Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Оптимизация параметров иммунологической безопасности и специфической активности жидкой формы препарата "Габриглобин-IgG"

БОЧКАРЕВА Светлана Сергеевна

ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЖИДКОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА «ГАБРИГЛОБИН-1§С»

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 [Г.Р /-012

Москва - 2012

005013245

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители: Лютов Андрей Германович

доктор биологических наук, профессор

Новикова Лидия Ивановна

кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

Русанов Валентин Михайлович

доктор медицинских наук, профессор, ГБУЗ г. Москвы «Станция переливания крови Департамента Здравоохранения г. Москвы», заместитель главного врача по производству

Краснопрошина Людмила Ивановна доктор медицинских наук, профессор НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, заведующая лабораторией иммунологических методов исследования

Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Государственный научный центр РФ «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства.

Защита диссертации состоится »¿.'2012 г. в ^ " часов на

заседании диссертационного совета Д 208.046.02. при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время в России ежегодно регистрируются около 30 миллионов инфекционных больных, а в годы эпидемических подъемов их число может достигать 60 и более миллионов человек. Бактериальные и вирусные инфекции приобретают все более тяжелое течение, затяжной характер и с трудом поддаются самым интенсивным методам лечения [Захаренко С. М., 2009]. Перспективным направлением в этой связи является терапия иммуноглобулинами для внутривенного введения (ВВИГ), которые, обладая доказанной эффективностью и высокой биодоступностью, являются средствами пассивной защиты, обеспечивая опсонизацию, нейтрализацию и выведение из организма бактерий, вирусов и токсинов [Качанов Д.Ю. и соавт., 2011; Rodriguez А. et. al., 2005]. Включение конкретного иммуноглобулинового препарата в комплекс лечебных мероприятий определяется рядом факторов, основные из которых - его безопасность и эффективность [Конюхов A.B. и соавт., 2010].

Базовым показателем иммунологической безопасности ВВИГ является отсутствие анафилактоидных реакций организма при внутривенных инфузиях, обеспечивающееся низкой антикомплементарной активностью препарата [Европейская фармакопея, 2011]. Антикомплементарная активность - это способность молекул иммуноглобулина после попадания в кровоток спонтанно активировать систему комплемента [Gardi А., 1984]. Клиническая эффективность характеризуется спектром бактериальных и вирусных антигенов, к которым ВВИГ содержит антитела, процентным содержанием иммуноглобулинов не изменивших свою мономерную структуру в процессе технологической обработки, а также длительностью их циркуляции в организме после введения пациенту [Румянцев А.Г., 2011].

Наибольшего соответствия указанным параметрам добились зарубежные производители. Их препараты «Пентаглобин», «Интраглобин», «Хумаглобин», «Биавен», «Октагам», «ИГ Вена», «Гамимун Н» и др. широко и успешно используются в мировой практике для лечения целого ряда бактериальных и вирусных инфекций [Плахута Т.Г. и соавт., 2006; Бойко А.Н. и соавт., 2010; Сенбаева А.Д. и соавт, 2010]. В то же время в рамках направления, заданного правительством РФ в принятом документе «Концепция долгосрочного социально-экономического развития Российской Федерации на период до 2020 года», одной из актуальнейших задач российского биотехнологического сектора является создание конкурентоспособных медицинских иммунобиологических препаратов, которые по своим потребительским характеристикам не должны уступать импортным аналогам. Примером успешной реализации данной программы может служить ВВИГ «Габриглобин», разработанный сотрудниками Московского НИИЭМ им.

Г.Н.Габричевского на базе фармацевтического предприятия «Иммуно-Гем». Препарат имеет низкое значение рН, производится без использования в технологическом процессе протеолитических ферментов и химических модификаторов, что позволяет полностью сохранить биологическую активность и естественные бифункциональные свойства молекулы иммуноглобулина в [Лютов А.Г., 2007]. Однако семилетний опыт промышленного производства и клинического применения лиофилизированной формы препарата «Габриглобин» выявили ряд технологических и потребительских недостатков, требующих пристального изучения и последующего устранения.

Цель работы: совершенствование технологии получения жидкой лекарственной формы габриглобина с гарантированной низкой

антикомплементарной активностью и широким спектром специфических антител к бактериальным и вирусным антигенам. Задачи исследования:

1. Изучить динамику снижения антикомплементарной активности препарата «Габриглобин-^в» в процессе выполнения диализа-диафильтрации и оптимизировать условия проведения данной стадии.

2. Установить факторы, определяющие качество конечного продукта, и внедрить усовершенствованную технологию производства жидкой формы препарата «Габриглобин-^О» на станциях переливания крови.

3. Оценить спектр и количественное содержание антител, присутствующих в жидкой форме препарата «Габриглобин-^в», в сравнении с коммерческими аналогами.

4. Выявить особенности распределения антител в препарате «Габриглобин-^С» в зависимости от региона его производства.

5. Обобщить опыт использования препарата «Габриглобин-1§С», обладающего широким спектром активности в отношении патогенов вирусной и бактериальной природы, при ряде заболеваний (состояний) инфекционного характера.

Научная новизна

Получены новые данные о динамике снижения антикомплементарной активности полуфабриката иммуноглобулина в процессе диализа.

Выявлено, что основным параметром, определяющим иммунологическую безопасность препарата, а именно, низкую антикомплементарную активность, является качество дистиллированной воды, используемой в производственном процессе.

Предложен способ снижения антикомплементарной активности методом диализа-диафильтрации, что оптимизировало технологию получения габриглобина,

и позволило обеспечить гарантированную иммунологическую безопасность жидкой формы лекарственного средства.

