Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка препарата иммуноглобулина для внутривенного введения и использование его для терапии иммунодефицитных состояний.

На правах рукописи

ТЮРИКОВ Юрий Михайлович

РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЕГО ДЛЯ ТЕРАПИИ ИММУНОДЕ ФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ

14.00.36. — аллергология и иммунология 14.00.29. — гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

003452079

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор

Доктор биологических наук,

C.H.C.

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Городецкий Владимир Матвеевич

Доктор медицинских паук,

профессор Краснопрошина Людмила Ивановна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московская медицинская

академия имени И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится « //> /_2008 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 208.046.02. при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора»

Автореферат разослан « / » //_2008 г.

Алешкин Владимир Андрианович Лютов Андрей Германович

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, с.н.с.

Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы: Первичные иммунодефицитные состояния - это врожденные нарушения системы иммунитета, связанные с генетическими дефектами одного или нескольких компонентов иммунного ответа, в частности, клеточного или гуморального звена, фагоцитоза или системы комплемента /доклады группы ВОЗ, 1978, 1980,1995; Ballow M., 2002/.

Иммунодефицитные состояния характеризуются повторными и хроническими инфекционными осложнениями, повышенной частотой возникновения аллергических или аутоиммунных заболеваний и развитием злокачественных опухолей /Rosen F.S. et al., 1997; Spector B.D. et al, 1978; Rehman S. et al., 2003/.

Актуальность проблемы иммунодефицитов y человека обусловлена высокой частотой встречаемости данного заболевания, которая составляет от 1:10000 до 1:500 /Cunningham-Rundles С., 2002/, неизбежностью летальных исходов при отсутствии заместительной терапии и низкой эффективностью традиционных антимикробных средств /Ярцев М.Н., Яковлева К.П., 2004; Etzioni А., 2003/.

Одной из основных задач в терапии врожденных и приобретенных иммунодефицитов является профилактика оппортунистических инфекций, вызываемых вирусами семейства Herpesviridae, в частности, цитомегаловирусом. Распространенность данной инфекции среди детей раннего возраста, беременных женщин, способность инфицировать плод и вызывать заболевания у реципиентов трансплантатов делают борьбу с цитомегаловирусной инфекцией особенно актуальной /Ф.И.Абазова, Л.Н.Хахалин, 1997, Pass P.F.et al.,1990/.

Эффективным барьером на пути передачи вируса цитомегалии от матери к плоду являются материнские антитела к цитомегаловирусу. Аналогичный эффект наблюдается и при пассивном введении в организм беременной женщины иммуноглобулина, содержащего специфические антитела /Абазова Ф.И., Хахалин Л.Н., 1997; Калинина Н.М., Кетлинский С.А., 2002/, поэтому в качестве одного из возможных средств борьбы с вирусными инфекциями могут быть использованы препараты иммуноглобулинов /Алешкин В.А. и соавт., 1996/.

Лечение иммунодефицитов заключается в заместительной терапии иммуноглобулином, пересадке костного мозга или генной терапии /Ярцев М.Н,

Яковлева К.П., 2004; Buckley R.H., 2002/. Тем не менее до настоящего времени основным принципом лечения всех форм агаммаглобулинемии и ее осложнений, является регулярная заместительная терапия иммуноглобулинами для внутривенного введения в сочетании с антибиотикотерапией /Сетдикова Н.Х. и соавт., 2004; De Gracia J. et al., 2004/.

В настоящее время имеется достаточно большой выбор иммуноглобулинов для внутривенного введения. Для лечебного применения предлагаются препараты, в основном, зарубежного производства, различающиеся по своему качеству, физическим параметрам, длительности циркуляции в организме и эффективности /Шарыгин С.Л., 1997; Бочкарева С.С. и соавт., 2003; Berkman S.A. et al., 1990/.

Отечественные иммуноглобулины для внутривенного введения выпускаются с использованием ферментативной обработки, что приводит к повреждению Fc-фрагмента молекулы иммуноглобулина G и ускоренному, в течение нескольких суток, выведению такого препарата из организма /Анастасиев В.В., 2000/. Восполнение уровня иммуноглобулинов в крови при агамма- или гипогаммаглобулинемии (заместительная терапия) данными препаратами недостаточно эффективно.

Поэтому создание препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, как неспецифических, пригодных для заместительной терапии различных форм гуморальных иммунодефицитов, так и направленных, предназначенных для лечения осложнений недостаточности иммунного ответа, в частности, цитомегаловирусной инфекции, является актуальной задачей.

Цель настоящего исследования: создание препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, пригодного для терапии гуморальных иммунодефицитов и их осложнений, в частности, цитомегаловирусной инфекции.

Задачи исследования:

1. Масштабировать лабораторный процесс получения иммуноглобулина до промышленного уровня и организовать производственный выпуск препарата, имеющего цельные молекулы IgG в мономерной форме.

2. Установить факторы, определяющие качественные показатели иммуноглобулина и оптимизировать технологические приемы получения препарата.

3. Включить в технологический процесс изготовления препарата стадии инактивации возможно присутствующих в нем вирусов.

4. Исследовать возможность получения иммуноглобулина для внутривенного введения с высоким титром антител к вирусу цитомегалии.

5. В рамках государственных клинических испытаний изучить эффективность иммуноглобулина для внутривенного введения (габриглобина) при первичных гуморальных иммунодефицитах.

Научная новизна.

Создана научно обоснованная технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения, пригодного для заместительной терапии гуморальных имму но дефицитов. Препарат содержит цельные молекулы в мономерной форме, которые сохраняют свои бифункциональные свойства.

Основными факторами, определяющими качество препарата, являются степень очистки воды, используемой в технологическом цикле и процесс снижения антикомплементарной активности.

Разработан алгоритм отбора донорского сырья с высоким титром антител к вирусу цитомегалии и показана принципиальная возможность получения направленного иммуноглобулина для внутривенного введения.

Продемонстрирована высокая эффективность заместительной терапии габриглобииом у больных с общим вариабельным иммунодефицитом и сохранение повышенной концентрации в крови после введения препарата в, течение более 21 суток.

Практическое значение работы.

Организовано промышленное производство иммуноглобулина для внутривенного введения с торговым названием "Габриглобин". Препарат может быть с успехом использован для терапии различных заболеваний, в первую очередь, для эффективного восполнения дефицита иммуноглобулинов у больных с гуморальными иммунодефицитами, а также для лечения вирусных инфекций.

Внедрение результатов исследования в практику.

Впервые в Российской Федерации на Ивановской областной станции переливания крови организовано промышленное производство иммуноглобулина

для внутривенного введения "Габриглобин", имеющего две стадии вирусинактивации (ФСП № 42-0265-1621-01).

Производственный регламент получения препарата "Габриглобин" (иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения сухой) и опытно-промышленный регламент производства препарата "Габриглобин-анти-ЦМВ" утверждены Комиссией по стандартизации Центральной лаборатории государственного контроля и изучения качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов ГУ "Гематологический научный центр РАМН" (протокол № 114 от 10.12.2003 г. и № 106 от 23.04.2003 г.)

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана научно обоснованная промышленная технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения с торговым названием "Габриглобин", который имеет низкое значение рН и цельные молекулы в мономерной форме.

Процесс получения препарата включает карантинизацию плазмы,, тестирование на вирусные маркеры, спиртовое фракционирование, концентрирование фильтрата «Б» ультрафильтрацией, стадию снижения антикомплементарной активности и удаления низкомолекулярных веществ путем диализа-диафильтрации, первую вирусинактивацию, высушивание, вторую вирусинактивацию, контроль, упаковку и маркировку.

2. Предложен алгоритм отбора донорского сырья с высоким титром антител к вирусу цитомегалии и доказана принципиальная возможность получения иммуноглобулина для внутривенного введения с титром антител к цитомегаловирусу 1:6400 - 1:12800, или с содержанием антител более 50 МЕ/мл -"Габриглобин-анти-ЦМВ".

3. Габриглобин обладает высокой терапевтической активностью при лечении первичных гуморальных иммунодефицитах, эффективно восполняя имеющийся дефицит что приводит к сокращению частоты рецидивов хронических заболеваний. Повышенная концентрация в крови после введения препарата сохраняется в течение более 21 суток.

Апробация материалов диссертации: Диссертация прошла апробацию на совместном заседании секций Ученого совета «Общая и прикладная иммунология» и «Медицинская биотехнология» Федерального Государственного Учреждения Науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ 15 июня 2008 г. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Международной научно-практической "конференции по донорству крови (Архангельск, 2001), на «Научно-практической конференции по иммунологии» (Москва, 2003), на научной конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Киров, 2005), на Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение» (Уфа, 2005), на научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 150 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав с изложением результатов собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 257 источников, из них 118 отечественных и 139 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками и 19 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В качестве исходного сырья использовано более 9000 л каранти-низированной плазмы крови доноров, соответствующей ФС 42-0091-02, которую заготавливали методом плазмафереза на центрифугах MPW-400, «Мединструмент», Польша и «Sorvall RC-3C plus», США. Всего на Ивановской областной станции переливания крови было приготовлено пять экспериментальных и 74 производственные серии препарата внутривенного иммуноглобулина (габриглобина).

Ультрафильтрацию проводили на оборудовании фирмы «Владисарт» (г. Владимир) с кассетами ПС-30 и шестеренчатым насосом с регулируемой

производительностью «Б1епс1ег Ытти1» (Германия). Воду для инъекций получали на установке «Шарья» («Биотехпрогресс», г. Кириши) и модульной установке «Рокем» ШЖО 0120 («Рокем сервис», Санкт-Петербург).

Высушивание иммуноглобулина осуществляли на сублимационных установках Ь2-45 (Чехословакия).

Определение групповой и резус-принадлежности крови проводили цоликлонами фирмы «Гемм», Москва, качество готовых препаратов иммуноглобулинов оценивали методами электро- и иммунофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографией на приборе «Стайер» производства «НПКФ Аквилон», антикомплементарную активность определяли в реакции связывания комплемента по ФСП № 42-0265-1621-01.

