Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Разработка биосовместимого композиционного матриксного гидрогеля для реконструктивной терапии травм центральной нервной системы

005058283

На правах рукописи

Щеблыкина Анна Владимировна

РАЗРАБОТКА БИОСОВМЕСТИМОГО КОМПОЗИЦИОННОГО МАТРИКСНОГО ГИДРОГЕЛЯ ДЛЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ТЕРАПИИ ТРАВМ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

14.03.06-фармакология, клиническая фармакология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 £ 2013

Владивосток - 2013

005058283

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук и в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет».

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Хотимченко Юрий Степанович

кандидат биологических наук Кумейко Вадим Владимирович

Официальные оппоненты:

Ломакин Алексей Викторович, д.м.н., профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет», Школа биомедицины, профессор кафедры фундаментальной медицины

Кропотов Александр Валентинович, д.м.н., профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры общей и клинической фармакологии

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита состоится «29» мая 2013 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.03 при ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России по адресу 690002, Владивосток, проспект Острякова, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, 2.

Автореферат разоаш > апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного сов

Просекова Елена Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Травматические повреждения центральной нервной системы являются причиной значительных изменений в качестве жизни человека. Исследование эпидемиологии травмы спинного мозга в период с 1995 по 2006 гг. выявило от 10 до 83 случаев на 1 млн. жителей в мире (Wyndaele, 2006), в России ее ежегодно получают более 8 тыс. человек (Леонтьев, 2003). За последние годы появилось много экспериментальных работ, посвященных разработке методов восстановительной терапии тяжелых повреждений спинного мозга с помощью средств клеточной терапии (Ogawa et al., 2002; Lima et al., 2010; Salewski et al., 2010; Park et al., 2011). При имплантации любого типа клеток в область дефекта спинного мозга происходит их массовая гибель из-за крайне агрессивной среды, в которую они попадают. Для того чтобы добиться успеха при имплантационных процедурах клетки необходимо имплантировать вместе с внеклеточным матриксом, который может выполнять несколько функций: физически восстанавливать целостность мозга, создавать благоприятную среду для имплантированных клеток, стимулировать их адгезию и миграцию, повышать регенераторный потенциал собственных клеток в очаге повреждения, обеспечивать регуляцию пролиферации и диффереицировки клеток, служить системой адресной доставки лекарств (Sykova et al., 2006; Фомина, 2007; Брюховецкнй, 2010; Хотимченко и др., 2012).

В качестве имплантируемого матрикса исследуют как природные полимеры -гиалуроновую кислоту (Wei et al., 2010), коллаген (Брюховецкнй, 2008), так и синтетические материалы - полиакриловую кислоту (Woerly et al., 2004), полимолочную кислоту (Baumann et al., 2010), полиэтиленгликоль (Luo, Shi, 2007). В экспериментах по реконструкции спинного мозга матрикс имплантируют самостоятельно или используют как основу для тканеинженерной конструкции. Несмотря на большое число экспериментальных исследований, оптимальные матриксные материалы для регенерации спинного и головного мозга не разработаны. Исследования направлены на поиск таких материалов, которые будут способны поддерживать рост регенерирующих аксонов, дифференцировку имплантированных клеток, препятствовать избыточному развитию глиалыюго рубца и при этом сохраняться в области имплантации длительный срок, достаточный для восстановления собственных тканей реципиента. Такими материалами, по нашему мнению, могут стать композиционные материалы на основе

стандартизованных препаратов модифицированных растительных полисахаридов и некоторых белков животного происхождения.

Цель работы: разработка фармакологически активных имплантируемых биосовместимых матриксных гидрогелей для реконструктивной терапии травм центральной нервной системы.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать препараты биополимеров внеклеточного матрикса.

2. Провести первичную оценку свойств препаратов биополимеров на культурах ней-ральных стволовых клеток эмбрионального мозга крыс.

3. Апробировать получение микроструктурированных матриксных материалов.

4. Разработать состав и схему приготовления имплантируемого композиционного матриксного гидрогеля.

5. Провести оценку биосовместимости композиционного матриксного гидрогеля.

6. Оцешггь возможность использования разработанного композиционного матрикса на модели острой спиналыюй травмы крыс в качестве консолидирующего нейрорепа-ративного геля, имплантируемого при реконструкции мозга в области травматического повреждения.

Положения, выносимые на защиту

1. Препараты модифицированных пектинов являются перспективным биоиску сст-

венным внеклеточным матриксом, который подавляет спонтанную дифференци-ровку нейральных стволовых клеток в культуре, сохраняя клетки, способные к дальнейшему росту и дифференцировке, что представляет интерес для биомедицинских клеточных технологий.

2. Композиционный гидрогель на основе препаратов модифицированного пектина,

коллагена I типа, ЬО-гексамеров коллагена IV типа является биосовместимым матриксным материалом, перспективным для применения в качестве консолидирующего нейрорепаративного геля в реконструктивной терапии травм центральной нервной системы. Научная новизна. В работе продемонстрирована возможность применения препаратов модифицированных пектинов в качестве компонентов матриксных материалов, поддерживающих жизнеспособность нервных клеток, и в сочетании с другими компонентами способствующих восстановлению нервных проводников при им-

плантации в область острой травмы спинного мозга. Для создания имплантируемых композиционных матриксных гидрогелей впервые использованы препараты NC1-гексамеров коллагена IV типа птиц, для которых продемонстрирована предпочтительная адгезия и направленный рост культивируемых нейральных стволовых клеток эмбрионального мозга крыс. Разработаны оригинальные имплантируемые композиционные матриксные гидрогели, являющиеся биосовместимыми и биодеградируемы-ми.