Определено, что в препарате «Габриглобин-IgG» содержится широкий спектр антител в высоком титре к следующим возбудителям инфекционных заболеваний: дифтерийной палочке, коклюшному токсину, вирусам семейства Herpesviridae, вирусам гриппа, клещевого энцефалита, респираторно-синцитиальному вирусу. Кроме того, во всех изученных образцах «Габриглобин-IgG» обнаружено достаточно большое количество антител к антигену CagA Helicobacter pylori.

Выявлена тесная взаимосвязь между титрами антител к возбудителям краснухи и клещевого энцефалита в препарате «Габриглобин-IgG» и заболеваемостью населения, проживающего на территориях сбора донорской плазмы как исходного сырья для получения иммуноглобулина.

Практическая значимость

Предложенный способ уменьшения антикомплементарной активности путем диализа-диафильтрации, позволивший сократить длительность данной стадии в 4-6 раз, внедрен в технологический процесс производственного получения препарата «Габриглобин-IgG» на Ивановской областной станции переливания крови..^

Внесены изменения в нормативную документацию на препарат «Габриглобин-IgG» (JIC-000412) - каждая серия препарата по требованиям фармакопейной статьи (ФСП № 42-8743-07) титруется на содержание антител к ЦМВ, вирусу" простого герпеса и вирусу гриппа. Данная информация указывается на упаковке препарата, что позволяет адекватно использовать его, отбирая серии габриглобина с повышенным титром антител к тому или иному возбудителю.

Отечественный препарат внутривенного иммуноглобулина «Габриглобин-IgG» по разнообразию и величине титров антител не уступает, а по ряду показателей превосходит импортные аналоги.

Внедрение результатов исследования в практику

Организовано серийное производство жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения с торговым названием «Габриглобин-IgG, раствор для инфузий» (ЛС-000412) на ГУЗ «Ивановская ОСПК» с июня 2009 г., а ГУЗ «Самарская областная клиническая станция переливания крови», ГУЗ «Тамбовская ОСПК», ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови» зарегистрированы в качестве производственных площадок выпуска препарата «Габриглобин-IgG».

Внесены изменения в нормативную документацию на препарат «Габриглобин» (ФСП № 42-8743-07), касающиеся дополнительного указания на упаковке препарата титра антител к ЦМВ, вирусу простого герпеса и вирусу гриппа.

Данные о спектре и титрах антител, присутствующих в препарате

«Габриглобин-^С», характеризующие его клиническую эффективность, обобщены в информационном письме «Использование поливалентного иммуноглобулина для внутривенного введения «Габриглобин-^О» при лечении бактериальных и вирусных инфекций» (утверждено на заседании Ученого совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора 16.12.2010 г.).

Положения, выносимые на защиту

1. Оптимизированная технологическая схема, включающая стадию диализа-ультрафильтрации и использование высококачественной дистиллированной воды, позволяет получать жидкую форму габриглобина («Габриглобин-^С») с гарантированной низкой антикомплементарной активностью, что обеспечивает его высокую иммунологическую безопасность.

2. Отечественный нормальный иммуноглобулин для внутривенного введения «Габриглобин-1§С» содержит широкий спектр антител к бактериальным и вирусным патогенам в достаточно высоких титрах, в связи с чем препарат может использоваться как для профилактики, так и терапии различных видов инфекционной патологии.

Апробация работы

Диссертация апробирована на совместном заседании секций Ученого совета «Медицинская биотехнология» и «Общая и прикладная иммунология»

МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского 15 февраля 2012 г. Основные положения диссертационной работы были доложены на Международной научно-практической конференции по донорству крови (Архангельск, 2001), на «Научно-практической конференции по иммунологии» (Москва, 2003), на научной конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2005), на научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008), на Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2008), на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009), на Санкт-Петербургском Международном форуме по фармацевтике и биотехнологиям (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 21 работа, в том числе 6 в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 138 страницах и состоит из введения, обзора

6

штературы, описания материалов и методов, трех глав с изложением результатов :обственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает !03 источника, из них 148 отечественных и 55 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 16 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом исследования служили коммерческие и экспериментально-производственные серии препаратов ВВИТ: б серий препарата «Габриглобин-IgG», серийно выпускаемого Ивановской ОСПК, три экспериментальные серии иммуноглобулина с повышенным титром антител к цитомегаловирусу («Габриглобин-анти-ЦМВ») и девять экспериментально-производственных серий препарата, полученных на Челябинской, Свердловской и Белгородской ОСГЖ.

В качестве препаратов сравнения был использован «Иммуноглобулин человека нормальный» для внутривенного введения (ИГЧН) производства Нижегородского филиала «Имбио» ФГУП «Микроген» и импортные препараты: «Хумаглобин» (Венгрия), «Октагам» (Австрия), «ИГ Вена» (Италия), «Интраглобин» (Германия). Препараты зарубежного производства были любезно предоставлены заведующей лабораторией иммуноглобулинов ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения и социального развития РФ к.м.н. Лаптевой JI.K.

В процессе совершенствования процедуры диализа использовано 1200 литров фильтрата «Б», получаемого в качестве промежуточного продукта производства препарата «Габриглобин-IgG» на Ивановской ОСПК.

Стадию концентрирования осуществляли на ультрафильтрационном модуле, состоящем из держателя с 5 кассетами фирмы «Владисарт» (Россия) и шестеренчатого насоса с регулируемой производительностью «Flender himmul» (Германия). Диализ полуфабриката иммуноглобулина выполняли по Брок Т. [1987] в вискозных оболочках.

Воду очищенную получали на установке «Шарья» производительностью 500 л/час фирмы «Биотехпрогресс» (Россия) и с помощью обратноосмотической модульной установки «Rochem» RORO 0120 («Рокем сервис», Россия).