Титр антител к ЦМВ в крови доноров и препаратах иммуноглобулина определяли имму но ферментным методом, используя тест-системы "ВектоЦМВ-^О-стрип" (ЗАО «Вектор-Бест») и «ДС-ИФА-анти-ЦМВ-О» (НПО «Диагностические системы»). Результаты регистрировали с помощью планшетных фотометров "МиШвсап МБ" и "МиМвсап ЕХ", фирмы "ЬаЬзузйтз", Финляндия. Количество антител к ЦМВ вычисляли относительно ОСО 42-28-371-03, содержащего 5 МЕ в 1 мл, в качестве препарата сравнения использован внутривенный иммуноглобулин «Цитотект» производства фирмы «Биотест Фарма», Германия (сер. 144081).

Определение анти-альфа-стафилолизина проводили в реакции нейтрализации гемолитических свойств стафилококкового альфа-токсина, а титр антител к вирусу кори - в реакции пассивной гемагглютинации.

Определение биологических характеристик иммуноглобулина (стерильности, пирогенности и токсичности) выполняли по методикам, описанным в ГФ XI.

Отсутствие антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2, гепатиту С, отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита В в плазме и лекарственной форме иммуноглобулина подтверждали в аттестованной лаборатории ОКК Ивановской областной станции переливания крови.

Клинические испытания габриглобина выполнены в соответствии с программой, утвержденной Фармакологическим комитетом МЗ РФ (протокол № 8

от 4.12.03) в отделении иммунопатологии (заведующая - д.м.н Латышева Т.В) ГНЦ "Институт иммунологии МЗ РФ".

Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии, используя сыворотки моноспецифические против иммуноглобулинов человека и стандартную сыворотку производства Нижегородского предприятия по производству бакпрепаратов по ФС 42-3641-98 (Н.Новгород).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием-компьютерных программ «Excel 4.0» и «Statistica 5.7».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание промышленной технологии производства иммуноглобулина для внутривенного введения.

За основу технологического процесса производства препарата иммуноглобулина для внутривенного введения с цельными молекулами IgG в мономерной форме и полностью сохраненными как эффекторной, антигенсвязывающей активностью, так и функциями Fc-фрагмента, был взят лабораторный метод /Алешкин В.А., Лютов А.Г., 1998, Лютов А.Г., Алешкин В.А, 1996/. Предлагаемая схема получения препарата предусматривала концентрирование фильтрата «Б» (III фракция по Кону) ультрафильтрацией при значении рН от 3,5 до 5,0 с последующим длительным диализом полуфабриката иммуноглобулина в вискозных оболочках для снижения антикомплементарной активности.

Задачей первого раздела исследований было совмещение данных методических приемов со схемой фракционирования плазмы, принятой на Ивановской областной станции переливания крови.

Проведенный анализ технологического процесса фракционирования плазмы, принятого на станции, и эксперимент, выполненный в лабораторных условиях по концентрированию фильтрата "Б" на ультрафильтрационном модуле, показали принципиальную возможность приготовления препарата иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения. Экспериментальный образец содержал более 95 % мономерного IgG и имел антикомплементарную активность 10 иг белка, не активирующих 2 СН50 (рис. 1).

30 ; £Л

во/

40/ 20/ ом ш,

КК 2,5 5 10 15

Рис. 1. Антикомплементарная активность экспериментального образца иммуноглобулина

КК - контроль комплемента

Примечание: Иг не должен активировать 2 гемолитические единицы комплемента (2СН 50)

Положительные результата эксперимента позволили перейти к масштабированию технологии. Процесс концентрирования фильтрата «Б» в производственных условиях проводили на 5 ультрафильтрационных кассетах фирмы «Владисарт», использовали промышленный шестеренчатый насос с регулируемой производительностью.

Центрифугат "Б" в количестве 177 л был разведен водой очищенной в соотношении 1:1, а величина рН раствора была снижена до 4,3. После концентрирования и диафильтрации (для полного освобождения иммуноглобулина от остаточного содержания этанола и солей) раствор иммуноглобулина подвергли осветляющей и стерилизующей фильтрации. Снижение антикомплементарной активности было проведено диализом в вискозных оболочках, а затем препарат был высушен. Иммуноглобулину было присвоено торговое наименование "Габриглобин".

Аналогичным образом были приготовлены еще четыре серии препарата. Анализ биологических и иммунохимических параметров полученных образцов показал, что все параметры производственных серий иммуноглобулина

Количество белка в пробе, мг

□ ИГ для внутримышечного введения ■ ИГ для внутривенного введения

соответствовали требованиям фармакопейной статьи. Однако антикомплементарная активность трех серий из пяти составила только 5 мг белка, не активирующих комплемент, хотя значительных отличий в технологических приемах, которые были использованы во время процесса приготовления препарата, найдено не было.

Подробный анализ всех стадий технологического процесса показал, что процесс высушивания, как наиболее критичный, не оказывает существенного влияния на иммуноглобулин. Было высказано предположение о том, что параметры конечной продукции может определять качество дистиллированной воды, используемой в технологическом цикле приготовления препарата. В пользу этого предположения свидетельствовал тот факт, что экспериментальный образец иммуноглобулина, приготовленный с использованием дистиллированной воды трехкратной перегонки, полученной на Ивановской ОСПК, имел антикомплементарную активность только 5 мг белка, тогда как образец иммуноглобулина, изготовленный из той же партии фильтрата "Б", но на, дистиллированной воде однократной перегонки в МНИИЭМ им. Г Н.Габричевского, имел антикомплементарную активность 10 мг белка, не активирующих 2 СН50.

Сравнительный полуколичественный анализ качества воды показал, что в воде из Иваново более высокое значение величины рН, чем в воде из МНИИЭМ Г.Н.Габричевского, одинаковое содержание восстанавливающих веществ, и несколько более высокое количество нитритов, нитратов и тяжелых металлов.

Исследования ТепоМ К.Л. /1983/ продемонстрировали, что чем меньше раствор иммуноглобулина содержит низкомолекулярных примесей в виде ШС1, спирта и пр., то тем больший процент молекул находится в мономерной форме и тем ниже его антикомплементарная активность. По-видимому, определяющее влияние дистиллированной воды на качество "Габриглобина", объясняется наличием в воде Ивановской ОСПК повышенного содержания ионов тяжелых металлов, которые могут дестабилизировать гидратную оболочку молекул иммуноглобулина, снижать его дзета-потенциал, что приводит к изменению конформации молекулы, образованию агрегатов и раскрытию участков, связывающих компоненты комплемента.

Опираясь на полученные данные, в технологическом цикле приготовления препарата мы предложили использовать в дальнейшем только воду, приготовленную путем обратного осмоса, что обеспечило стабильность всех показателей препарата от серии к серии.

Далее, для увеличения объема выпускаемой продукции, был проведен комплекс исследований по замене ручной стадии диализа иммуноглобулина в вискозных оболочках (этап уменьшения антикомплементарной активности) на диафильтрацию полуфабриката с использованием ультрафильтрационной кассетной системы.

Для подбора условий снижения антикомплементарной активности иммуноглобулина методом диафильтрации полуфабриката на ультрафильтрационном модуле бьшо исследовано несколько режимов проведения процесса и выбран метод, обеспечивающий гарантированное снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина, заключающийся в использовании противотока диализирующей жидкости.

В результате первого этапа исследований, посвященного масштабированию процесса и поддержанию стабильных показателей качества препарата от серии к серии, с 2002 г. организован промышленный выпуск препарата "Иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения сухой", получившего коммерческое название "Габриглобин" (ФСП № 42-0265-1621-01).

Разработка методов инактивации возможно присутствующих вирусов.

Препараты крови человека, получаемые путем фракционирования, не могут быть в полной мере вирусобезопасными, поскольку не представляется возможным получение крови от абсолютно здоровых доноров. Даже карантинизация всех порций плазмы не может дать 100 %-ную гарантию отсутствия инфекционных агентов. Панов В.П. и соавт. /2005/ указывают, что вирусная безопасность продуктов крови обеспечивается тремя непременными факторами: отбором доноров, тестированием донаций и пулов плазмы, инактивацией и удалением вирусов в процессе производства, причем способы удаления вирусов должны быть четко различимы от способов их инактивации.

Несмотря на то, что, по данным Henin et al. /1988/, в фильтрате "Б" вирус иммунодефицита не определяется, теоретическая возможность передачи на сегодняшний день неизвестных инфекций остается. Вследствие этого одной из задач исследования было изучение возможности включения в технологический цикл производства габриглобина двух стадий вирусинактивации.

Известны различные подходы по инактивации и удалению вирусов, включающие: пастеризацию, химическую инактивацию, сухой нагрев и др. /Русанов В.М., Левин И., 2004; Kasper С.К., Silva М.С., 2003/. Доказано, что при низкой величине pH разрушаются липид-содержащие (вирус СПИДа, гепатита В, гепатита С) и липид-несодержащие (вирус гепатита А, парвовирус В 19) вирусы /Louie R.E.et al., 1994/. Эффективность инактивации вирусов во время обработки полуфабриката иммуноглобулина при показателе pH от 4,0 до 4,5 валвдирована (подтверждена) ведущими странами (ФРГ, США, Канада) /Мостовская Е.В., 2004; Исрафилов А .Г. и соавт., 2005; Revie D., 1998/.

Данные литературы убедительно свидетельствуют об эффективности процессов вирусной инактивации при кислом значении pH или высокой температуре, что позволило нам не проводить работу по контролю инактивации модельных вирусов, а сосредоточить внимание на исследовании влияния различных вариантов вирусинактивации на основные показатели качества габриглобина.

Первой стадией инактивации возможно присутствующих вирусов в технологическом цикле приготовления препарата "Габриглобин" стал этап, выдерживания полуфабриката при величине pH 4,2 в течение 21 суток. Оценка качества полуфабриката до и после выдерживания при данных условиях показала, что различия основных параметров иммуноглобулина были статистически незначимыми (значение р от 0,226 до 1,0), что доказывает отсутствие влияния условий инкубации препарата на его качественные характеристики.

