Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Препараты внутривенных иммуноглобулинов из донорской плазмы для терапии бактериальных и вирусных инфекций



На правах рукописи

о'

- # «Г

Л/

ШАРЫГИН Сергей Леонидович

ПРЕПАРАТЫ ВНУТРИВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ИЗ ДОНОРСКОЙ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ТЕРАПИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ (получение и клиническое применение)

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

С.-Петербург - 1997

Работа выполнена в Кировском научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови МЗ РФ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

М.А.Ажигирова

И.Г.Дугкевич

А.И.Смирнова

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский

на заседании диссертационного совета Д 084.19.01 в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии МЗ РФ (193024, С-Петербург, ул. 2-ая Советская, д. 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии

институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасе-вича МЗ РФ

Защита диссертации состоится

¿У"_М _1997 г. в /¿7

час.

Автореферат разослан "

1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

В.С.Быков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Инфекционные заболевания и осложнения продолжают занимать значительный удельный вес в- общей структуре заболеваемости населения, несмотря на достижения современной медицины. В последние годы возросла частота заболеваний стафилококковой этиологии, которые отличаются тяжестью течения, малой результативностью или неэффективностью антимикробной терапии. Широкое распространение получили внутригос-питальные стафилококковые инфекции (Зайцева Г.А., 1990; Cunney R.J. et al., 1996) .Весьма грозным заболеванием является столбняк, летальность при котором составляет более 40%. Особенно она высока среди больных детей и стариков (Traverso Н.Р. et al., 1991; Heath Т.С. et al., 1996). Клещевой.энцет фалит представляет одну из сложных проблем здравоохранения. Это связано с тяжестью и длительностью заболевания, поражением центральной нервной системы больного, высокой летальностью, частотой необратимой инвалидности (Берета JI.A. и соавт., 1994; Tomazic I. et al., 1997).

В комплексном лечении бактериальных, вирусных заболеваний, гнойно-септических осложнений все большее значение приобретают иммунные препараты крови. В последние годы их роль особенно возросла в

«

связи с повышением устойчивости патогенной микрофлоры к большинству применяемых антибиотиков (Jenkis S.G.,1996). Ряд авторов считает, что причина увеличения частоты гнойно-септических процессов и некоторых инфекционных заболеваний кроется не только в появлении антибиотико-устойчивых форм микробов, но и в изменении иммунного статуса населения (Константинов В.Н., 1988, Барсуков B.C., 1989: Fleischer В. et al., 1991). В настоящее время с целью заместительной терапии широко используются иммунная плазма и иммуноглобулины (ИГ) различной направленности для внутримышечного введения. Несмотря на высокую терапевтическую эффективность указанных лечебных средств, они обладают рядом существенных недостатков и мало эффективны при тяжелых гнойно-септических и

вирусных заболеваниях (Сапожникова B.C., 1990; Анастасиев В.В., 1997).

Перспективным направлением повышения эффективности заместительной иммунотерапии является разработка и изготовление препаратов с высокой специфической активностью, пригодных для внутривенного введения. Этот путь применения препарата, в отличие от внутримышечного, позволяет вводить ИГ в больших, необходимых для лечения дозах и быстро увеличивать уровень специфических антител в крови реципиента. Высокая терапевтическая эффективность иммуноглобулинов для внутривенного введения (ИГВВ) подтверждена многими исследованиями у нас в стране и за рубежом (Мигунов В.Н. и соавт.,1995; Sun К.О. et al., 1994; Sanders R.K.11996).

Первые препараты ИГ, пригодные для внутривенного введения, были получены в начале 60-х годов. Они были приготовлены путем протеоли-тического расщепления пепсином или плазмином как полимеров, так и значительной части мономеров IgG (Barandun S. et al., 1962). В настоящее время в разных странах для получения ИГВВ предложено несколько методов, но основным требованием при изготовлении является снижение антикомплементарной активности при сохранении титров антител. В нашей стране пока существует единственный производственный метод получения иммуноглобулина для внутривенного введения, разработанный И.А.Киселевой и В.В.Анастасиевым (1976,1981). Метод основан на кислотно-ферментативной обработке ИГ, очищенного и концентрированного спиртовым фракционированием. Он вписывается в комплексную технологию фракционирования плазмы и доступен большинству учреждений, занятых производством препаратов. В настоящее время по разработанной технологии "Иммуноглобулин нормальный человека для внутривенного введения" (ФС 42-3159-95) выпускается на ряде предприятий страны. Его получают из пула сыворотки или плазмы крови доноров, содержащего усредненные уровни различных антител, характерные для данной популяции.

Для повышения терапевтической эффективности ИГ необходимо шире внедрять в практику препараты для внутривенного введения на ч

ленного действия, в которых концентрация антител к определенным антигенам в 5 и более раз выше, чем в нормальном ИГ (ВОЗ, 1982). Однако отечественных специфических ИГВВ до настоящего времени нет. Проблема разработки и получения специфических ИГВВ является комплексной и включает в себя несколько аспектов. Это заготовка иммунного сырья в необходимых объемах, определение требований к нему; разработка технологии изготовления препаратов, изучение их физико-химических и иммунобиологических свойств, а также определение терапевтической эффективности ИГВВ.

Всё возрастающие потребности в иммунном сырье обусловливают необходимость поиска дополнительных источников его получения. Научные исследования Российского НИИ гематологии и трансфузиологии показывают, что приоритетным в этом направлении следует считать серологический скрининг донорской крови и плазмы по выявлению "естественных" сывороточных антибактериальных антител с целью последующего получения иммунного сырья (Мельникова В.Н. и соавт., 1989; Смирнова А.И.,1990). Вместе с тем, проводимая в широких масштабах намеренная иммунизация доноров для получения иммунной плазмы далеко не всегда дает ожидаемый результат и требует более целенаправленного отбора лиц с активной выработкой антител (Демидова Н.В., 1982; Зайцева Г.А.,1990).

9

Одним из важных этапов создания специфических ИГВВ является разработка технологии их получения. Отечественная технология изготовления внутривенного ИГ существует около 20 лет. Современный мировой опыт производства ИГ свидетельствует о необходимости улучшения качественных характеристик готового препарата, то есть усовершенствования имеющейся в нашей стране технологии получения внутривенного ИГ.

Таким образом, создание препаратов внутривенных иммуноглобу-щнов для терапии бактериальных и вирусных инфекций является актуаль-юй задачей медицинской науки и практики.

Цель исследования. Разработка и изучение лечебной эффек-и.'^.нти новых препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введе-

ния: антисгафилококкового, противостолбнячного и против клещевого энцефалита.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить возможность получения гипериммунной плазмы серологическим скринингом донорской крови и плазмы на наличие "естественных" специфических антител.

2. Разработать критерии определения потенциальной иммунологической реактивности доноров при их намеренной иммунизации.

3. Установить требования к исходному сырью (содержание специфических антител, условия и сроки хранения иммунной плазмы).

4. Усовершенствовать существующую технологию производства внутривенного иммуноглобулина.

5. Получить новые препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения; антистафилококковый, противостолбнячный, против клещевого энцефалита.

6. Изучить терапевтическую эффективность разработанных специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения в клинике и эксперименте.

Научная новизна. Впервые применен комплексный научно-обоснованный подход к проблеме создания ИГ направленного действия для внутривенного введения, включающий этапы заготовки иммунного сырья, разработки технологии их получения и изучения лечебной эффективности препаратов.

На основании результатов изучения частоты встречаемости среди доноров лиц с высокими титрами "естественных" антибактериальных и противовирусных антител показана возможность получения от них иммунной плазмы.

Определение потенциальной иммунологической реактивности донора при намеренной иммунизации позволяет производить отбор "перспективных" антителопродуцентов при комплектовании групп иммунных доноров. С иммуногенетических позиций показана нецелесообразность

привлечения к искусственной иммунизации носителей определенных антигенов.

Получены новые данные об уровнях специфических антител в исходном сырье и препаратах ИГ, позволяющие дифференцировать подходы к созданию специфических ИГВВ.

Проведенные исследования по освобождению иммуноглобулиновых растворов от остаточного спирта с помощью ультрафильтрации позволили предложить новую схему изготовления ИГВВ. При этом препарат получается более высокого качества и технологическая схема сокращается на три стадии.

Разработан новый вариант кислотно-ферментативного метода получения ИГВВ, улучшающий его качественные характеристики. На "Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения" получен патент-Российской Федерации № 2068695 от 10 ноября 1996 г.

Впервые разработаны специфические ИГВВ: антистафилококковый, противостолбнячный, против клещевого энцефалита. При этом противостолбнячный ИГВВ разработан в сухой форме с длительным (до 3-х лет) сроком хранения.

На способы получения ИГВВ антистафилококкового и против клещевого энцефалита получены приоритетные справки № 96104591 от 20.03.96 г. и № 96109309 от 22.05.96 г. соответственно.

Установлены и сформулированы требования к препаратам, показана их терапевтическая эффективность в клинике и эксперименте.

Практическая значимость.