Теоретическая п практическая значимость. Результаты, полученные в работе, способствуют более глубокому пониманию процессов взаимодействия клеток и внеклеточного матрикса, расширяют представления о спектре фармакологических свойств растительных полисахаридов и связи структуры и физико-химических свойств пектинов с их фармакологической активностью. Практическая ценность работы заключается в разработке состава и способа приготовления матриксных гидрогелей, перспективных для применения в регенеративной медицине. Разработан лабораторный регламент получения композиционного матриксного гидрогеля. Разработанные материалы прошли первичные доклинические испытания, показавшие их безопасность и эффективность, и могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения в качестве средств регенеративной медицины.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010 г.), Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва 2011 г.), Школе-конференции для молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины» (Санкт-Петербург 2011 года), годичных научных конференциях ИБМ ДВО РАН (2009-2011 гг.).

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Из mix - 7 в репетируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК, 4 публикации га которых являются полнотекстовыми статьями.

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии в выполнении всех экспериментальных работ, обработке и анализе результатов исследований.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 130 страницах печатного текста, иллюстрировала 29 рисунками, содержит 5 таблиц. Список литературы вкшочает 228 источников.

Благодарности. Автор благодарит сотрудников ИБМ ДВО РАН: Ковалева Валерия Владимировича за помощь в освоении методов выделения, модификации и характеристики полисахаридов; Дюйзен Инессу Валерьевну за помощь в освоении методов работы с лабораторными животными и постановке модели экспериментальной травмы спинного мозга. Работа выполнена при финансовой поддержке государственных контрактов с Минобрнауки Российской Федерации №02.740.11.0292, №02.740.11.0450, №16.512.11.2178.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и очистка биополимеров. Модифицированные пектины получали из высокоэтерифицированного цитрусового пектина со степенью этерификащш 60,2% методом щелочной деэтерификации (Ковалев, 2004). Степень этерификации и содержание ангидрогалактуроновой кислоты определяли титриметрическим методом (Afanasyev et al., 1984).

Коллаген I выделяли in сухожилий хвостов крыс экстракцией 0,03М раствором уксусной кислоты и селективным осаждением хлоридом натрия до концентрации 3% (Price, 1975).

NCl-гексамеры коллагена IV выделяли из куриных мускульных желудков (Perris et al., 1993). Серией циклов гомогенизации и центрифугирования отделяли клеточное содержимое. Обрабатывали полученный внеклеточный матрикс буфером, содержащим 0,01М ЭДТА. Экстрагировали примесные белки в 0,5М уксусной кислоте в течение 3 дней. Осадок нейтрализовали и проводили ограниченный ферментативный гидролиз трипсином в течение 4 ч. Надосадочную жидкость, содержащую гидроли-зат, подвергали селективному осаждению хлоридом натрия до концентрации 1,7М. Полученный осадок растворяли в буфере с 2М мочевиной, диализовали против того же буфера. Препарат коллагена IV очищали при помощи ионообменной хроматографии на носителе DEAE Sepharose. Собирали проточную фракцию.

Препараты белков и промежуточные продукты анализировали методом денатурирующего электрофореза в присутствие додецилсульфата натрия по Лэммли (Laem-mli, 1970) в 6% полиакриламидном геле (ПААГ) для коллагена I и 7,5% ПААГ для

коллагена IV. Концентрации белков определяли, исследуя оптическую плотность растворов при 280 нм, а также мпкробиуретовым методом (Ytzhaki, Gill, 1964).

Маркирование NCl-гексамеров коллагена IV типа флуоресцеш1а-5-нзотноцианатом (ФИТЦ). К раствору белка добавляли раствор ФИТЦ в молярном соотношении равном 1:20 при pH 9,3. Смесь инкубировали 1 час при комнатной температуре на шейкере. Отделяли конъюгат от несвязавшегося красителя при помощи гель-фильтрации на Sephadex G-25. Определяли оптическую плотность при длинах волн 280 и 493 им. Объединяли фракции, содержащие конъюгат белка и красителя.

Исследование морфологии молекул биополимеров. Препараты коллагена I и NCl-гексамеров коллагена IV наносили на слюдяные подложки, инкубировали во влажной камере 30 мин. и удаляли неадгезированный материал с одновременной сушкой в потоке очищенного сжатого воздуха. Образцы анализировали с помощью атомно-силового микроскопа BioScope Catalyst (Bruker).

Культнвпроваппе пенральных стволовых клеток. Нейральные стволовые клетки получали из эмбрионального мозга крыс линии Wistar. Использовали вентральные области среднего мозга, обонятельные доли и гиппокамп 15-дневных эмбрионов. Клетки дезагрегировали с помощью пипетки Пастера, осаждали при 100g, 10 мин. Далее клетки обрабатывали раствором трипсина и ЭДТА на фосфатно-солевом буферном растворе. Действие трипсина иигибировапи добавлением среды с феталыгой сывороткой. Материал пипетировали и осаждали при 100g, 10 мин. Осадок ресуспендировали в среде с добавлением 12% феталыюй сыворотки коров. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью окраски трипановым синим. Альтернативно, те же отделы эмбрионального мозга крыс дезагрегировали с помощью пипетки Пастера, оставляли в покое на 1 мин. для седиментации крупных фрагментов, суспен-зшпо переносили в новую пробирку и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в среде Neurobasal (Invitrogen) с добавкой В-27 без витамина А, 10 иг/мл EGF, 20 иг/мл bFGF. Суспензию клеток высевали в полистирольные флаконы плотностью 2x105 клеток в 1 см3 среды. Клетки выращивали в среде ДМЕМ с добавлением 12% феталь-ной сыворотки коров или в среде Neurobasal с вышеуказанными добавками при 37°С, 5% С02. Пересев осуществляли каждые 7 дней, для этого собирали и дезагрегировали нейросферы, не затрагивая адгезированный и одиночный клеточный материал.