Учитывая данные о высокой эффективности инактивации вирусов методом сухого прогрева или пастеризации /Зубкова Н.В., Анастасиев В.В., 2002; Horowitz В. et al., 1992; Laso М. et al., 2002/, в качестве второй стадии вирусинактивации возможно присутствующих вирусов был использован прогрев сублимационно высушенного габриглобина во флаконах. Для выбора режима вирусинактивации

было проведено исследование влияния температурной обработки при 60, 70 и 80°С в течение 6, 24, 48 и 72 часов на отдельные параметры иммуноглобулина.

Анализ препаратов по ряду показателей, проведенный до и после прогревания, показал, что прозрачность и цветность испытуемых образцов несколько изменялись и зависели от длительности и режима прогрева. Тем не менее данные показатели находились в пределах допустимых значений в соответствии с требованием фармакопейной статьи.

Антикомплементарная активность габриглобина при различных режимах прогревания изменялась в зависимости от температуры и длительности инкубации (рис.2). При сопоставлении динамики изменения антикомплементарной активности препарата и его прозрачности в процессе инактивации было отмечено, что снижение антикомплементарной активности габриглобина с 20 до 10 мг белка сопровождалось уменьшением прозрачности раствора к 24 часам инкубации, а затем, к 72 часам, показатели прозрачности и антикомплементарной активности возвращались к исходным значениям. Механизм изменения данных показателей требует специального изучения.

30

25 20

0 6 24 48 72

Время инкубации, ч

0,009

0,008 1

0,007 о

0,006 |

0,005 с х

0,004 5 5

0,003 ф

0,002 |

0,001 о о

Е5Я АКА (60 С) АКА (70 С) 1=1 АКА (80 С) 1

-♦—Пр. (60 С) -+• Пр. (70 С) -Ж-Пр. (80 С)

Рис. 2. Изменение прозрачности (ПР) и антикомплементарной активности (АКА) габриглобина в процессе прогревания при различных режимах

Молекулярные параметры иммуноглобулина практически не изменялись при прогревании сухих образцов при температуре 60 "С, так и при выдерживании их при 80 °С.

Содержание антител к вирусу кори при всех режимах вирусинакгивации оставалось стабильным на протяжении первых 24 часов и к 48 часам содержание антител уменьшалось на одно разведение. Концентрация антител к альфа-стафилолизину в образцах уменьшалась более плавно и зависела от температуры и длительности инкубации. Количество антител к ЦМВ в образцах иммуноглобулина при прогревании при температуре 60 °С снижалось к концу процедуры не более, чем на 3,5 % (рис. 3). Однако прогревание препарата при 80 °С привело к значительному падению уровня антител к ЦМВ уже через 24 часа (на 43 %), а к 72 часам - на 53,9 %.

55

5 50 | 45

>. 40

и г-

|1 35

о Ш

* Е 30

с а £ 2 25 = =т £ 20 я

£ 15

* ю

5

0 6 24 48 72

Время инкубации, ч

А АТ к вирусу кори * АТ к ЦМВ —♦"Анти-альфа-стафилолизин

Рис. 3. Изменение титров антител в препарате габриглобин во время выстаивания при температуре 60 "С

Таким образом, был сделан вывод об отсутствии значительного влияния

прогревания сухой формы препарата габриглобина при 60 °С в течение 72 часов

или при 70 °С в течение 48 часов на качественные характеристики препарата.

Производственные возможности и наличие оборудования на станции переливания крови позволили ввести в производственный процесс приготовления

вирусбезопасного габриглобина стадию прогревания препарата при 60 °С в течение 72 часов.

Получение препарата внутривенного иммуноглобулина для лечения цитомегаловирусной инфекции.

В последнее время для комплексной терапии оппортунистических инфекций' активно применяют препараты иммуноглобулинов человека /Кострова О.М., Алешкин В А., 1995/. Предложен внутримышечный иммуноглобулин с повышенным титром антител к ЦМВ "Меговир" (Россия), импортные препараты для внутримышечного и внутривенного введения - цитотект (фирма "Biotest", Германия), CMV-polyglobulin, (США), cytogam ("Medimmune", Великобритания) /Хабибулина В.В., 2003; Stippel D. et al., 1992; Kocher A.A. et al., 2003; Vrtovec B. et al., 2004/. Поэтому одной из задач настоящего исследования было изучение возможности получения иммуноглобулина для внутривенного введения с цельной, нерасщелленной молекулой IgG и высоким титром антител к ЦМВ.

С этой целью был определен титр антител к ЦМВ в препаратах нормального иммуноглобулина человека, выпускаемого Ивановской станцией переливания крови, и установлены критерии отбора донорской крови. Фоновое содержание указанных антител в иммуноглобулине составило величину 1:1600 - 1:3200 (титр в пересчете на 5 %-ный белок), поэтому, принимая во внимание минимальное различие в содержании антител между «нормальным» и «специфическим» иммуноглобулином в 4-6 раз, допустимый титр антител к ЦМВ в гипериммунном препарате должен составлять 1:6400 - 1:12800, а минимальный допустимый титр анти-ЦМВ-антител в плазме крови доноров иметь величину 1:1600.

Был создан банк из 107 доноров, имеющих титр антител к вирусу ЦМВ более 1:1600. Плазма, собранная методом плазмафереза, после карантинизации была использована для приготовления трех промышленных серий иммуноглобулина с повышенным титром антител к вирусу цитомегалии, получившего коммерческое название "Габриглобин-анти-ЦМВ".

Степень концентрирования антител к ЦМВ во всех полученных образцах составила 8 раз, что свидетельствует о правильности выбранных технологических параметров процедуры фракционирования. Титр антител в трех сериях препарата непосредственно после их изготовления составлял 1:12800 - 1:25600, что

соответствовало расчетным данным на специфический антицитомегаловирусный иммуноглобулин. Через три года хранения (срок наблюдения) титр антител к ЦМВ уменьшался всего лишь на одно разведение, что, тем не менее, удовлетворяло заложенным в проект ФСП требованиям на препарат (1:6400). Другие параметры внутривенного иммуноглобулина также соответствовали требованиям нормативной документации в течение трех лет.

Если на первом этапе анализ содержания антител к ЦМВ проводился полуколичественным методом с использованием тест-системы ВектоЦМВ-^О-стрип, имеющий нормативный документ (ФСП) с представлением результатов в виде титра (степени разведения препарата), то в дальнейшем была применена тест-система, имеющая внутренний стандарт и позволяющая определять титр антител в МЕ/мл - ДС-ИФА-анти-ЦМВ-а

При сравнении содержания антител, определяемых с использованием этих тест-систем, обращает на себя внимание разброс значений, выраженных в МЕ/мл при одном и том же разведении образцов (табл. 1).

Таблица 1

Определение анти-ЦМВ антител в препаратах иммуноглобулинов с использованием двух различных тест-систем

Наименование препарата Содержание анти-ЦМВ-антител по данным:

«ВектоЦМВ-^О-стрип» "ДС-ИФА-анти-ЦМВ-С', М±т

1 Габриглобин-анти-ЦМВ с. 1 1:6400 51,3 + 1,9

2 Габриглобин-аити-ЦМВ с. 2 1.6400 58,8 + 1,7

3 Габриглобин-анти-ЦМВ с. 3 1:12800 66,4+1,8

4 Цитотектс. 144081, 10% 1:6400 51,2+1,1

5 Противоцитомегаловирусный иммуноглобулин для внутривенного введения (Кировский НИИГПК, экспериментальный образец) 1:12800 72,7 + 2,8

6 ОСО № 42-28-371-03 с содержанием антител к ЦМВ 5 МЕ/мл 1:400 5,3+0,2

Так, если титр антител препаратов "Габриглобин-анти-ЦМВ" с. 1 и с. 2 был 1:6400 («ВектоЦМВ-^О-стрип»), то при анализе этих же образцов тест-системой "ДС-ИФА-анти-ЦМВ-О" были получены значения 51,3 и 58,8 МЕ/мл

Аналогичная картина наблюдалась при разведении препаратов 1:12800: у препарата "Габрипгобин-анти-ЦМВ" с. 3 содержание антител по данным, полученным в тест-системе "ДС-ИФА-анти-ЦМВ-G", составило 66,4, а у экспериментального образца анти-ЦМВ-иммунопгобулина, произведенного в Кировском НИИГПК - 72,7 ME/мл. Эти результаты свидетельствуют, что для грубой оценки содержания антител (в связи с большим шагом разведения проб) может быть использована тест-система «BeicroI^Mß-IgG-CTpHn», а если необходимо получение более точных результатов, лучше применять тест-систему "ДС-ИФА-анти-ЦМВ-G", содержащую внутренний стандарт, калиброванный по ОСО № 42-28-371-03.

Сравнение препарата габриглобин-анти-ЦМВ с коммерческим аналогом -препаратом цитотект («Biotest Pharma», Германия) показало, что габриглобин не уступает по специфической активности зарубежному образцу (табл 1). После согласования нормативной документации предполагается проведение клинических испытаний препарата при различных формах ЦМВ-инфекции.

Положительные результаты, достигнутые при фракционировании плазмы с высоким титром таких лабильных антител подкласса IgG3, какими являются антитела к ЦМВ, позволили разработать общую технологию фракционирования плазмы для получения препаратов "Габриглобин" и "Габриглобин-анти-ЦМВ" (рис. 4). Схема включает карангинизадию плазмы, тестирование на вирусные маркеры, спиртовое фракционирование, концентрирование фильтрата «Б» ультрафильтрацией при величине pH 4,2, стадию снижения антикомплементарной активности (диализ-диафильтрация), первую вирусинактивацшо (выдерживание при pH 4,2 в течение 21 суток), высушивание, вторую вирусинактивацию (прогрев при 60 °С в течение 72 ч), контроль, упаковку и маркировку. Промышленное производство препарата организовано на Ивановской областной станции переливания крови.

Клинические испытания габрнглобина при врожденных гуморальных иммунодефицитах.