Обоснована возможность заготовки иммунной плазмы путем выявления доноров с "естественно" высоким содержанием антибактериальных и противовирусных антител. Система серологического скрининга донорской крови и плазмы по выявлению специфических сывороточных антител с целыо последующего получения иммунной плазмы внедрена в практическую деятельность станции переливания крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

Рекомендован метод отбора доноров для намеренной иммунизации с учетом потенциальной иммунологической реактивности индивида. Отстранение от иммунизации лиц, ареактивных к определенному антигену, предотвращает неоправданную антигенную нагрузку на их организм, сокращает нецелесообразные материальные затраты. Применение разработанного способа-прогнозирования иммунного ответа на станции перелива-: ния крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови, Свердловской областной станции переливания крови (г.Первоуральск), в государственном медицинском производственном объединении "Сангвис" (г.Екатеринбург) позволило увеличить число иммуноактивных лиц при намеренной иммунизации до 80-85%.

Результаты работы легли в основу нормативно-технической документации на производство иммуноглобулина человека антистафилококкового для внутривенного введения, который разработан совместно с Нижегородским государственным предприятием по производству бактерийных препаратов. На препарат утверждена временная фармакопейная статья (ВФС) 42-2854-97 от! 1.03.97 г., изменения к регламенту производства № 2 и № 8 от 15 марта 1993 года, инструкция по применению (утверждена Минздравом Российской Федерации 15.03.1993 года).

Применение препарата в медицинской практике показало его высокую эффективность в комплексном лечении тяжелообожженных, больных неспецифическими заболеваниями легких, с гнойно-септическими осложнениями и другими заболеваниями стафилококковой этиологии.

Препарат выпускается серийно станцией переливания крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови, Нижегородским государственным предприятием по производству бактерийных препаратов, его выпуск осваивается также Нижегородским областным центром крови.

Совместно с Хабаровским НИИ эпидемиологии и микробиологии, Хабаровским предприятием по производству иммунобиологических препаратов разработан и прошел 'клинические испытания "Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения".

ннческие испытания показали высокую лечебную эффективность препарата при менингеальной и очаговых формах клещевого энцефалита.

Для утверждения в ГИСК им. Л.А.Тарасевича представлена необходимая нормативно-техническая документация на препарат (письмо ГИСКа им. Л.А.Тарасевича от 09.07.97 г. № 01-46/5):

- отчет о результатах оценки лечебной. эффективности применения иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения (одобрен Ученым советом ГИСКа 7.10.97 г., протокол № 17),

- ВФС на препарат, , , .

- регламент производства препарата,

- инструкция по его применению.

Разработаны требования, технология получения, проведены экспе- , . риментальные исследования противостолбнячного иммуноглобулина, для , внутривенного введения, которые свидетельствуют о его высоком терапев- • , тическом эффекте. Получение препарата в сухой форме с длительным,сро-ком хранения (до 3-х лет) позволит иметь его запас на случай стихийных, • бедствий и катастроф.

Результаты работы вошли в методические рекомендации "Лечение инфекционных осложнений при проведении современных программ терапии острых лейкозов" ( Киров, 1997 г.), которые утверждены Минздравом Российской Федерации 15.01.1997 г. № 97/5.

Материалы исследования используются в преподавании на кафедре гематологии и трансфузиологии ФУВа Пермской государственной медицинской академии на базе Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА-ЗАЩИТУ

1. Скрининг донорской крови и гошмы на наличие "естественных^' ,, специфических антител и отбор "перспективных" доноров,- антителопро-дуцентов при намеренной иммунизации позволяют увеличить объемы заго-гожи иммунного сырья и избежать неоправданной антигенной нагрузки на организм донора.

2. Для изготовления ИГВВ: антистафилококкового с содержанием антиальфастафилолизина не менее 20,0 ME/мл, противостолбнячного - не менее 30,0 ME/мл столбнячного антитоксина, против клещевого энцефалита с титром антител к вирусу клещевого энцефалита не менее 1:40 должна использоваться иммунная плазма, хранившаяся при температуре 6,0 + 4,0°С не более одного Месяца и в замороженном состоянии при температуре не выше минус 20°С не более трех месяцев, с титрами антител для антистафилококковой плазмы - 4,5 + 0,5 ME/мл антиальфастафилолизина, противостолбнячной - 7,5 + 0,5 ME/мл столбнячного антитоксина, противоэнцефа-литной -1:10 и выше к вирусу клещевого энцефалита.

3. Усовершенствованная технология производства внутривенного иммуноглобулина, включающая ультрафильтрацию и новый вариант метода кислотно-ферментативного гидролиза, позволяет получать ИГВВ направленного действия (антистафилококковый, противостолбнячный, против клещевого энцефалита) высокоспецифичные, качественные и стабильные в процессе хранения.

4. Клинические испытания ИГВВ антистафилококкового и против клещевого энцефалита, изучение в эксперименте противостолбнячного ИГВВ свидетельствуют о высокой лечебной эффективности разработанных препаратов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты и положения работы доложены на II Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (г.Челябинск, 1986 г.); Ill Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (г.Киров, 1991 г.); 3-й международной конференции по службе крови стран Восточной Европы (г.С-Петербург,1996 г.): III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (г.С-Петербург,1996 г.); республиканских и зональных научно-практических конференциях, а также неоднократно докладывались на итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

По материалам диссертации опубликованы 44 научные ;\ч<>:.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертация изложена на 282 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, трех глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 476 источников, из них 204 отечественных и 272 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 63 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

¡У'/;'

Объем, материалы и методы исследования Источником получения специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения служила плазма крови доноров, отобранная в процессе скрининга донорской крови и плазмы на наличие "естественных" антибактериальных и противовирусных антител, а также заготовленная от намеренно иммунизированных доноров.

Скрининг донорской крови и плазмы на наличие специфических антител проводился в соответствии с методическими рекомендациями "Организация новой формы иммунного донорства среди лиц с "естественными" антибактериальными антителами с целью получения препаратов направленного действия" (Л.,1989). Титрование сывороток крови

«

доноров на наличие антиальфастафилолизина проводили в реакций нейтрализации гемолитических свойств стафилококкового альфатоксина специфическими антителами в соответствии с "Методическими указаниями по определению антиальфастафилолизина в сывороточных препаратах крови человека и животных", утвержденными МЗ СССР 04.12.1984г. Исследование сывороток крови доноров на содержание противостолбнячных антител проводили в РПГА, на наличие антител к вирусу клещевого энцефалита - в РТГА с соответствующими диагностикумами согласно. прилагаемым инструкциям. Всего осуществлено 82154 исследования, в т.ч. на наличие антиальфастафилолизина -79972, столбнячного антитоксина - 1296, антител к вирусу клещевого энцефалита - 886.

Намеренную иммунизацию адсорбированным стафилококковым анатоксином (230 доноров), столбнячным анатоксином (253 донора) и вакциной клещевого энцефалита очищенной концентрированной инактивиро-ванной сухой (93 донора) проводили согласно действующих инструкций.

Идентификацию HLA- антигенов локусов A,B,C,DR проводили в микролимфоцитотоксическом тесте (Terasaki et al., 1970) по набору типи-рующих cbraopöTOK Российского НИИ гематологии и трансфузиологии, для DR - типирования, кроме того, применяли сыворотки фирм "Biotest" и "One Lambda".

Всего для проведения исследовгчий использовано 2303,3 л донорской плазмы крови,' в том числе: антисгафилококковой - 1411,0 л, противостолбнячной -'287,3 л, противоэнцефалитной - 605,0 л.

Для изучения изменений специфической активности, происходящих в гипериммунной плазме во время длительного хранения, было заготовлено 35 образцов антистафилококковой, 20 - противостолбнячной и 35 - противоэнцефалитной плазм. Плазму хранили при различных температурных режимах: 6,0+4,0 0 С в течение 3 месяцев и не выше минус 20°С в течение 12 месяцев. '

Специфические ИГ для внутривенного введения изготавливали из осадков фракции II или их лиофилизированных порошков, полученных из иммунных плазм с • использованием метода 9 Кона-Онклея согласно "Типовому комплексному регламенту производства белковых препаратов плазмы донорской крови", утвержденному МЗ СССР 21.12.1979 г, по двум вариантам А и В технологического процесса на основе метода кислотно-ферментативного гидролиза, предложенного Киселевой И.А., Анастасие-вым В.В. (1976,1981). По варианту А этанол из растворов удаляли методом лиофилизации. В схеме технологического процесса варианта В стадия лио-филизации заменена на ультрафильтрацию. Лиофилизацию раствора осадка фракции II проводили на аппарате КС - 30 с предварительным замораживанием и закалкой. Для проведения ультрафильтрации использовали кассетную систему "Pellicon" ("Millipore", США).

Для оценки физико-химических и иммунобиологических свойств специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения изготовлено по варианту А 17 серий антистафилококхового, 8 серий противоэнцефа-литного и 7 серий противостолбнячного, по варианту В - 8 серий антистафилококкового и 3 серии противостолбнячного иммуноглобулинов.

В плазме, растворах ИГ на этапах изготовления, в готовых препаратах и в процессе их хранения изучали содержание антиальфастафилолизи-на, столбнячного антитоксина и антител к вирусу клещевого энцефалита. Все опыты ставили параллельно с национальными стандартами антител, полученными из ГИСК им. Л.А.Тарасевича, оттитрованными по международным стандартам.