Культивирование клеток на матрицах. Матрицы изготавливали на основе покровных оптических стекол. Стекла обрабатывали предварительно в горячей соляной кислоте, а для адсорбции белков в ряде случаев дополнительно покрывали три-этоксивинилсиланом. После отмывок, сушки и стерилизации стекла инкубировали 1 час в 1% растворах пектинов и 0,01% растворах белков. Высушивали стекла и раскладывали в лунки планшетов. Перед использованием матрицы инкубировали в двух порциях солевого буферного раствора Хэнкса, для формирования гелей на основе пектинов в первую порцию раствора предварительно вводили 3-10 мМ СаС12. Микро-струкгурированные матрицы изготавливали на оригинальной инжекторной установке.

После трех недель культивирования нейральные стволовые клетки пересаживали на матрицы в лунках 24-луночных планшетов нз расчета 22 тыс. клеток на лунку. В качестве контроля использовали культивирование на полистирольный пластике и покровных стеклах. Клетки культивировали до 30 суток. Препараты анализировали на инвертированных микроскопах Axio Observer и LSM 510 Meta (Carl Zeiss).

Приготовление матрнксных материалов. Матриксные материалы в форме гидрогелей готовили по схеме, разработанной в данной работе (см. главу Результаты). Использовали полученные препараты биополимеров: модифицированный пектин (МПК-30), препарат коллагена I, препарат NCl-гексамеров коллагена IV. Маточный раствор инициатора гелеобразования для композиционного геля содержал 20мМ NaOH, 450мМ HEPES, 85мМ СаС12, 2,1М NaCl. Инициатор гелеобразования для углеводного геля содержал ЮОмМ HEPES, 12мМ СаС12, ЗООмМ NaCl.

Подкожная имплантация матрнксных материалов. В эксперимеоте использовали 36 белых крыс-самок линии Wistar массой 250-300г. Животных вводили в наркоз внутримышечным введением смеси золетила (2 мг/кг) и ксилазина (4 мг/кг). На спине выбривали операционное поле и обрабатывали антисептиком. Тупым рассечением делали подкожные карманы и в каждый карман помещали по одному импланта-ту (4 образца одного типа одному животному). Кожу ушивали шелком. В течение трех дней после операции проводили курс антибактериальной терапии (цефтриаксон 40 мгк/г). Животных выводили из эксперимента глубоким эфирным наркозом. Извлекали имплантаты, фиксировали в 4% параформальдегиде, в течение суток.

Имплантация гидрогелей в модели острой травмы .......юго мозга. В эксперименте использовали крыс-самок линии Wistar массой 250-300г. Модель острой

травмы спинного мозга создавали путем удаления фрагмента спгапюго мозга длинной 2 мм на уровне Т12 - LI (Woerly et al., 2001). Анестезию осуществляли ингаляцией этилового эфира. Выбривали операционное поле, обрабатывали антисептиком. Кожу рассекали продольно над позвоночником от Т9 до L3. Проводили ламинэктомто на уровне 12 грудного позвонка, открывая прямой доступ к спинному мозгу. Отсекали фрагмент спинного мозга. Кровотечение останавливали гемостатической коллагено-вой губкой ("БЕЛКОЗИН"). В группе «Контроль» дефект спинного мозга заполняли гемостатической губкой. В группе «Углеводный гель» дефект заполняли углеводным гидрогелем (15мг/мл МПК-30), в группе «Композиционный гель» - композиционным гидрогелем (15мг/мл МПК-30, 0,5мг/мл коллагена I, 0,05мг/мл коллагена IV). Им-плантат изолировали коллагеновой мембраной. Рану послойно ушивали. В течение трех дней после операции проводили курс антибактериальной терапии (цефтриаксон 40 мгк/г). Осмотр животных проводили ежедневно в течение 3 месяцев. Мочу спускали дважды в день. Животных выводили из эксперимента глубоким эфирным наркозом. Фрагмент позвоночного столба, включающий область травмы спинного мозга, фиксировали в 4% параформальдегиде в течение суток. Декальцинацию образцов проводили 6% раствором трихлоруксусной кислоты в течение 6 ч.

Анализ двигательной активности крыс проводили с использованием патен-товатпгой шкалы «ВВВ» (Basso et al., 1995), включающей набор ib 21 критерия качественной и количествешюй оценки движений в задних конечностях животных.

Гистологическому анализу были подвергнуты подкожные имплантаты и образцы спинного мозга крыс. Образцы заливали в парафин по стандартной методике. Изготавливали поперечные срезы толщиной 5 мкм для подкожных имплантатов и сагиттальные срезы толщиной 15 мкм для спинного мозга. Окрашивали гематоксилином и эозином для выявлеш<я общего строения. В препаратах спинного мозга выявляли нейрональные структуры (антитела против ß-III-тубулина) и астроциты (антитела против глиалыюго фибриллярного кислого белка, GFAP). Ядра клеток окрашивали DAPI. Препараты анализировали при помощи эпнфлуоресцентного микроскопа Leica 4500 (Leica) и лазерного конфокального микроскопа LSM Meta 510 (Carl Zeiss).