Располагая официально выпускаемым препаратом с содержанием, по данным колоночной хроматографии, мономерного иммуноглобулина G 98-99 %, мы должны были убедиться в его терапевтических возможностях. •

Рис. 4. Производственная схема получения препаратов "Габриглобнн" и "Габриглобин-анти-ЦМВ"

Абсолютным показанием для назначения иммуноглобулина является первичный гуморальный иммунодефицит /Кострова О.М., Алешкин В А., 1995; Сетдикова Н.Х. и соавт., 2004; Goldman A.S., Goldblum R.M, 1977/. При этом выявляются все преимущества и недостатки того или иного коммерческого препарата иммуноглобулина: скорость достижения уровня циркулирующего IgG в сыворотке крови, длительность сохраняющейся концентрации и частота побочных реакций. Клиническая эффективность внутривенных иммуноглобулинов напрямую связана со степенью повреждения молекулы иммуноглобулина во время процедуры получения коммерческого препарата.

Клинические испытания выполнены в рамках "Протокола открытого одноцентрового исследования безопасности и клинической эффективности препарата "Габриглобин" у взрослых с агаммаглобулинемией", утвержденного Фармакологическим комитетом МЗ РФ (протокол № 8 от 4.12.03) в отделении иммунопатологии (заведующая - д.м.н. Латышева Т.В.) ГНЦ "Институт иммунологии МЗ РФ". Все больные (10 пациентов) до начала лечения получали заместительную терапию: плазмой (2 человека) и иммуноглобулинами для внутривенного введения отечественного производства (г. Нижний Новгород и г. Уфа) - 8 человек. Несмотря на проводимую заместительную терапию у больных сохранялось значительное снижение концентрации IgG и полностью отсутствовали иммуноглобулины классов М и А. Только у одного больного присутствовало остаточное количество иммуноглобулинов А и М (табл. 2).

Таблица 2

Содержание иммуноглобулинов (мг%) в сыворотке крови у больных с

агаммаглобулинемией до начала лечения габриглобином

Иммуно- Норма, Больные (п = 10)

глобулины мг% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

IgG 900-1800 214 268 32 39 109 838 0 478 202 472

IgA 100-300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48

IgM 80-250 0 0 0 0 0 0 0 о 0 47

Габриглобин вводили в разовой дозе 0,6 г/кг массы тела трехкратно с интервалом 3 недели. Ни у одного больного не было зарегистрировано каких-либо системных реакций. За время применения габриглобина больными

агаммаглобулинемией в течение 3-х месяцев отмечалось сокращение частоты рецидивов хронических заболеваний, что вело за собой сокращение потребности и длительности применения антибактериальной терапии. Так, например, перед началом лечения четверо больных нуждались практически в постоянном приеме антибиотиков в связи с непрерывно рецидивирующим, воспалительным процессом, в последующие 2 месяца только один больной нуждался в антибактериальной терапии.

Уже на первый день после введения габриглобина отмечалось значительное повышение концентрации иммуноглобулина G в сыворотке крови, в среднем в 2-3 раза, а у некоторых больных - в 5-6 раз. Начало снижения достигнутой концентрации иммуноглобулина G в сыворотке крови наблюдалось лишь на 15-й день после введения препарата (рис. 5).

Обращает на себя внимание увеличение максимальной достигнутой концентрации иммуноглобулина G в крови больных с каждым последующим циклом применения габриглобина. Так, если у пациента № 3 до начала лечения концентрация иммуноглобулина в крови была 32 мг%, то максимальная концентрация IgG в крови после первого курса введения препарата составила 569 мг%, после второго курса - 604 мг%, а после третьего введения - 718 мг%, постепенно снижаясь к окончанию лечения. Аналогичная картина наблюдалась у всех других пациентов (рис. 5).

Таким образом, длительность сохранения повышенной концентрации IgG в крови больных агаммаглобулинемией после введения габриглобина составляет более 21 суток (3 недели).

Необходимо отметить, что препарат "Габриглобин" был успешно использован для терапии вирусных инфекционных заболеваний: при так называемом "синдроме атипичной пневмонии", при невынашивании беременности, связанной с цитомегаловирусной инфекцией, и при лечении вирусного энцефалита, вызванного вирусом Эпштейна-Барр.

Синдром атипичной пневмонии (SARS) — острое вирусное заболевание, вызванное, как предполагают, мутированным корона- или парамиксовирусом, характеризующееся преимущественным поражением легочной ткани и высокой смертностью,

До 1 2 5 10 15 21 1 2 5 10 15 21 1 2 5 10 21

Дни после применения габриглобина

Рис. 5 Динамика концентрации иммуноглобулина С в крови больных агаммаглобулинемией (п=10)

По одним данным, перенесенное заболевание не дает полноценного иммунитета, так как в крови у некоторых переболевших атипичной пневмонией повторно обнаруживается возбудитель заболевания. По другим сведениям, сыворотка крови от переболевших больных способствует более легкому течению заболевания и значительно снижает смертность. В нашей стране зарегистрирован случай данного заболевания у больного С., 25 лет, в г. Благовещенске Амурской области.

Располагая отечественным препаратом иммуноглобулина для внутривенного введения "Габриглобин", хорошими результатами клинических испытаний препарата при агаммаглобулинемии и учитывая развивающийся при атипичной пневмонии иммунодефицит, мы предположили, что габриглобин может явиться высокоэффективным средством комплексной терапии SARS.

Габриглобин, по заключению консилиума Амурской областной инфекционной клинической больницы, был использован у больного С. в период ранней реконвалесценции, в дозе 7,5 г ежедневно в течение 3 дней, что составило 0,12 г/кг массы тела в сутки. Переносимость препарата была хорошей, введение не сопровождалось никакими нежелательными реакциями. Со вторых суток применения препарата не наблюдалось подъема температуры, уменьшился лейкоцитоз, улучшилось общее состояние. Вскоре больной был выписан под амбулаторное наблюдение. Положительные результаты клинического использования габриглобина при синдроме атипичной пневмонии позволили рекомендовать включение препаратов иммуноглобулинов в комплексную терапию данного заболевания /Письмо МЗ РФ 2510/4194-03-27,2003 г/

Учитывая сведения о том, что эффективным барьером на пути передачи вируса цитомегалии от матери к плоду являются материнские анти-ЦМВ-антитела /Калинина Н.М., Кетлинский С.А., 2002/, и то обстоятельство, что препарат габриглобин-анти-ЦМВ еще только направлен для проведения клинических испытаний, а обычные, «неспецифичные» серии габриглобина также содержат антитела к ЦМВ, хоть и в меньшем титре, была сделана попытка применения «неспецифичного» габриглобина для лечения ЦМВ-инфекции.

Габриглобин был использован у больной В., находившейся на лечении в 3-ем гинекологическом отделении Ивановского НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова с диагнозом «невынашивание беременности смешанного генеза,

хроническая ЦМВ-инфекция». После проведенного курса лечения габриглобином по 7,5 г еженедельно в течение 4 недель наступила беременность, во время которой ежемесячно пациентка получала по 5 г препарата внутривенно капельно. Беременность закончилась срочными родами, родился здоровый мальчик. В настоящее время развитие ребенка (1 год и 7 месяцев) нормальное, признаки ЦМВ-инфекции отсутствуют.

Лечение вирусного энцефалита, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, проведено у больного Г., 37 лет, находившегося в отделении реанимации ГКБ № 23 г. Москвы с диагнозом: бактериально-грибково-вирусный сепсис, аспергиллез, вирусцый энцефалит Эпштейна-Барр, отек головного мозга, бактериально-вирусно-грибковая пневмония, дыхательная недостаточность, острая печеночно-почечная и надпочечниковая недостаточность. Диагноз установлен клинически и был подтвержден инструментальными и лабораторными методами.

Лечение вирусного энцефалита было проведено ацикловиром в дозе 1,5 г в сутки в течение 10 дней без эффекта. По решению консилиума был назначен курс лечения габриглобином в дозе 30 г иммуноглобулина в течение трех суток в сочетании с ацикловиром. Через 10 суток выполнена люмбальная пункция и получен светлый прозрачный ликвор, в котором вирус Эпштейна-Барр отсутствовал.

Таким образом, габриглобин обладает высокой эффективностью у больных с общим вариабельным иммунодефицитом, снижает потребность в антибактериальных средствах и может использоваться для лечения вирусных и бактериальных инфекций.

ВЫВОДЫ

1. Научно обоснованный процесс масштабирования лабораторной технологии позволил впервые в Российской Федерации организовать промышленное производство препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, с низким значением рН, состоящего из цельных молекул в мономерной форме и сохранивших свои бифункциональные свойства.

Технологическая схема производства препарата, получившего торговое наименование "Габриглобин", включает: карантинизацию плазмы, тестирование на вирусные маркеры, спиртовое фракционирование, концентрирование фильтрата

«Б», стадии диафильтрации и диализа, первую вирусинактивацию, высушивание, вторую вирусинактивацию, контроль, упаковку и маркировку.

2 Оптимизированы технологические производственные операции и установлены факторы, определяющие основные качественные показатели препарата: степень очистки воды, используемой в технологическом цикле и этап снижения антикомплементарной активности. Соблюдение регламентных режимов позволяет выпускать габриглобин с минимальными колебаниями показателей качества.

3. Подобраны и включены в технологический процесс получения препарата "Габриглобин" две стадии инактивации возможно присутствующих вирусов: инкубация жидкого полуфабриката иммуноглобулина при величине рН 4,2 в течение более 21 суток и прогрев флаконов с сухим препаратом при 60 °С в течение 72 часов. Процесс вирусинактивации не ухудшает физико-химические и биологические свойства препарата.

4. Разработан алгоритм отбора донорского сырья с высоким титром антител к вирусу цитомегалии и доказана принципиальная возможность получения иммуноглобулина для внутривенного введения с титром антител к цитомегаловирусу 1:6400 - 1:12800, или с содержанием антител более 50 МЕ/мл. Препарат "Габриглобин-анти-ЦМВ" стабилен в течение трех лет (срок наблюдения).