Препараты в процессе получения, непосредственно после изготовления и во время хранения контролировали по показателям ФС 42-232ВС-88, ФС 42-3159-95 в соответствии с методами, изложенными в "Сборнике инструкций" (утвер. приказом МЗ СССР № 31 от 13.01.1983г.)! ФС 42-344ВС-90, методических рекомендациях "Определение антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулина" (утвер. МЗ РСФСР 21.04.1988г.), "Методических рекомендациях по применению физико-химических, химических и иммунохимических методов контроля препаратов иммуноглобулина" (утвер. МЗ СССР 10.06.1982г.). , . . ; -

Плазму и готовые препараты контролировали на отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ8Ад) и антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) иммуноферментными методами с коммерческими тест-системами в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями. Плазму контролировали на отсутствие антител к вирусу гепатита С.

Используемые в работе реактивы, материалы, реагенты и оборудование соответствовали требованиям ГОСТа, Госфармакопеи XI (1987, 1990), предъявляемым при производстве препаратов крови.

В соответствии с приказом МЗ СССР № 245 от 18.06.1990г. проведены клинические испытания ИГ антистафилококкового для внутривенного гудения. Испытания проведены на клинических базах гг.Кирова, Перми,

Москвы. Под наблюдением находились 54 пациента с различной патологией, осложненной стафилококковой инфекцией. В качестве препарата сравнения был взят ИГ нормальный человеческий для внутривенного введения. Для оценки эффективности применения препарата исследовались общеклинические показатели, такие как температура тела,частота пульса, артериальное давление, частота дыхания, проводился общий анализ крови и мочи, определялся общий белок сыворотки крови. Изучались иммунологические показатели: количество Т- и В-лимфоцитов (Е-РОК и ЕАС-РОК), фагоцитарная активность нейтрофилов по отношению к инертным частицам латекса размером 0,8 ц, уровень иммуноглобулинов классов С, А, М в реакции радиальной иммунодиффузии. Указанные тесты выполняли с использованием унифицированных методик, изложенных в методических рекомендациях института иммунологии РАМН "Оценка иммунного статуса

, V 'Г •

человека при массовых обследованиях" (Р.В.Петров и соавт,- М„ 1992). Функциональную активность системы комплемента исследовали гемолитическим микрометодом по Козлову Н.В.; титр антиальфастафилолизина в сыворотке крови определяли в реакции нейтрализации гемолитических свойств стафилококкового альфатоксина.

Клинические испытания ИГ против клещевого энцефалита для внутривенного введения проведены в соответствии с Программой и методикой оценки лечебной эффективности препарата, утвержденной Председателем Комитета по иммунобиологическим препаратам при МЗ РФ Н.В.Медуницыным от 12.07.1994г., № 01-07/219 . Испытания проведены на -клинических базах гг. Хабаровска и Екатеринбурга на 84 больных менин-геальной и очаговыми формами клещевого энцефалита.Терапевтическая эффективность ИГВВ человека против клещевого энцефалита определялась в зависимости от доз и сроков его введения в сопоставлении с лечебной эффективностью препарата ИГ против клещевого энцефалита для внутримышечного введения и симптоматической терапией.

Исследовались такие показатели эффективности лечения, как норм^-лизация температуры, улучшение общего состояния, регресс мекигг^

ных и обшемозговых симптомов, санация спинномозговой жидкости.

Проводилось сравнительное исследование действия препаратов ИГ, введенных различными путями, на активную продукцию антител при клещевом энцефалите, изучение длительности циркуляции антител. Наряду с вышеназванными методами оценки иммунного статуса у больных клещевым энцефалитом в опытной и контрольной группах определяли количество теофиллинчувствительных и теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов. Динамику циркуляции антигена вируса клещевого энцефалита проводили с помощью реакции связывания комплемента и ИФА.

Эффективность противостолбнячного ИГВВ изучали в сравнении с внутримышечным противостолбнячным ИГ на экспериментальной модели заболевания. Под наблюдением находились 60 белых беспородных мышей массой 17,0+1,Ог, которым вводили летальную дозу столбнячного токсина. Через 30 минут (превентивное действие) или через 24 часа после заражения (лечебный эффект) животным вводили специфические иммуноглобулины. Группу сравнения оставляли без лечения. За животными наблюдали в течение 4-6 суток, учитывая клинические проявления заболевания и выживаемость.

При проведении клинических и экспериментальных испытаний специфических ИГВВ изучались также реактогенность и безвредность разработанных препаратов.

Статистический анализ результатов исследования проводили с помощью пакета прикладных программ на персональной ЭВМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение иммунной донорской плазмы, определение требований к сырью и условиям его хранения.

Расширение выпуска лечебных препаратов и компонентов крови, имеющих специфическую иммунологическую направленность, напрямую •?г.лс:п от увеличения объемов заготовки иммунной плазмы. Решение этой

задачи связано с разработкой и внедрением в практику новых форм им-мукного донорства. Важным резервом получения иммуного сырья для изготовления специфических ИГ является скрининг донорской крови и плазмы на наличие специфических антител. Результаты скрининга плазмы доноров на наличие специфических антител представлены в таблице 1. Полученные данные'свидетельствуют, что среди обследованных доноров 1,71% имеют титры антиальфастафилолизина (4 МЕ /мл и выше), достаточные для того, чтобы из этого иммунного сырья был получен антистафилококковый ИГВВ, содержащий не менее 20 МЕ/мл (ВФС 42-2854-97).

В группе доноров, обследованных на наличие противостолбнячных антител, у ,7,33 % их концентрация в плазме составила не менее 7,0 МЕ/мл, что необходимо для получения гипериммунного противостолбнячного ИГВВ с содержанием столбнячного антитоксина не менее 30 МЕ/мл.

Таблица 1

Результаты скрининга плазмы доноров на наличие специфических антител

Специфичность антител Общее количество доноров Достаточный для получения ИГВВ уровень антител Количество доноров с достаточным для получения ИГВВ уровнем антител

абс. %

антиальфа-стафилолизин 79972 4 МЕ/мл 1370 1,71

столбнячный антитоксин 1296 7 МЕ/мл 95 7,33

антитела к вирусу клещевого энцефалита; 886 1:10 в РТГА 66 • 7,45

Итого 82154

Удельный вес доноров с титром антител к вирусу клещевого энцефалита 1:10 и выше, достаточным для получения специфического ИГВВ

(титр в 1:40 и выше), составил 7,45% со значительными колебаниями между неэндемичными и эндемичными по клещевому энцефалиту районами (от 0,69% до 12,63% соответственно).

Таким образом, за счет серологического скрининга донорской крови и плазмы на наличие "естественных" антибактериальных и противовирусных антител могут быть получены определенные объемы иммунного сырья. При этом обеспечивается рациональное использование донорской крови и донорских ресурсов.

Известно, что антибактериальные и противовирусные антитела вырабатываются как у реконвалесцентов, так и у прививаемого контингента. В стране специфическая профилактика столбняка проводится в соответствии с приказом МЗ СССР № 1152 от 09.11.1981 г. "О мерах по совершенствованию профилактики столбняка". В результате значительная часть

населения имеет стойкий иммунитет к столбнячной инфекции. Вместе,с тем,

i

согласно полученным нами данным, среди обследованных доноров титры антител к столбняку, достаточные для производства ИГВВ, выявлены лишь у 7,33% обследованных. Аналогичные результаты получены Смирновой А.И. (1990), Русаковой Е.В. и соавт.(1991).

Говоря об антистафилококковом иммунитете населения, следует отметить. что прививки против стафилококковой инфекции в плановом порядке в России уже много лет не проводятся. Это, безусловно, не могло не вызвать ослабления иммунитета среди здорового населения к этой инфекции и снижения выработки антител. Выполненные нами исследования показали, что удельный вес доноров с повышенным содержанием антиаль-фастафилолизина в сыворотке крови (4 ME/мл и,выше) с каждым годом снижался и в 1995 году составил 0,81% против 3,42% в 1991 году.

Специфической профилактике против клещевого энцефалита в соответствии с приказом МЗ СССР № 141 от 09.04.1990 г. "О дальнейшем совершенствовании мероприятий по профилактике клещевого энцефалита" подлежат контингента, которые преимущественно имеют разъездной ха-¡.л'.тер работы и не относятся к донороактивным. Скрининг сывороток

крови доноров Кировской области, которая относится к эндемичным территориям России по заболеваемости клешевьПи энцефалитом, также выявил незначительный удельный вес лиц с повышенными титрами антител к вирусу клещевого энцефалита (1:10 и выше). Следовательно, получение необходимых объемов иммунного сырья для производства специфических ИГ только за счет скрининга донорской крови и плазмы стало проблематичным.