Исследования на животных проведены в соответствие с «Правилами надлежащей лабораторной практики» и одобрены локальным этическим комитетом при ИБМ ДВО РАН (протокол №5 от 10.09.2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ Выделение, очистка и модификация компонентов композиционных мат-риксных материалов. Методом щелочной деэтерификащш было получено 3 образца пектинов со степенью ¡тарификации, 1,2 %, 27,4% и 52,0% (табл. 1). Полученным образцам были присвоены условные обозначения МПК-0, МПК-30 и МПК-50.

Таблица 1

Характеристика препаратов модифицированных пектинов_

Наименование показателя Образцы

МПК-0 МПК-30 МПК-50

Степень ¡тарификации, % 1Д 27,4 52,0

Содержание ангидрогалактуроновой кислоты, % 73,7 67,8 72,0

Содержите свободной (неэтерифицированной) ангидрогалактуроновой кислоты, % 72,8 49,2 34,6

Характеристическая вязкость, мл/г ангидрогалактуроновой кислоты 408 452 570

Получен препарат коллагена I из сухожилий хвостов крыс. По данным электрофореза препарат содержал мономеры коллагена I типа - полипептиды с молекулярными массами 115, 130, соответствующие al, а2-цепям коллагена I типа, а также димеры и небольшое количество олигомеров. Чистота препарата составила 98%. Концентрация белка в препарате - 1,8 мг/мл. При помощи атомно-силовой микроскопии установлена морфолопи молекул коллагена I, которые представляют собой тяжи длиной 250-280 нм и толщиной 6 нм.

Получен препарат NCl-гексамеров коллагена IV из мышечных желудков цыплят. По данным атомно-силовой микроскопии препарат выявлялся в виде отдельных нитей толщиной 9 нм различной длины, связанных между собой попарно глобулярными доменами (NCl-гексамеры). По данным электрофореза препарат коллагена IV обогащенный NCl-гексамерами коллагена IV включал мономерные формы (103, 115 и 135 кДа) и более высокомолекулярные полипептиды - олигомерные формы. Концентрация белка в препарате составила 1,6 мг/мл. Всего за один прием было получено 80 мг коллагена IV. Выход белка составил 0,8%.

Свойства искусственного внеклеточного матрикса in vitro. Из трех отделов головного мозга эмбрионов крыс, изолированных на 15 сут. беременности, были получены культуры нейральных стволовых клеток. Полученные культуры активно про-лиферировали в среде с добавлением 12% эмбриональной сыворотки или в присутствии ростовых факторов и образовывали многочисленные нейросферы. Клетки были

способны к спонтанной дифференцпровке в условиях 2% сыворотки и к тщуциро-ванной адгезии и дифференцпровке на субстратах, покрытых препаратом коллагена IV.

Анализ поведен™ клеток на субстратах, представляющих собой модифицированные пектины МПК-0, МПК-30 и МПК-50, показал способность материалов инги-бировать дифференцировку нейральных стволовых клеток. Все исследуемые культуры на матриксе МПК-0 представляли собой поля разрозненных слабо адгезировашплх клеток сферической формы, которые в отдельных случаях образовывали небольшие ассоциации го 5-15 клеток (рис. 1А). Признаки начала дифференцировки - плотная адгезия, образование отростков - не наблюдались. Культуры нейральных стволовых клеток проявляли несколько иные свойства на матриксе МПК-30. Особенной чертой таких культур являлось формирование сфероидных ассоциаций клеток (рис. 1Б), схожих с ненросферами по размерам. Некоторым их отличием являлось формирование гладких границ наблюдаемых тел, а клетки в их составе проявляли более выраженные, чем в нейросферах, контактные взаимодействия, что в целом демонстрировало внешнее сходство данных образований с эмбриоидными телами, наблюдаемыми в культурах эмбриональных стволовых клеток. В составе таких культур мы также не обнаружили признаков дифференцировки клеток на протяжении эксперимента. На субстрате МПК-50 клетки формировали конгломераты, для которых была отмечена более разобщенная структура с менее выраженными контактами «клетка-клетка». Часть клеток россыпью располагалась по периферии конгломератов, значительная доля клеток в культурах была спорадически распределена между конгломератами (рис. 1В). Среди свободно рассеянных элементов встречались веретеновидные и от-ростчатые клетки, их доля не превышала 1-2%.

Была проведена серия экспериментов, посвящетгах рекультивированию нейральных стволовых клеток, в ходе которых клетки были сняты с полисахаридных субстратов МПК и подвергнуты рекультивированию на матриксе, содержащем препарат ЫО-гексамеров коллагена-1У. В ходе рекультивирования происходила активная адгезия клеток, формирование отростков. Через трое суток клеточные культуры содержали значительное количество многоотростчатых клеток (рис. 1Г).

Рис. 1. Результат культивирования нейральных стволовых клеток крыс на матриксах МПК-0 (А), МПК-30 (Б) и МПК-50 (В). Формирование отростчатых клеток на третьи сутки рекультивирования на коллагене IV после МПК-30 (Г). Масштабный отрезок 50 мкм. Изображение получено методом фазового контраста.

Таким образом, все три типа исследуемых полисахаридных матриксных материалов подавляют дифференцировку клеток обратимым способом. Тем не менее, существуют и некоторые отличия в поведении клеток на данных субстратах. Культуры

на МПК-0 характеризуются сниженной жизнеспособностью по сравнению с таковой на МПК-30 и МПК-50 (рис. 2).