Осветляющую и стерилизующую фильтрацию препарата проводили с использованием фильтров УСФ ПО «Прогресс» (Россия). В качестве фильтрующего материала применяли фильтрокартон и капроновые мембраны фирмы "Pall" (Германия) с порами 0,8, 0,45 или 0,22 мкм.

Количественное определение NaCl в пермеате проводили методом пламенной фотометрии и с использованием кондуктометра «КЭЛ-1М» (Россия), предварительно откалиброванного по эталонным растворам NaCl.

Антикомплементарную активность (АКА) габриглобина определяли в реакции связывания комплемента, изложенной в ФСП № 42-0265-1621-01.

Определение молекулярных параметров иммуноглобулиновых препаратов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе «Стайер» производства НПКФ «Аквилон» (Россия) на колонке Phenomenex bio ser-se-s-4000 (США).

Содержание специфических антител IgG-класса в ВВИТ определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) согласно инструкциям к наборам, а результаты регистрировали с помощью планшетных фотометров "Multiscan MS" и "Multiscan EX" фирмы "Labsystems" (Финляндия), измеряя оптическую плотность при длине волны 450 нм. Результаты выражали в виде МЕ/мл, относительных единиц, коэффициента позитивности (КП), титра (последнего положительного разведения иммуноглобулина) или арбитражных единиц (АЕ) [Handsfield Н. et al., 1987].

Анализ физико-химических и биологических параметров «Габриглобина-IgG» осуществляли в аттестованной лаборатории ОКК Ивановской станции переливания крови.

Раздел работы, посвященный расширению сферы клинического применения препарата «Габриглобин-IgG», выполнялся совместно с сотрудниками ФГУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова» -профессором Попцовым В.Н., к.б.н. Козловой М.Н. и Санкт-Петербургского ФГБУ «НИИ Детских Инфекций ФМБА» России - профессором Скрипченко Н.В.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ «Excel 4.0» и «Statistica 5.7».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Совершенствование технологии производства габриглобина

Первый этап исследования был посвящен оценке антикомплементарной активности габриглобина, как основного фактора его иммунологической безопасности, на всех стадиях производства и совершенствованию технологии для гарантированного обеспечения низких значений данного показателя в промышленных сериях препарата. До сих пор в процессе производства габриглобина для снижения антикомплементарной активности использовался диализ в вискозных оболочках - весьма эффективный, но технологически сложный, не поддающийся механизации метод, продолжающийся в течение 18 часов. Нами было предложено заменить ручной диализ методом ультрафильтрации на плоскокамерных аппаратах, задействованных при первичном концентрировании фильтрата «Б» (рис. 1). Время проведения'данной технологической стадии сокращалось в 4-6 раз.

В дальнейшем при выполнении серии экспериментов с различными вариантами ведения данного процесса установили, что простое увеличение циклов

Спиртовое фракционирование Концентрирование фильтрата «Б» ультрафильтрацией при величине рН 4,2

I

Стадия снижения антикомплементарной активности (диализ) Вирусинактивация: Выдерживание при рН 4,2 в течение 21 суток Высушивание или Розлив

\

Габриглобин (сухой)

или

Габриглобин-^в (жидкий)

Рисунок 1. Схема получения габриглобина.

диафильтрации с 5 до 10 или проведение двукратной ультрафильтрации с промежуточной осветляющей фильтрацией не влияло на связывание иммуноглобулина с комплементом. Внесение в полуфабрикат ВВИТ хлорида натрия или мальтозы с последующей диафильтрацией также существенно не изменяло степень активации комплемента иммуноглобулином. Наиболее эффективным оказалось удаление остаточного этанола и хлорида натрия из иммуноглобулина потоком диализирующего раствора, отделенного от продукта мембраной, с использованием противотока концентрируемого продукта и диализирующей жидкости. При этом содержание низкомолекулярных ионов в фильтрате в процессе диафильтрации контролировали кондуктометром с проточной ячейкой. Таким образом определили, что электропроводность пермеата (фильтрата) (рис. 2) зависела от первоначального содержания низкомолекулярных веществ в полуфабрикате иммуноглобулина и снижалась пропорционально увеличению циклов диафильтрации, достигая постоянного значения после 5-го цикла. Для достижения постоянного значения электропроводности пермеата требовалось от 15 до 20 объемов диализирующего раствора.

Первоначально процесс диализ-диафильтрации был опробован нами в лабораторных условиях, причем качество получаемых образцов габриглобина соответствовало требованиям нормативной документации: содержание мономерного

в полученном препарате составило более 99%, а антикомплементарная активность - 10 мг белка не активирующих 2СН50.

При внедрении процедуры диализ-диафильтрации на Ивановской ОСПК было обнаружено что, антикомплементарная активность трех из пяти экспериментальных серий составила только 5 мг белка, не активирующих комплемент. Проведенный нами анализ факторов, влияющих на антикомплементарную активность

0,45

0,4

и 0,35

то г 0,3

а

г 0,25 ;

з-

« а 0,2

£ а 0,15

Я-

X о ОД ;

X 0,05 ;

О :......................................................

1 3 Б 7 9 11 13 15 17 19

Рисунок 2. Содержание №С1 в пермеате в зависимости от объема диализирующего раствора и производительности процесса. (По оси ординат -концентрация ЫаС1, регистрируемая по электропроводности оттекающего пермеата; по оси абсцисс - объем диализирующего раствора, л; ряд 1- содержание №С1 в пермеате при потоке 20 л/ч; ряд 2 -содержание №С1 в пермеате при потоке 50 л/ч.)