Сокращение числа лиц с высокими титрами "естественных" антибактериальных и противовирусных антител диктует необходимость более широкого применения намеренной иммунизации доноров. В связи с этим нами была изучена возможность целенаправленного отбора доноров, у которых предполагается активная выработка антител при искусственной иммунизации конкретным антигеном. Как показывает многолетняя практика иммунизации, определенная часть привитых лиц не отвечает активной ан-тителопродукцией на введение антигена. А.И.Смирнова и соавт. (1982) отмечают, что величина титра у привитых стафилококковым анатоксином варьирует в пределах 2-80 МЕ/мл. У подавляющего большинства доноров титры не превышают 6-8 МЕ/мл и остаются на этом уровне непродолжительное время (3-4 месяца). Это заставляет вести поиск факторов, влияющих на интенсивность антителопродукции. Так, Н.В.Демидовой (1982) была изучена зависимость выработки антител от времени года, профессии, донорского стажа, возраста и некоторых других параметров. Полученные за последние годы данные свидетельствуют, что адекватным методом оценки иммунологической реактивности организма является НЬА-типирование, поскольку наличие в тканях индивида определенных НЬА-антигенов ассоциируется с особенностями его иммунного статуса, и тканевые антигены могут служить маркерами, позволяющими выявить различия в иммунореактивности доноров (Серова Л.Д. и соавт., 1982; Зайцева Г.А. и соавт., 1988).

В нашем исследовании 230 доноров - мужчин в возрасте от 20 до 50 лет были иммунизированы адсорбированным стафилококковым анатокси-

ном согласно действующей инструкции. У всех наблюдавшихся определяли титр антиальфастафилолизина до иммунизации и в различные сроки после нее, группу крови, резус-фактор, НЬА-фенотип. В зависимости от выраженности иммунного ответа доноры были разделены на 2 альтернативные группы: 1 -ая - доноры с высоким иммунным ответом (титр 10 МЕ/мл и более), 2-ая - доноры со слабым ответом ( титр < 6 МЕ/мл).

При сравнении между собой альтернативных по иммунному ответу групп достоверные различия были найдены для антигенов Н1_А-А1 (Х2=5,43; р=0,020, рс>0,05), А 11 (*2=3,99, р=0,045, рс>0,05), А9 (х2=8,01, р=0,004, рс>0,05). На рисунке 1 представлено графическое изображение частоты встречаемости названных антигенов в группах иммунизированных доноров, а также в смешанной выборке, состоящей из 795 здоровых жителей Кировской области (контроль).

Н1.А-А1 Н1.А-А9 Н1А-А11

¡контроль Ш1-Я группа 12-я группа

Рис. 1. Частота встречаемости антигенов НЬА-А1, А9, АН у доноров с разной активностью продукции антиальфастафилолизина

Используя формулу расчета относительного риска возникновения заболевания (Зарецкая Ю.М. и соавт., 1986) для определения степени им-

мунного ответа, мы нашли, что наличие в тканях доноров антигенов AI, All или сочетаний А1-АЗ, AI-All, АЗ-А11, А1-В8, А11-В15 увеличивает возможность получения активного иммунного ответа в 1,5-1,7 раза, тогда как присутствие антигена А9 или сочетаний А1-А9, A9-Ax, А9-В8, А9-В13, А9-В17, А9-В27 в 1,6-8,4 раза чаще обусловливает низкий иммунный ответ.

Следовательно, напрашивается вывод о явной нецелесообразности привлечения лиц с присутствием антигена А9 или сочетаний А1-А9, А9-Ах, А9-В8, А9-В13, А9-В17 к искусственной иммунизации с целью получения гипериммунной антистафилококковой плазмы. Предпочтение в этом случае следует отдать лицам, имеющим антигены AI, All или сочетания А1-АЗ, AI-All, АЗ-А11, А1-В8, А11-В15.

Аналогичные исследования были проведены среди доноров (253 человека) в возрасте 18-25 лет, которых иммунизировали столбнячным анатоксином с целью получения плазмы специфической направленности. Среди привитых было 103 мужчины и 150 женщин.

По выраженности иммунного ответа выделили группу доноров с высоким уровнем антитоксина (> 32 ME/мл - 1 группа) и с низким (< 8МЕ/мл - 2 группа).

При изучении частоты выявления HLA-антигенов у наблюдавшихся доноров установлены четко выраженные различия в распределении антигенов HLA-B5 и В35 (рис.2).

Из 83 доноров с высоким содержанием антитоксина антиген В5 был выявлен у 7 (8,43%), а из 87 доноров с низким уровнем антител у 23 (26,44%). Иная закономерность обнаружена для антигена В35. Среди активных антителопродуцентов он встретился у 22 (26,51%), среди доноров с низким уровнем антитоксина - у 9 (10,34%).

При определении степени выраженности иммунного ответа у носителей вышеуказанных признаков мы нашли, что присутствие антигена В35 или антигенных сочетаний A3-B35, В35-Вх увеличивает вероятность получения активного ответа на столбнячный анатоксин в 1,6 -2,0 раза, а наличие антигена В5 или сочетаний А2-В5, АЗ-В5, B5-Bx, В5-В14, В5-В15 в 2,75-

19,7 раза чаще предопределяет низкий иммунный ответ.

Н1.А-В5 Н1.А-В35

Нконтроль □ 1-я группа Ш2-я группа

Рис. 2. Частота встречаемости антигенов НЬА-В5 и В35 у доноров с разным титром столбнячного антитоксина

Группу доноров (93 человека) иммунизировали вакциной против клещевого энцефалита. При изучении частоты встречаемости НЬА-антигенов у иммунизированных лиц установленьГ выраженные различия в распределении антигенов А9, В13 и В21 (рис. 3). Среди 74 доноров первой группы, ответивших на иммунизацию, антиген А9 был выявлен у 34 (45,95%), антиген В13 - у 16 (21,62%). Из 19 доноров второй группы, не ответивших на иммунизацию, антиген В21 был определен у 5 (26,32%).

Расчеты показали, что присутствие антигенов А9, В13, антигенных сочетаний А2-А9, В8-В13, В12-В13, А2-В13, А9-В8 увеличивает вероятность получения активного ответа на вакцину против клещевого энцефалита в 2,1-8,4 раза, а наличие антигена В21, антигенных сочетаний АЗ-В21, В7-В21, В12-В21, В21-В40 в 8,5-13,6 раза чаще предопределяет низкий иммунный ответ.

50 45 40 35 30 % 25 20 15-| 10

Н1.А-А9 ША-В13 Н1_А-В21

■ контроль П1-я группа Ш2-я группа

Рис. 3. Частота выявления НЬА-антигенов А9, В13, В21 у доноров с разной активностью продукции антител при иммунизации вакциной клещевого энцефалита

Полученные данные свидетельствуют, что присутствие в тканях индивида одних антигенов обусловливает активную антителопродукцню, наличие других предопределяет слабый иммунный ответ. Следовательно, зная фенотип донора, можно с определенной долей вероятности предсказать характер его иммунологической реактивности на конкретный антиген.

Прогнозирование силы иммунного ответа имеет первостепенное значение при комплектовании групп иммунных доноров, когда необходимо от максимального числа привитых получить гипериммунную специфическую плазму как сырье для производства ИГВВ направленного действия. При этом отвод от иммунизации "неперспективных" антителопродуцентов дает возможность сократить неоправданные материальные затраты, отстранить от иммунизации слабоотвечающих лиц, то есть избежать ненужной антигенной нагрузки на организм донора.

С целью установления требований к исходному сырью (оптимальные температурные режимы и сроки хранения) были исследованы 35 образцов антистафилококковой, 20 - противостолбнячной и 35 - противоэнцефалит-ной плазм. Критерием оценки пригодности сырья для изготовления иммуноглобулинов являлось содержание специфических антител в плазме крови. Образцы плазмы хранили в двух температурных режимах: 6,0+4,0°С с максимальным сроком 3 месяца и при температуре не выше - 20°С с максимальным сроком 12 месяцев. В результате проведенных исследований было установлено, что допустимым сроком хранения плазмы при положительных температурах является 1 месяц, так как уже через 2 месяца ее специфическая активность существенно снижалась. Максимальный срок хранения иммунной плазмы в замороженном состоянии составляет 3 месяца. Мы не рекомендуем накопление иммунной плазмы для фракционирования в сроки более 3 месяцев при температуре не выше -20 °С и одного месяца при 6,0±4,0°С еще и потому, что согласно действующей технической документации такая плазма не может быть использована для получения из нее альбумина и гемостатических препаратов.

Большой практический интерес представляло научное обоснование оптимального содержания специфических антител в исходной иммунной плазме для получения ИГ с заданной специфической активностью. Критериями оценки являлись уровни специфических антител в сырье и в готовом препарате. Было установлено, что для получения антистафилококкового ИГВВ со специфической активностью не ниже 20,0 МЕ/мл содержание ан-тиальфастафилолизина в котловой загрузке плазмы должно составлять 4,5+0,5 МЕ/мл. Для приготовления противостолбнячного ИГВВ с антитоксической активностью не менее 30,0 МЕ/мл оптимальный уровень содержания столбнячного антитоксина в котловой загрузке плазмы, определяемый по реакции нейтрализации токсина на белых мышах, должен быть 7,0+0,5 МЕ/мл. ИГ против клещевого энцефалита для внутривенного введения с титром антител 1:40 и выше может быть получен из иммунной плазмы с со--;с;>;ханием специфических антител не менее 1:10.