Рис. 2. Жизнеспособность нейральных стволовых клеток через 7 суток культивирования на модифицированных пектинах. Указано среднее значение и стандартное отклонение. * - р □ 0,02.

Ингибированис дифференциров-ки было отмечено при культивировании клеток на поверхности других растительных полисахаридов, альгинатов (Novikova, 2006) и агарозы (Lin et al., 2005).

На основании проведенных экспериментов из трех типов матриксов для дальнейших исследований мы выбрали препарат модифицированного пектина МПК-30 как субстрат, который способствует оптимальному выживанию клеток, не препятствует формированию нейросфер и способен образовывать гидрогели при физиологичной концентрации неорганических ионов.

Изготовление н тестирование микроструктурнрованного матрнкса. В качестве графического образа, по шаблону которого мы осуществляли печать микроструктурированных матриц, были полосы препарата коллагена IV, который был мар-

кирован флуоресцентным красителем ФИТЦ. Было апробировано распыление полос в виде пятен и прецизионное нанесение точечного рисунка (размеры отдельных точек составляли 1-7 мкм) на поверхность оптического стекла. После посева нейральных стволовых клеток на матрицы наблюдалась активная адгезия и дифференцировка клеток. Клетки располагались вдоль треков коллагена IV уже на 2 сут. культивирован™, первоначально в виде отдельных адгезированиых клеток и небольших нейросфер. На 5-7 сутки большая часть клеточных отростков располагалась вдоль треков морфогена. Другой тип матриц включал основу в виде модифицированных пектинов МПК-0, МПК-30 и МПК-50, поверх которых был нанесен препарат коллагена IV. На данных матрицах мы не обнаружили признаков дифференцировки клеток, однако конгломераты недифференцированных клеток располагались вдоль треков коллагена IV.

Целью разработки метода инжекторного нанесения является создание структурированного матрикса для регенерации нервных путей. Имплантат должен не только создавать оптимальную среду для роста аксонов, но и предотвращать их избыточное ветвление - спраутинг (Stokols, 2006; Yoshii et al., 2009). Наш подход в структурировании предполагает печать паттерна на гелевую подложку, нанесение клеточной культуры на матрицу и организацию полученной матрицы в трехмерный имплантат.

Микроструктурированные матрицы могут использоваться как самостоятельный инструмент в исследованиях. Результаты культивирования нейральных стволовых клеток на микроструктурированных матрицах, в которых коллаген IV был в виде полос нанесен на подложку из коллагена I доказывают, что препарат коллагена IV специфически стимулирует адгезию нейральных стволовых клеток, так как клетки предпочитают именно этот субстрат даже по сравнению с коллагеном I (рис. 3).

Рис. 3. Комбинированное изображение микроструктурированной матрицы (зеленые точки - прецизионное нанесение препарата NCl-гексамеров коллагена IV, меченного флуоресцеина изотиоцианатом) и культивируемых на ней клеток, располагающихся вдоль треков

Получение и тестирование композитных гидрогелей in vitro. Основой им-плантатов для реконструктивной терапии травм ЦНС должны являться гидрогели -

материалы, максимально имитирующие высокогидратированный естественный внеклеточный матрикс животных. Применяя полученные ранее компоненты, мы разработали схему приготовления композитного матриксного материала.

В качестве основного гелеобразующего компонента использовали модифицированный пектин МПК-30, формирующий гели в присутствие физиологичной концентрации ионов кальция (6 мМ, по результатам собственного исследования). Препарат коллагена I был использован в качестве фибриллярного компонента, который также способен к гелеобразованию и придает матриксу адгезионные свойства. Коллаген IV использовали в качестве индукторного компонента.

Композиционный матрикс готовили согласно схеме, разработанной в данном исследовании (рис. 4). Были получены образцы композиционного гидрогеля, содержащего 15 мг/мл МПК-30, 0,5мг/мл коллагена I, 0,05мг/мл коллагена IV. Также был приготовлен углеводный гель, содержащий 15мг/мл МПК-30, 6мМ СаС12, 150мМ

№С1.

Рис. 4. Схема получения «композиционного геля» из основного углеводного компонента, фибриллярного и индукторного белковых компонентов.

инициатор1 + Инициатор II

Фибриллярный Индукторный Инициатор компонент компонент

0°С

Коллоидный раствор

Основной компонент

Коипозиционныи гидрогель

25°С

Гидрогель I

I 37°С

Гидрогель II

При культивировании на поверхности матриксных материалов в гелевой форме нейральные стволовые клетки формировали конгломераты различной морфологии. В контрольной культуре наблюдали нейросфе-ры типичной формы и отдельные клетки униполярной, биполярной и триангулярной формы с короткими отростками (рис. 5А). На поверхности углеводного гидрогеля (рис. 5Б) было отмечено формирование плотных нейросфер с редким высеванием клеток по периферии и отсутствие отростчатых клеток. На поверхности композиционного гидрогеля происходило формирование длинных отростков нервных клеток, простирающихся на значительные расстояния от границ нейросфер (рис. 5В). Способность внеклеточного матрикса, предназначенного для регенерации нервной системы, поддерживать формирование и рост отростков нервных клеток является наиболее показательной и рассматривается как признак эффективности материала.

■НЯИВБММ

, <- ,4 '' г. *.- Ёл, 4 mí wM

•1: • • & м h \ ч. 4i 5 .

• ,-V f * г ф,

А — Б — в _

Рис. 5. Нейросферы на поверхности полистирола (А), углеводного гидрогеля (Б), композиционного гидрогеля (В). Масштабный отрезок - 50 мкм. Изображение получено методом фазового контраста.