5. Клинические испытания показали высокую эффективность заместительной терапии габриглобином у больных с общим вариабельным иммунодефицитом, сохранение повышенной концентрации ^О в крови после введения препарата в течение более 21 суток. Препарат обладает терапевтической активностью при синдроме атипичной пневмонии, врожденной ЦМВ-инфекции и энцефалите, вызванном вирусом Эпштейна-Барр.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тюриков Ю.М., Трофимова С.И. О донорском движении в Ивановской области. Производство иммуноглобулинов. /Материалы международной научно-практической конференции по донорству крови. - Архангельск, 2001. - с. 29.

2. Лотов А.Г., Алешкин В.А., Тюриков Ю.М, Капустянская И.Ю., Клюева Е.А., Бочкарева С.С. Изучение переносимости и клинической эффективности Габриглобина - нового отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения. /Новое в трансфузиологии. Информационный бюллетень. - М., 2002, вып. 33, с. 61-72.

3. Лютов А.Г., Алешкин В.А, Платонов A.B., Лесик Н.В, Тарасов А.В,Бочкарева С.С, Зайцева Т.А, Тюриков Ю.М. Применение препарата "Габриглобин" при атипичной пневмонии. Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения. /Сборник материалов научно-практической конференции. Приложение к журналу "Вестник восстановительной медицины". М„ 2003. - С. 32-33

4. Лютов А.Г, Бочкарева С.С, Тюриков Ю.М, Румянцева Т.Е. Влияние условий диафильтрации на антикомплементарную активность иммуноглобулина. Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения. /Сборник материалов научно-практической конференции. Приложение к журналу "Вестник восстановительной медицины". М, 2003. - С. 16-17.

5. Лютов А.Г, Латышева Т.В, Ситдикова Н.Х, Алешкин В.А, Мостовская Е.В, Тюриков Ю.М, Бочкарева С.С. Опыт применения габриглобина у больных с агаммаглобулинемией. /Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. - Киров, 2005 - с. 219-221.

6. Лютов А Г, Мостовская Е.В, Исрафилов А.Г, Алешкин В.А , Кудашева Г.Б, Тюриков Ю.М. Некоторые сравнительные характеристики препаратов иммуноглобулинов. Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение. //Материалы Всероссийской научной конференции. - Уфа, "Иммунопрепарат", 2005. - Ч. 2, с. 13-21

7. Лютов А.Г, Алешкин В.А, Мостовская Е.В, Тюриков Ю.М. Использование габриглобина при местных и системных воспалительных заболеваниях. /Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. Киров, 2005, с. 215-219.

8. Лютов А.Г, Мостовская Е.В, Донюш Е.К, Алешкин В.А, Тюриков Ю.М.. Габриглобин - эффективный отечественный иммуноглобулин для внутривенного введения. //Тезисы Всероссийской научно-практич. конференции «Вакцинология-2006». - М, 2006. С. 60.

9. Мостовская Е.В, Лютов А.Г, Долматов В.Ю, Дробкова A.B., Соловьев А.Ф, Карпова М.В, Мальцева О.В, Блинова Е.А, Бочкарева С.С, Тюриков Ю.М. Габриглобин как основа создания специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения. /Вопросы трансфузиологии и клинической медицины. Материалы научно-практической конференции молодых ученых. Киров, 2007 -с. 39-41.

10. Тюриков Ю.М На новый уровень безопасности. //Медицина и экономика сегодня - М, 2007, № 6. - С. 91-92.

11. Лютов А.Г, Мостовская ЕВ, Денисов А.К, Тюриков Ю.М, Бочкарева С.С. О безопасности и клинической эффективности габриглобина - отечественного

ммуноглобулина для внутривенного введения. //Педиатрия, 2008, № 3, с. 739.

юриков Ю.М, Лютов А.Г., Алешкин В.А., Бочкарева С.С., Долматов В.Ю., остовская Е.В. Габриглобин как возможное средство терапии итомегаловирусной инфекции. //Вестник новых медицинских технологий. 008, №2.-С. 239-241

очкарева С.С., Лютов А.Г., Алешкин В.А., Новикова Л.И., Тюриков Ю.М., олматов В.Ю., Мостовская Е.В. Содержание антител к вирусам семейства ерпеса в препарате внутривенного иммуноглобулина «Габриглобин». овременные представления об иммунокоррекции. /Материалы Всероссийской аучно-пратической конференции. - Пенза, 2008. - С.20-23.

ТЮРИКОВ Юрий Михайлович

Разработка препарата иммуноглобулина для внутривенного введения и использования его для терапии иммунодефицитных состояний

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Лицензия ИД № 05235 от 4 июля 2001 г. Подписано в печать 28.10.2008. Формат 60x84 1/16 Печать плоская. Усл. печ. л. 1,62 Тираж 100 экз. Заказ № 187. ГОУ ВПО «Ивановсхий государственный энергетический университет им. В.И. Ленина» 153003, Иваново, ул. Рабфаковская, 34.

Отпечатано в РИО ИГЭУ.

Первичные иммунодефицитные состояния - это врожденные нарушения системы иммунитета, связанные с генетическими дефектами одного или нескольких компонентов иммунного ответа, в частности, клеточного или гуморального звена, фагоцитоза или системы комплемента /доклад группы ВОЗ, 1978, 1980, 1995; Ballow М., 2002/.

Актуальность проблемы иммунодефицитов у человека обусловлена высокой частотой встречаемости данного заболевания, которая составляет от 1:10000 до 1:500 /Cunningham-Rundles С., 2002/, неизбежностью летальных исходов при отсутствии заместительной терапии и тем обстоятельством, что постоянное воздействие на человека ксенобиотиков, рост сопротивляемости микроорганизмов, неэффективность традиционных антимикробных средств и недостаточная реакция иммунной системы на интервенцию патогенов вызывают генетические дефекты и, как следствие, способствуют развитию иммунодефицитов /Ярцев М.Н., Яковлева К.П., 2004; Etzioni А., 2003/.

Первичные иммунодефицита, как правило, проявляются после рождения в виде обычных или оппортунистических инфекций. Одной из основных задач при лечении иммунодефицитов является борьба с оппортунистическими инфекциями, вызываемыми, в частности, вирусами семейства Herpesviridae. Для всех 8-ми антигенных серотипов (вирусы простого герпеса 1 и 2 типа, ветряной оспы — опоясывающего герпеса, цитомегаловирус (ЦМВ), вирус Эпштейна-Барр, вирусы герпеса человека 6, 7 и 8 типов) характерна большая вариабельность, высокая контагиозность, полиморфизм клинических проявлений и резистентность к проводимой антивирусной терапии.

Особое место среди вирусных осложнений, клиническое проявление которых становится возможным лишь на фоне иммунной недостаточности, занимает цитомегаловирусная инфекция, что обусловлено ее широким распространением среди детей раннего возраста. Так, следы перенесенной

ЦМВ-инфекции выявляются у 40-60 % детей в возрасте до 5 лет и у 30-90 % взрослых старше 25 лет /Adler S.P. et al., 1995/.

Необходимость изучения ЦМВ объясняется не только его способностью инфицировать плод, но и риском посттрансфузионных ЦМВ-инфекций, развитием инфекции у реципиентов трансплантатов, не вполне ясной ролью вируса в патогенезе ряда злокачественных заболеваний /Казанцев А.П., Попова Н.И. 1980; Yamani М.Н. et al., 2001; Weinberg А., 2002/.

Считается, что единственным эффективным функциональным барьером на пути ЦМВ к плоду являются нейтрализующие антитела класса IgG, как материнские, так и внесенные извне /Абазова Ф.И., Хахалин JI.H., 1997; Калинина Н.М., Кетлинский С.А., 2002/. Поэтому в качестве одного из возможных средств борьбы с вирусными инфекциями могут быть использованы препараты иммуноглобулинов /Алешкин В.А. и соавт., 1996/.

Исследования в области молекулярной биологии позволили идентифицировать молекулярные дефекты основных первичных иммунодефицитных состояний и способствовали созданию новых терапевтических подходов, таких как пересадка костного мозга или генная терапия /Ярцев М.Н., Яковлева К.П., 2004; Buckley R.H., 2002/. Тем не менее, основным принципом лечения всех форм агаммаглобулинемии (гуморальных иммунодефицитов) и ее осложнений, является регулярная заместительная терапия иммуноглобулинами для внутривенного введения в сочетании с антибиотикотерапией /Сетдикова Н.Х. и соавт., 2004; Goldman A.S., Goldblum R.M, 1977/.

В настоящее время имеется достаточно большой выбор иммуноглобулинов для внутривенного введения. Для лечебного применения предлагаются препараты, в основном, зарубежного производства, различающиеся по своему качеству, физическим параметрам, длительности циркуляции в организме и эффективности /Сапожникова В.С, 1990; Шарыгин C.JL, 1997; Berkman S.A. et al., 1990/. Предлагается ряд специфических, или направленных, иммуноглобулинов /Алешкин В.А. и соавт., 2003/.

Отечественные иммуноглобулины для внутривенного введения выпускаются с использованием ферментативной обработки, что приводит к повреждению Fc-фрагмента молекулы иммуноглобулина G и ускоренному, в течение нескольких суток, выведению такого препарата из организма /Анастасиев В.В., 2000/. Восполнение уровня иммуноглобулинов в крови при агамма- или гипогаммаглобулинемии (заместительная терапия) данными препаратами недостаточно эффективно.

Поэтому создание препаратов иммуноглобулина для внутривенного введения, как неспецифических, пригодных для заместительной терапии различных форм гуморальных иммунодефицитов, так и направленных, предназначенных для лечения осложнений недостаточности иммунного ответа, в частности, цитомегаловирусной инфекции, является актуальной задачей.

Цель работы: создание препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, пригодного для терапии гуморальных иммунодефицитов и их осложнений, в частности, цитомегаловирусной инфекции.

Задачи исследования:

1. Масштабировать лабораторный процесс получения иммуноглобулина до промышленного уровня и организовать производственный выпуск препарата, имеющего цельные молекулы IgG в мономерной форме.

2. Установить факторы, определяющие качественные показатели иммуноглобулина и оптимизировать технологические приемы получения препарата.

3. Включить в технологический процесс стадии инактивации возможно присутствующих вирусов.

4. Исследовать возможность получения иммуноглобулина для внутривенного введения с высоким титром антител к вирусу цитомегалии.