2. Специфические иммуноглобулины для внутривенного введения, их получение, изучение физико-химических и иммунобиологических свойств

Анализ отечественной и зарубежной литературы убедительно показывает, что основным методом фракционирования белков плазмы крови по-прежнему остается этаноловый метод Кона, как наиболее доступный и безопасный в отношении вирусной контаминации получаемых препаратов. Однако в процессе фракционирования плазмы происходят конформацион-ные изменения белковых молекул, вызывающие нарушение их функциональных особенностей. Наличие полимерных форм ИГ влияет на качество препаратов, снижает эффективность и безопасность их применения. В связи с этим все разнообразные способы получения ИГВВ направлены на снижение содержания агрегатов ^О и антикомплементарной активности.

В нашей стране утвержден единственный производственный метод получения внутривенного иммуноглобулина, применяемый для изготовления ИГВВ человека нормального (Киселева И.А., Анастасиев В.В., 1976, 1981). Метод основан на снижении антикомплементарной активности ИГ посредством гидролиза пепсином в слабокислой среде с последующим удалением фермента гидроокисью алюминия. По данным В.В.Немова (1989), метод позволяет получать препарат, содержащий в основном мономерную форму и до 30% фрагментов. По мнению С.А.В1аск (1997) препараты, содержащие фрагменты, в ряде случаев более эффективны для терапии бактериальных и вирусных инфекций. Это связано с необходимостью введения массированных доз ИГ в короткие интервалы времени в остром периоде тяжелого инфекционного заболевания. Ускоренный процесс выведения из организма образовавшихся иммунных комплексов в данном случае становится положительным фактором. В связи с этим для получения антистафилококкового, противостолбнячного и противоэнцефалитного ИГВВ нами был взят за основу метод кислотно-ферментативного гидролиза с использованием в качестве фермента высокоочшценного лиофилизи-рованного пепсина.

Результаты изучения свойств полученных препаратов и анализ технологического процесса показали, что на этапе выстаивания регламентируемое значение рН 7,0±0,5 не является оптимальным,,так как ведет к медленной (до трех месяцев) преципитации балластных белков, а при длительном хранении препарата - к нестабильности нехоторых образцов ИГВВ.

В предложенном нами варианте кислотно-ферментативного метода получения ИГВВ на этапе выстаивания проведена коррекция рН до значений 6,0-6,4. Это положительно сказалось на качестве препаратов, привело к более интенсивному образованию осадка лабильных белковых примесей, что сократило период выстаивания в 3 раза. Осадок удаляли центрифугированием в течение 30 минут при 6000 об/мин. В таблице 2 представлены сравнительные характеристики ИГ, полученных разработанным нами способом и способом-прототипом.

Таблица 2

Характеристика иммуноглобулинов для внутривенного введения, полученных разработанным способом и способом-прототипом

| Показатели После изготовления Через 12 месяцев хранения

Прототип Разработ. способ Р Прототип Разработ. способ Р

Антикомплементарная активность (мг белка на 2ОН50) 14,0+ 0,55 20,5+ 1,5 <0,05 8,7+ 0,7 20,0+ 1,15 <0,05

Прозрачность (ед.опт.пл.) 0,03+ 0,004 0,008+ 0,001 <0,05 0,065+ 0,007 0,008+ 0,0007 <0,05

Наличие мути, осадка в 3-х сериях

Препарат, полученный разработанным нами способом, имел низкую :итикомплементарную активность и более высокую прозрачность. Через 12

месяцев эти различия становились еще более выраженными. В трех сериях иммуноглобулина, полученного способом-прототипом, появилась макроскопическая муть и осадок. Это свидетельствует о выпадении нестабильных белков, которые оставались в препарате после его изготовления по способу-прототипу. В препарате, полученном разработанным способом, существенных изменений в процессе хранения не отмечалось. Следовательно, этот препарат обладает более высокими качественными характеристиками. На данный "Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения" получен патент РФ № 2068695 от 10 ноября 1996 года.

Было отмечено также, что удаление эталона из белково-водно-спиртовой смеси раствора осадка фракции II путем лиофилизации оказывает заметное денатурирующее действие на структуру молекул увеличивалось количество агрегатов и димеров а также антикомплементарная активность ИГ. В связи с этим была изучена возможность замены лиофилизации методом ультрафильтрации, получившим в последние годы широкое распространение в биотехнологии. Характеристика растворов осадков фракции II, их изменение после лиофилизации и ультрафильтрации представлены в таблице 3. Полученные результаты показали, что ультрафильтрация не вызывает столь значительных изменений антикомплементарной активности и молекулярного состава белковых растворов и, кроме того, способствует дополнительной очистке иммуноглобулина от сопутствующих белков! Специфическая активность препаратов в пересчете на I г белка при удалении остаточного спирта достоверно не изменялась. При сравнительном исследовании эффективности ультрафильтрации и лиофилизации как альтернативных методов удаления этанола установлено, что тем и другим методами спирт из растворов удаляется полностью.

Таким образом, в результате проведенных исследований усовершенствована существующая технология получения внутривенного иммуноглобулина. Включение в технологическую схему этапа ультрафильтрации, модификация метода кислотно-ферментативного гидролиза позволили м<: ключить дорогостоящую и энергоемкую стадию лиофилизации, значите;;'

Таблица 3

Характеристика растворов осадков фракции II, их изменение после лиофилизации и ультрафильтрации

Показатели Раствор осадка фракции II

До удаления этанола После лиофилизации После ультрафильтрации

анти-стафи-локок-ковый противостолбнячный анти-стафи-локок-ковый противостолбнячный анти-стафи-локок-ковый противостолбнячный

Содержание белка, г/дл 10,10+ 0,32 10,10+ 0,27 14,5+ 0,21 14,10+ 0,26 14,0+ 0,45 13,50+ 0,69

Антикомплементарная активность, мг белка, не активирующих 2 С'Н5о*& 0,14+ 0,02 0,10+ 0,03 0,03+ 0,01 0,03+ 0,01 0,30+ 0,050 0,25+ 0,04

Фракционный состав, кол-во дуг преципитации 4-6 4-6 4-5 4-6 2-3 2-3

Содержание антиальфаста-филолизина, МЕ/мл 50.68+ 1,10 - 71,6+ 1,96 - 71,5+ 2,19 -

Содержание столбнячного антитоксина, МЕ/мл 77,00+ 3,51 - 110,0+ 2,51 - 106,00+8,02

Содержание полимеров ДО*% 1,72+0,18 12,70+0,23 1.80+0,30

Содержание димеров ДО, %* 8,0+0,81 27,50+1,14 8,30+0,35

Концентрация этанола, % 0,70+ 0.09 0,86+ 0,06 0,0 0,0 0,0 0,0

Примечание: *Различия достоверны между показателями в исходном растворе и после лиофилизации & Различия достоверны между показателями в растворах после лиофилизации и ультрафильтрации

но сократить продолжительность производственного процесса, а также получить специфические ИГВВ высокого качества. Доказана воспроизводимость разработанного нами технологического метода в производственных условиях. Предложенный метод относительно прост и доступен, может быть внедрен во всех учреждениях, занимающихся фракционированием белков плазмы крови'.'

Исследования качества полученных ИГ показали, что свежеприготовленные препараты ИГВВ (25 серий антистафилококкового, 10 серий противостолбнячного и 8 серий против клещевого энцефалита) обладали высокой специфической активностью: содержание антиальфастафилолизи-на, столбнячного антитоксина и антител к вирусу клещевого энцефалита более, чем в 5 раз превышало их уровни в стандартном препарате, что соответствовало требованиям ВОЗ (1982, 1988). По своим качественным характеристикам полученные препараты полностью соответствовали нормативным требованиям к внутривенным ИГ, предъявляемым в нашей стране (ФС 42-3159-95). Результаты исследования физико-химических и иммунобиологических свойств разработанных специфических ИГВВ представлены в таблице 4.

Качественные характеристики разработанных препаратов были изучены в динамике в процессе хранения. Изменения свойств антистафилококкового ИГ, выявленные нами через 12 месяцев, не выходили за рамки нормативных показателей. После 24-месячного хранения в трех сериях препарата из 15 возросла антикомплементарная активность, через 36 месяцев в двух из пяти серий уровень специфических антител был ниже 20,0 МЕ/мл. Следовательно, полученный нами антистафилококковый ИГВВ соответствовал нормативным требованиям в течение одного года хранения.

В противостолбнячном ИГВВ через 12 месяцев хранения изменения физико-химических и иммунобиологических свойств исследуемых образцов препарата в сравнении со свежеприготовленными были не достоверны. Через 24 месяца основные параметры оставались в пределах нормы с : -уровень антитоксической активности был ниже 30,0 МЕ/мл.