габриглобина, показал, что материал диализной мембраны, так же как и детали проведения самого процесса, не оказывали существенного влияния на антикомплементарную активность габриглобина - определяющим оказалось качество используемой дистиллированной воды. В подтверждение этого провели следующий модельный эксперимент: дистиллированную воду, отобранную на Ивановской ОСПК, «сконцентрировали» путем упаривания при температуре 100 °С в 25 раз, и добавили к гемолитической системе (эритроциты барана + комплемент морской свинки + гемолитическая сыворотка) (рис. 3). Из графика видно, что введение такой «концентрированной» воды приводило к снижению интенсивности гемолиза, хотя должно было наоборот, способствовать разрушению эритроцитов.

60

гГ

| 40

о

С 20 о

- Габриглобин (Иваново)

Габриглобин после диализа

"Концентрированная" вода

1 2 3 4 5

КК 2.5 мг 5 мг 10 мг 15 мг 0,25 мл 0,5 мл 0,75 мл 1,0 мл Рисунок 3. Зависимость антикомплементарной активности габриглобина от качества воды, используемой в технологическом процессе. (По шкале абсцисс — 1-ая строка - количество мг белка, не активирующего 2СН50, 2-ая строка - кол-во вводимой в систему «концентрированной» воды, мл; по шкале ординат - степень гемолиза, %).

Физико-химический анализ воды Ивановской ОСПК продемонстрировал зысокое содержание восстанавливающих веществ, нитритов и тяжелых металлов, 1то даже в низких концентрациях, нарушает структуру иммуноглобулина, открывая /часток для связывания комплемента, тем самым увеличивая антикомплементарную «сгивность [Кяйвяряйнен А.И., 1980; Литмен Г., Гуд Р. 1981]. На графике 3 также показано изменение антикомплементарной активности габриглобина, полученного 1а Ивановской ОСПК, после диализа в дистиллированной воде из другого источника (Москва).

В дальнейшем в технологическом цикле производства габриглобина на Ивановской ОСПК было рекомендовано использование дистиллированной воды, полученной на установке «КосЬеш» и прошедшей дополнительные стадии очистки ионным обменом и адсорбцией.

Результаты масштабирования оптимизированной технологии получения препарата «Габриглобин-1§С» на базе Ивановской областной станции переливания крови представлены в таблице 1 - все десять произведенных подряд серий ВВИТ соответствуют требованиям фармакопейной статьи, имея при этом минимально возможные отклонения от средних значений контролируемых параметров.

Таблица 1. Отклонения от средних числовых значений основных показателей качества десяти производственных серий «Габриглобин-^С».

Показатели качества

Норма по НТД

Значение показателей

Минимальное и

максимальное значение

Среднее значение

Среднегеометрическое отклонение

Прозрачность

<0,02

0,001-0,006

0,0033

0,0013

Цветность

<0,05

0,009-0,013

0,0107

0,00104

рН

4,0-4,5

4,25-4,38

4,33

0,0276

Белок, %

4,5-5,5

4,61 - 5,21

4,89

0,153

Натрия хлорид, %

<0,3

0,1 - 0,12

0,102

0,0036

Содержание полимеров, %

0-0

Содержание димеров, %

<10

1,99-3,50

2,777

0,345

Содержание мономеров, %

>85

96,50 - 97,58

97,166

0,2988

Содержание фрагментов, % Антикомплементарная активность, мг белка

<5

>10

0-0,45 10-10

0,088

10

0,1408 О

Воспроизводимость технологического процесса получения габриглобина на Ивановской ОСПК позволила распространить опыт производства препарата и на другие станции переливания крови. Итогом биотехнологического раздела исследований стало изготовление опытно-промышленных серий препарата, получившего торговое наименование «Габриглобин-1цО, раствор для инфузий» на Белгородской, Свердловской и Челябинской областных станциях переливания крови

и

и регистрация Самарской, Свердловской, Тамбовской и Челябинской областных станций переливания крови в качестве производственных площадок, способных осуществлять серийный выпуск данного лекарственного средства (регистрационное удостоверение ЛС-000412 от 09.06.2010 г.).

2. Изучение спектра антител в препаратах внутривенных иммуноглобулинов различных производителей

На втором этапе исследования мы оценили спектр противобактериальных и противовирусных антител, определяющий специфическую активность и являющийся ведущим фактором клинической эффективности ВВИГ, в препарате «Габриглобин-^О», произведенном на разных станциях переливания крови (в ряде случаев определяли зависимость их титров от географической области сбора плазмы крови доноров), и его отечественных и импортных аналогах.

Было выявлено, что антитела к возбудителям «управляемых» бактериальных инфекций (уровень заболеваемости которых может регулироваться средствами специфической профилактики [Таточенко В.К., 2010]) содержались во всех изученных образцах иммуноглобулинов (табл. 2) и их титр оказался закономерно высоким. Наибольшее содержание антитоксических противодифтерийных и противококлюшных антител в зарубежных ВВИГ определили у «ИГ Вена», а наивысший показатель среди российских препаратов - в образцах габриглобина, полученных на Ивановской ОСПК. Титр антител к менингоккоку в отечественных препаратах был невысок, т.к. вакцинация против данной инфекции не является обязательной и последние 15 лет в нашей стране наблюдается межэпидемический период.

