

Электрофорез на бумаге является эффективным и родственным ТСХ (планарных) методом очистки органических соединений, сочетающимся с последующим обнаружением и идентификацией их на электрофореграмме (ЭФГ), при исследовании биологических объектов.

Метод отличается, также, простым аппаратурным оформлением, доступными расходными реактивами и материалами, длительной сохранностью проявленных ЭФГ.

В тоже время, он не изучен в варианте электрофореза-скрининга С целью проведения ненаправленного химико-токсикологического (судебно-химического) исследования биологического материала на неизвестный яд, а также при анализе фальсифицированных лекарственных средств.

Одним из современных и перспективных подтверждающих электромиграционных методов является капиллярный электрофорез, характеризующийся высокой эффективностью (превышающий ВЭЖХ в сотни тысяч раз), сочетанием разделения веществ ионогенной и нейтральной природы, с последующей их детекцией в УФ-области спектра непосредственно в кварцевом капилляре.

Однако, необходимо отметить, что его возможности, применительно к системному химико-токсикологическому (судебно-химическому) и лабораторному клиническому исследованию АССОХ, не изучены.

Цель и задачи исследования. Теоретическое и экспериментальное обоснование аспектов применения электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза, с целью расширения их возможностей как аналитических методов при системном анализе азотсодержащих соединений основного характера (АССОХ) в биологических объектах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1 .Теоретически обосновать и экспериментально подтвердить оптимальные условия предварительного (скринингового) обнаружения АССОХ методом электрофореза на бумаге.

2.Разработать условия идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методом капиллярного электрофореза.

3. Изучить