Таблица 4

Результаты исследования физико-химических и иммунобиологических свойств специфических ИГВВ

Показатели и единицы измерения Требования ФС 423159-95 ИГВВ

антистафи-логакковый, п=25 противостолбнячный, п=10 против клещевого энцефалита, п=8

1 2 3 4 5

Физические свойства: прозрачность (ед.опт.пл.); <0,05 0,010+0,001 0,014+0,003 0,009+0,003

1 цветность (ед.опт.пл.); <0,08 0,021+0,003 0,03+0,06. 0,027+0,004

рН 7,0+0,5 6,87+0,05 6,95+0,11 6,83+0,04

Содержание белка (г/дл); 5,0+0,5 5,04+0,06 4,86+0,15 5,03+0,13

Содержание натрия хлорида (г/дл); 0,9+0,1 0,88+0,01 0,81+0,03 0,83+0,02

Содержание глюкозы (г/дл); 1,0+0,2 0,92+0,02 0,98+0,04 0,90+0,01

Содержание гликокола (г/дл); 0,5+0,2 0,51+0,03 • 0,53+0,02 0,56+0,02,

Электрофоретическая однородность (содержание иммуноглобулинов, %) 100 100 100 100

Количество линий преципитации в иммуно-электрофорезе <2 2 2 2

Молекулярный состав: мономеры, % >60,0 81,15+1,36 82,5+1,72 82,1 + 1,9

дим еры , % <10,0 3,60+0,51 3,60+0,74 6,7+0,7

фрагменты, % <30,0 15,25+0,78 13,90+1,21 11,2+1,5

Окончание таблицы 4

1 2 3 4 5

Антикомплементарная активность (мг белка, не связывающих 2 С'Няо); >10,0 19,4+1,53 18,00+1,92 13,8+2,1

Протеолитическзя активность (ед.опт.пл.) 0,0 0,0 0,0 0.0

Содержание антиаль-фастафилолизина (МЕ): в одном мл -в дозе >2,0 24,2+0,70 605,2± 16,08 - -

Содержание столбнячного антитоксина (МЕ): в одном мл -•в дозе - - 38,50+2,17 1925,0+108,7 -

Титр антител к вирусу клещевого энцефалита* а 80,0

Примечание: * средняя геометрическая обратного титра по данным РТГА

С целью увеличения времени сохранения специфической активности противостолбнячного ИГВВ, создания необходимого запаса препарата для чрезвычайных ситуаций и улучшения транспортабельности была изготовлена лиофилизированная форма ИГВВ. Апробированы три режима лиофилизации с максимальными температурами 2РС, 38° С и 40°С. Предполагалось, что более мягкий режим сушки (21 °С) не окажет денатурирующего воздействия высокой температуры на молекулы и это обеспечит более полное сохранение специфической активности без изменения антикомплементарных свойств. Однако в процессе исследования было установлено, что по своим качественным характеристикам образцы препарата, лиофилизированные по указанным режимам, мало различались и отвечали требованиям, предъявляемым к ИГВВ. Содержание столбнячного антитоксина соответствовало его уровню до лиофилизации. Между тем, образцы, высушенные при температуре 21 °С, имели, более высокий продел влажности (2,8%), общая продолжительность данного режима сушки ч

•■•асов превышала время лиофилизации при 38°С. В образцах препарата, лиофилизированных при максимальной температуре 40°С, происходило некоторое повышение антикомплементарной активности (10,0 мг белка не сзязывали 2 С'РЬо). Таким образом, целесообразно высушивание противостолбнячного ИГВВ проводить по режиму с максимальной температурой jS°C. Использование данного режима лиофилизации дает возможность получения других ИГВВ в сухой форме.

Изучение качественных характеристик противостолбнячного ИГВВ в сухой лекарственной форме при хранении в условиях комнатной температуры показало, что такая форма препарата обеспечивает сохранение специфических антител, физико-химических, иммунобиологических свойств в течение длительного времени (36 месяцев).

При изучении стабильности ИГ против клещевого энцефалита для внутривенного введения через 12 месяцев хранения все свойства препарата не выходили за рамки нормативных показателей. Через 24 месяца отмечено достоверное возрастание уровня антикомплементарной активности, которое ограничивает использование препарата для лечения больных одним годом.

3. Изучение терапевтической эффективности иммуноглобулинов направленного действия для внутривенного введения в клинике и эксперимен-Ye.

Известно, что не существует прямой корреляции между уровнем антител in vitro и их активностью in vivo (Morell А., 1986). Для доказательства эффективности препаратов необходимо проведение клинической апробации.

С целью определения терапевтической эффективности антистафилококкового ИГВВ проведены его клинические испытания (Приказ МЗ СССР .Ns 425 от 18.06.90 г.). Базами для испытаний явились клиники г.г.Кирова, Перми. Москвы.

Исследования проведены на 54 больных с различной патологией, осложненной стафилококковой инфекцией. Ни в одном случае не выявлено

никаких осложнений, связанных с введением ИГВВ.

Применение препарата в лечении тяжелообожженных привело к повышению общей эффективности комплексной терапии. В большинстве случаев после курса лечения улучшалось общее состояние больных, уменьшались симптомы интоксикации. Это сопровождалось более выраженной положительной динамикой таких показателей, как температура тела, частота пульса, общее число лимфоцитов, содержание Т-лимфоцитов, иммуноглобулинов класса С, фагоцитарная активность нейтрофилов, фагоцитарный -индекс и содержание антиальфастафилолизина в крови больных.

Включение ИГ в комплексное лечение при некоторых неспецифических заболеваниях легких существенно улучшало течение заболеваний, ускоряло купирование воспалительного процесса с бронхоспастическим синдромом и улучшало динамику иммунологических показателей. Отмечено статистически значимое возрастание уровня антиальфастафилолизина.

Использование антйстафилококкового ИГВВ у больных с острыми хирургическими заболеваниями органов брюшной и грудной полостей, травмами головы, шеи, живота, у которых заболевание протекало с выраженными гнойно-септическими осложнениями, вызванными стафилококком в монокультуре или в сочетании с другими возбудителями, подтвердило высокую клиническую эффективность разработанного препарата.

.. . При применении препарата в комплексной терапии вторичных заболеваний у детей больных ВИЧ-инфекцией, сепсисом удалось достигнуть улучшения или стабилизации состояния пациентов.

Клинические исследования позволили рекомендовать следующие дозировки препарата:

- при генерализованной стафилококковой инфекции препарат вводят в разовой дозе 5-7 МЕ антиальфастафилолизина на 1 кг массы тела больного. Интервал между введениями составляет 24-72 часа. Кратность введения в зависимости от тяжести заболевания - до 10 инфузий.

- для детей разовая доза препарата составляет 5-7 МЕ на 1 кг ?!,:.: -но не более 25 мл. Инфузии проводят через 24-72 часа до 10 иг гу. с:

ння.

На препарат утверждена нормативно-техническая документация: ВФС 42-2854-97 от 11.03.1997 г., изменения к регламенту производства № 2 н № 8 от 15 марта 1993 г., инструкция по применению (утверждена МЗ РФ 15.03.1993 г.). Препарат выпускается серийно для лечебных учреждений станцией переливания крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови, Нижегородским государственным предприятием по производству бактерийных препаратов, его выпуск осваивается также Нижегородским областным центром крови.

Клинические испытания ИГ против клещевого энцефалита для внутривенного введения проведены в соответствии с Программой и методикой оценки лечебной эффективности препарата, утвержденной Председателем Комитета по иммунобиологическим препаратам при Минздраве РФ Н.В.Медуницыным от 12.07.94 г. № 01-07/219. Испытания проведены на клинических базах г.г. Хабаровска и Екатеринбурга на 84 больных менин-геальной и очаговыми формами клещевого энцефалита. Дозы испытуемого препарата и препарата сравнения (ИГ человека против клещевого энцефалита для внутримышечного введения) были адекватными по специфической 'активности. Соблюдался принцип равноценности тяжести заболевания в опытной группе и группе сравнения.

При сопоставлении воздействия внутривенного препарата и препарата сравнения на течение менингеальной формы клещевого энцефалита отмечено, что опытный ИГ эффективнее по срокам нормализации общего состояния, регресса менингеальных симптомов, санации ликвора. При очаговых формах клещевого энцефалита удалось установить положительное влияние специфической терапии ИГВВ против клещевого энцефалита на динамику регресса менингеальных симптомов и санацию ликвора. Отмечена значимость максимально раннего начала проведения специфического лечения заболевания. Установлена безвредность и ареактогенность ИГ против клещевого энцефалита для внутривенного введения.

Клинические испытания позволили рекомендовать следующие дози-

ровки препарата:

- больным менннгеальной формой инфекции необходимо вводить препарат в разовой дозе 25,0 мл, в суточной - 25,0 мл. Продолжительность введения - до 6 дней ежедневно. При этом курсовая доза составляет до 150,0 мл.

- больным Очаговыми формами клещевого энцефалита при разовой дозе 25,0 мл суточная доза составляет 50,0 мл. Продолжительность введения - не менее 6 дней ежедневно. На курс вводится не менее 300,0 мл препарата.

Установлено, что экономический эффект при специфической терапии клещевого энцефалита внутривенным ИГ в сравнении с большими дозами внутримышечного препарата (в той же условно нейтрализующей дозе) составляет 1,944 млн.руб. в расчете на одного больного менингеальной формой инфекции и 3,89 млн.руб. - очаговыми формами (в ценах на 1.01.97 г.).