Таблица 2. Средние значения содержания антител к возбудителям бактериальных инфекций в препаратах внутривенного иммуноглобулина различных производителей.__

Препарат иммуноглобулина Наименование заболевания и размерность значения АТ, М+т

Дифтерия, Ед/мл Коклюш, Ед/мл Менингит, КП

Габриглобин-^С (Ивановская ОСПК) 36,20 + 2,17 279+ 13,95 2,91+0,15

Габриглобин-^С (Челябинская ОСПК) 24,85+ 1,74 125+8,75 2,49+0,2

Габриглобии-^С (Свердловская ОСПК) 18,22+ 1,46 93+ 5,58 2,92+0,21

Габриглобин-^О (Белгородская ОСПК) 28,26+ 1,41 120+ 9,6 2,33+0,21

ИГЧН (Н.Новгород) 22,37+ 1,57 109,7+ 8,78 2,18+0,11

Хумаглобин 38,33+ 2,68 102,5+5,13 2,46+0,15

ИГ Вена 98,48+ 4,92 170+ 10,2 4,02+ 0,28

Интраглобин 29,63+ 1,78 80+4,8 1,49+0,09

Октагам 91,56+4,58 160+4,8 4,32+0,35

Представляет определенный интерес обнаружение во всех изученных образцах иммуноглобулинов антител к антигену CagA Helicobacter pylori. Так, антитела в конечном разведении 1:1280 выявлены в габриглобине производства Ивановской и Свердловской ОСПК, а также в экспериментальных сериях препарата «Габриглобин-анти-ЦМВ». Среди импортных аналогов наибольшее содержание антител к хеликобактеру (разведение 1:640) обнаружено в препарате «ИГ Вена» (Италия).

Полученные данные свидетельствуют о том, что среди доноров весьма велика категория людей-носителей Helicobacter pylori, в то же время присутствие этих антител в образцах ВВИГ создает предпосылки к использованию этих препаратов в комплексной терапии хеликобактерной инфекции.

Кроме того, все препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения содержали антитела к хламидиям в высоком титре, как правило, 1:400, а «Габриглобин-IgG» Ивановской ОСПК - 1:800, что свидетельствует о высокой частоте встречаемости в популяции хламидийной инфекции (90 миллионов новых случаев заболевания в год [Alary М. et al., 1999]). Однако большая часть времени в цикле развития хламидий приходится на пребывание возбудителя внутри клетки в виде ретикулярных телец, поэтому использование иммуноглобулинов для внутривенного введения с целью специфического лечения хламидийной инфекции маловероятно.

Примером эффективного использования антибактериального действия препарата «Габриглобин-IgG» может служить его применение в комплексном лечении кардиохирургических больных с ранними проявлениями синдрома полиорганной недостаточности (СПОН), развившегося после операций в условиях искусственного кровообращения и сопровождающегося сепсисом. В результате проведенного лечения суммарный балл по шкале SOFA (оценка органной недостаточности при сепсисе) у пациентов основной группы (43 человека), в составе комплексной терапии получавших «Габриглобин-IgG» по 2,5-7,5 г/сут в течение 5-7 дней, снизился в 2 раза: с 11,7±2,4 до 6,8±1,9 (р<0,05), тогда как у пациентов группы сравнения (25 человек) на фоне традиционной инфузионной, симптоматической и антибактериальной терапии при тех же сроках послеоперационного лечения данный показатель достоверно не изменился. Летальность, оцениваемая на 28-е сутки после операции, на фоне инфузии препарата «Габриглобин-IgG» составила 17%, а в группе сравнения 38%, что отчетливо свидетельствует об эффективности данного лекарственного средства в отношении купирования сепсиса.

В рамках реализации задачи по определению спектра специфической активности образцов препарата «Габриглобин-IgG» и его отечественных и

зарубежных аналогов нами была определена панель противовирусных антител, содержащихся в этих ВВИТ (табл. 3). Так, установлено, что наиболее высокий уровень антител к вирусу кори был у габриглобина, произведенного на Ивановской и Челябинской ОСПК. Среди зарубежных препаратов наиболее высокое содержание антител имел иммуноглобулин «ИГ Вена» (57,2 МЕ/мл). Самая высокая противокраснушная активность отмечалась у препаратов «ИГ Вена» и «Габриглобин-^О» производства Ивановской ОСПК.

Таблица 3. Средние значения содержания антител к возбудителям некоторых вирусных инфекций в препаратах ВВИТ.

Препарат иммуноглобулина Наименование заболевания и размерность значения АТ, М+т

Корь, МЕ/мл Краснуха, МЕ/мл Гепатит А, 103 АЕ

Габриглобин-^С (Ивановская ОСПК) 38,7+1,94 1231,5+ 55,41 1249+58,7

1;ш[иило6ин-1<;С (Челябинская ОСПК) 37,0+ 1,48 586+23,4 159+7,25

Габриглобин-^С (Свердловская ОСПК) 20,7+ 0,83 293+ 14,36 211+10,55

I абри1лобии-1»(; (Белгородская ОСПК) 33,1+ 1,16 657,6+31,89 295+ 14,46

ИГЧН (Н.Новгород) 22,3+ 1,03 592+ 27,52 1235+ 59,17

Хумаглобин 46,9+2,30 1211+ 47,96 671+ 29,26

ИГ Вена 57,2+ 2,06 2136,6+ 102,13 307+ 15,04

Интраглобин 31,1+ 1,49 754,4+36,21 77+3,57

Октагам 45,4+ 1,49 1883,3+79,09 88+ 4,22

Сопоставление полученных нами данных по содержанию антител к вирусу краснухи в образцах ВВИТ отечественных производителей с заболеваемостью данной инфекцией в различных территориальных образованиях Российской Федерации [Онищенко Г.Г., 2007] выявило следующие закономерности (рис. 4): наиболее высокий титр антител к вирусу краснухи был выявлен в габриглобине, полученном на Ивановской ОСПК - 1231,5 МЕ/мл, т.е. произведенном из плазмы крови доноров, проживающих в местности расположенной в зоне высокой заболеваемости. Препарат ИГЧН, выпущенный в Нижнем Новгороде, находящимся в относительно благополучном по заболеваемости краснухой регионе, имел в два раза меньший титр антител - 592 МЕ/мл.

Подобная зависимость между заболеваемостью населения краснухой и титром антител к краснушному антигену прослеживается и в «Габриглобине-^С», изготовленном на Белгородской и Челябинской ОСПК (657,6 и 586 МЕ/мл, соответственно).