5. В рамках государственных клинических испытаний изучить эффективность иммуноглобулина для внутривенного введения (габриглобина) при первичных гуморальных иммунодефицитах.

Научная новизна.

Создана научно обоснованная технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения, пригодного для заместительной терапии гуморальных иммунодефицитов, Препарат содержит цельные молекулы IgG в мономерной форме, которые сохраняют свои бифункциональные свойства.

Основными факторами, определяющими качество препарата, являются степень очистки воды, используемой в технологическом цикле и процесс снижения антикомплементарной активности.

Разработан алгоритм отбора донорского сырья с высоким титром антител к вирусу цитомегалии и показана принципиальная возможность получения направленного иммуноглобулина для внутривенного введения.

Продемонстрирована высокая эффективность заместительной терапии габриглобином у больных с общим вариабельным иммунодефицитом и сохранение повышенной концентрации IgG в крови после введения препарата в течение более 21 суток.

Практическое значение работы.

Организовано промышленное производство иммуноглобулина для внутривенного введения с торговым названием "Габриглобин". Препарат может быть с успехом использован для терапии различных заболеваний, в первую очередь, для эффективного восполнения дефицита иммуноглобулинов у больных с гуморальными иммунодефицитами, а таюке для лечения вирусных инфекций.

Внедрение результатов исследования в практику.

Впервые в Российской Федерации на Ивановской областной станции переливания крови организовано промышленное производство иммуноглобулина для внутривенного введения "Габриглобин", имеющего две стадии вирусинактивации (ФСП № 42-0265-1621-01).

Производственный регламент получения препарата "Габриглобин" (иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения сухой) утвержден Комиссией по стандартизации Центральной лаборатории государственного контроля и изучения качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов ГУ "Гематологический научный центр РАМН" (протокол №414 от 10.12.2003 г.).

Опытно-промышленный регламент производства препарата "Габриглобин-анти-ЦМВ" утвержден Комиссией по стандартизации Центральной лаборатории государственного контроля и изучения качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов ГУ "Гематологический научный центр РАМН", (протокол № 106 от

23.04.2003 г.)

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана научно обоснованная промышленная технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения с торговым названием "Габриглобин", который имеет низкое значение рН и цельные молекулы IgG в мономерной форме.

Процесс получения препарата включает карантинизацию плазмы, тестирование на вирусные маркеры, спиртовое фракционирование, концентрирование фильтрата «Б» ультрафильтрацией, стадию снижения антикомплементарной активности и удаления низкомолекулярных веществ путем диализа-диафильтрации, первую вирусинактивацию, высушивание, вторую вирусинактивацию, контроль, упаковку и маркировку.

2. Предложен алгоритм отбора донорского сырья с высоким титром антител к вирусу цитомегалии и доказана принципиальная возможность получения иммуноглобулина для внутривенного введения с титром антител к цитомегаловирусу 1:6400 — 1:12800, или с содержанием антител более 50 МЕ/мл - "Габриглобин-анти-ЦМВ".

3. Габриглобин обладает высокой терапевтической активностью при лечении первичных гуморальных иммунодефицитах, эффективно восполняя имеющийся дефицит IgG, что приводит к сокращению частоты рецидивов хронических заболеваний. Повышенная концентрация IgG в крови после введения препарата сохраняется в течение более 21 суток.

Апробация материалов диссертации.

Диссертация прошла апробацию на совместном заседании секций Ученого совета «Медицинская биотехнология» и «Общая и прикладная иммунология» Федерального Государственного Учреждения Науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ 15 июня 2008 г. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции по донорству крови (Архангельск, 2001 г.), на «Научно-практической конференции по иммунологии» (Москва, 2003 г.), на научной конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Киров, 2005 г.), на Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение», Уфа, 2005 г., на научно-практической конференции «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Научно обоснованный процесс масштабирования лабораторной технологии позволил впервые в Российской Федерации организовать промышленное производство препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, с низким значением рН, состоящего из цельных молекул IgG в мономерной форме и сохранивших свои бифункциональные свойства.

Технологическая схема производства препарата, получившего торговое наименование "Габриглобин", включает: карантинизацию плазмы, тестирование на вирусные маркеры, спиртовое фракционирование, концентрирование фильтрата «Б», стадии диафильтрации и диализа, первую вирусинактивацию, высушивание, вторую вирусинактивацию, контроль, упаковку и маркировку.

2. Оптимизированы Технологические производственные операции и установлены факторы, определяющие основные качественные показатели препарата: степень очистки воды, используемой в технологическом цикле и этап снижения антикомплементарной активности. Соблюдение регламентных режимов позволяет выпускать габриглобин с минимальными колебаниями показателей качества.

3. Подобраны и включены в технологический процесс получения препарата "Габриглобин" две стадии инактивации возможно присутствующих вирусов: инкубация жидкого полуфабриката иммуноглобулина при величине рН 4,2 в течение более 21 суток и прогрев флаконов с сухим препаратом при 60 °С в течение 72 часов. Процесс вирусинактивации не ухудшает физико-химические и биологические свойства препарата.

4. Разработан алгоритм отбора донорского сырья с высоким титром антител к вирусу цитомегалии и доказана принципиальная возможность получения иммуноглобулина для внутривенного введения с титром антител к цитомегаловирусу 1:6400 - 1:12800, или с содержанием антител более 50 МЕ/мл. Препарат "Габриглобин-анти-ЦМВ" стабилен в течение трех лет (срок наблюдения).

5. Клинические испытания показали высокую эффективность заместительной терапии габриглобином у больных с общим вариабельным иммунодефицитом, сохранение повышенной концентрации IgG в крови после введения препарата в течение более 21 суток. Препарат обладает терапевтической активностью при синдроме атипичной пневмонии, врожденной ЦМВ-инфекции и энцефалите, вызванном вирусом Эпштейна-Барр.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммунодефицитные состояния — широкое понятие, которое включает врожденные и приобретенные нарушения иммунного ответа, сопровождающиеся инфекционными бактериальными или вирусными заболеваниями. Врожденные нарушения системы иммунитета могут быть связаны с генетическими дефектами только одного или сразу нескольких компонентов системы иммунитета, в частности, клеточного или гуморального звена, фагоцитоза или системы комплемента /Ballow М., 2002; Yel L. et al., 2003/.

Иммунодефицитные состояния характеризуется повторными и хроническими инфекционными осложнениями, повышенной частотой возникновения аллергических или аутоиммунных заболеваний и развитием злокачественных опухолей /Rosen F.S. et al., 1997; Spector B.D. et al., 1978; Rehman S. et al., 2003/.

Лечение иммунодефицитов заключается в заместительной терапии иммуноглобулином, пересадке костного мозга или генной терапии /Buckley R.H., 2002/. Тем не менее до настоящего времени основным принципом лечения всех форм агаммаглобулинемии и ее осложнений, является регулярная заместительная терапия иммуноглобулинами для внутривенного введения в сочетании с антибиотикотерапией /Сетдикова Н.Х. и соавт., 2004; Goldman A.S., Goldblum R.M, 1977, De Gracia J. et al., 2004).

Одной из основных задач в терапии врожденных и приобретенных иммунодефицитов является профилактика оппортунистических инфекций, вызываемых вирусами семейства Herpesviridae, в частности, цитомегаловирусом. Распространенность данной инфекции среди детей раннего возраста, беременных женщин, способность инфицировать плод и вызывать заболевания у реципиентов трансплантатов делают борьбу с ЦМВИ особенно актуальной /Ф.И.Абазова, Л.Н.Хахалин, 1997, Pass P.F.et al.,1990/.

Эффективным барьером на пути передачи вируса цитомегалии от матери к плоду являются материнские антитела к цитомегаловирусу. Аналогичный эффект наблюдается и при пассивном введении в организм беременной женщины иммуноглобулина, содержащего специфические антитела /Абазова Ф.И., Хахалин J1.H., 1997; Калинина Н.М., Кетлинский С.А., 2002/.

Создание препаратов иммуноглобулина для внутривенного введения, пригодных для заместительной терапии гуморальных иммунодефицитов и их осложнений, в частности, цитомегаловирусной инфекции, является актуальной задачей.

Разработка препаратов иммуноглобулинов, пригодных для заместительной терапии агаммаглобулинемии, является непростым делом. Например, существующие отечественные препараты иммуноглобулинов получены с использованием фермента пепсина, который, обеспечивая отсутствие побочных эффектов при внутривенном вливании, значительно укорачивает время циркуляции иммуноглобулина в организме /Анастасиев В.В., 2000/.

Алешкиным В.А. и Лютовым А.Г. /1998/ предложена технология получения нерасщепленного иммуноглобулина с низким значеним рН, который может быть эффективным средством терапии гуморальных иммунодефицитов.

Задачами настоящего исследования было масштабирование процесса получения препарата иммуноглобулина, состоящего из цельных молекул IgG в мономерной форме, до промышленного уровня; установление факторов, определяющих основные качественные показатели иммуноглобулина и оптимизация технологических приемов получения препарата; использование двух стадий инактивации возможно присутствующих вирусов; исследование возможности получения иммуноглобулина для внутривенного введения с высоким титром антител к вирусу цитомегалии и изучение клинической эффективности иммуноглобулина для внутривенного введения, получившего торговое наименование "Габриглобин", при первичных гуморальных иммунодефицитах.

Для решения поставленных задач в первую очередь было необходимо изучить возможность получения иммуноглобулина, пригодного для внутривенного вливания, в соответствии с рекомендациями Алешкина В.А., Лютова А.Г. /1998/, с использованием технологических приемов и исходного сырья Ивановской областной станции переливания крови.

Проведенный анализ технологического процесса фракционирования плазмы, принятого на станции, и эксперимент, выполненный в лабораторных условиях по концентрированию фильтрата "Б" на ультрафильтрационном модуле, состоящем из кассетной системы «Pellicon» и шестеренчатого насоса, показали принципиальную возможность приготовления препарата иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения. Экспериментальный образец содержал более 95 % мономерного IgG и имел антикомплементарную активность 10 мг белка, не активирующих 2 СН50.

Положительные результаты эксперимента позволили перейти к масштабированию технологии. Процесс концентрирования фильтрата «Б» в производственных условиях проводили на 5 ультрафильтрационных кассетах фирмы «Владисарт», использовали промышленный шестеренчатый насос с регулируемой производительностью.

Центрифугат "Б" в количестве 177 л был разведен дистиллированной водой, а величина рН раствора была снижена до 4,3. После концентрирования и диафильтрации (для полного освобождения иммуноглобулина от остаточного содержания этанола и солей) раствор иммуноглобулина подвергли осветляющей и стерилизующей фильтрации. Снижение антикомплементарной активности было проведено диализом в вискозных оболочках, а затем препарат был высушен. Иммуноглобулину было присвоено торговое наименование "Габриглобин".

Аналогичным образом были приготовлены еще четыре серии препарата. Анализ биологических и иммунохимических параметров полученных образцов показал, что все параметры производственных серий иммуноглобулина соответствовали требованиям фармакопейной статьи. Однако антикомплементарная активность трех серий из пяти составила только 5 мг белка, не активирующих комплемент, хотя значительных отличий в технологических приемах, которые были использованы во время процесса приготовления препарата, найдено не было.

Подробный анализ всех стадий технологического процесса показал, что процесс высушивания не оказывает существенного влияния на иммуноглобулин. Было высказано предположение о том, что параметры конечной продукции может определять качество дистиллированной воды, используемой в технологическом цикле приготовления препарата. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что экспериментальный образец иммуноглобулина, приготовленный с использованием дистиллированной воды трехкратной перегонки, полученной на Ивановской ОСПК, имел антикомплементарную активность только 5 мг белка, тогда как образец иммуноглобулина, изготовленный из той же партии фильтрата "Б", но на дистиллированной воде однократной перегонки в МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, имел антикомплементарную активность 10 мг белка, не активирующих 2 СН50.

Сравнительный полуколичественный анализ качества воды показал, что в воде из Иваново более высокое значение величины рН, чем в воде из МНИИЭМ Г.Н.Габричевского, одинаковое содержание восстанавливающих веществ, и несколько более высокое количество нитритов, нитратов и тяжелых металлов.

Антикомплементарная активность - один из основных параметров качества иммуноглобулинов, предназначенных для внутривенного введения, а вода - главный фактор, определяющий конформационные изменения белковых молекул в растворе. Поэтому любые воздействия, изменяющие конфигурацию иммуноглобулина, могут приводить к открытию участка, связывающего Clq (субкомпонент первого компонента системы комплемента), и запуску каскада активации комплемента /Кэбот Е., Мэйер М., 1968; Евченко Т.А., 2000; Козлов JI.B. и соавт., 2005/.

Исследования Tenold R.A. /1983/ продемонстрировали, что чем меньше раствор иммуноглобулина содержит низкомолекулярных примесей в виде NaCl, спирта и пр., то тем больший процент молекул IgG находится в мономерной форме и тем ниже его антикомплементарная активность. По-видимому, определяющее влияние дистиллированной воды на качество "Габриглобина", объясняется наличием в воде Ивановской ОСПК повышенного содержания ионов тяжелых металлов, которые могут дестабилизировать гидратную оболочку молекул иммуноглобулина, снижать его дзета-потенциал, что приводит к изменению конформации молекулы, образованию агрегатов и раскрытию участков, связывающих компоненты комплемента.

Опираясь на полученные данные, в технологическом цикле приготовления препарата мы предложили использовать только воду, приготовленную путем обратного осмоса, что обеспечило стабильность всех показателей препарата от серии к серии.

Далее, для увеличения объема выпускаемой продукции, был проведен комплекс исследований по замене ручной стадии диализа иммуноглобулина в вискозных оболочках (этап уменьшения антикомплементарной активности) на диафильтрацию полуфабриката с использованием ультрафильтрационной кассетной системы.

Для подбора условий снижения антикомплементарной активности иммуноглобулина методом диафильтрации полуфабриката на ультрафильтрационном модуле было исследовано несколько режимов проведения процесса и выбран метод, обеспечивающий гарантированное снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина. Данный прием заключается в использовании противотока диализирующей жидкости во время ультрафильтрации в количестве от 20 до 40 объемов по отношению к объему иммуноглобулина.

В результате первого этапа исследований, посвященного масштабированию производственного процесса и поддержанию стабильных показателей качества препарата от серии к серии, с 2002 г. организован промышленный выпуск препарата "Иммуноглобулина человека нормального для внутривенного введения сухого", получившего коммерческое название "Габриглобин" (ФСП № 42-0265-1621-01).

В связи с тем, что при контакте с донорской кровью возможна передача более 30 различных видов инфекций /Подгорная Е.Ю., Порохненко С.Г., 2005/, при производстве препаратов из данного сырья необходимо соблюдение определенных мероприятий, таких как карантинизация плазмы и наличие одной или нескольких стадий инактивации вирусов /Карякин А.В., 2005/.

Панов В.П. и соавт. /2005/ указывают, что вирусная безопасность продуктов крови обеспечивается тремя непременными факторами: отбором доноров, тестированием донаций и пулов плазмы, инактивацией и удалением вирусов в процессе производства. Причем способы удаления вирусов должны быть четко различимы от способов их инактивации.

Возможность передачи инфекционных агентов с продуктами крови заставляет производителей препаратов совершенствовать технологию их производства и вводить специальные стадии вирусной инактивации. Так, например, в производственный цикл получения отечественного препарата иммуновенин включены несколько международных валидированных методик инактивации вирусов: этанольное фракционирование плазмы крови по Кону, глубинная фильтрация через мембраны LP-60 (Cuno), нанофильтрация через фильтры L+VR (Cuno) или Ultipor DV50 (Pall) и инкубация при кислом значении рН 4,25 /Исрафилов и соавт., 2005/.

Несмотря на то, что, по данным Henin et al. /1988/, в фильтрате "Б" вирус иммунодефицита не определяется, теоретическая возможность передачи на сегодняшний день неизвестных инфекций остается.

Вследствие этого одной из задач исследования было изучение возможности включения в технологический цикл производства габриглобина двух стадий вирусинактивации.

Комбинация спиртового метода с выдерживанием полуфабриката при кислом значении рН позволили ведущим фирмам — производителям внутривенных иммуноглобулинов "Bayer" и "Sandoz" валидировать свою продукцию в США и Европе /Исрафилов и соавт., 2005/. Поэтому первой стадией инактивации возможно присутствующих вирусов в технологическом цикле приготовления препарата "Габриглобин" стал этап выдерживания полуфабриката иммуноглобулина при величине рН 4,0 - 4,5 в течение 21 суток.

Оценка качества полуфабриката до и после выдерживания при данных условиях показала, что различия основных параметров иммуноглобулина были статистически незначимым (значение р между группами от 0,226 до 1,0), что доказывает отсутствие значимого влияния условий инкубации препарата на его качественные характеристики.

В связи с тем, что рекомендованные в настоящее время методы инактивации вирусов, а именно, сухой прогрев, пастеризация, обработка растворителем и детергентом практически одинаково эффективны /Horowitz В et al., 1992; Laso М. et al., 2002/, особенно эффективен прогрев иммуноглобулина /Зубкова Н.В., Анастасиев В.В., 2002/, в качестве второй стадии вирусинактивации возможно присутствующих вирусов был использован прогрев сублимационно высушенного габриглобина во флаконах. Для выбора режима вирусинактивации было проведено исследование влияния температурной обработки при 60, 70 и 80 °С в течение 6, 24, 48 и 72 часов на отдельные параметры иммуноглобулина.

Анализ препаратов по ряду показателей, проведенный до и после прогревания, показал, что прозрачность и цветность испытуемых образцов несколько изменялись и зависели от длительности и режима прогрева. Тем не менее данные показатели находились в пределах допустимых значений в соответствии с требованием фармакопейной статьи.

Анализ антикомплементарной активности габриглобина при различных режимах прогревания показал, что данный параметр несколько изменялся в зависимости от температуры и длительности инкубации. При сопоставлении динамики изменения антикомплементарной активности препарата и его прозрачности в процессе инактивации было отмечено, что снижение антикомплементарной активности габриглобина с 20 до 10 мг белка сопровождалось уменьшением прозрачности раствора к 24 часам инкубации, а затем, к 72 часам, показатели прозрачности и антикомплементарной активности возвращались к исходным значениям. Возможный механизм изменения антикомплементарной активности иммуноглобулина, сопровождающийся колебаниями прозрачности раствора, может объясняться следующим. При сублимационном высушивании в «сухом» иммуноглобулине остается до 3 % воды, что регистрируется при определении показателя «потеря массы при высушивании» в открытом сосуде. При прогреве в герметично закрытом флаконе вполне возможно, что сначала белок (иммуноглобулин) начинает терять остаточную воду, в результате чего происходят конформационные изменения молекул иммуноглобулина, и участок связывания для первого компонента комплемента становится более доступным. Затем, в процессе продолжающегося прогрева, наступает равновесие между водой, находящейся в гидратных оболочках молекул иммуноглобулина и ограниченным объемом герметичного флакона. Наступившее равновесие сопровождается восстановлением первоначальной влажности и конформации молекул иммуноглобулина.

Данное предположение подтверждается тем, что молекулярные параметры иммуноглобулина практически не изменялись ни при прогревании сухих образцов при температуре 60 °С, ни при выдерживании их при 80 °С.

Содержание антител к вирусу кори при всех режимах вирусинактивации оставалось стабильным на протяжении первых 24 часов и к 48 часам содержание антител уменьшалось на одно разведение. Концентрация антител к альфа-стафилолизину в образцах уменьшалась более плавно и зависела от температуры и длительности инкубации. Количество антител к ЦМВ в образцах иммуноглобулина при прогревании при температурах 60 °С и 70 °С снижалось к концу процедуры не более, чем на 3,5 % (рис. 3). Однако прогревание препарата при 80 °С привело к значительному падению уровня антител к ЦМВ уже через 24 часа (на 43 %), а к 72 часам - на 53,9 %.

Таким образом, был сделан вывод об отсутствии значительного влияния прогревания сухой формы препарата габриглобина при 60 °С в течение 72 часов или при 70 °С в течение 48 часов на качественные характеристики препарата.

Производственные возможности и наличие оборудования на станции переливания крови позволили ввести в .производственный процесс приготовления вирусбезопасного габриглобина стадию прогревания препарата при 60 °С в течение 72 часов. Таким образом, в процесс производства габриглобина были включены две специальные стадии инактивации возможно присутствующих вирусов.

Учитывая, что одним из самых серьезных осложнений иммунодефицитных состояний является развитие оппортунистических инфекций, в частности, вызванных цитомегаловирусом, и принимая во внимание данные о терапевтической эффективности нормальных и специфических иммуноглобулинов при цитомегаловирусной инфекции, одной из задач настоящего исследования было изучение возможности получения иммуноглобулина для внутривенного введения с цельной, нерасщепленной молекулой IgG с высоким титром антител к ЦМВ.

С этой целью был определен титр антител к ЦМВ в препаратах нормального иммуноглобулина человека, выпускаемого Ивановской станцией переливания крови, и установлены критерии отбора донорской крови.

Фоновое содержание указанных антител в иммуноглобулине составило величину 1:1600 - 1:3200 (титр в пересчете на 5 %-ный белок), поэтому, принимая во внимание минимальное различие в содержании антител между «нормальным» и «специфическим» иммуноглобулином в 4-6 раз, допустимый титр антител к ЦМВ в гипериммунном препарате должен составлять 1:6400 — 1:12800, а минимальный допустимый титр анти-ЦМВ-антител в плазме крови доноров иметь величину 1:1600.

Был создан банк из 107 доноров, имеющих титр антител к вирусу ЦМВ более 1:1600. Плазму собирали методом плазмафереза. После карантинизации плазма была использована для приготовления трех промышленных серий иммуноглобулина с повышенным титром антител к вирусу цитомегалии, получившего коммерческое название "Габриглобин-анти-ЦМВ".

Степень концентрирования антител к ЦМВ во всех полученных образцах составила 8 раз, что свидетельствует о правильности выбранных технологических параметров процедуры фракционирования.

Титр антител в трех сериях препарата непосредственно после их изготовления составлял 1:12800 - 1:25600, что соответствовало расчетным данным на специфический антицитомегаловирусный иммуноглобулин. Через три года хранения (срок наблюдения) титр антител к ЦМВ уменьшался всего лишь на одно разведение, что, тем не менее, удовлетворяло заложенным в проект ФСП требованиям на препарат (1:6400).

Контрольные исследования содержания антител к ЦМВ, проведенные с использованием двух различных тест-систем, показали, что обе ИФА-тест-системы одинаково пригодны для этой цели. Для грубой оценки, в связи с большим шагом разведения проб, может быть использована тест-система «BeKToUMB-IgG-cTpHn», а если необходимо получение более точных результатов, необходимо применять тест-систему "ДС-ИФА-анти-ЦМВ-G".

Все три серии препарата "Габриглобин-анти-ЦМВ" имели содержание антител более 50 МЕ/мл и не уступали по специфической активности коммерческому образцу — препарату "Цитотект".

Положительные результаты, достигнутые при фракционировании плазмы с высоким титром таких лабильных антител подкласса IgG3, какими являются антитела к ЦМВ, позволили разработать общую технологию фракционирования плазмы для получения препаратов "Габриглобин" и "Габриглобин-анти-ЦМВ". Схема включает карантинизацию плазмы, тестирование на вирусные маркеры, спиртовое фракционирование, концентрирование фильтрата «Б» ультрафильтрацией при величине рН 4,2, стадию снижения антикомплементарной активности (диализ-диафильтрация), первую вирусинактивацию (выдерживание при рН 4,2 в течение 21 суток), высушивание, вторую вирусинактивацию (прогрев при 60 °С в течение 72 ч), контроль, упаковку и маркировку.

Располагая официально выпускаемым препаратом с содержанием, по данным колоночной хроматографии, мономерного иммуноглобулина G 9899 %, мы должны были убедиться в его терапевтических возможностях.

Абсолютным показанием для назначения иммуноглобулина является первичный гуморальный иммунодефицит /Кострова О.М., Алешкин В.А., 1995; Сетдикова Н.Х. и соавт., 2004; Goldman A.S., Goldblum R.M, 1977/. При этом выявляются все преимущества и недостатки того или иного коммерческого препарата иммуноглобулина: скорость достижения уровня циркулирующего IgG в сыворотке крови, длительность сохраняющейся концентрации и частота побочных реакций. Клиническая эффективность внутривенных иммуноглобулинов напрямую связана со степенью повреждения молекулы иммуноглобулина во время процедуры получения коммерческого препарата.

С целью доказательства сохранности всех основных функциональных свойств молекулы IgG были проведены клинические испытания препарата габриглобин у больных, страдающих врожденной агаммаглобулинемией.

Клинические испытания выполнены в рамках "Протокола открытого одноцентрового исследования безопасности и клинической эффективности препарата "Габриглобин" у взрослых с агаммаглобулинемией", утвержденного Фармакологическим комитетом МЗ РФ, согласованного с Комитетом по этике Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, в отделении иммунопатологии (заведующая - д.м.н. Латышева Т.В.) ГНЦ "Институт иммунологии МЗ РФ".

Целью исследования была оценка безопасности и клинической эффективности применения габриглобина в комплексной терапии у взрослых пациентов с агаммаглобулинемией.

Разовая доза препарата составляла 0,6 г/кг веса. Все больные до начала лечения получали заместительную терапию: плазмой (2 человека) и иммуноглобулинами для внутривенного введения отечественного производства (г. Нижний Новгород и г. Уфа) - 8 человек. Несмотря на ранее проводимую заместительную терапию у больных сохранялось значительное снижение концентрации иммуноглобулина G и полностью отсутствовали иммуноглобулины классов М и А. Только у одного больного присутствовало остаточное количество иммуноглобулинов А и М.

Во время введения габриглобина ни у одного больного не было зарегистрировано каких-либо системных реакций. За время применения габриглобина больными агаммаглобулинемией в течение 3-х месяцев отмечалось сокращение частоты рецидивов хронических заболеваний, что вело за собой сокращение потребности и длительности применения антибактериальной терапии. Так, например, перед началом лечения четверо больных нуждались практически в постоянном приеме антибиотиков в связи с непрерывно рецидивирующим воспалительным процессом, в последующие 2 месяца только один больной нуждался в антибактериальной терапии.

Исследование концентрации IgG в крови больных на 0, 1-ый, 2-ой, 5-ый, 10-й, 15-ый и 21-ый дни после инфузии подтвердили, что длительность сохранения повышенного уровня IgG в крови после введения габриглобина составляет более 21 суток (3 недели).

Кроме того, препарат "Габриглобин" был успешно использован для терапии вирусных инфекционных заболеваний: при так называемом "синдроме атипичной пневмонии", при невынашивании беременности, связанной с цитомегаловирусной инфекцией, и при лечении вирусного энцефалита, вызванного вирусом Эпштейна-Барр.

Положительные результаты клинического использования габриглобина при синдроме атипичной пневмонии позволили рекомендовать включение препаратов иммуноглобулинов в комплексную терапию данного заболевания /Письмо МЗ РФ, 2003/.

Эффективность терапии препаратами иммуноглобулина, в частности, с высоким титром антител к ЦМВ, такого грозного осложнения, каким является присоединяющаяся при трансплантации органов цитомегаловирусная инфекция, подтверждена исследованиями Моисеева С.И. и соавт. /2002/; Valatine Н.А. et al. /2001/; Andreoni К.А. et al. /2001/; Snydman D.R. /2001/; Zamora M.R. /2001/; Vrtovec B. et al. /2004/. Другие исследователи не нашли существенной разницы в использовании обычных (нормальных) и специфических иммуноглобулинов /Kocher A.A. et al., 2003, Kruger R.M., et al., 2003, Bonaros N.E. et al., 2004/.

Вполне вероятно, что недостаточная эффективность направленных антицитомегаловирусных препаратов, продемонстрированная в ряде исследований, была связана с тем, что использованные препараты имели недостаточно высокий уровень специфических защитных антител или поврежденные во время фракционирования или последующей химической обработке молекулы иммуноглобулина G, а также избирательным снижением подкласса IgG4. Это подкрепляется данными Мостовской Е.В. /2004/ и Лютова А.Г. и соавт. /2005/ о низком титре антител к ЦМВ в препарате цитотект и отрицательном действии химической обработки растворителем/детергентом на антительную активность иммуноглоблинов.

Мы считаем, что препарат "Габриглобин" с высоким титром антител к вирусу цитомегалии, неповрежденным Fc-фрагментом, цельными молекулами IgG в мономерной форме, полученный без использования химической или ферментативной обработки, может стать эффективным средством лечения ЦМВ-инфекции у иммунокомпрометированных лиц. Предположение косвенно подтверждается высокой эффективностью препарата, проявленной при лечении больных с первичными иммунодефицитами. Это позволило предложить "Габриглобин-анти-ЦМВ" для клинических испытаний. Составлена программа проведения исследования безвредности и клинической эффективности препарата "Габриглобин-анти-ЦМВ" у больных с трансплантированными органами, которая представлена для согласования в Фармакологический комитет Министерства здравоохранения и социального развития России. Оценка эффективности данного препарата является задачей дальнейшего научного исследования.

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана производственная технология получения иммуноглобулина с неповрежденным Fc-фрагментом, имеющего цельные молекулы IgG в мономерной форме, низкое значение рН и две стадии инактивации возможно присутствующих вирусов. Технологический процесс обеспечивает получения препаратов "Габриглобин" (иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения сухой) и "Габриглобин-анти-ЦМВ" (габриглобин с высоким титром антител к вирусу цитомегалии). Клинические испытания подтвердили высокое качество габриглобина, который эффективно восполнял дефицит циркулирующего IgG в крови больных с первичными гуморальными иммунодефицитами и сохранял высокую концентрацию IgG в течение более 21 суток.