На препарат составлена и направлена в Фармкомитет РФ на утверждение необходимая нормативно-техническая документация (письмо ГИСКа им. A.A. Тарасевича от 9.07.97 г. № 01-46/5):

- отчет о результатах оценки лечебной эффективности применения иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения (одобрен Ученым советом ГИСКа 7.10.97 г., протокол № 17),

- ВФС на препарат,

- регламент производства препарата,

- инструкция по его применению.

Внедрение препарата в широкую клиническую практику позволит повысить эффективность лечения больных клещевым энцефалитом при значительном снижении материальных затрат.

В эксперименте было изучено лечебное действие и превентивные свойства противостолбнячного ИГВВ как в жидкой, так и в сухой формах. В качестве модели столбняка нами были выбраны белые беспородные м</-ши, получившие летальную дозу столбнячного токсина. Превентч№:

:чебные свойства противостолбнячного ИГВВ изучали в сравнении с жмерческим противостолбнячным ИГ, применяемым внутримышечно, озы для введения ИГ были установлены согласно рекомендациям ВОЗ 982) и действующей нормативно-технической документации. В первой се-ш экспериментов препараты вводили в начале инкубационного периода -рез 30 минут после заражения животных летальной дозой столбнячного 1ксина, во второй - через 24 часа, на фоне появления первых признаков олбняка. Наблюдения за животными проводили ежедневно, учитывая юявления заболевания и выживаемость.

Лучшие результаты были получены при использовании препарата я внутривенного введения. Причем инфузия ИГВВ непосредственно в овеносное русло через 30 минут после заражения животных полностью йтрализовала действие столбнячного токсина. Его применение в более здние сроки (через 24 часа) предохраняло всех животных от гибели, а у Уо из них купировало клинические признаки столбняка. Результаты экс- N риментальных испытаний противостолбнячного ИГВВ свидетельствуют го высокой протективной активности и лечебной эффективности.

Таким образом, в результате проведенных исследований определены тональные пути комплектования групп доноров иммунной плазмы для :личения объемов ее заготовки, разработана технология получения ан-ггафилококкового, противостолбнячного, против клещевого энцефалита ВВ. Доказана выраженная специфическая активность и высокая эффек-(ность новых препаратов в терапии бактериальных и вирусных инфек-1.

ВЫВОДЫ

1. Комплексный научно-обоснованный подход к проблеме созда-препаратов специфических внутривенных иммуноглобулинов позволил еделить источники заготовки иммунного сырья в необходимых объ-■. ^ совершенствовать технологию изготовления и получить антистафи-

лококковый, противостолбнячный, против клещевого энцефалита ИГВВ, оценить их терапевтическую эффективность.

2. Серологический скрининг донорской крови и плазмы на наличие "естественных" антибактериальных и противовирусных антител обеспечивает рациональное использование донорской крови и донорских кадров, открывает перспективы увеличения производства и расширения номенклатуры специфических ИГВВ.

3. Целенаправленный отбор доноров - активных продуцентов антител для проведения намеренной иммунизации стафилококковым, столбнячным анатоксинами, вакциной против клещевого энцефалита позволяет увеличить число иммуноактивных доноров, отстранить от иммунизации ареактивных к конкретному антигену лиц и тем самым предотвратить неоправданную антигенную нагрузку на их организм, сократить нецелесообразные материальные затраты.

4. Установлены требования к исходной иммунной плазме:

- оптимальные уровни содержания антител в плазме, гарантирующие получение ИГВВ с высокой специфической активностью: для антистафилококковой плазмы - 4,5+0,5 МЕ/мл антиальфастафилолизина; для противостолбнячной плазмы - 7,5 +0,5 МЕ/мл столбнячного антитоксина; для противоэнцефалитной плазмы - титр антител к вирусу клещевого энцефалита не менее 1:10;

- максимальные сроки хранения антистафилококковой, противостолбнячной, противоэнцефалитной плазмы: 1 месяц при температуре 6,0 ±4,0°С, 3 месяца при температуре не выше - 20°С.

5. Предложенный метод изготовления специфических ИГВВ включает ультрафильтрацию, что дает возможность исключить из технологического процесса дорогостоящую и энергоемкую стадию лиофилизации, сократить продолжительность производственного цикла и улучшить качественные характеристики препаратов.

6. Усовершенствованный технологический метод кислотно-ферментативного гидролиза позволяет получать ИГВВ высокого качества

со специфической активностью: антистафилококковый ИГ - не менее 20 ME/мл антиальфастафилолизина; противостолбнячный ИГ - не менее 30 ME/мл столбнячного антитоксина; ИГ против клещевого энцефалита - титр антител к вирусу клещевого энцефалита не менее 1:40.

7. Созданы новые препараты ИГВВ: антистафилококковый (ВФС 42-2854-97 от 11.03.97 г., изменения к регламенту производства № 2 и № 8 от 15 марта 1993 г.), противостолбнячный, против клещевого энцефалита, определены условия их получения и требования к ним.

8. Впервые разработана сухая лекарственная форма ИГВВ - противостолбнячного, срок хранения которого в три раза превышает аналогичный показатель для препарата в жидкой форме. Это позволяет иметь его запас на случай стихийных бедствий и катастроф.

9. Доказана высокая лечебная эффективность разработанных ИГВВ: штистафилококкового и против клещевого энцефалита - в клинике, противостолбнячного - в эксперименте, установлены их разовые и курсовые юзы. "

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Научно-организационные принципы массовой заготовки плазмы рови для обеспечения потребности ЛПУ в компонентах и препаратах крои /В.А.Журавлев, Г.А.Тимофеев, И.М.Думкин, С.А.Ситников, '.А.Ситникова, С.Ю.Васенин, Л.Г.Шканакин, С.Л.Шарыгин// Второй Все-оссийский съезд гематологов и трансфузиологов: Тезисы докладов (30 гнт.-2 окт. 1986 г. Челябинск). - Челябинск, 1986. - С.53-54.

2. Зайцева Г.А., Козьминых Л.Ф., Шарыгин С.Л. и др. Оценка раз-ичных источников получения иммунной плазмы// Актуальные вопросы эансфузиологии: Материалы научн.конф. - Л., 1987. - С.25.

3. Зайцева Г.А:; Новикова Н.Д., Шарыгин С.Л. Прогнозирование иска развития гнойно-септических инфекций по иммуногенетическим мзнакам // Экономические проблемы иммунологии и аллергологии: I

■-укологический съезд Белоруссии. - Минск, 1990. - С. 128.

4. Шарыгин С.Л., Сапожникова B.C. Внутривенное применение иммуноглобулина в клинической практике (по материалам зарубежной литературы) // Клинич.медицина. - 1991. - № 7. - С.20-23.

5. Шарыгин С.Л. Внутривенное введение иммуноглобулина при тромбоцитопениях у взрослых (по материалам зарубежной литературы) // Советская медицина".'- 1991. - № 7. - С. 37-39.

6. Шарыгин С.Л. Иммуноглобулины для внутривенного введения в педиатрической практике // Педиатрия. -1991. - № 9. - С.105-107.

7. Шарыгин С.Л., Порохненко С.Г., Тимофеева М.А. и др. Потребность лечебных учреждений в специфических иммуноглобулинах для внутривенного введения, получение иммунного сырья и разработка оптимальной технологии изготовления препаратов // III Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов: Тезисы докладов (окт.1991 г., г.Киров). - М., 1991. -Т.1.-С.100-101.

8. Зайцева Г.А., Власова Л.В., Шарыгин С.Л. и др. Распределение типов гаптоглобина у здоровых людей и при некоторых видах патологии //III Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов: Тезисы докладов (окт. 1991 г., г. Киров). -М„ 1991. - т.Ш. - С.681-682.

9. Шарыгин С.Л., Сапожникова B.C. Комплексная программа разработки специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения. II Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Материалы научн.конф. (2-3 марта 1993 г.) - Киров, 1993. - С.3-4.

10. Сапожникова B.C., Кардовский А.Г., Шарыгин С.Л. Новый лечебный препарат из донорской плазмы - иммуноглобулин человека антистафилококковый для внутривенного введения // Новое в трансфузиологии: Информац.бюл. - 1994. - № 5. - С.36-38.

11. Шарыгин С.Л. Основные направления научных исследований Кировского НИИ гематологии и переливания крови // Новое в трансфузиологии: Информац.бюл. - 1994. - № 7-8. - С. 12-14.

12. Егорова Т.В., Мальцева О.В., Лазыкина A.B., Шарыгин С.Л. Получение внутривенного иммуноглобулина с высоким титром антител про-

тив клещевого энцефалита и его применение у детей II Актуальные вопросы клинической педиатрии, акушерства и генекологии: Материалы 3-й научной конф. (29-30 сент. 1994 г.). - Киров, 1994. - С.65-66.

13. Исаева Н.В., Зайцева Г.А., Шарыгин С.Л., Сергеев Н.М. Сравнительная характеристика иммунологических показателей доноров, обследованных с 1989-1994 г.г. // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Материалы научн.-практ. конф. ин-та по итогам работы в 1994 г. - Киров, 1995. - С. 3-4.