Во всех анализируемых образцах отечественных препаратов нами были

определены антитела к вирусу гепатита А, причем, их титр также различался в зависимости от региона сбора плазмы. Высокие значения выявлены у препарата |:<Габриглобин-^0» производства Ивановской ОСПК (1249х103 АЕ) и ИГЧН производства «Микроген» (1235 х10'' АЕ), в 6-8 раз ниже отмечались титры в габриглобине изготовленном на Челябинской и Свердловской ОСПК (табл. 3).

Рисунок. 4. Заболеваемость краснухой в Российской Федерации в 2006 году. (Надписи указывают расположение областных станций переливания крови и титр антител в препарате «Габриглобин-^О», произведенном на данной ОСПК).

Результаты, полученные по определению титра антител к вирусу клещевого энцефалита в отечественных ВВИТ, подтверждают его зависимость от географической области сбора донорской плазмы. Так, препарат «Габриглобин-^в», приготовленный из плазмы крови доноров, проживающих в эндемичных по КЭ районах — Челябинской и Свердловской областях, содержал, соответственно, 386 и 376 АЕ, тогда как габриглобин, приготовленный из плазмы крови доноров, проживающих в Белгородской и Ивановской областях, имел титр антител к вирусу КЭ только 28 и 52 АЕ (рис. 5).

] При исследовании специфической противовирусной активности образцов ВВИТ к возбудителям оппортунистических инфекций оказалось, что все препараты содержали антитела в высоком титре к определяемым типам вирусов семейства герпеса (табл. 4). Наибольший титр антител к ВПГ 1 и 2-го типов определялся у «Октагама», на втором месте был «Габриглобин-^в» производства Челябинской и Ивановской ОСПК. Максимальной антицитомегаловирусной активностью из

неспецифических иммуноглобулинов обладали образцы Ивановской ОСПК, однако ВВИТ направленного действия превосходил их по титру антител более чем в два раза.

Рисунок 5. Заболеваемость клещевым энцефалитом в Российской Федерации. (Надписи указывают расположение областных станций переливания крови и титр антител в препарате «Габриглобип-^О». произведенном на данной ОСПК).

Подтверждением высокой противогерпетической активности препарата «Габриглобин-^С» может служить опыт его успешного применения при энцефалитах различной этиологии (ВПГ, ВПГ-2, ВГЧ-6, ЦМВ, ВЭБ, ВВЗ) у детей 518 лет. Установлено, что применение габриглобина в основной группе пациентов (36 детей) в дозе 0,4 г/кг массы тела в сутки ежедневно в течение 3-х дней приводило к уменьшению сроков восстановительного периода на 16,4±4,2 суток, сокращению продолжительности пребывания в стационаре на 7,4±2,5 суток и более ранней, чем в группе сравнения (28 детей, получавших комплексную противовирусную терапию без ВВИТ) нормализации иммунологических показателей.

Исследованная нами противовирусная панель антител, содержащихся в образцах иммуноглобулинов, включала также определение некоторых представителей из 6 наиболее значимых вирусов, вызывающих респираторные инфекции: риновирусы, респираторно-синцитиальный вирус (PCB), коронавирусы, аденовирусы, вирусы гриппа и парагриппа. В изученных ВВИТ определяли антитела к вирусу гриппа А+В и PCB. Причем, наибольшим содержанием антител к вирусам гриппа А и В отличался препарат «Октагам» (1561 ОЕ/мл), а «Габриглобин-IgG» производства Ивановской ОСПК (лучший среди отечественных аналогов) занимал

'ретье место - 1088 ОЕ/мл. Величины титров антител к РСВ, содержащихся в ;репарате «Габриглобин-(§0» различных производителей, представлены на рисунке

Таблица 4. Содержание ¡репаратах ВВИТ.

антител к вирусам семейства НегреБУтёае в

Препараты внутривенных иммуноглобулинов Тип вируса герпеса, АЕ, М+ш

ВПГ 1 и 2-го типов цмв ввз ВПГ-2 ВГЧ-6

абриглобин-^С (Ивановская ОСПК) 84836+1492 15036+866 1350+159 693+101 1608+203

и6риглобин-|£С; (Челябинская ОСПК) 85046+4763 7656+168 747+29 ^2864+995 2338+222

абриглобин-1ёС (Свердловская ОСПК) 47369+3544 3570+212 636+51 5957+2243 1430+91

абриглобин-^С (Белгородская ОСПК) 66892+3345 7854+738 1013+142 6286+1768 2233+202

"абриглобин-анти-ЦМВ 45785+1459 32211+1146 498+69 391+84 1402+157

1ГЧН (Н.Новгород) 34077+1118 4954+211 311+28 4626+1409 698+65

'умаглобин 44087+1048 5024+177 899+86 3003+842 1449+199

)ктагам 120041+9532 2179+70 1140+181 476+110 5485+834

1Г Вена 80684+7357 4377+146 1113+169 533+92 3296+383

1нтраглобин 18062+1282 1642+98 606+41 215+53 1129+85

В заключение нами был проведен сравнительный анализ специфической «активности внутривенных иммуноглобулинов различных производителей с учетом Зсей панели исследованных антител (рис. 7). Суммарная оценка специфической жтивности «Г'абриглобипа-^О» Ивановской ОСПК, складывающаяся из его позиций в рейтингах по всем исследованным инфекциям, превосходит суммы зейтингов проанализированных в работе ВВИТ других наименований.