Исследование биосовместимости бнонолимсриых матрнксов in vivo. При подкожной имплантации углеводного и композиционного гидрогелей крысам на период до 3 месяцев не было отмечено ухудшения состояния животных, макроскопических признаков воспаления - покраснения, отека.

Гистологический анализ также не выявил признаков острой воспалительной реакции или отторжения. Через 10 дней после имплантации выявлялись единичные лимфоциты, нейтрофилы не выявлялись. Вокруг имплантатов сформировалась рыхлая фиброзная капсула толщиной 99±18 мкм для углеводного геля и 104±10 мкм для композиционного геля. Капсула уменьшалась со временем и через 3 месяца после имплантации составляла 47±22 мкм в толщину для композиционного геля и не выявлялась в области имплантации углеводного геля.

Имплантированные гидрогели являлись биодеградируемыми. Углеводный гель деградировал в значительной степени уже через 10 дней после имплантации, когда выявлялись фрагменты недеградировавшего матрикса, окруженные новой тканью (рис. 6А). Через 1 месяц мы наблюдали преобразование ткани, сформированной фиб-робластами в области имплантации. Ткань приобретала сетчатый вид, «ячейки» этой сетки местами сливались в более крупные низкохромаффинные структуры (рис. 6Б). Через 3 месяца ремоделированная зона имплантации уменьшилась в размере, при этом сохраняла ту же морфологию, что и через 1 месяц после имплантации (рис. 6В).

Композиционный гидрогель деградировал в меньшей степени (рис. 6Г). Через 10 дней в области имплантации выявлялась центральная часть имплантата, не заселенная клетками, и периферическая, где происходила инфильтрация имплантата фиб-робластами. Наблюдалась васкуляризация не только соединительной ткани, окру-

жавшей имплантат, но и самого матрикса. Через 1 месяц после имплантации количество клеток увеличилось, они равномерно заселили матрикс (рис. 6Д). Композиционный матрикс медленно деградировал, через 3 месяца его количество в области имплантации сократилось, но все еще оставалось существенным (рис. 6Е).

Рис 6 Строение углеводного (А, Б, Б) и композиционного (Г, Д, Е) гидрогелей через 10 дней (А, Г), 1 месяц (Б, Д), 3 месяца (В, Е) после подкожной имплантации. Окраска гематоксилином и эозином. Масштабный отрезок 200 мкм.

Г - гидрогель, ФК - фиброзная капсула.

Реконструкция спиппого мозга при помощи композиционного матрикспо-го гидрогеля на модели острой травмы спинного мозга крыс. В таблице 2 и на рисунках 7 и 8 представлены данные о признаках патологии и ремиссии у экспериментальных животных. Восстановление двигательной активности в задних конечностях крыс произошло в группах «Контроль» и «Композиционный гель». В группе «Углеводный гель» у животных наблюдали лишь слабые движения в тазобедренных суставах (1-2 балла по шкале «ВВВ»), При этом отличительной чертой данной группы было полное отсутствие явлений аутотомии и гипертонуса.

В контрольной группе восстановление двигательной активности произошло почти у половины животных и в среднем составило 4,3 балла по шкале «ВВВ», что соответствовало движениям во всех трех суставах без способности удерживать вес задними конечностями. В целом этот показатель был ниже, чем в группе «Композиционный гель», в которой восстановление двигательной активности произошло у 90% животных (рис 7). Через три месяца после операции в группе «Композиционный гель» наблюдали крыс, способных к самостоятельному передвижению с использованием обеих задних конечностей и периодической координацией их с передними. В целом восстановление двигательной активности задних конечностей крыс в группе «Композиционный гель» варьировало от 5 до 15 баллов по шкале «ВВВ» через три месяца после имплантации. Максимальное восстановление двигательной активности животных в 15 баллов соответствовало стабильной подошвенной ходьбе и координации между передними и задними конечностями.

Таблица 2

Анализ признаков патологии и ремиссии у животных разных групп

«Контроль» «Углеводный гель» «Композиционный гель»

Количество прооперированных животных 17 7 19

Аутотомия 71% 0% 28,5%

Гипертонус 42,8% 0% 50%

Данные, полученные нами, согласуются с литературными источниками. Имплантация других углеводов в область дефекта спинного мозга - гиалуроновой кислоты (Нош et al., 2007), альгината (Novikov, 2002) также не приводила к восстановлению двигательных функций у экспериментальных животных. Именно поэтому разрабатывают гели на основе углеводов, но модифицированные добавлением белков внеклеточного матрикса: коллагена (Prang et al., 2006), ламинина (Dhoot et al., 2004), фибронектина (Mosahebi et al., 2003), а также специфических аминокислотных сигнальных последовательностей (Park et al., 2009; Sondermeijer et al., 2009).

В нашем исследовании, также как и в исследованиях других авторов, в которых восстановление двигательной активности животных было зарегистрировано, восстановление начиналось уже на первой неделе, далее на второй неделе был небольшой скачок почти до половины уровня конечного восстановления и затем достигало плато примерно на 8-12 неделе (Woerly et al., 2001; Rochkind et al., 2006; Li et al., 2009; Joo et al., 2012).

I 40 к

о 20 Ч

0

I восстановление движения I параплегия

СП

т ш

/

Рис. 7. Двигательная активность экс периментальных животных.