14. Лазыкина A.B., Мальцева О.В., Вальцева Л.Н., Шарыгин С.Л., Матвеев Г.А. Некоторые модификации технологии изготовления иммуноглобулинов для внутривенного введения // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Материалы науч.-практ.конф. ин-та по итогам работы в 1994 г. - Киров, 1995. - С. 12-13.

15. Кардовский А.Г., Зайцева Г.А., Шарыгин С.Л. Повышение эффективности трансфузионной терапии тяжелообожженных // Восьмая научная конференция по проблеме: Ожоги. - С.-Петербург, 1995. - С. 71-72.

16. Лазыкина A.B., Мальцева О.В., Шарыгин С.Л. и др. Применение ультрафильтрации для удаления этанола из полуфабриката иммуноглобулина // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: (Тезисы докладов Российской конф. 6-8 июня 1995 г., С.-Петербург). - С.-Петербург, 1995.-С.304-305.

17. Лазыкина A.B., Мальцева О.В., Мигунов В.Н., Шарыгин С.Л., Матвеев Г.А. Изучение ферментолиза при получении иммуноглобулина для знутривенного введения // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: (Тезисы докладов Российской конф. 6-8 июня 1995 г., С.Петербург). - С.-Петербург, 1995. - С.303.

18. Шарыгин С.Л. Иммуноглобулины направленного действия для щутривенного введения II Медицинские технологии. - 1995. - № 5. - С.36-38.

19. Шарыгин С.Л. Проблемы развития службы крови в новых эконо-шческих условиях II Новое в трансфузиологии: Информац.бюл. - 1995. - № I С29-33.

20. Шарыгин С.Л. Программа создания отечественных специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения на базе Кировского НИИГиПК Н Препараты крови и кровезаменители - производство, контроль и клиническое применение: Материалы научн. - практ.конф. - Киров, 1995.-С. 19-21.

21. ШарыгиН СЛ., Лазыкина A.B., Мальцева О.В., Матвеев Г.А. Опыт получения противостолбнячного иммуноглобулина для внутривенного введения// Препараты крови и кровезаменители - производство, контроль и клиническое применение: Материалы научн.-практ.конф.- Киров, 1995. С.49-50.

22. Шарыгин С.Л.,Матвеев Г.А., Старостина Е.Е. К вопросу об организации титрования естественных антител в плазме доноров // Препараты крови и кровезаменители - производство, контроль и клиническое применение: Материалы научн.-практ. конф. - Киров, 1995. - С.63-64.

23. Синицына Г.М., Шарыгин С.Л., Зайцева Г.А. и др. Оценка эффективности нормального иммуноглобулина человеческого для внутривенного введения при бронхиальной астме // Препараты крови и кровезаменители - производство, контроль и клиническое применение: Материалы научн,- практ. конф. - Киров, 1995. - С.78-79.

24. Кардовский А.Г., Зайцева Г.А., Шарыгин С.Л. Иммуноглобулины для внутривенного введения в лечении тяжелообожженных // Препараты крови и кровезаменители - производство, контроль и клиническое применение: Материалы научн. - практ.конф. - Киров, 1995. - С.93-95.

25. Шарыгин С.Л. Осложнения при гемотерапии //Терапевт.арх. -1995. - Т.67, N 7. - С.85-87.

26. Исаева Н.В., Зайцева Г.А., Шарыгин С.Л., Куноф В.К. Результаты иммунологического обследования доноров крови и плазмы // Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация: Тезисы докл.Всерос. конф. (23-24 ноября 1995 г.). - М„ 1995. - С.70-71.

27. Шарыгин С.Л. Разработка препаратов из донорской крови и плазмы - важнейшее направление научной деятельности Кировского НИИ

гематологии и переливания крови // Новое в трансфузиологии: Инфор-мац.бюл. - 1996. - N 13. - С.16-19.

28. Кардовский А.Г., Шарыгин СЛ., Зайцева Г.А., Шардаков В.И. Специфические иммуноглобулины в лечении обожженных // INTERNATIONAL JOURNAL ON IMMUNOREHABILITATION, May. -1996.-N2. - P.268.

t

29. Мальцева О.В., Шарыгин С.Л., Лазьпсина A.B. и др. К вопросу технологии получения иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения // Современные достижения биотехнологии: Материалы Всероссийской конф. (Ставрополь, июль 1996 г.) -Ставрополь, 1996. - С.285.

30. Шарыгин С.Л., Лазыкина A.B., Матвеев Г.А., Мальцева О.В. Препараты иммуноглобулинов из плазмы донорской крови // Лекарственное обозрение: Научн.-практ. журнал Кировского гос. мед. ин-та для врачей. - 1996.-N4.-С.40-43.

31. Мальцева О.В., Лазыкина A.B., Матвеев Г.А., Шарыгин С.Л., Деловальникова О.П. Получение и изучение свойств иммуноглобулина че-ювека против клещевого энцефалита для внутривенного введения /Вопросы трансфузиологии и клинической медицины: (Материалы на-'чн.конф. 5-6 марта 1996 г.). - Киров, 1996. - С. 5-$.

32. Лазыкина A.B., Шарыгин С.Л., Зленко В.И. К вопросу получения [ммуноглобулина для внутривенного введения из внутримышечного пре-арата // Вопросы трансфузиологии и клинической медицины: (Материалы аучн.конф. 5-6 марта 1996 г.).- Киров, 1996. - С.7-8.

33. Харламова A.B., Шарыгин С.Л., Матвеев Г.А. О способах полу-ения иммуноглобулинов для внутривенного введения // Вопросы трансфу-юлогии и клинической медицины: (Материалы научн.конф. 5-6" марта >96 г.)-Киров, 1996.-С.17-18.

34. Старостина Е.Е., Шарыгин С.Л., Матвеев Г.А. Первый опыт ра-ггы группы титрования плазмы доноров // Вопросы трансфузиологии и

. .".хкой медицины: (Материалы научн.конф. 5-6 марта 1996 г.). - Ки-

ров, 1996.-С. 18-20.

35. Лазыкина A.B., Мальцева О.В., Гребенева Г.А., Шарыгин С.Л., Матвеев Г.А. Удаление пирогенов из растворов иммуноглобулина // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Тезисы докладов III Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов. - С.Петербург, -1996.-С.77. -- -

36. Мальцева О.В., Лазыкина A.B., Шарыгин С.Л. и др. Разработка технологии получения внутривенного иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Тезисы докладов III Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов. - С.Петербург, 1996. - С.78.

37. Шарыгин С.Л., Матвеев Г.А., Лазыкина A.B., Мальцева О.В. Некоторые итоги работы по созданию специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Тезисы докладов III Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов - С.-Петербург, 1996. - С.78.

38. Шарыгин С.Л. Заготовка и фракционирование плазмы с целью получения иммуноглобулинов для внутривенного введения // Новое в трансфузиологии: Информац.бюл. - 1996. - N 16. - С. 17-26.

39. Лечение инфекционных осложнений при проведении современных программ терапии острых лейкозов: (Метод.рекомендации) (Сост.

B.В.Черепанова, Е.П.Сведенцов, С.Л.Шарыгин и др.). - Киров, 1996. - 6 с.

40. Сапожникова B.C., Шарыгин С.Л. Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения II Пат.РФ N 2068695. - 10.11.1996.

41. Мальцева О.В., Старостина Е.Е., Шарыгин С.Л., Матвеев Г.А. Исследование содержания антител к вирусу клещевого энцефалита в плазме доноров // Актуальные вопросы трансфузионной и клинической медицины: (Материалы научн. конф. 16-17 апр. 1997 г.).- Киров, 1997. -

C.25.

42. Евдокимов Е.В., Надеждина М.В., Бадаев Р.И., Котов Н.Б., Шарыгин С.Л. и др. Изучение эффективности противоэнцефалитного внутри-

венного иммуноглобулина человека при тяжелых формах клещевого энцефалита II Актуальные вопросы трансфузионной и клинической медицины: (Материалы научн.конф. 16-17 апр. 1997 г.) - Киров, 1997. -С.26-27.

43. Шарыгин СЛ., Зайцева Г.А., Матвеев Г.А. и др. Иммунные препараты из донорской плазмы для внутривенного введения // Новое в трансфузиологии: Информац.бюл. - 1997. - N 17. - С. 5-12.

44. Мальцева О.В., Лазыкина A.B., Шарыгин С.Л. и др. Актуальные вопросы заместительной иммунотерапии клещевого энцефалита // Вестник службы крови России. - 1997. - N 1. - С. 31-33.

Автор выражает сердечную благодарность сотрудникам лаборатории препаратов кр.ови, иммуногематологии, станции переливания крови, экс-перементально-биологической клиники, отделения клинической трансфу-зиологии, гемотерапевтического отдела Кировского НИИ гематологии и переливания крови, Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов, Хабаровского НИИ эпидемиологии и микробиологии, Хабаровского предприятиятия по производству иммунобиологических препаратов, Свердловской ОСПК (г.Первоуральск), кафедры госпитальной хирургии Пермской государственной медицинской академии, Центрального НИИ эпидемиологии (г.Москва), городского центра диагностики и лечения клещевого энцефалита и Лайм-боррелиоза (г.Екатеринбург) активно содействовавшим выполнению данной работы.