1200 -

1000 -

с

£ а 800 -

о

600 -

<1>

Ь 400 -

ГС

а н 200 -

ь 0 1

□ "Габриглобин-1дС" Иваново □"Габриглобин-1дС" Белгород

■ "Г:абриглобин-1д6" Челябинск о "Габриглобин-1дО" Первоуральск

Рисунок 6. Титр антител к респираторно-синцитиальному вирусу в препарате «Габриглобин-^О» различных производителей.

Рисунок 7. Сравнительная оценка специфической активности габриглобина различных производителей (а), импортных и отечественных ВВИТ (б). (Высота столбцов гистограммы соответствует суммарному рейтингу титров антител по всем исследованным инфекциям).

Таким образом, проведенные исследования убедительно свидетельствуют о наличии в отечественном иммуноглобулине для внутривенного введения «Габриглобин-^в» широкого спектра антител к бактериальным и вирусным патогенам в достаточно высоких титрах, что нашло свое отражение как в нормативной документации (по требованиям фармакопейной статьи - ФСП № 428743-07 - препарат дополнительно титруется на содержание антител к ЦМВ, вирусу герпеса и вирусу гриппа, что указывается на его упаковке), так и в рекомендациях по профилактическому и лечебному применению препарата «Г'абриглобин-^С, раствор для инфузий» (Информационное письмо «Использование поливалентного иммуноглобулина для внутривенного введения «Габриглобин-^С» при лечении бактериальных и вирусных инфекций», утверждено на заседании Ученого совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора 16.12.2010 г.).

выводы

1. Предложен способ уменьшения антикомплементарной активности препарата «Габриглобин-^С» методом ультрафильтрации, что позволило сократить длительность стадии диализа в 4-6 раз. Данный метод внедрен в технологический процесс получения препарата на Ивановской областной станции переливания крови.

2. Установлено, что основным параметром, определяющим иммунологическую безопасность препарата - низкую антикомплементарную активность, является качество воды, используемой в производственном процессе. Четкое соблюдение заданных параметров (степень очистки используемой воды, объем диализирующего раствора, присутствие стабилизатора) обеспечивает получение лекарственной формы препарата «Габриглобин-^О», соответствующей всем требованиям нормативной документации с минимальными отклонениями показателей от среднего значения. Воспроизводимость технологического процесса позволила распространить опыт производства жидкой формы препарата на Самарскую, Тамбовскую и Челябинскую областные станции переливания крови.

3. Исследование панели антител к возбудителям наиболее распространенных бактериальных и вирусных инфекций в отечественном препарате иммуноглобулина для внутривенного введения «Габриглобин-1§С» показало, что он содержит антитела к дифтерийной палочке, коклюшному токсину, вирусам семейства НегреБУМае, вирусам гриппа, клещевого энцефалита, респираторно-синцитиальному вирусу, менингококку, хеликобактеру, хламидиям, и по их разнообразию и величине титров не уступает отечественным и импортным коммерческим аналогам.

4. Распределение антител в препарате «Габриглобин-^О» зависит от географической области сбора плазмы. Так, наиболее высокий уровень антител к возбудителям широко распространенных инфекций (корь, краснуха, дифтерия, грипп) определяется в препарате, полученном из плазмы крови доноров, проживающих в центральных областях, где расположена Ивановская ОСПК. Уровень антител к вирусу клещевого энцефалита закономерно выше в образцах внутривенных иммуноглобулинов, изготовленных из плазмы крови доноров, проживающих в эндемичных по данному заболеванию районах (Челябинская и Свердловская области).

5. Наличие в отечественном нормальном иммуноглобулине для внутривенного введения «Габриглобин-1§С» широкого спектра антител к бактериальным и вирусным патогенам в сравнительно высоких титрах позволяет использовать препарат как для профилактики, так и терапии различных видов

инфекционной патологии, что убедительно подтверждается клиническим опытом его применения при лечении энцефалитов различной этиологии у детей и купировании септических осложнений у кардиохирургических больных, оперированных в условиях искусственного кровообращения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лютов А.Г., Алешкин В.А., Тюриков Ю.М., Капустянская И.Ю., Клюева Е.А., Бочкарева С.С. Изучение переносимости и клинической эффективности Габриглобина - нового отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения. //Новое в трансфузиологии. Информационный бюллетень. М., 2002, вып. 33, с. 61-72.

2. Лютов А.Г., Бочкарева С.С., Тюриков Ю.М., Румянцева Т.Б. Влияние условий диафильтрации на антикомплементарную активность иммуноглобулина. //Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения. Сборник материалов научно-практической конференции. Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». М., 2003, с. 16-17.

3. Лютов А.Г., Алешкин В.А., Платонов A.B., Лесик Н.В., Тарасов A.B., Бочкарева С.С., Зайцева Т.А., Тюриков Ю.М. Применение препарата «Габриглобин» при атипичной пневмонии. //Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения. Сборник материалов научно-практической конференции. Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». М., 2003, с. 32-33

4. Бочкарева С.С., Лютов А. Г., Алешкин A.B. Рынок препаратов внутривенных иммуноглобулинов. Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения. //Сборник материалов научно-практической конференции. Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». М., 2003, с. 44-45.

5. Лютов А.Г., Латышева Т.В., Ситдикова Н.Х., Алешкин В.А., Мостовская Е.В., Тюриков Ю.М., Бочкарева С.С. Опыт применения габриглобина у больных с агаммаглобулинемией. //Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. Киров, 2005, с. 219-221.

6. Мостовская Е.В., Лютов А.Г., Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Соловьев А.Ф., Карпова М.В., Мальцева О.В., Блинова Е.А., Бочкарева С.С., Тюриков Ю.М. Габриглобин как основа создания специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения. //Вопросы трансфузиологии и клинической медицины. Материалы научно-практической конференции молодых ученых. Киров, 2007, с. 39-41.