Рис. 8. Динамика восстановления двигательных функций крыс. На графике обозначены средние значения ± стандартная ошибка средней, * - р<0,05

Гистологический анализ спинного мозга крыс. Через 10 дней после сегмен-тэктомии в группе «Контроль» в области травмы спинного мозга мы наблюдали экспериментально созданную полость, заполненную коллагеновой губкой. Внутри губки в некоторых местах наблюдали скопления эритроцитов и лимфоцитов. Не произошло массивной инфильтрации имплантата клетками реципиента. Губка заполняла дефект, но не соединяла культи между собой. Строение спинного мозга на сроке 3 месяца после операции было неодинаковым для всех животных в группе «Контроль». Одним из вариантов стало формирование в области травмы посттравматической капсулы, которая препятствовала регенерации нервных волокон (рис. 9). Единичные нервные волокна прорастали по периферии, огибая капсулу (рис. 9Б). В других случаях у животных наблюдали формирование слишком плотного соединительно-тканного рубца, непреодолимого для аксонов. Плотность астроцитов на границе спинного мозга и рубца была повышена, что соответствует представлениям о формировании глиального ограничительного барьера.

В группе «Композиционный гель» уже в раннем послеоперационном периоде (10 дней после сегментэктомии) была восстановлена физическая целостность спинного мозга. Часть рубца, прилежащая к ростральному участку мозга, была представлена рыхлым соединительнотканным рубцом. Центральную область рубца заполняли многочисленные фрагменты геля, разобщенные тяжами ткани, в которых в том числе выявлялись новые сосуды. При иммуноцитохимическом маркировании нейрональных

18

Т-1-1-1-1-Г-

« "ч "V "Ь к « 4 А ^ ^ недели после операции

композиционный гель -т- контроль -*- углеводный гель

структур интенсивно окрашивались ростральная и каудальная части мозга. В области рубца выявлялись единичные нервные волокна. В сером веществе спинного мозга в областях, прилежащих к области травмы, наблюдалась гибель нейронов, особенно выраженная в каудальной части. В группе «Композиционный гель», несмотря на деструктивные процессы, серое вещество в каудальной части находилось в более сохранной форме, чем в группе «Контроль».

Через 3 месяца после операции в группе «Композиционный гель» выявили консолидацию рострального и каудального фрагментов спинного мозга экспериментальных животных (рис. 10А). В области травмы все еще выявлялись многочисленные фрагменты геля, разделенные тяжами ткани, в которых методом иммуногистохимии обнаруживались нейрональные структуры (рис. 10Б). Отростки нейронов проникали непосредственно в гель, что подтверждает, что этот матрикс поддерживает аксональ-ный рост (рис. 10В, Г). В области рубца были видны многочисленные макрофаги, что свидетельствует о продолжающемся процессе биодеградации имплантата (рис. 10 Д). У некоторых животных в области травмы выявлялось даже больше сохранившего матриксного материала, чем на более ранних сроках после операции. Вероятно, скорость деградации материала достаточно сильно варьирует в зависимости от индивидуальных особенностей организма. Основываясь на данных о двигательной активности животных, можно предположить, что сохранение матрикса в течение продолжительного периода способствует восстановлению проводящих путей мозга.

Рис. 9. Гистологическое строение спинного мозга крыс из группы «Контроль» через 3 месяца после операции.

А - формирование постгравматической капсулы в области травмы, окраска гематоксилином и эозином; Б, В - область, обозначенная прямоугольником на рис.А; Б - им-муногистохимическое выявление ß-III-тубулина (вторичные антитела, коныогиро-ванные с Alexa 546); В - окраска ядер DAPI. HB - нервные волокна, CK - стенка капсулы.

Изображения получены методом светлого поля (А), эпифлуоресцентной микроскопии (Б, В) при помощи микроскопа Leica 4500 (Leica).

I

20

Рис. 10. Гистологическое строение спинного мозга крыс из экспериментальной группы «Композиционный гель» через 3 месяца после операции. Окраска гематоксилином и эозином (А, Д); иммуногистохимическое выявление ß-Ш-тубулина, вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 546 (Б, В, Г).

А - общий вид; Б - область рубца и каудальный отдел; В, Г - область рубца, стрелками указаны отростки нервных клеток, прорастающие в гель; Д - макрофаги в области рубца. M - макрофаги; НС - нейрональиые структуры.

Изображения получены методом светлого поля (А, Д), эпифлуоресцентной микроскопии Leica 4500 (Б, Г) и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии LSM 510 (Carl Zeiss) (В - слитое изображение, полученное в проходящем и отраженном свете).

выводы

1. Получены и охарактеризованы препараты биополимеров, пригодные для создания имплантируемых композиционных матриксных гидрогелей. NCl-гексамеры коллагена IV цыпленка, коллаген I и модифицированные пектины впервые использованы совместно для изготовления биосовместимых композиционных матриксных препаратов медицинского назначения.

2. Препараты модифицированных пектинов со степенью этерификации 1,2%, 27,4% и 52,0%, использованные в качестве однокомпонентного матрикса для культивирования клеток, подавляют спонтанную дифференцировку нейральных стволовых клеток, сохраняя культуры, способные к дальнейшему росту и дифференцировке на субстрате NC1 -гексамеров коллагена IV.

3. С помощью микроинжекторной установки получены лабораторные образцы микроструктурированных матриксных материалов на основе препаратов коллагена I, NC1-гексамеров коллагена IV и модифицированного пектина со степенью этерификации 27,4%. Нейральные клетки эмбрионального мозга крыс при культивировании на микроструктурированных матрицах локализуются вдоль треков NC1-гексамеров коллагена IV типа цыпленка, предпочитая его в качестве субстрата.

4. Разработан лабораторный регламент получения имплантируемого композиционного матрикса в форме гидрогеля, предназначенного в качестве консолидирующего субстрата для реконструктивной терапии травм мозга, на основе препаратов коллагена I, NC1 гексамеров коллагена IV и модифицированного пектина со степенью этерификации 27,4%.

5. Установлена биосовместимость композиционного матрикса in vitro при культивировании нейральных клеток и in vivo при подкожной имплантации крысам:

6. Имплантация композиционного матриксного материала в область повреждения на модели острой травмы спинного мозга крыс способствует восстановлению двигательной активности животных в среднем до 8,5±3,3 баллов по шкале оценки локомоторной активности «ВВВ».

7. Консолидирующий матрикс сохраняется в области травматического повреждения не менее 3 месяцев после экспериментальной травмы, препятствует развитшо посттравматической капсулы и способствует регенерации проводящих элементов спинного мозга.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации:

1. Кумейко В.В., Анисимов А.П., Щеблыкина A.B., Астахова A.A., Згом-ченко Н.Е., Токмакова Н.П.,. Кирсанова И.А, Аннспмова A.A., Демиденко Е.В., Дюйзен И.В., Хотимченко Ю.С. Ингибирование дифферепцировкн неГфальпых стволовых клеток с помощью бнополнмерных матриксных материалов // Тихоокеанский медицинский журнал. 2010. №2. С. 68-74.

2. Кумейко В.В., Хотимченко Ю.С., Астахова A.A., Щеблыкина A.B., Зюмченко Н.Е., Токмакова Н.П.,. Кирсанова И.А, Анисимова A.A., Титов С.И., Демиденко Е.В., Борейко A.A., Дюйзен И.В., Анисимов А.П. Управление ростом н дифференцировкой ненральных стволовых клеток с помощью микроструктурированных ианогетерогенных матриксных материалов // Тихоокеанский медицинский журнал. 2010. №2. С. 74-79.

3. Щеблыкина A.B., Астахова A.A., Дюйзен И.В., Демиденко Е.В., Хотимченко Ю.С., Кумейко В.В. Разработка композитных наноструктурированных гидрогелей для реконструктивной терапии травм центральной нервной системы // Перспективные направления развития нанотехнологий в ДВО РАН. 2010. Т. 3. Владивосток: из-во «Дальнаука». С. 134-149.

4. Астахова A.A., Токмакова Н.П., Кирсанова И.А., Аннсимов А.П., Щеблыкина A.B., Зюмченко Н.Е., Мищенко П.В., Хотимченко Ю.С., Кумейко В.В. Олфактомедннсодержащий белок морских ежен Strogyfocentrotus nudus влияет на свойства ненральных стволовых клеток млекопитающих // Цитология. 2011. Т. 53, №9. С. 724-725.

5. Кумейко В В., Хотимченко Ю.С., Щеблыкина A.B., Борейко A.A., Астахова A.A., Зюмченко Н.Е., Токмакова Н.П., Анисимова A.A., Титов С.И., Демиденко Е.В., Кирсанова И.А., Дюйзен И.В., Анисимов А.П. Разработка микроструктурированных ианогетерогенных матриксных материалов, управляющих ростом и дифференцировкой нейральных ствловых клеток // Перспективные направления развития нанотехнологий в ДВО РАН. 2011. Т. 4. Владивосток: из-во «Дальнаука». С. 153-160.

6. Попкова П.А., Зюмченко U.E., А.В.Щсблыкнна, Токмакова Н.П., Кирсанова H.A., Хотимченко Ю.С., Анисимов А.П., Ковалев В.В., Колеченко Е.А., Кумейко В.В. Разработка препаратов низкомолекулярных пектинов как пер-

\ о

спектнвных антипролиферативных компонентов биополимерно-клеточных им-

плантатов // Цитология. 2011. Т. 53, №9. С. 744.

7. Щеблыкина A.B., ДюГпен И.В., Астахова A.A., Демиденко Е.В., Хотим-чеико Ю.С., Кумсйко В.В. Разработка биополимерных пмплантатов для терапии травм центральной первной системы //Цитология. 2011. Т. 53, № 9. С. 755.

8. Щеблыкина A.B., Дюйзен И.В., Астахова A.A., Демиденко Е.В., Хотимчен-ко Ю.С., Кумейко В.В. Имплантация гидрогелей на основе модифицированного поли-сахаридного комплекса как перспективный метод терапии острой спинальной травмы // Сборник трудов Всероссийской конференции «Регенеративная биология и медицина». -М.: Издательский дом «Нарконет», 2011. - С. 170.

9. Хотимченко Ю.С., Щеблыкина A.B., Кумейко В.В.. Бносовместимые матриксные имнлантаты па основе природных и синтетических полимеров как перспективные средства для терапии дегенеративных п постгравматических заболеваний центральной нервной системы // Тихоокеанский медицинский журнал. 2012. №2. С. 92-98.

10. Щеблыкина A.B., Мищенко П.В., Кумейко В.В.. Биосовместимые де-градируемые материалы на основе пектинов для тканевой инженерии: местная реакция тканей при подкожной имплантации // Тихоокеанский медицинский журнал. 2013. № 2. С. 13-17.

Щеблыкина Анна Владимировна

РАЗРАБОТКА БИОСОВМЕСТИМОГО КОМПОЗИЦИОННОГО МАТРИКСНОГО ГИДРОГЕЛЯ ДЛЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ТЕРАПИИ ТРАВМ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 23.04.2013г. Формат 60x84 1/16. Усл. п. л. 1.39. Тираж 120 экз. Заказ 276 Отпечатано в Типографии ИД ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10.