7. Лютов А.Г., Мостовская Е.В., Денисов А.К., Тюриков Ю.М., Бочкарева С.С. О безопасности и клинической эффективности габриглобина -отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения. //Педиатрия, 2008, № 3, с. 73-79.

8. Тюриков Ю.М., Лютов А.Г., Алешкин В.А., Бочкарева С.С., Долматов В.Ю., Мостовская Е.В. Габриглобин как возможное средство терапии цитомегаловирусной инфекции. //Вестник новых медицинских технологий. 2008, №2, с. 239-241.

9. Бочкарева С.С., Лютов А.Г., Алешкин В.А., Новикова Л.И., Тюриков Ю.М., Долматов В.Ю., Мостовская Е.В. Содержание антител к вирусам семейства герпеса в препарате внутривенного иммуноглобулина «Габриглобин». //Современные представления об иммунокоррекции. Материалы Всероссийской научно-пратической конференции. Пенза, 2008, с.20-23.

Ю.Иванова Т.Ф., Лютов А.Г., Чернышева Т.А., Карасева О.В., Бочкарева С.С., Алешкин В.А., Мостовская Е.В. Использование габриглобина у детей в раннем периоде травматологической болезни. //Современные представления об иммунокоррекции. Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Пенза, 2008, с. 37-38.

П.Козлова М.Н., Сускова B.C., Попцов В.Н., Шумаков Д.В., Лютов А.Г., Емец В.П., Быстрых O.A., Бочкарева С.С., Топтыгина А.П. Внутривенный иммуноглобулин G-Габриглобин в комплексной терапии при вспомогательном кровообращении. //Тезисы IV Всероссийского съезда трансплантологов, посвященный памяти академика В.И. Шумакова, 2008, с. 56-58.

12.Козлова М.Н., Попцов В.Н., Сускова B.C., Лютов А.Г., Шумаков Д.В., Емец В.И., Быстрых O.A., Сусков С.И., Топтыгина А.П., Бочкарева С.С. Клинико-иммунологическое обоснование применения внутривенного иммуноглобулина G-Габриглобина у больных с синдромом полиорганной недостаточности после операций с искусственным кровообращением. //Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2008, № 6 (44), с. 3439.

13. Козлова М.Н., Сускова B.C., Попцов В.Н., Бочкарева С.С., Лютов А.Г., Алешкин В.А. Сравнительная оценка влияния препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на оксидазную активность нейтрофилов у доноров. //Российский иммунологический журнал, 2008, т. 2, JV» 2-3, с. 142.

14. Бочкарева С.С., Лютов А.Г., Лаптева Л.К., Алешкин В.А., Новикова Л.И. Оценка антибактериальной и антивирусной активности препарата «Габриглобин». //Тезисы докладов Всероссийской научно-практич. конференции «Вакцинология-2008». М., 2008, с. 27.

15. Бочкарева С.С., Новикова Л.И., Лютов А.Г., Мостовская Е.В., Алешкин В.А., Тюриков Ю.М. Изучение спектра антител к вирусным и бактериальным инфекциям в препарате внутривенного иммуноглобулина - «Габриглобине». //Биологическая безопасность в современном мире. Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора. Оболенск, 2009, с. 106-108.

16. Еочкарева С.С., Лютов А.Г., Новикова Л.И., Алешкин В.А., Денисов А.К. Репертуар антител к вирусным и бактериальным патогенам в препарате внутривенного иммуноглобулина «Габриглобин-IgG». //Инфекционные болезни, 2010, т. 8, № 4, с. 31-37.

17. Лютов А.Г., Мостовская Е.В., Денисов А.К., Бочкарева С.С. Безопасность и эффективность габриглобина - отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения. //Поликлиника, 2011, № 2, с.108-111.

18. Лютов А.Г., Мостовская Е.В., Бочкарева С.С. Использование инновационных технологических решений при создании препаратов из плазмы крови человека.//Материалы Санкт-Петербургского Международного Форума по фармацевтике и биотехнологиям, Спб., 2011, с. 156.

19. Использование поливалентного иммуноглобулина для внутривенного введения «Габриглобин-IgG» при лечении бактериальных и вирусных инфекций. //Информационное письмо. Коллектив авторов. М., 2011, 49 с.

20. Бочкарева С.С., Лютов А.Г., Новикова Л.И. Оценка специфической активности отечественного иммуноглобулинового препарата дли внутривенного введения «Габриглобин-IgG». //Астраханский медицинский журнал, 2011, т.6, №4, с. 36-40.

21. Петрова М.С., Бочкарева С.С., Новикова Л.И., Лютов А.Г., Алешкин В.А., Абрамова E.H., Рахалина A.A. Опыт клинического наблюдения и лечения больных с синдромом Кавасаки в респираторном отделении. //Инфекционные болезни, 2012, №1, с. 51-54.

Список сокращений

АЕ - арбитражные единицы

АКА - антикомплементарная активность

AT - антитела

ВВЗ - вирус варицелла-зостер (ветряной оспы - опоясывающего

ВВИГ - внутривенный иммуноглобулин

ВГЧ-6 - вирус герпеса человека 6-го типа

ВПГ - вирус простого герпеса

ВЭБ - вирус Эпштейна-Барр

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГУЗ -государственное учреждение здравоохранения ИГЧН - иммуноглобулин человека нормальный ИФА - иммуноферментный анализ КП — коэффициент позитивности КЭ - клещевой энцефалит

ОГУП - областное государственное унитарное предприятие

ОКК - отдел контроля качества

ОСПК - областная станция переливания крови

PCB - респираторно-синцитиальный вирус

СПОН - синдром полиорганной недостаточности

ЦМВ - цитомегаловирус

Подписано в печать: 05.03.2012 Тираж: 100 экз. Заказ №732 Отпечатано в типографии «Реглет» 19526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru